Burada, perivasküler yağ dokusu fonksiyonunun ve vasküler hücrelerle ilişkisinin incelenmesine izin vererek, fare periaortik yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyondan türetilen preadipositlerin izolasyonunu, kültürünü ve adipojenik indüksiyonunu açıklıyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Fare Periaortik Yağ Dokusundan Stromal Vasküler Fraksiyon Kaynaklı Preadipositlerin İzolasyonu, Kültürü ve Adipojenik İndüksiyonu
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Perivasküler yağ dokusu (PVAT), kan damarlarını çevreleyen ve beyaz, bej ve kahverengi adipositlerin fenotiplerini sergileyen bir yağ dokusu deposudur. Son keşifler, PVAT'ın vasküler homeostazın düzenlenmesinde ve kardiyovasküler hastalıkların patogenezine katılmadaki merkezi rolüne ışık tutmuştur. PVAT özelliklerinin ve regülasyonunun kapsamlı bir şekilde anlaşılması, gelecekteki tedavilerin geliştirilmesi için büyük önem taşımaktadır. Periaortik adipositlerin primer kültürleri, PVAT fonksiyonunu ve periaortik adipositler ile vasküler hücreler arasındaki karışmayı incelemek için değerlidir. Bu makale, fare periaortik yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyondan türetilen preadipositlerin izolasyonu, kültürü ve adipojenik indüksiyonu için ekonomik ve uygulanabilir bir protokol sunmaktadır ve bu, in vitro adipogenez veya lipogenezin modellenmesi için yararlı olabilir. Protokol, genç farelerden periaortik adipositlerin kültürlenmesi için doku işleme ve hücre farklılaşmasını ana hatlarıyla belirtir. Bu protokol, PVAT işlevinin araştırılması için tezgah tarafında teknolojik temel taşı sağlayacaktır.
Giriş
Olgun adipositler ve stromal vasküler fraksiyonun (SVF) karışımından oluşan perivasküler bir yapı olan perivasküler yağ dokusunun (PVAT), sekretomu aracılığıyla komşu damar duvarı ile parakrineal olarak etkileşime girdiğine inanılmaktadır1. Vasküler homeostazın kritik bir düzenleyicisi olarak, PVAT disfonksiyonu kardiyovasküler hastalıkların patogenezinde rol oynar 2,3,4. Adiposit dokusunun SVF'si, endotel hücreleri, bağışıklık hücreleri, mezotelyum hücreleri, nöronal hücreler ve adipoz kök ve progenitör hücreler (ASPC'ler) dahil olmak üzere birkaç bek....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvan protokolleri, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi'ne bağlı Şanghay Göğüs Hastanesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (onay numarası: KS23010) ve ilgili etik düzenlemelere uygundu. Bu deney için 4-8 haftalık erkek ve dişi C57BL/6 fareler tercih edilmelidir.
1. Cerrahi aletlerin, tamponların ve kültür ortamlarının hazırlanması
- Cerrahi aletler (örn. cerrahi makas ve standart forseps) 121 °C'de 30 dakika boyunca otoklavlayın. Mikrocerrahi aletleri% 75 alkol ile dezenfekte edin.
- % 1 v / v penisilin-streptomisin ve% 10 v / v penisilin-streptomisin ile deste....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yukarıda açıklanan bu protokolü kullanarak, fare torasik aortlarını çevreleyen PVAT'leri dikkatlice izole ettik (Şekil 1A-D). PVAT'lar steril makas kullanılarak yıkandıktan ve küçük parçalara ayrıldıktan sonra (Şekil 1E,F), doku parçaları tip 1 kollajenaz (1 mg/mL) ve dispas II (4 mg/mL) içeren bir sindirim solüsyonunda sindirildi ve 37 °C'de bir çalkalayıcı üzerinde 30-45 dakika inkübe edildi (Şekil 1G).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Fare periaortik yağ dokusundan SVF'den türetilen preadipositlerin izolasyonu ve adipojenik indüksiyonu için pratik ve uygulanabilir bir yaklaşım öneriyoruz. Bu protokolün avantajları basit ve ekonomik olmasıdır. Başarılı izolasyon için yeterli sayıda fare kritik öneme sahiptir, çünkü yetersiz doku düşük SVF yoğunluğuna ve zayıf büyüme durumuna neden olabilir ve sonuçta lipojenik verimliliği etkileyebilir. Ek olarak, SVF'nin adipojenik potansiyeli yaşla birlikte azaldığı için fare yaşı dikkate alınması gereken önemli bir .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edecekleri finansal veya başka türlü herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82130012 ve 81830010) ve Şanghay Göğüs Hastanesi'nin temel araştırmaları için Yetiştirme projeleri (Hibe Numarası: 2022YNJCQ03) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.2 ve mu; m şırınga filtreleri | PALL | 4612 | |
| 12 oyuklu plaka | Labselect | 11210 | |
| 15 mL santrifüj tüpü | Labserv | 310109003 | |
| 3,3 ',5-triiyodo-L-tironin (T3) | Sigma-Aldrich | T-2877 | 1 nM |
| 50 mL santrifüj tüpü | Labselect | CT-002-50A | |
| anti-adiponektin | Abcam | ab22554 | 1: 1.000 çalışma konsantrasyonu |
| anti-COX IV | CST | 4850 | 1: 1.000 çalışma konsantrasyonu |
| anti-FABP4 | CST | 2120 | 1: 1.000 çalışma konsantrasyonu |
| anti-PGC1 ve alfa; | Abcam | ab191838 | 1: 1.000 çalışma konsantrasyonu |
| anti-PPAR ve gama; | Invitrogen | MA5-14889 | 1: 1.000 çalışma konsantrasyonu |
| anti-UCP1 | Abcam | ab10983 | 1: 1.000 çalışma konsantrasyonu |
| anti-&alfa;-Aktinin | CST | 6487 | 1: 1.000 çalışma konsantrasyonu |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | %1 |
| C57BL / Her iki cinsiyetten 4-8 haftalık 6 fare | Shanghai Model Organisms Center, Inc. | ||
| Hücre Süzgeci 70 & m, naylon | Falcon | 352350 | |
| Baldır derisinden kollajen | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Kollajenaz, Tip 1 | Worthington | LS004196 | 1 mg / mL |
| Deksametazon | Sigma-Aldrich | D1756 | 1 & mu; M |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | 4 mg / mL |
| Fetal sığır serumu | Gibco | 16000-044 | %10 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | 20 mM |
| Yüksek glikozlu DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM |
| İnkübatör | Shanghai longyue Instrument Eruipment Co., Ltd. | LYZ-103B | |
| İnsülin (sığır) | Sigma-Aldrich | 11070-73-8 | 1 μ M |
| Isofluran | RWD | R510-22-10 | |
| Krebs-Ringer'ın Çözeltisi | Pricella | PB180347 | Işıktan koruyun |
| Mikrocerrahi forseps | Beyotime | FS233 | |
| Mikrocerrahi makas | Beyotime | FS217 | |
| Yağ Kırmızı O | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | A600395-0050 | |
| PBS (Fosfat tamponlu salin) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | B548117-0500 | |
| Penisilin-Streptomisin | Gibco | 15140122 | |
| Peroksidaz AffiniPure Goat Anti-Fare IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1: 5.000 çalışma konsantrasyonu |
| Peroksidaz AffiniSaf Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | 1:5.000 çalışma konsantrasyonu |
| Rosiglitazon | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 & mu; M |
| Standart forseps | Beyotime | FS225 | |
| Cerrahi makas | Beyotime | FS001 |
Kaynaklar
- Akoumianakis, I., Antoniades, C. The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad. Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).
- Huang, C. L., et al.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
