Fare Periaortik Yağ Dokusundan Stromal Vasküler Fraksiyon Kaynaklı Preadipositlerin İzolasyonu, Kültürü ve Adipojenik İndüksiyonu

Olgun adipositler ve stromal vasküler fraksiyonun (SVF) karışımından oluşan perivasküler bir yapı olan perivasküler yağ dokusunun (PVAT), sekretomu aracılığıyla komşu damar duvarı ile parakrineal olarak etkileşime girdiğine inanılmaktadır¹. Vasküler homeostazın kritik bir düzenleyicisi olarak, PVAT disfonksiyonu kardiyovasküler hastalıkların patogenezinde rol oynar ^2,3,4. Adiposit dokusunun SVF'si, endotel hücreleri, bağışıklık hücreleri, mezotelyum hücreleri, nöronal hücreler ve adipoz kök ve progenitör hücreler (ASPC'ler) dahil olmak üzere birkaç beklenen hücre popülasyonundan ^oluşur5,6. Yağ dokusunun SVF'sinde bulunan ASPC'lerin olgun adipositlere yol açabileceği iyi bilinmektedir⁵. SVF'nin PVAT'ta kritik bir olgun adiposit kaynağı olduğu sonucuna varılmıştır. Birkaç çalışma, PVAT-SVF'nin belirli indüksiyon koşulları altında olgun adipositlere farklılaşabileceğini göstermiştir ^6,7,8.

Şu anda, SVF'yi yağ dokusundan izole etmek için biri enzimatik sindirim ve diğeri enzimatik olmayan olmak üzere iki izolasyon sistemi vardır⁹. Enzimatik yöntemler tipik olarak daha yüksek çekirdekli progenitör hücre verimi ile sonuçlanır¹⁰. Bugüne kadar, SVF'nin yara iyileşmesi, ürogenital ve kardiyovasküler hastalıklarda vasküler rejenerasyonu ve neovaskülarizasyonu desteklemedeki faydaları, özellikle dermatoloji ve plastik cerrahide^12,13 yaygın olarak gösterilmiştir11. Bununla birlikte, PVAT'tan türetilen SVF'nin klinik uygulama beklentileri iyi araştırılmamıştır, bu da SVF'nin PVAT'tan izolasyonu için standart bir yöntemin olmamasına bağlanabilir. Bu protokolün amacı, torasik aortu çevreleyen fare PVAT'ından SVF'den türetilen preadipositlerin izolasyonu, kültürü ve adipojenik indüksiyonu için standart bir yaklaşım oluşturmak ve PVAT fonksiyonunun daha fazla araştırılmasını sağlamaktır. Bu protokol, genç farelerden elde edilen periaortik adipositlerin kültürlenmesi için doku işleme ve hücre farklılaşma tekniklerini optimize eder.

Hayvan protokolleri, Şanghay Jiao Tong Üniversitesi Tıp Fakültesi'ne bağlı Şanghay Göğüs Hastanesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı (onay numarası: KS23010) ve ilgili etik düzenlemelere uygundu. Bu deney için 4-8 haftalık erkek ve dişi C57BL/6 fareler tercih edilmelidir.

1. Cerrahi aletlerin, tamponların ve kültür ortamlarının hazırlanması

1. Cerrahi aletler (örn. cerrahi makas ve standart forseps) 121 °C'de 30 dakika boyunca otoklavlayın. Mikrocerrahi aletleri% 75 alkol ile dezenfekte edin.
2. % 1 v / v penisilin-streptomisin ve% 10 v / v penisilin-streptomisin ile desteklenmiş 10 mL PBS ile desteklenmiş steril fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın.
   NOT: Aşağıdaki bölümlerde, özellikle belirtilmemişse, PBS, normal steril PBS'yi ifade eder.
3. Krebs Ringer HEPES BSA tamponunu hazırlayın:% 1 sığır serum albümini (BSA), Krebs Ringer çözeltisinde çözülmüş 20 mM HEPES.
4. Taze sindirim çözeltisi hazırlayın: tip 1 kollajenaz (1 mg / mL) ve dispas II (4 mg / mL) Krebs Ringer HEPES BSA tamponunda çözülür. Çözeltiyi 0,2 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edin.
5. Kollajen kaplı 12 oyuklu bir plaka hazırlayın.
   1. Kollajen çözeltisini (1 mg/mL) steril deiyonize su ile 40 μg/mL konsantrasyonuna seyreltin. 6-10 μg/^cm2'lik bir konsantrasyon elde etmek için her bir oyuğun yüzeyine 1 mL seyreltilmiş kollajen çözeltisi ekleyin. Kaplamayı oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
   2. Kalan çözeltiyi çıkarın ve her bir kuyuyu 2 kez 1 mL PBS ile durulayın. Plakayı hemen kullanın veya plakayı sınıf II laminer akış başlığında havayla kurutun ve kaplanmış plakayı 2-8 °C'de saklayın. Saklarken, kaplanmış plakaları parafilm ile kapatın.
6. Kültür ortamı hazırlayın: yüksek glikozlu Dulbecco's-Modifiye Eagles Medium (DMEM),% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 v / v penisilin-streptomisin. 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
7. Lipitojenik indüksiyon ortamı hazırlayın: yüksek glikozlu DMEM, %10 FBS, %1 v/v penisilin-streptomisin, 1 nM triiyodotironin, 1 μM rosiglitazon, 1 μM insülin, 0.5 mM 3-izobütil-1-metilksantin (IBMX) ve 1 μM deksametazon. 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
8. Bakım ortamı hazırlayın: yüksek glikozlu DMEM, %10 FBS, %1 v/v penisilin-streptomisin, 1 nM triiyodotironin, 1 μM rosiglitazon ve 1 μM insülin. 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.

2. Perivasküler yağ dokusunun diseksiyonu ve izolasyonu (PVAT)

1. Fareyi% 2 izofluran anestezisi altında servikal çıkık veya aşırı dozda karbondioksit ile ötenazi yapın. Cilt dezenfeksiyonu için% 75 alkol püskürtün.
2. Fareyi sırtüstü pozisyonda (yukarı bakacak şekilde) yerleştirin.
3. Cildi kaldırın, küçük bir kesi yapın ve ventral orta hat boyunca pelvisten boyuna kadar cerrahi makasla cildi ve karın kaslarını künt bir şekilde ayırın. Orta hattın her iki tarafındaki diyaframı ve kaburgaları keserek kalbi ve akciğerleri ortaya çıkarın.
4. Karaciğeri, dalak, bağırsakları ve böbreği dikkatlice çıkarın. Bağırsak duvarını kesmekten kaçının.
5. Akciğerleri ve yemek borusunu çıkarın.
6. Bir elinizde forseps ile kalbi nazikçe kaldırın ve diğer elinizde cerrahi makasla aort damarını omurgadan ayırın. Ardından, kalbi ve aortu %1 v/v penisilin-streptomisin içeren PBS'li 60 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin.
7. Mikrocerrahi forsepsleri ve mikrocerrahi makasları alkolden çıkarın ve fazla alkolü çıkarmak için 25 mL PBS'de durulayın. Stereo mikroskop altında, timus ve diğer dokuları kalpten ve aorttan çıkarın, ardından kalbi çıkarın ve aortu PVAT'lerle bırakın.
8. PVAT'lı aortu %1 v/v penisilin-streptomisin içeren PBS'li 60 mm'lik temiz bir Petri kabına aktarın.
9. PVAT'ları soymak için mikrocerrahi forseps kullanın, bir çift forseps aortu sabitler ve diğeri yağ dokusunu çeker. Perivasküler yağ dokusuna verilen zararı en aza indirirken damar dokusunu mümkün olduğunca çıkarın.
10. Torasik aortu çevreleyen PVAT'ı, buz üzerine yerleştirilmiş %1 v/v penisilin-streptomisin ile desteklenmiş yüksek glikozlu DMEM içeren 2 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne toplayın.

3. Stromal vasküler fraksiyonun (SVF) izolasyonu

1. Toplanan dokular %10 v/v penisilin-streptomisin içeren PBS ve %1 v/v penisilin-streptomisin içeren PBS ile sırayla durulayın.
   NOT: Bu adımdan itibaren, tüm deneyler steril koşullar altında sınıf II laminer akış başlığında gerçekleştirilmelidir.
2. Dokuları steril 60 mm'lik bir Petri kabına aktarın, 200 μL sindirim solüsyonu ekleyin ve steril makas kullanarak 1 mm³ parçaya kıyın.
3. Karışımı plastik bir pipet ucu kullanarak 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın, ucu steril bir makas kesimi ile genişletildi ve sindirim reaksiyonunu başlatmak için 6 mL sindirim solüsyonu ekleyin.
   NOT: Altı fareden PVAT depoları için bir sindirim reaksiyonu (3 mL sindirim solüsyonu) yeterlidir.
4. Dokuları 37 °C'de orbital çalkalayıcı (etkili karıştırma için 150 rpm frekans) ile bir inkübatörde 30-45 dakika inkübe edin. Tüplerin yatay olarak sallanmasını sağlamak için tüpleri bir rafa düz bir şekilde bağlayın. Her 5-10 dakikada bir 10 saniye boyunca elle kuvvetlice yukarı ve aşağı sallayın.
   NOT: Doku parçası kalmayan homojen, sarımsı bir sindirim sıvısı görüldüğünde sindirim kesilebilir.
5. Sindirilmiş dokuları 70 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne süzün. Hücre verimini en üst düzeye çıkarmak ve sindirimi durdurmak için hücre süzgecini eşit hacimde kültür ortamı ile durulayın.
6. Süzüntüyü yeni bir 15 mL'lik santrifüj tüpüne aktarın ve 10 dakika boyunca 1.800 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atmak için tüpü ters çevirin ve peletleri 5 mL PBS'de yeniden süspanse edin. 1.800 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
7. Tüpü ters çevirerek süpernatanı atın ve peletleri uygun bir hacimde kültür ortamında yeniden süspanse edin.
   NOT: Her altı fareden toplanan hücre peletleri, 1 mL kültür ortamında yeniden süspanse edilir ve 12 oyuklu bir plakanın bir oyuğuna ekilir.
8. Hücreleri kollajen kaplı 12 oyuklu bir plakaya tohumlayın ve gece boyunca %5_CO2 içeren nemli bir atmosferde 37 °C'de inkübe edin.
9. Ertesi gün, kültür ortamını aspire edin, hücre kalıntılarını ve kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için hücreleri% 1 v / v penisilin-streptomisin içeren önceden ısıtılmış (37 ° C) PBS ile yıkayın ve her bir kuyucuğa 1 mL taze kültür ortamı ekleyin.

4. Periaortik yağ dokusundan SVF kaynaklı preadipositlerin adipojenik indüksiyonu

1. Hücreler ~% 60-70 birleşmeye ulaşana kadar kültür ortamını her gün değiştirin.
   NOT: Hücrelerin %60-70 birleşmeye ulaşması genellikle 3-4 gün sürer.
2. Hücreler% 60-70 birleşmeye ulaştığında, kültür ortamını aspire edin ve kahverengi adipojenik indüksiyon ortamı ile değiştirin. Adipojenik farklılaşmanın indüksiyon gününü farklılaşmanın 0. günü olarak düşünün.
3. 72 saat sonra (farklılaşmanın 3. günü), ortamı bakım ortamıyla yenileyin. Hücreler deneyler için kullanılana kadar bakım ortamını her 2 günde bir değiştirin.
4. Adipojenik hücreleri, Yağ Kırmızısı O boyama¹⁴ ve batı lekeleme¹⁵ gibi uygun bir şekilde analiz edin.

Yukarıda açıklanan bu protokolü kullanarak, fare torasik aortlarını çevreleyen PVAT'leri dikkatlice izole ettik (Şekil 1A-D). PVAT'lar steril makas kullanılarak yıkandıktan ve küçük parçalara ayrıldıktan sonra (Şekil 1E,F), doku parçaları tip 1 kollajenaz (1 mg/mL) ve dispas II (4 mg/mL) içeren bir sindirim solüsyonunda sindirildi ve 37 °C'de bir çalkalayıcı üzerinde 30-45 dakika inkübe edildi (Şekil 1G). Sindirilen dokular 70 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne süzüldü (Şekil 1H). Santrifüjlemeden sonra hücre peletleri toplandı (Şekil 1I).

SVF'den türetilen preadipositlerin adipojenik potansiyelini doğrulamak için, hücreleri 1 nM triiyodotironin, 1 μM rosiglitazon, 1 μM insülin, 0.5 mM IBMX ve 1 μM deksametazon içeren kahverengi adipojenik indüksiyon ortamı ile indükledik. Olgun adipositler, 7-10 günlük kahverengi adipojenik indüksiyondan sonra, Yağ Kırmızısı O-boyanmış lipid açısından zengin vakuollerin oluşumu ile karakterize edildi (Şekil 2A). Western blotlama analizi ayrıca adiponektin, Fabp4, Pgc1α, Pparγ, Ucp1 ve mitokondriyal protein Cox IV dahil olmak üzere adiposit spesifik proteinlerin artan ekspresyon seviyelerini gösterdi (Şekil 2B, C). Bu veriler, fare periaortik yağ dokusundan SVF'den türetilen preadipositlerin güçlü adipojenik potansiyel sergilediğini göstermektedir.

Şekil 1: Fare periaortik yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyonun izolasyonu . (A) Kalp ve aort, cerrahi forseps ve makas kullanılarak dikkatlice diseke edilir. Beyaz ve sarı ok uçları sırasıyla kalbi ve aortu gösterir. (B) Torasik aortu çevreleyen PVAT'lar forseps kullanılarak dikkatlice sıyrılır. (C) Torasik aortu çevreleyen PVAT'ın çıkarılmasından sonra kalan aort. (D) PVAT'ler,% 1 v / v penisilin-streptomisin içeren yüksek glikozlu DMEM içeren 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde toplanır. (E) PVAT'ler, %10 v/v penisilin-streptomisin içeren PBS ve %1 v/v penisilin-streptomisin içeren PBS ile sırayla durulanır. (F) PVAT'ların steril makas kullanılarak 1 mm3 parçaya kıyılması. (G) Kıyılmış PVAT'ların 6 mL sindirim çözeltisi içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarılması ve dokuların 37 °C'de 30-45 dakika boyunca 150 rpm'de çalkalanarak inkübe edilmesi. (H) Sindirimi durdurun ve süspansiyonu 70 μm'lik bir hücre süzgecinden 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne süzün. (I) Süzüntüyü 10 dakika boyunca 1.800 × g'da santrifüjleyin; SVF izole edildi. Kısaltmalar: PVAT = perivasküler yağ dokusu; SVF = stromal vasküler fraksiyon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Stromal vasküler fraksiyonun fare periaortik yağ dokusundan adipojenik farklılaşması . (A) 8. günde periaortik preadipositlerden farklılaşan primer adipositlerin ışık mikroskobu ve Yağ Kırmızısı O boyamasının temsili görüntüleri. Ölçek çubukları = 200 μm. (B,C) 8. günde periaortik preadipositlerden farklılaşan primer adipositler için adiponektin, Fabp4, Pgc1α, Pparγ, Cox IV ve Ucp1 protein seviyelerinin Western blotting analizi. İki grup arasındaki anlamlı farklılıkları hesaplamak için eşleştirilmemiş iki kuyruklu Student t-testi kullanıldı. Değerler ortalama ± SEM'dir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların beyan edecekleri finansal veya başka türlü herhangi bir çıkar çatışması yoktur.