Burada, ubikitin ligazları Von Hippel-Lindau E3 ligaz (VHL) ve Cereblon (CRBN) içeren kimeraları (PROTACS) hedefleyen proteoliz tarafından indüklenen üçlü kompleks oluşumunun biyofiziksel karakterizasyonu için protokolleri açıklıyoruz. Burada gösterilen biyofiziksel yöntemler arasında yüzey plazmon rezonansı (SPR), biyokatman interferometrisi (BLI) ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) bulunur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kimeraları Hedefleyen Proteoliz Tarafından İndüklenen Üçlü Kompleks Oluşumunun Değerlendirilmesi için Biyofiziksel Testlerin Geliştirilmesi ve Uygulanması (PROTACS)
Bu makalede
Özet
Özet
Bozunma için hedeflenen E3 ligazları ve proteinleri, çok aşamalı bir işlemde heterobifonksiyonel moleküller tarafından kompleksler oluşturmak üzere indüklenebilir. İlgili etkileşimlerin kinetiği ve termodinamiği, ubikitinasyonun verimliliğine ve bunun sonucunda proteinin bozulmasına katkıda bulunur. Yüzey plazmon rezonansı (SPR), biyokatman interferometrisi (BLI) ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) gibi biyofiziksel teknikler, bu etkileşimlerin optimizasyonunda kullanılabilecek değerli bilgiler sağlar. İki model sistemi kullanılarak, üçlü kompleks oluşumunun işbirliğine dayalılığını ve 'kanca etkisinin' bağlanma kinetiği üzerindeki etkisini anlamak için bir biyofiziksel tahlil araç kiti oluşturulmuştur. Bir vakada, Brd4BD2 ve VHL arasında üçlü kompleks oluşumunu indükleyen kimera (PROTAC) molekülünü hedefleyen bir proteoliz değerlendirildi. Heterobifonksiyonel molekül olan MZ1, hem Brd4BD2 proteini (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) hem de VHL kompleksi (SPR K D = 29 nM, ITC K D = 66 nM) için nM afinitelerine sahiptir. Bu sistem için, üçlü kompleks oluşumunun işbirliğine elverişliliğini gösteren yayınlanmış sonuçları yeniden üreten sağlam SPR, BLI ve ITC tahlilleri geliştirilmiştir. Diğer durumda, 46.0 kDa'lık bir protein, PPM1D ve sereblon [CRBN (319-442)] arasında üçlü kompleksleri indükleyen bir molekül incelenmiştir. Heterobifonksiyonel molekül, BRD-5110, PPM1D için bir SPRKD = 1 nM'ye sahiptir, ancak kesilmiş CRBN (319-442) kompleksine (SPR KD = ~ 3 μM) karşı çok daha zayıf bağlanmaya sahiptir. Bu durumda, SPR'de CRBN için bağlanma doygun değildi ve bu da bir "kanca etkisi" ile sonuçlandı. SPR, BLI ve ITC için verim ve reaktif gereksinimleri değerlendirildi ve bunların PROTAC projelerine uygulanması için genel öneriler sağlandı.
Giriş
Hücredeki proteinlerin poliubikitinasyonu, Ubiquitin Ligas ailesi 1,2'deki enzimleri içeren sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir süreçtir. Yoldaki terminal enzimler, ubikuitin moleküllerini protein bağlayıcı ortaklarınakovalent olarak bağlayan E3 ubikuitin ligazlarıdır 3. Bu protein bağlayıcı ortakların poliubikitinasyonu, onları proteazom4 tarafından proteolitik bozunma için hedefler. Bu sistem, hastalık5'te yer alan proteinlerin bozulmasını indüklemek için terapötik olarak kullanılan protein homeostazı sürecinin bir parçasıdır. Von Hippel-Li....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm proteinler, literatür protokolleri18'e uygun olarak iyi verim ve saflıkta (% >80) E.coli'de aşırı eksprese edildi. Biyotinilasyon, BirA katalizli bir reaksiyon18 kullanılarak gerçekleştirildi. Tüm küçük moleküller %100 DMSO'da 1 mM stok çözeltilerde hazırlandı. Burada açıklanan prosedürler, özel laboratuvar güvenlik ekipmanı veya önlemleri gerektirmez. Standart laboratuvar kişisel koruyucu ekipmanı (KKD) kullanılmalıdır (örn. laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve eldiven).
Bu çalışmada uygulanan proteinler aşağıda listelenmiştir:
VHL: ElonginB'nin C-terminalinde Avi-etiketli b....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
VHL: MZ1 ikili kompleksi ve VHL: MZ1: Brd4BD2 üçlü kompleksinin karakterizasyonu, çok benzer bir tampon kullanılarak Şekil 2 (ITC), Şekil 3 (BLI) ve Şekil 4'te (SPR) bulunabilir. Ortogonal tahlillerdenekstrakte edilen KD tutarlıdır. Kooperatifçilik, oldukça pozitif olan (ITC'den 15 veya SPR'den 26)KD (ikili) / KD (üçlü) ile hesaplanabilir.
CRBN:PROTAC: PPM1D sis.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
PROTAC molekülleri ve bunların protein bağlayıcı ortakları arasındaki ikili ve üçlü etkileşimlerin biyofiziksel karakterizasyonu, yaygın olarak kullanılan hücresel sistemlere göre benzersiz ve tamamlayıcı bilgiler sağlayabilir. Bir PROTAC molekülünün her bir savaş başlığı ile protein bağlayıcı ortakları arasındaki afiniteyi anlamak, bu etkileşimlerin optimizasyonuna yönelik tıbbi kimya çabalarını yönlendirmeye yardımcı olabilir. Üçlü PROTAC komplekslerinin daha önce yayınlanmış kristal yapıları, bağlayıcı bölgedeki atoml.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların birbiriyle çelişen finansal çıkarları veya diğer çıkar çatışmaları yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, MIT ve Harvard Broad Enstitüsü'ndeki Terapötik Geliştirme Merkezi'nden bir İnovasyon ve Teknoloji Geliştirme ödülü ile desteklenmiştir. Yazarlar, bu çalışmaya verdikleri destek için üst düzey liderlik ekibi üyelerine ve inceleme komitesine teşekkür etmek istemektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 96 plakalı | Greiner | 655076 | düz tabanlı, siyah plakalar |
| 96 oyuklu plaka | Nunc | 73520-120 | ITC numune hazırlama için plaka kullanımı |
| 96 oyuklu plaka | Greiner | 650101 | SPR deneyleri için numune hazırlamak için kullanılan plaka |
| Otomatik iTC200 mikro kalorimetre | Malvern Panalytical | ITC deneylerini gerçekleştirmek için kullanılan alet. Ürün durduruldu. | |
| Biacore S200 | Cytiva | 29136649 | SPR deneylerini gerçekleştirmek için kullanılan Alet, |
| MZ1 | ProbeChem | PC-60099 | VHL ve Brd4BD2'ye bağlanan PROTAC |
| NTA sensör çipi | PPM1D içeren SPR deneylerini gerçekleştirmek için kullanılan Cytiva BR100532 SPR çipi | ||
| BLI | Sartorius | Cihazı. Ürün durduruldu. | |
| Plaka kapağı | Malvern | PQA0001 | Nunc 96 kuyulu plaka için kapak (73520-120) |
| Plaka kapağı | Cytiva | 28975816 | Greiner plakası için plaka kapağı (650101) |
| S Serisi SA sensör çipi | Cytiva | BR100531 | MZ1:VHL:BRD4 içeren SPR deneylerini gerçekleştirmek için kullanılan SPR çipi |
| Streptavidin (SA) Daldırma ve Okuma Biyosensörleri | Sartorius | 18-509 | BLI'da kullanılan kaplamalı sensörler Deney |
Kaynaklar
- Balaji, V., Hoppe, T. Regulation of E3 ubiquitin ligases by homotypic and heterotypic assembly. F1000Research. 9, (2020).
- Song, L., Luo, Z. -Q. Post-translational regulation of ubiquitin signaling. Journal of Cell Biology. 218 (6), 1776-1786 (2019).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
