Kimeraları Hedefleyen Proteoliz Tarafından İndüklenen Üçlü Kompleks Oluşumunun Değerlendirilmesi için Biyofiziksel Testlerin Geliştirilmesi ve Uygulanması (PROTACS)

Özet

Burada, ubikitin ligazları Von Hippel-Lindau E3 ligaz (VHL) ve Cereblon (CRBN) içeren kimeraları (PROTACS) hedefleyen proteoliz tarafından indüklenen üçlü kompleks oluşumunun biyofiziksel karakterizasyonu için protokolleri açıklıyoruz. Burada gösterilen biyofiziksel yöntemler arasında yüzey plazmon rezonansı (SPR), biyokatman interferometrisi (BLI) ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) bulunur.

Özet

Bozunma için hedeflenen E3 ligazları ve proteinleri, çok aşamalı bir işlemde heterobifonksiyonel moleküller tarafından kompleksler oluşturmak üzere indüklenebilir. İlgili etkileşimlerin kinetiği ve termodinamiği, ubikitinasyonun verimliliğine ve bunun sonucunda proteinin bozulmasına katkıda bulunur. Yüzey plazmon rezonansı (SPR), biyokatman interferometrisi (BLI) ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) gibi biyofiziksel teknikler, bu etkileşimlerin optimizasyonunda kullanılabilecek değerli bilgiler sağlar. İki model sistemi kullanılarak, üçlü kompleks oluşumunun işbirliğine dayalılığını ve 'kanca etkisinin' bağlanma kinetiği üzerindeki etkisini anlamak için bir biyofiziksel tahlil araç kiti oluşturulmuştur. Bir vakada, Brd4^BD2 ve VHL arasında üçlü kompleks oluşumunu indükleyen kimera (PROTAC) molekülünü hedefleyen bir proteoliz değerlendirildi. Heterobifonksiyonel molekül olan MZ1, hem Brd4^BD2 proteini (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) hem de VHL kompleksi (SPR K D = 29 nM, ITC K _D = 66 nM) için nM afinitelerine sahiptir. Bu sistem için, üçlü kompleks oluşumunun işbirliğine elverişliliğini gösteren yayınlanmış sonuçları yeniden üreten sağlam SPR, BLI ve ITC tahlilleri geliştirilmiştir. Diğer durumda, 46.0 kDa'lık bir protein, PPM1D ve sereblon [CRBN (319-442)] arasında üçlü kompleksleri indükleyen bir molekül incelenmiştir. Heterobifonksiyonel molekül, BRD-5110, PPM1D için bir SPR_{KD =} 1 nM'ye sahiptir, ancak kesilmiş CRBN (319-442) kompleksine (SPR K_D = ~ 3 μM) karşı çok daha zayıf bağlanmaya sahiptir. Bu durumda, SPR'de CRBN için bağlanma doygun değildi ve bu da bir "kanca etkisi" ile sonuçlandı. SPR, BLI ve ITC için verim ve reaktif gereksinimleri değerlendirildi ve bunların PROTAC projelerine uygulanması için genel öneriler sağlandı.

Giriş

Hücredeki proteinlerin poliubikitinasyonu, Ubiquitin Ligas ailesi ^1,2'deki enzimleri içeren sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir süreçtir. Yoldaki terminal enzimler, ubikuitin moleküllerini protein bağlayıcı ortaklarına^{kovalent olarak bağlayan E3} ubikuitin ligazlarıdır 3. Bu protein bağlayıcı ortakların poliubikitinasyonu, onları proteazom⁴ tarafından proteolitik bozunma için hedefler. Bu sistem, hastalık^5'te yer alan proteinlerin bozulmasını indüklemek için terapötik olarak kullanılan protein homeostazı sürecinin bir parçasıdır. Von Hippel-Lindau E3 ligaz (VHL) veya sereblon (CRBN) gibi E3 ubikitin ligazları arasındaki etkileşimi indükleyen küçük moleküller, tipik olarak, bozunma için hedeflenen proteine bağlanan bir savaş başlığına esnek bir bağlayıcı ile bağlanan bir E3 ligaz bağlayıcı savaş başlığından oluşur. Bu heterobifonksiyonel moleküller genellikle kimeraları veya PROTACS^6'yı hedefleyen proteoliz olarak adlandırılır.

PROTACS'ın geliştirilmesi, moleküllerin hücrelerdeki proteinlerin bozulmasını indükleme yeteneğinin değerlendirilmesini içerir. Hücrelerin bir PROTAC molekülü ile muamelesi üzerine hedef protein ile VHL veya CRBN gibi E3 ligaz bileşenleri arasındaki indüklenmiş etkileşimi izleyen birçok hücresel tahlil sistemi geliştirilmiştir. Böyle bir hücresel tahlil olan nanoluc-Halotag sistemi⁷, Halotag alıcısına kaynaşmış bir E3 ligaz ve bir nanoluc donörü ile etiketlenmiş bir hedef protein içerir. Üçlü kompleks oluşumu, nanoluc donörü ve Halotag alıcısını yakınlaştırır ve donörden alıcıya enerji transferine izin vererek ışığın yayılmasına neden olur. Bu sistemin varyasyonları, PROTACS moleküllerinin⁸ hücresel geçirgenliğini veya hedef protein ubikitinasyonunun⁹ nispi seviyesindeki değişiklikleri değerlendirmek için kullanılabilir. Bu hücresel sistemler PROTACS'ın optimizasyonunu sağlamak için gerekli olsa da, E3 ligazları ve bozunması hedeflenen proteinler arasında komplekslerin oluşumu çok aşamalı bir süreçtir^10,11. İlgili ikili ve üçlü etkileşimlerin kinetiği ve termodinamiği, verimliliğin her yerde bulunmasına ve bunun sonucunda proteinin^{parçalanmasına katkıda bulunur 12,13,14}.

Burada, yüzey plazmon rezonansı (SPR), biyotabaka interferometrisi (BLI) ve izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) kullanılarak PROTACS tarafından indüklenen üçlü kompleks oluşumunun biyofiziksel karakterizasyonu için uyarlanabilen protokoller açıklanmaktadır. Literatür raporlarından türetilen Brd4^{BD2 ve VHL} arasında üçlü kompleks oluşumunu indükleyen MZ1 PROTAC molekülü için SPR ve ITC protokolleri^13,15 ve burada açıklanan^, rapor edilen prosedürlerin bazı modifikasyonları ile rapor edilen sonuçları özetleyebilmiştir. MZI, Brd4^BD2 ve VHL arasındaki üçlü kompleks oluşumunu değerlendirmek için kullanılan bir BLI testinin açıklaması bu rapora dahil edilmiştir. BLI'dan alınan afinite ölçümleri, SPR ve ITC'de gözlemlenenlerle tutarlıydı. Ekspresyonu p53'e bağımlı bir şekilde indüklenen bir Ser/Thr protein fosfataz^{olan PPM1D ile CRBN arasında PROTAC} kaynaklı üçlü kompleks oluşumunu değerlendirmek için bir SPR testinin geliştirildiği daha önce yayınlanmış bir protokol de açıklanmaktadır. Bu durumda, PROTAC molekülü PPM1D için nanomolar bir afiniteye sahiptir, ancak CRBN için sadece bir mikromolar afiniteye sahiptir. Bu durumda, PROTAC molekülünün CRBN'ye bağlanması doygun değildir, bu da yaygın olarak gözlenen "kanca etkisi" ile sonuçlanır. Kanca etkisi, her ikisi de bir köprüleme molekülüne bağlandığında heterotrimerik bir kompleks oluşturabilen iki türün bulunduğu üç vücut sisteminin bir özelliğidir (Şekil 1)¹⁷. Kanca etkisi, köprüleme türleri diğer iki türe göre aşırı konsantrasyonda olduğunda gözlenir. Ortaya çıkan durum, ikili etkileşimlerin üçlü etkileşimleri geride bıraktığı bir durumdur. Kanca etkisinin gözlemlendiği sistemler, bu raporda tartışılan belirli deneysel tasarım hususlarını gerektirir. PROTAC kaynaklı üçlü kompleks oluşumunun değerlendirilmesi için biyofiziksel testlerin kullanımını değerlendirmek için genel kavramlar ve reaktif gereksinimleri sağlanmıştır.

Protokol

Tüm proteinler, literatür protokolleri^18'e uygun olarak iyi verim ve saflıkta (% >80) E.coli'de aşırı eksprese edildi. Biyotinilasyon, BirA katalizli bir reaksiyon¹⁸ kullanılarak gerçekleştirildi. Tüm küçük moleküller %100 DMSO'da 1 mM stok çözeltilerde hazırlandı. Burada açıklanan prosedürler, özel laboratuvar güvenlik ekipmanı veya önlemleri gerektirmez. Standart laboratuvar kişisel koruyucu ekipmanı (KKD) kullanılmalıdır (örn. laboratuvar önlüğü, koruyucu gözlük ve eldiven).

Bu çalışmada uygulanan proteinler aşağıda listelenmiştir:
VHL: ElonginB'nin C-terminalinde Avi-etiketli biyotinillenmiş VHL (53-213) / ElonginB (1-104) / ElonginC (17-112) kompleksi.
Brd4^BD2: Etiketsiz Brd4^BD2(333-460)
CRBN: N terminalinde Avi etiketli biyotinillenmiş CRBN (319-442)
PPM1D: N terminalinde etiketsiz veya çift His8 etiketli PPM1D(1-420)

Bu çalışmada uygulanan küçük moleküller aşağıda listelenmiştir:
MZ1 (MW = 1002.6 Da): VHL ve Brd4^BD2'ye bağlanan PROTAC
BRD-2512 (MW = 841.4 Da): CRBN_{KD ~} 3 μM, PPM1D'ye bağlanmaz
BRD-5110 (MW = 872.0 Da): CRBN KD ~3 μM, PPM1D_{KD =} 1-2 nM
BRD-4761 (MW = 476.6 Da): CRBN, PPM1D_{KD =} 1-2 nM'ye bağlanmaz

1. Yöntem 1: ITC (izotermal titrasyon kalorimetrisi)

NOT: Titrasyonlar, otomatik enjeksiyonlu bir mikro kalorimetre kullanılarak gerçekleştirilir.

1. Tampon hazırlama: 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7.5 içeren 3 L tampon hazırlayın.
2. Diyaliz: VHL ve Brd4^BD2'yi (her biri 150 μM'de ~ 500 μL) adım 1.1'de hazırlanan tamponun 1 L'sine karşı, 4 ° C'de 3 kez, sırasıyla 4 saat, 2 saat ve yaklaşık 16 saat boyunca diyaliz edin. Son diyalizden sonra tamponu sonraki adımlarda kullanmak üzere saklayın.
3. Numuneleri plastik kapaklı 96 oyuklu bir plaka üzerinde hazırlayın.
   1. Her titrasyon için hücre için 400 μL çözelti, şırınga için 125 μL ve temizlik için 400 μL tampon hazırlayın. Numuneleri plakadaki ardışık üç oyuğa ekleyin. Bileşik stok% 100 DMSO'da 1 mM'de hazırlandığından, hücre ve şırıngada eşleşen tamponu sağlamak için protein çözeltilerine aynı oranda DMSO ekleyin. Nihai çözümlere %2 DMSO ekleyin.
      1. VHL'nin MZ1'e titrasyonu için örnek: 1 mM'de (10 μM nihai konsantrasyon) 392 μL tampon, 4 μL MZ1 ve 4 μL %100 DMSO içeren hücre çözeltisi hazırlayın. 85.7 μM'de 122.5 μL VHL, 2.5 μL% 100 DMSO (84 μM nihai konsantrasyon) içeren bir şırınga çözeltisi hazırlayın.
      2. VHL'nin tampona titrasyonu için numuneler (veriler, numune 1.3.1.1'den oluşturulan verilerin arka planda çıkarılması için kullanılacaktır): 392 μL tampon, 8 μL %100 DMSO içeren hücre çözeltisi hazırlayın. 85.7 μM'de (84 μM nihai konsantrasyon) 122.5 μL VHL içeren bir şırınga çözeltisi hazırlayın ve 2.5 μL% 100 DMSO ekleyin.
      3. VHL'nin MZ1 ve Brd4 BD2'ye titrasyonu için numuneler: 1 mM'de (8.4 μM nihai konsantrasyon) 392 μL 17.1 μM Brd4^BD2 (16.8 μM nihai konsantrasyon), 3.36 μL MZ1 ve 4.64 μL %100 DMSO içeren hücre çözeltisi hazırlayın. 85.7 μM'de (84 μM nihai konsantrasyon) 122.5 μL VHL ve 2.5 μL% 100 DMSO içeren bir şırınga çözeltisi hazırlayın.
      4. VHL'nin Brd4 BD2'ye titrasyonu için numuneler (1.3.1.3'ün arka planı): 392 μL 17.1 μM Brd4^BD2 (16.8 μM nihai konsantrasyon) ve 8 μL %100 DMSO içeren hücre çözeltisi hazırlayın. 85.7 μM'de (84 μM nihai konsantrasyon) 122.5 μL VHL ve 2.5 μL% 100 DMSO içeren bir şırınga çözeltisi hazırlayın.
4. Mikro kalorimetrede dört titrasyonun tümünü çalıştırın. Her biri, 120 s zaman aralıklarında 2 μL/s hızında 19 μL 2 μL şırınga çözeltisi enjeksiyonundan oluşur. İlk protein enjeksiyonunu (0.4 μL) yapın ve veri analizi sırasında atın. Tüm deneyleri 25 °C'de, 600 rpm'de karıştırarak gerçekleştirin.
5. Veri analizi: Üretici tarafından sağlanan analiz yazılımını kullanarak stokiyometriyi (n), ayrışma sabitini_(KD) ve bağlanma entalpisini (ΔH) elde etmek için verileri tek bağlama bölgesi modeline sığdırın (Şekil 2).

2. Yöntem 2: BLI (biyotabaka interferometrisi)

1. Streptavidin (SA) kaplı sensörleri kullanarak oda sıcaklığında (RT) 5 Hz alım hızıyla BLI deneyleri gerçekleştirin. Otomatik BLI deneyi sırasında, sensörlerin tek bir kolon içinde sabit olduğundan emin olun ve maksimum kuyu hacmi 392 μL olan 96 kuyulu, düz tabanlı, siyah bir plakanın farklı sütunları arasında hareket edin. Deneyde kullanılan plakanın her bir kuyucuğunu 200 μL çözelti ile doldurun.
   NOT: BLI sadece protein-protein etkileşimlerini (yani üçlü kompleks oluşumunu) tespit etmek için yararlıdır. Proteinler ve küçük moleküller arasındaki etkileşimleri tespit edecek kadar hassas değildir.
   1. Tampon hazırlama: 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, %0.05 P20, pH 7.5 içeren 100 mL tampon hazırlayın.
   2. İmmobilizasyon adımı için optimizasyon: Test sensörünü üretici tarafından önerildiği gibi 1-3 nm'ye yükleyin. Burada açıklanan prosedürler için ~1.0 nm'lik bir yükleme kullanılır. Bunu başarmak için, sensörü 80 saniye boyunca 1,5 μg/mL'de VHL içeren bir çözeltiye daldırın.
   3. Aşağıdaki sırayı kullanarak yedi SA sensörü uygulayarak BLI kinetik ölçümleri gerçekleştirin:
      1. İlk temel aşama için, 60 saniye boyunca tampona daldırın.
      2. İmmobilizasyon aşaması için, 80 saniye boyunca 1.5 μg/mL'de bir VHL çözeltisine daldırın.
      3. İkinci temel aşama için, 60 s boyunca tampona daldırın.
      4. Birleşme aşaması için, 2 μM'de sabit bir Brd4^BD2 konsantrasyonu, %2'de sabit DMSO konsantrasyonu ve 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.3 nM, 3.1 nM ve 0 nM'de değişen MZ1 konsantrasyonları (referans sensörü) 300 s için.
      5. Ayrışma aşaması için 600 s tampona daldırın.
   4. Üreticinin yazılımını kullanarak veri analizi gerçekleştirin. k _açık, k_kapalı ve KD_veri uydurma için rapor edilir (Şekil 3).

3. Yöntem 3: SPR (yüzey plazmon rezonansı)

NOT: Tüm SPR deneyleri, RT'de streptavidin (SA) kaplı sensör çipleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. NTA çipi, protein ve küçük moleküller arasındaki tespit için kullanılsa da, muhtemelen yüklü çip yüzeyi ile analitteki protein arasındaki elektrostatik etkileşimler nedeniyle, SA çipinden çok daha yüksek bir arka plan gözlendiğinden, üçlü komplekse uygulandığında dikkatli kullanılmalıdır.

1. VHL-MZ1 etkileşimi için SPR
   1. Tampon hazırlama.
      1. 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1 mM TCEP, %0.005 P20, pH 7.5 içeren 1 L'lik bir tampon hazırlayın ve 0.2 μm'lik bir filtre ünitesinden geçirin.
      2. İleride kullanmak üzere 20 mL tamponu çıkarın (DMSO içermeyen tampon) ve 20 mL DMSO (son çalışan tamponda %2 DMSO) ile yeniden doldurun. Aşağıda açıklanan tüm örneklerde DMSO'yu %2'de tutun (adım 3.1 ve 3.2)
   2. Üreticinin protokolünü izleyerek SA çipini etkinleştirin ve VHL'yi ~2000 RU'ya sabitleyin (5 μL/dk'da 5 μg/mL protein çözeltisi enjekte edin).
   3. MZ1'i, maksimum 130 μL hacme sahip 384 oyuklu, konik tabanlı, yarı saydam, polipropilen bir plaka üzerinde üst konsantrasyonu 10 μM'de olacak şekilde 3 katlı, 8 noktalı seri seyreltmede hazırlayın. Plakayı polipropilen mikroplakalarla uyumlu kendinden yapışkanlı, şeffaf plastik folyolarla kaplayın.
      1. Son konsantrasyonda %2 DMSO'yu sağlamak için üst konsantrasyonu DMSO içermeyen tamponla hazırlayın. 147 μL DMSO içermeyen tampona, 1 mM'de 1,5 μL MZ1 stoğu ve 1,5 μL %100 DMSO ekleyin.
      2. %2 DMSO içeren çalışan tampon ile 3 katlı seri seyreltmeyi hazırlayın. 100 μL'lik çalışan tampona, adım 3.1.3.1'de hazırlanan en yüksek konsantrasyonda 50 μL çözelti ekleyin ve 2^{. en yüksek} konsantrasyonu hazırlamak için iyice karıştırın.
      3. Daha sonra adım 3.1.3.2'de hazırlanan çözeltinin 50 μL'sini sonraki 100 μL'lik çalışan tampona aktarın, 3^{. en yüksek} konsantrasyonu hazırlamak için iyice karıştırın vb.
   4. Çok döngülü kurulumu kullanarak SPR'yi çalıştırın: Mod: Yüksek performans; temas süresi: 120 sn; ayrışma süresi: 300 s; akış hızı: 50 μL/dak.
   5. Cihaz üreticisi tarafından sağlanan değerlendirme yazılımını kullanarak veri analizi gerçekleştirin. Kararlı durum analizi_{, KD =} 26 (± 3) nM ve Rmax'ın ~%91 (± %5) bağlanma sağlandığını gösterdi (Şekil 4A)
2. VHL için SPR: MZ1: Brd4^BD2 üçlü kompleksi
   1. Arabelleği adım 3.1.1'de açıklandığı gibi hazırlayın.
   2. Üreticinin protokolünü izleyerek SA yongasını etkinleştirin ve VHL'yi ~100 RU'ya sabitleyin. ~100 RU yüzey yoğunluğuna ulaşılana kadar 5 μL/dak akış hızında ve 1-5 dakika arasında temas süresinde 0,5 μg/mL VHL'lik bir protein çözeltisi enjekte edin.
   3. Maksimum 323 μL hacme sahip 96 kuyulu, şeffaf, polistiren, yuvarlak tabanlı bir plakada iki adet 5 katlı, 5 noktalı tek döngülü enjeksiyon için numuneler hazırlayın ve 3.2.3.1-3.2.3.2 adımlarında açıklandığı gibi polistiren mikroplakalarla uyumlu kendinden yapışkanlı, şeffaf, plastik folyolarla kaplayın.
      1. Negatif kontrol: analit sadece Brd4^BD2 içerir.
         1. 200 μL hacimli çalışma tamponunda 25 μM'de en yüksek konsantrasyonu hazırlayın (#A5)
         2. Soldaki sonraki 4 kuyucuğa çalışan tamponda 2 μM'de her biri 160 μL Brd4^BD2 ekleyin (#A1-A4)
         3. 40 μL A5'i A4'e aktarın. İyice karıştırın.
         4. 40 μL A4'ü A3'e aktarın. İyice karıştırın. A1'e kadar bunu yapmaya devam edin.
      2. Üçlü kompleks oluşumu: analit MZ1 ve Brd4^BD2 içerir.
         1. DMSO içermeyen tamponda (#B5) 25.5 μM Brd4^BD2 içeren 196 μL'ye% 100-DMSO çözeltisinde 20 μM'de 4 μL MZ1 ekleyerek üst konsantrasyonu hazırlayın. Nihai konsantrasyonlar 25 μM Brd4^BD2, 100 nM MZ1 ve% 2 DMSO'dur.
         2. Soldaki sonraki 4 kuyucuğa (#B1-B4) çalışan tamponda 2 μM'de her biri 160 μL Brd4^BD2 ekleyin
         3. 40 μL B5'i B4'e aktarın. İyice karıştırın.
         4. 40 μL B4'ü B3'e aktarın. İyice karıştırın. B1'e kadar bunu yapmaya devam edin.
   4. Tek döngülü kurulumu kullanarak SPR'yi çalıştırın: Temas süresi: 100 sn; ayrışma süresi: 720 s; akış hızı: 50 μL/dak. Sabit bir arka plan sağlamak için her numuneden önce üç tampon enjeksiyonu uygulayın.
   5. Veri analizi: Çıkarma için arka plan olarak arabelleğin üçüncü enjeksiyonunu uygulayın. Negatif kontrol olarak, MZ1 mevcut olmadığında, VHL ve Brd4^BD2 arasındaki SPR yanıtı ihmal edilebilir. MZ1 mevcut olduğunda, kinetik uydurma, VHL ve MZ1-Brd4^BD2 kompleksi arasındaki etkileşimi gösterir k _açık = 7.9 (± 1.5) *10⁷ /M/s, k_kapalı = 0.014 ^s-1 _{ve KD =} 1 nM'dir. (Şekil 4B)
3. CRBN ve küçük molekül etkileşimleri için SPR
   1. Tampon hazırlama.
      1. 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl 2, 0.5 mM TCEP, %0.005 P20, pH 7.5 içeren 1 L'lik bir tampon hazırlayın ve_0.2 μm'lik bir filtre ünitesinden geçirin.
      2. 20 mL tamponu çıkarın ve 20 mL %100 DMSO'yu (son çalışan tamponda %2 DMSO) yeniden doldurun. Aşağıda açıklanan tüm örneklerde DMSO'yu %2'de tutmak önemlidir (adım 3.3, 3.4 ve 3.5).
   2. Üreticinin protokolünü izleyerek SA yongasını etkinleştirin ve CRBN'yi ~800 RU'ya hareketsiz hale getirin.
   3. Bileşikleri, 3.1.3'te açıklandığı gibi 30 μM'lik bir üst konsantrasyona sahip 384 oyuklu bir plaka üzerinde 3 katlı, 6 pt seri seyreltmede hazırlayın.
   4. Çok döngülü kurulumu kullanarak SPR'yi çalıştırın: Mod: Yüksek performans, temas süresi: 60 sn, ayrışma süresi: 90 sn; akış hızı: 50 μL/dak. Bu sistem için, kararlı bir arka plan elde etmek için üç tampon enjeksiyonu yeterlidir. Diğer tahlil sistemleri için ek tampon enjeksiyonları yapmak gerekebilir.
   5. Üreticinin yazılımını kullanarak veri analizi gerçekleştirin.
      NOT: Kararlı durum analizi, BRD-2512 ve BRD-5110'un_KD'sinin her ikisinin de 3 μM civarında olduğunu gösterir. Bununla birlikte, bağlanma en yüksek konsantrasyonda yalnızca ~% 70 R_maksimum bağlanmaya ulaştı. Hem zayıf afinite hem de sensorgramın şekli, yüksek konsantrasyonlarda bileşik çözünmezliğin meydana gelme olasılığının yüksek olduğunu gösterir. Bu nedenle,_{gerçek KD 3} μM'den daha yüksek olabilir. CRBN'ye bağlanmayan BRD-4761, negatif kontrol olarak dahil edildi.
4. PPM1D ve küçük molekül etkileşimleri için SPR
   1. Arabelleği adım 3.3.1'de açıklandığı gibi hazırlayın. Bir nitriloasetik asit (NTA) sensör çipi kullanın.
   2. PPM1D savaş başlığının yavaş bir k_açık ve k_kapalı olması nedeniyle tek döngü uygulayın. Üreticinin varsayılan kurulumunu kullanarak NTA çipini yeniden oluşturun ve her bileşik enjeksiyondan sonra PPM1D'yi ~ 1000 RU'ya hareketsiz hale getirin (5 μL/dk'da 5 μg/mL protein çözeltisi enjekte edin).
   3. Bileşikleri, 3.1.3'te açıklandığı gibi en yüksek konsantrasyon 400 nM'de olacak şekilde 3 katlı, 5 noktalı seri seyreltmede hazırlayın.
   4. Tek döngülü kurulumu kullanarak SPR'yi çalıştırın: Mod: yüksek performans; temas süresi: 90 sn; ayrışma süresi: 600 s; akış hızı: 50 μL/dak. Stabil bir arka plan sağlamak için her bileşikten önce üç tampon enjeksiyonu uygulayın.
   5. Veri analizi. Tamponun üçüncü enjeksiyonunu çıkarma için arka plan olarak uygulayın. Negatif kontrol olarak BRD-2512, PPM1D'ye bağlanma göstermez. BRD-4761 ve BRD-5110 için kinetik bağlantı, her ikisi için de KD'nin 1-2 nm olduğunu gösterdi.
5. CRBN için SPR:PROTAC: PPM1D üçlü kompleks
   1. Arabelleği adım 3.3.1'de açıklandığı gibi hazırlayın.
   2. Üreticinin protokolünü izleyerek SA çipini etkinleştirin ve CRBN'yi ~35 RU'ya hareketsiz hale getirin (5 μL/dk'da 0,5 μg/mL'lik bir protein çözeltisi enjekte edin).
   3. Adım 3.2.3'te açıklanan yöntemi kullanarak, boşluklar dahil tüm numunelerde [PPM1D]'yi 1 μM'de tutarken, 30 μM üst konsantrasyona sahip 3 katlı, 6 noktalı seri seyreltmede üç bileşik hazırlayın.
   4. Çok döngülü kurulumu kullanarak SPR'yi çalıştırın: Mod: Yüksek performans; temas süresi: 60 sn; ayrışma süresi: 90 sn; akış hızı: 50 μL/dak.
   5. Üreticinin yazılımını kullanarak veri analizi gerçekleştirin.
      NOT: BRD-2512 ve BRD-4761 hiçbir / ihmal edilebilir yanıt göstermezken, BRD-5110 hızlı açma/kapama kinetiği ile kararlı durumda "kanca etkisini" açıkça gösterir (Şekil 5A-C). BRD-5110'dan (Şekil 5C) gelen deneysel bağlanma yanıtı, KD'nin (CRBN, cpd) 3 veya 10 μM₍Şekil 5E) olduğu varsayıldığında simülasyondan tahmin edilen yanıt arasındadır, bu da üçlü_{KD ve ikili KD'nin} çok benzer olduğunu düşündürür. PPM1D: BRD-5110: CRBN kompleks oluşumunun belirgin bir işbirliği yoktur.

Sonuçlar

VHL: MZ1 ikili kompleksi ve VHL: MZ1: Brd4^BD2 üçlü kompleksinin karakterizasyonu, çok benzer bir tampon kullanılarak Şekil 2 (ITC), Şekil 3 (BLI) ve Şekil 4'te (SPR) bulunabilir. Ortogonal tahlillerden_ekstrakte edilen KD tutarlıdır. Kooperatifçilik, oldukça pozitif olan (_ITC'den 15 veya SPR'den 26)_{KD (}ikili) / KD (üçlü) ile hesaplanabilir.

CRBN:PROTAC: PPM1D sisteminin karakterizasyonu SPR ile gerçekleştirilmiştir (Şekil 5A-D). CRBN, üçlü kompleks oluşumunun gözlemlenmesini kolaylaştırmak için ~ 35 RU'ya immobilize edildi. PROTAC'ın tek başına bağlanması, gürültünün altında olan <2 RU'luk bir sinyalle sonuçlandı. Analitteki PPM1D, SA çip yüzeyinde yüksek bir arka plan sinyali verir ve uygulanabilecek en yüksek konsantrasyon 1 μM civarındadır. Bu değer, CRBN ile savaş başlığı ≥3 μM) arasındaki_KD'den daha düşüktür, bu nedenle "kanca etkisi" beklenir. SPR, simülasyonla iyi bir uyum içinde olan bunu algılayacak kadar hassastır (Şekil 5E). Simülasyon, klasik SPR hesaplaması [Yanıt_maks = (Yanıt Ligandı × Kütle_{İmmobilizasyonu})/Kütle_Ligandı] ile birlikte literatür^19'daki işbirlikçi olmayan denge kullanılarak yapılmıştır. _Bileşiğin yüksek konsantrasyonda çözünmezliği nedeniyle CRBN ve bileşik arasındaki KD doğru bir şekilde belirlenmediğinden, simülasyon dört varsayımsal KD kullanılarak yapıldı: 1 μM, 3 μM, 10 μM veya 30 μM. Deneysel sonuçlar, simüle edilmiş 3 μM ve 10 μM eğrileri arasında yer aldı, bu da ikili_{sistemdeki KD ile} neredeyse aynıydı ve bu da işbirliği olmadığını düşündürdü.

Şekil 1: Üç bağlama senaryosunun gösterimi ve farklı KD'lerin tanımı. (A) Klasik iki bileşenli sistemler. (B) PROTAC'ın bir ucunun doyurulabildiği üç bileşenli sistem, böylece iki bileşenli bir sistem olarak değerlendirilebilir. (C) "Kanca etkisinin" gözlemlendiği üç bileşenli sistem. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: ITC sonuçları. VHL'nin MZ1 (solda) veya MZ1:Brd4^BD2 kompleksine (sağda) titre edilmesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: BLI sonuçları. MZ1, VHL: MZ1: Brd4^BD2 üçlü kompleksinin oluşumuna aracılık eder. (A) Ham veriler. (B) [MZ1] = 0 olduğunda arka plan sinyallerinin çıkarılması. (C) K'yi_açık, _{k'yi çıkarmak} için B'nin kinetik uydurması, k kapalı ve KD_. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: SPR sonuçları . (A) MZ1'in VHL'ye bağlanması. (B) MZ1:Brd4^BD2 VHL'ye ikili karmaşık bağlanma. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Temsili bir PPM1D-PROTAC'ın "kanca etkisini" gösteren SPR sonuçları. CRBN, SA çip yüzeyinde immobilize edilirken, [PPM1D] tüm vakalar için analitte 1 μM'de tutuldu. (A) Yalnızca CRBN'ye bağlanan bir bileşik olan BRD-2512, neredeyse hiç yanıt vermez. (B) Yalnızca PPM1D'ye bağlanan bir bileşik olan BRD-4761 de yanıt vermez. (C,D) BRD-5110'de CRBN'nin savaş başlığına ve BRD-2512'de PPM1D'nin savaş başlığına sahip bir PROTAC olan BRD-4761, üçlü kompleksin oluşumunu indükledi. (E) CRBN ile bileşik arasındaki_KD'nin 1 μM (siyah), 3 μM (mavi), 10 μM (kırmızı) veya 30 μM (yeşil) olduğunu varsayarak SPR sonuçlarının bir simülasyonu. BRD-2512 eğrisi 3 μM ile 10 μM arasındadır, bu da ölçülen ikili_KD'ye çok yakındır, bu da işbirliği olmadığını düşündürür (işbirliği = 1). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

PROTAC molekülleri ve bunların protein bağlayıcı ortakları arasındaki ikili ve üçlü etkileşimlerin biyofiziksel karakterizasyonu, yaygın olarak kullanılan hücresel sistemlere göre benzersiz ve tamamlayıcı bilgiler sağlayabilir. Bir PROTAC molekülünün her bir savaş başlığı ile protein bağlayıcı ortakları arasındaki afiniteyi anlamak, bu etkileşimlerin optimizasyonuna yönelik tıbbi kimya çabalarını yönlendirmeye yardımcı olabilir. Üçlü PROTAC komplekslerinin daha önce yayınlanmış kristal yapıları, bağlayıcı bölgedeki atomların, protein bağlayıcı ortaklardan biri veya her ikisi ile etkileşimler oluşturabileceğini ortaya koymuştur^16,20. Üçlü kompleks oluşumunun işbirliğinin deneysel olarak belirlenmesi, bağlayıcı optimizasyonunu destekleyebilir.

Bu raporda, PROTAC molekülleri ve protein bağlayıcı ortakları arasındaki bağlanma afiniteleri hakkında bilgi sağlayabilen üç farklı biyofiziksel tekniğin kullanılması anlatılmaktadır. Yöntem 1, PROTAC molekülü, MZ1, VHL E3 ligaz kompleksi ve Brd4^BD2 bromodomain için izotermal titrasyon kalorimetrisi (ITC) deney düzeneğini detaylandırır. ITC sonuçları, MZ1 ve VHL arasındaki ikili etkileşim için 59 nM'lik KD'leri ve VHL ile önceden karıştırılmış MZ1 ve Brd4^BD2 arasındaki üçlü etkileşim için 4 nM'lik_KD'leri gösterdi. Afiniteler, SPR (MZ1 K D = 26 nM'ye immobilize VHL bağlanması, önceden karıştırılmış MZ1 ve Brd4^{BD2 K} D = 1 nM'ye immobilize VHL bağlanması) ve BLI'da (K _D = 2.8 nM) gözlenenlerle tutarlıydı. VHl'nin MZ1'e bağlanması için ITC_KD sonuçları bildirilen değerler¹⁶ ile tutarlı olsa da, elde edilen stokiyometri farklıdır. Bu sonucun olası bir açıklaması, burada açıklanan protokolde kullanılan HEPES bazlı tamponda MZ1'in zayıf çözünürlüğüdür, literatürden elde edilen sonuçlar ise Bis-tris bazlı bir tampon kullanılarak oluşturulmuştur. Yazarlar SPR, ITC ve BLI'da aynı tampon bileşenlerini kullanmayı tercih ettiler.

Yöntem 2, hareketsizleştirilmiş VHL, sabit bir Brd4^BD2 konsantrasyonu ve değişen MZ1 konsantrasyonlarının etkileşiminin BLI analizi için deney düzeneğini açıklar. Tekniğin duyarlılık sınırlamaları nedeniyle, üçlü kompleks oluşumu_{için KD,} k_açık ve k_kapalı değerleri üretilebilir, ancak MZ1 ve proteinler arasındaki ikili etkileşim için üretilemez.

Yöntem 3, birden çok SPR tahlilini açıklar. SPR, BLI'dan daha hassastır ve hem protein-küçük molekül (ikili) hem de protein-protein (üçlü) etkileşimlerini gözlemlemek için uygulanabilir. İkinci durumda, analitteki protein yüksek ve kararsız sinyaller verebileceğinden arka plan sinyalleri dikkatle izlenmelidir. SPR, DMSO, gliserol ve deterjanlar dahil olmak üzere yüksek kırılma indisine sahip reaktiflere karşı çok hassastır. Protein, gliserol veya deterjan içeren tamponda depolanıyorsa, çalışan tampon bu bileşenlerin eşleşen konsantrasyonlarını içermelidir. Alternatif olarak, boyut dışlama kromatografisinin uygulanması, herhangi bir SPR deneyinden önce bunları tamamen ortadan kaldırır. Tampon ve analit numuneleri arasındaki DMSO konsantrasyonlarının yakından eşleşmesine özen gösterilmelidir. DMSO solvent düzeltmeleri, üreticinin talimatlarına göre gerçekleştirilir.

Adım 3.1'deki yöntem, ikili VHL-MZ1 etkileşimi için SPR tahlilini açıklar. Yöntem 3.2, VHL için SPR tahlilini açıklar: VHL'nin hareketsiz hale getirildiği MZ1: Brd4 BD2 üçlü kompleksi ve analit ya tek başına Brd4 BD2 ya da MZ1: Brd4^BD2 kompleksidir. Bu sistemde, Brd4^{BD2 ve VHL} arasındaki etkileşim ihmal edilebilir düzeydedir. Üçlü kompleks oluşumu oldukça işbirlikçidir (ɑ = 26). Üçlü kompleks oluşumu için off-rate, tek döngülü kinetiğin kullanılmasını gerektiren 0.014 ^s-1'dir. ITC'den elde edilen sonuçlar ayrıca oldukça işbirlikçi bir üçlü kompleks oluşumu göstermektedir (ɑ=15). Adım 3.3, 3.4 ve 3.5'teki SPR yöntemleri, bir PROTAC molekülü olan BRD-5110'un varlığıyla indüklenen CRBN ve PPM1D arasında bir kompleks oluşumunu değerlendirmek için yapılan testleri açıklar. PROTAC molekülü, CRBN için zayıf bir afiniteye (KD ~ 3 μM) ve PPM1D için güçlü bir afiniteye_{(KD =} 1-2 nM) sahiptir. Sonuç olarak, CRBN'ye zayıf bağlanma doygun değildir ve gözlemlenen bir "kanca etkisi" ile sonuçlanır. Deneyde kullanılan DMSO konsantrasyonunu artırarak ligand çözünürlüğünü artırmak mümkün olsa da, bu durumlarda yüksek DMSO konsantrasyonlarından olumsuz etkilenebilecek protein stabilitesini dikkatlice izlemek önemlidir. Ek olarak, DMSO, ligandların proteine bağlanma ısısını gizleyebilen yüksek bir çözünme ısısına sahiptir. Şırıngadaki çözeltinin DMSO konsantrasyonlarının ve hücredeki çözeltinin eşleşmesine dikkat edilmelidir. Yazarlar, aynı tampon preparatına karşı iki çözeltinin diyalizini önermektedir.

Burada gerçekleştirilen ve raporlanan deneylere dayalı olarak genel öneriler ve yönergeler sağlanmaktadır. PROTAC molekülleri ve protein bağlayıcı ortakları arasındaki ikili etkileşimlerin afiniteleri güçlü olduğunda_{(KD <} 1 μM), SPR, üçlü kompleks oluşumunun işbirliği hakkında değerli bilgilerle birlikte güvenilir ve tekrarlanabilir afiniteler sağlar. Protein bağlayıcı ortaklardan biri ile PROTAC molekülü arasındaki ikili etkileşimin afiniteleri zayıf olduğunda_{(KD >} 1 μM), tahlil kurulumunun değiştirilmesi gerekecektir. Bu durumlarda, bağlanma sabitlerinin sabit olduğu ve ligand ve analit konsantrasyonlarının değiştiği moleküler simülasyonların kullanılması, tahlil tasarımına rehberlik etmede ve deneysel sonuçları yorumlamada değerli olabilir. ITC tahlilleri, bağlanmanın stokiyometrisi hakkında önemli bilgiler sağlar, ancak SPR ve BLI'ya göre önemli ölçüde daha fazla protein ve bileşik reaktifi gerektirir. Ek olarak, PROTAC molekülünün çözünürlüğü ITC deneyleri için sınırlayıcı olabilir. BLI, ITC'den daha yüksek verime sahiptir ve daha az protein ve bileşik reaktifi gerektirir. Bununla birlikte, hassasiyet sınırlamaları nedeniyle, BLI, PROTAC molekülleri ve protein bağlayıcı ortakları arasındaki ikili etkileşimleri değil, yalnızca üçlü kompleks oluşumunu değerlendirmek için kullanılabilir. SPR'nin hem ikili hem de üçlü PROTAC bağlanma testlerinin ve SPR'den elde edilen sonuçların ortogonal validasyonu için kullanılan BLI ve ITC testlerinin rutin testleri için kullanılması önerilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
96 plakalı	Greiner	655076	düz tabanlı, siyah plakalar
96 oyuklu plaka	Nunc	73520-120	ITC numune hazırlama için plaka kullanımı
96 oyuklu plaka	Greiner	650101	SPR deneyleri için numune hazırlamak için kullanılan plaka
Otomatik iTC200 mikro kalorimetre	Malvern Panalytical		ITC deneylerini gerçekleştirmek için kullanılan alet. Ürün durduruldu.
Biacore S200	Cytiva	29136649	SPR deneylerini gerçekleştirmek için kullanılan Alet,
MZ1	ProbeChem	PC-60099	VHL ve Brd4BD2'ye bağlanan PROTAC
NTA sensör çipi	PPM1D içeren SPR deneylerini gerçekleştirmek için kullanılan Cytiva BR100532 SPR çipi
BLI	Sartorius		Cihazı. Ürün durduruldu.
Plaka kapağı	Malvern	PQA0001	Nunc 96 kuyulu plaka için kapak (73520-120)
Plaka kapağı	Cytiva	28975816	Greiner plakası için plaka kapağı (650101)
S Serisi SA sensör çipi	Cytiva	BR100531	MZ1:VHL:BRD4 içeren SPR deneylerini gerçekleştirmek için kullanılan SPR çipi
Streptavidin (SA) Daldırma ve Okuma Biyosensörleri	Sartorius	18-509	BLI'da kullanılan kaplamalı sensörler Deney