Yöntem makalesi

İn Vivo B Hücre Aktivasyonunu İnhibe Ederek ve Galaktoz Eksikliği Olan IgA1 Üretimini In Vitro Azaltarak Diosin Aracılı IgA Nefropatisinin Hafifletilmesi

2.5K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/65719

⸱

13 Ekim 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Guanganmen Hospital, 2Department of Nephrology, 906 Hospital of Joint Logistic Support Force of People's Liberation Army (PLA), 3Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, immünoglobulin A nefropatisinin (IgAN) Dioscoreae Nipponicae Rhizoma'nın (DNR) aktif bileşeni olan Dioscin (DIO) ile tedavisi için deneysel veriler ve bitkisel tıbbın etkilerini ve altta yatan mekanizmaları in vivo ve in vitro olarak incelemek için bir paradigma sunmaktadır.

Özet

Dolaşımdaki galaktoz eksikliği olan IgA1'in (Gd-IgA1) artışı, IgA nefropatisinin (IgAN) patogenezinde kritik bir bağlantı olan mukozal immün yanıtlar sürecinde IgA-pozitif salgı hücrelerinin aşırı aktivasyonundan kaynaklanır. B lenfositlerinin IgA salgılayan plazma hücrelerine dönüştüğü belirgin yer olan Peyer yaması, IgA'nın birincil kaynağıdır. Ek olarak, çekirdek 1β-1,3-galaktosiltransferaz (C1GalT1) ve moleküler şaperonu, C1GalT1'e özgü moleküler şaperonun (Cosmc) daha düşük ekspresyonu, IgAN hastalarında IgA1'in anormal glikosilasyonu ile ilişkilidir. Klinik deneyimlerimiz, Dioscoreae Nipponicae Rhizoma'nın (DNR) bitkisel ilacının IgAN hastalarında proteinüri ve hematüriyi hafifletebileceğini ve böbrek fonksiyonlarını iyileştirebileceğini göstermektedir. Diosin (DIO), çeşitli farmakolojik aktivitelere sahip olan DNR'nin ana aktif bileşenlerinden biridir. Bu çalışma, DIO'nun IgAN tedavisinde olası mekanizmasını araştırıyor.IgAN model fare, mukozal immün indüksiyon ile kurulmuştur. Fareler kontrol, model ve DIO gavaj gruplarına ayrıldı. Farelerde glomerüler IgA birikimi, renal patolojik değişiklikler ve Peyer yamasındaki B hücre belirteçleri CD20 ve CXCR5 ekspresyonu immünofloresan ve immünohistokimya ile tespit edildi. Lipopolisakkarit (LPS) stimülasyonundan sonra, DIO'nun DAKIKI hücrelerinin proliferasyonu, IgA ve Gd-IgA1 sekresyonu, C1GalT1 ve Cosmc ekspresyonu üzerindeki etkileri, hücre sayma kiti-8 (CCK-8) testi, enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) testi, kantitatif gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (QRT-PCR) ve western blotting (WB) ile incelendi. İn vivo çalışmalarda, glomerüler mezanjiyal hiperplazi ile birlikte IgA birikimi ve IgAN model farede Peyer yamasında CD20 ve CXCR5'in artmış ekspresyonu DIO ile hafifletildi. İn vitro çalışmalar, 0.25 μg/mL ila 1.0 μg/mL DIO'nun LPS ile indüklenen DAKIKI hücre proliferasyonunu, IgA ve Gd-IgA1 sekresyonunu inhibe ettiğini ve C1GalT1 ve Cosmc'nin mRNA ve protein ekspresyonunu yukarı regüle ettiğini gösterdi. Bu çalışma, DIO'nun IgA salgılayan hücrelerin aşırı aktivasyonunu inhibe ederek ve C1GALT1/Cosmc ekspresyonunu yukarı regüle ederek Gd-IgA1 üretimini azaltabileceğini göstermektedir.

Giriş

IgA Nefropatisi (IgAN), spesifik bir tedavisi olmayan en yaygın primer glomerülonefrit türüdür ve son dönem böbrek yetmezliğinin önemli bir nedeni olmaya devam etmektedir1. IgAN'ın patogenezi hala tam olarak anlaşılamamış olsa da, "çoklu isabet hipotezi" genel olarak kabul edilmekte ve çok sayıda klinik ve deneysel araştırma kanıtı ile desteklenmektedir2. IgAN'ın patogenezi B hücrelerinin aktive edilmesini ve Galaktoz eksikliği olan IgA1 (Gd-IgA1) üretilmesini içerir3. Mukozal immün yanıt sırasında IgA salgılayan hücrelerin aşırı proliferasyonu ve aktivasyonuna bağlı olarak dolaşımdaki Gd-IgA1'deki artış, IgAN 4,5,6'nın patogenezinde kritik bir bağlantıdır. B lenfosit fenotipinin IgA salgılayan hücrelere dönüşümünün proliferasyonu ve aktivasyonu için merkezi yer olan Peyer yaması, IgAN7,8'in oluşumu ve gelişimi ile yakından ilişkili olan IgA sekresyonunun birincil kaynağıdır. Ek olarak, IgA1 salgılayan hücrelerin proliferasyonu ve ayrıca Core 1β-1,3-galaktosiltransferaz (C1GalT1) ve C1GalT1'e özgü moleküler şaperon (Cosmc) ekspresyonu, IgA1'in anormal glikozilasyonu ile ilişkilendirildi, bu da IgAN hastalarında GD-IgA1 üretimine neden olur 6,9.

Bitkisel ilaçlarla IgAN tedavisi ile ilgili klinik çalışmalar son yıllarda ilerlemiştir. Yiqi Qingjie Formülü, Guang'anmen Hastanesi Nefroloji Bölümü tarafından IgAN'ı tedavi etmek için gerekli bir formüldür. Grubumuzun önceki çalışması, Yiqi Qingjie Formülü ile tedaviden sonra IgAN hastalarının serumunda Gd-IgA1'in azaldığını buldu. Yiqi Qingjie Formülünde en çok kullanılan bitkilerden biri olan Dioscoreae Nipponicae Rhizoma (DNR), bağışıklığı düzenlemek, iltihabı baskılamak, öksürüğü ve astımı hafifletmek gibi çeşitli işlevlere sahip olan Dioscorea Nipponica Makino'nun kurutulmuş köksapıdır10,11. Birkaç bilim adamı IgAN'ı DNR ile tedavi etti ve iyi sonuçlar elde etti 12,13,14. DNR15'in ana aktif bileşeni olan Dioscin (DIO) ürik asidi düşürür, fibrozu inhibe eder, inflamatuar yanıtı inhibe eder ve antioksidatif stresi inhibe eder16,17. Bu nedenle, DIO, aşırı Gd-IgA1'in hücresel sekresyonunu inhibe etmek ve spesifik böbrek koruma etkileri uygulamak için yeni bir etki mekanizmasına sahip olabilir. Yine de, DIO'nun IgAN'ı tedavi etmek için etki mekanizması hakkında herhangi bir çalışma bildirilmemiştir.

DIO'nun IgAN üzerindeki potansiyel terapötik mekanizmasını araştırmak ve IgAN tedavisi için yeni bir yöntem sağlamak için, DIO'nun IgAN üzerindeki terapötik etkileri için in vivo ve in vitro deneyler yaptık.

Protokol

Guanganmen Hastanesi etik kurulu bu deneyi onayladı (hayvan deneyi etik onay numarası: IACUC-GAMH-2023-003).

1. Farelerin deneysel prosedür için hazırlanması

  1. Hastanenin/araştırma merkezinin hayvan tesisinde 22 SPF dereceli erkek Balb/c faresi (6-7 haftalık, vücut ağırlığı 20-25 g) yetiştirin. Rastgele sayı tablosu yöntemini kullanarak hayvanları kontrol (n = 8) ve model (n = 14) gruplarına bölün.
  2. Laboratuvar kafesinde 1 haftalık adaptif yetiştirmeden sonra, model grubunu (IgAN grubu) Zou ve ark.18'in modelleme protokolüne göre 9 hafta boyunca 6 mmol/L HCl içeren asitlendirilmiş suda %0.1 sığır gama globulini (BGG) çözeltisi ile besleyin.
  3. Bir IgAN deneysel fare modeli18 hazırlamak için BGG solüsyonu içmeye devam ederken, art arda 3 gün boyunca salin içinde salin içinde 0.1 mL% 0.1 BGG solüsyonu enjekte edin.
  4. Kontrol grubunun 9 hafta boyunca BGG olmadan 6 mmol/L HCl asitlendirilmiş suyu serbestçe içmesine izin verin. Karşılık gelen hacimdeki salini art arda 3 gün boyunca kuyruk damarına enjekte edin.
    NOT: Kontrol ve model grupları normal yemle aynı kalitede beslenmiştir.
  5. Kuyruk damarı enjeksiyonundan sonra, kontrol grubunda 2 fare ve model grubunda 2 fareyi rastgele seçin ve modellemenin başarılı olup olmadığını belirlemek için proteinüri, ışık mikroskobu ve immünofloresan ile inceleyin.
    NOT: Hayvanlara yiyecek verilmemektedir, ancak suya maruz kalmaları yasak değildir; idrar çıkışını kaydedin.
  6. Metabolik kafeslerle 24 saat boyunca idrar toplayın ve 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin; İdrar tortusunu atın. Süpernatantın 10 kat seyreltilmesinden sonra, bir idrar proteini tahlil kiti kullanarak proteinüri konsantrasyonunu ölçün ve daha sonra 24 saat toplam idrar proteini elde etmek için seyreltme faktörü ve idrar hacmi ile çarpın.
    NOT: Mikroskopi ve immünofloresan yöntemleri sırasıyla bölüm 3 ve 4'te gösterilmiştir.
  7. Modeli başarılı bir şekilde hazırladıktan sonra, model grubundaki 12 fareyi, rastgele sayı tablosu yöntemine göre model grubunda (IgAN grubu) ve DIO gavaj grubunda (DIO grubu) olmak üzere 6 fareye bölün.
  8. Kontrol grubunun BGG'siz 6 mmol/L HCl asitlenmiş su içmeye devam etmesine izin verin ve model grubu 6 mmol/L HCl içeren asitlenmiş sudan oluşan %0.1'lik BGG solüsyonu. Farmakolojik deneysel metodolojinin doz dönüşüm formülüne göre DIO grubu gavaj uygulamasının dozunu hesaplayın (70 kg'lık insan vücudu kütlesine göre dönüştürülür)19. Gavaj DIO tabletleri 8 hafta boyunca günde bir kez 0.06 g / kg.
  9. 8 haftalık gavajdan sonra, fareleri intraperitoneal olarak% 0.4 pentobarbital sodyum (60 mg / kg) ile uyuşturun ve ayak parmağı tutamıyla uygun anesteziyi onayladıktan sonra, sonraki ışık mikroskobu ve immünohistokimya analizleri için böbrekleri ve Peyer yamasını izole edin.
    NOT: İn vivo model için şema Ek Şekil 1'dedir.

2. Histolojik analiz

  1. Böbrekler için parafin bölümleri ve Peyer yaması
    1. 3 mm kalınlığındaki böbrek dokularını veya 1 Peyer yamasını 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin, gradyan etanol ve ksilen ile kurutun. 2 saat balmumuna batırın, kapatın ve dondurun.
    2. 2 μm kalınlığında böbrek kesitleri ve 4 μm kalınlığında Peyer yama kesitlerini kesin ve ılık suda yayın. Katlanmamış dilimleri temiz bir cam sürgü ile toplayın ve sabit sıcaklıktaki fırında 40 °C'de 1 saat pişirin. Numunenin ön işleminden sonra boyamaya başlayın.
      NOT: Böbreğin hiler kısmının koronal yüzeyini, 3 mm doku bloğu kalınlığında alın.
  2. Parafin bölümlerini oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca periyodik asit çözeltisi ile ışıktan arındırın ve boyayın. Damıtılmış su ile durulayın ve Schiff'in boyama solüsyonu ile 20-30 dakika boyunca ışıktan kaçınarak kuru-lekeli olarak silin. Mikroskop altında bölümler kırmızı olana kadar damıtılmış su ile durulayın.
  3. Bölümleri hematoksilen boyama solüsyonuna yerleştirin, çekirdekleri 3 dakika boyayın (çok derin boyanmış çekirdekler etanol hidroklorür ile bölünebilir) ve slaytlar renksiz olana kadar akan su ile durulayın.
  4. Gradyan konsantrasyonlarında etanol ve ksilen ile rutin dehidrasyon yapın, bölümleri nötr sakızla kapatın ve mikroskop altında gözlemleyin. PAS pozitif kırmızıdır ve çekirdek mavidir.

3. Peyer yamasının immünohistokimyasal analizi

  1. Peyer yamasının parafin bölümlerini adım 2.1'de açıklandığı gibi hazırlayın.
    NOT: İmmünohistokimyasal ve müteakip immünofloresan için bölümlerin kalınlığı 4 μm'dir.
  2. Parafin bölümlerini mumdan arındırın:
    1. Bölümleri 5 dakika ksilen I'e, 5 dakika ksilen II'ye ve 5 dakika ksilen III'e koyun.
    2. Ayrıca, slaytları susuz etanol I'de 5 dakika, susuz etanol II'de 5 dakika, %85 alkolde 5 dakika, %75 alkolde 5 dakika durulayın. Ardından slaytları damıtılmış suyla durulayın.
  3. Antijen alımı
    1. 50x stok sodyum sitrat çözeltisi hazırlayın ve kullanım için damıtılmış su ile 1x'e seyreltin. Otoklavda 2 dakika ısıtın, ardından dilimleri otoklava yerleştirin ve sıvı seviyesinin dilimlerin seviyesini aştığından emin olun.
    2. 5 dakika yüksek sıcaklıkta ısıtın, ardından slaytların doğal olarak soğumasını bekleyin. Dilimleri PBS solüsyonu ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  4. Endojen peroksidazın bloke edilmesi: Dokunun sınırlarını immünohistokimyasal bir kalemle bir daire içinde işaretleyin. Bölümleri% 3 hidrojen peroksit çözeltisi içinde% 3 hidrojen peroksit çözeltisi içinde, RT'de 15 dakika inkübe edin, ışıktan koruyun ve bölümleri her seferinde 5 dakika PBS çözeltisi ile üç kez yıkayın.
  5. Serum blokajı: RT'de 30 dakika boyunca işaretlenen doku bölümlerine %10 keçi serumu damlatarak bölümleri bloke edin. Bölümlerin leke ile eşit şekilde kaplandığından emin olun.
  6. Birincil antikor inkübasyonu: Bloke edici çözeltiyi yavaşça çalkalayın ve hazırlanan birincil antikorun bir kısmını ekleyin (CD20 [1:800]; CXCR5 [1:800]) bölümüne ekleyin. Kesiti düz bir şekilde ıslak bir kutuya koyun ve gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
    NOT: Antikorun buharlaşmasını önlemek için ıslak kutuya az miktarda su ekleyin.
  7. İkincil antikor inkübasyonu: Bölümleri her seferinde 5 dakika boyunca PBS solüsyonu ile üç kez yıkayın. Bölümleri kurulayarak PBS'yi çıkarın, dokuyu birincil antikorun ilgili türlerinin bir damla ikincil antikoru (HRP etiketi) ile örtün ve RT'de 50 dakika inkübe edin.
  8. 3,3'-diaminobenzidin (DAB) homojenizasyonu: Bölümleri PBS solüsyonu ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Bölümleri kuruladıktan sonra, taze hazırlanmış DAB kromojenik solüsyonunu bölümlerin üzerine bırakın. Mikroskop altında renk gelişim süresini gözlemleyin; Pozitif kahverengimsi sarıdır. Renk gelişimini sonlandırmak için musluk suyuyla durulayın.
  9. Boyama çekirdekleri: Hematoksilen ile yaklaşık 1 dakika tekrar boyayın, musluk suyuyla yıkayın ve ardından maviye dönmek için musluk suyuyla 10 dakika durulayın.
  10. Dehidrasyon ve sızdırmazlık:
    1. Bölümleri 5 dakika %75 alkole ve 5 dakika %85 alkole yerleştirin. Bölümleri 5 dakika susuz etanol I, 5 dakika susuz etanol II ve 5 dakika susuz etanol III içine yerleştirin.
    2. Bölümleri ksilen I'de 5 dakika yıkayın, hafifçe kuruması için çıkarın ve bölümleri nötr sakızla kapatın.
  11. Görüntü elde etme: Mikroskobik inceleme ile Görüntüleri toplayın ve dokunun panoramik görüntü analizi için halo yazılımı ile analiz edin.
    NOT: Hematoksilen lekeli çekirdekler mavidir ve DAB pozitif ekspresyonu kahverengimsi sarı olarak gözlenir.

4. Renal IgA immünofloresan

  1. Adım 2.1'de anlatıldığı gibi böbrekler için parafin bölümleri hazırlayın.
  2. Dewax parafin bölümleri:
    1. Bölümleri 5 dakika ksilen I'e, 5 dakika ksilen II'ye ve 5 dakika ksilen III'e koyun. Bölümleri susuz etanol I, susuz etanol II, %95 etanol, %90 etanol, %80 etanol, %70 etanol ve %50 etanol içinde her biri 5 dakika işlemden geçirin ve damıtılmış su ile yıkayın.
  3. Proteinaz K alımı: Bölümleri kurulayın ve histokimyasal bir kalemle doku bölümünün etrafına bir daire çizin. Dokuyu kaplamak için proteinaz K çalışma solüsyonunu (1: 9 stok solüsyonu ve PBS oranı) damla damla ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Bölümleri PBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  4. Hücre zarına nüfuz etmek: Bölümleri hafifçe kurulayın ve ardından üzerlerini %0.1 Triton ile örtün. RT'de 20 dakika inkübe edin ve bölümleri her biri 5 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın.
  5. Engelleme: RT'de 30 dakika boyunca bloke etmek için dokuyu eşit şekilde kaplamak için% 10 keçi serumu ekleyin.
  6. Birincil antikor inkübasyonu: Dokuyu homojen bir şekilde kaplamak için uygun miktarda keçi anti-fare AF488-konjuge IgA antikoru (1:500) ekleyin ve gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
  7. Boyama çekirdekleri: Dilimleri PBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. PBS'yi çıkardıktan sonra, 4 ",6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) boyasını bölümlere damla damla ekleyin ve ışıktan koruyarak RT'de 15 dakika inkübe edin.
  8. Bölümleri yıkayın ve kapatın: Bölümleri PBS ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın, ardından bir antifade montaj ortamı ile kapatın.
  9. Mikroskopi ve fotoğrafçılık: Floresan mikroskobu altında kesitleri gözlemleyin ve görüntü alın.
    NOT: DAPI için ultraviyole uyarma dalga boyu 330-380 nm'dir ve emisyon dalga boyu 420 nm, mavi ışıktır. Floresein izotiyosiyanat (FITC) uyarma dalga boyu 465-495 nm'dir ve emisyon dalga boyu 515-555 nm, yeşil ışıktır.

5. Hücre kültürü

  1. ATCC, ABD'den insan B lenfosit hattı DAKIKI'yi edinin. % 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş RPMI-1640 ortamında kültür DAKIKI hücreleri.
  2. Hücreleri 37 °C,% 5 CO2 inkübatörde kültürleyin ve her 2-3 günde bir alt kültürleyin. Tüm deneyler için logaritmik büyüme aşamasındaki hücreleri kullanın.
  3. % 70 -% 80 birleşimde, hücreleri steril bir pipetle toplayın ve hücreleri 5 dakika boyunca 140 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın, serumsuz ortamla tekrar süspanse edin ve 24 saat sonra, sonraki tedavi için tüm hücreleri hareketsiz bir dönemde bırakın.

6. Normal DAKIKI hücrelerinde güvenli DIO konsantrasyonlarının taranması için LDH sitotoksisite testleri

  1. DAKIKI hücrelerini 96 oyuklu plakalarda 4x105 hücre / kuyu yoğunluğunda tohumlayın ve bir Düşük kontrol grubu, bir Yüksek kontrol grubu ve farklı DIO konsantrasyonları (0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 8.0 μg / mL) ayarlayın. Gruplama yöntemine göre ilgili işlemden sonra 24 saat boyunca% 5 CO2, 37 ° C inkübatörde inkübe edin.
  2. Sitotoksisite tespit kitinin talimatlarına göre, yüksek kontrol grubundaki kuyucuk başına 5 μL lizat ekleyin ve ardından plakayı 15 dakika boyunca% 5 CO2, 37 ° C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
  3. Plakayı çıkarın, her bir oyuğa 100 μL reaksiyon karışımı ekleyin, RT'de 10 dakika karanlıkta inkübe edin ve ardından 50 μL durdurma reaksiyonu çözeltisi ekleyin. Mikroplaka okuyucuda OD değerini 490 nm'de mümkün olan en kısa sürede ölçün.
  4. Aşağıdaki formüle göre uygulanan maksimum doz olarak farklı DIO konsantrasyonlarının LDH salım oranını ve %≤10'u hesaplayın: LDH salım oranı = (deneysel kuyu LDH - düşük kontrol LDH) / (yüksek kontrol LDH - düşük kontrol LDH) x %100.

7. DIO'nun DAKIKI hücre proliferasyonu üzerindeki etkisini tespit etmek için CCK-8 testi

  1. Önceki deneylerimizin20 sonuçlarına dayanarak, DAKIKI hücrelerini indüklemek için LPS 40 μg / mL kullanarak bir IgAN modeli oluşturun.
  2. Daha sonra, 96 oyuklu plakalarda 4x105 hücre / kuyu tohumlayın ve kontrol, model ve DIO düşük, orta ve yüksek konsantrasyon gruplarına (0.25 μg / mL, 0.5 μg / mL ve 1.0 μg / mL) bölün. Plakaları %5 CO2, 37 ° C'lik bir inkübatörde 24 saat inkübe edin.
  3. Daha sonra, her bir oyuğa 20 μL CCK-8 reaktifi ekleyin ve plakaları 2 saat boyunca inkübatöre (% 5 CO2, 37 ° C) geri yerleştirin. İnkübasyondan sonra, mikroplaka okuyucuda OD'yi mümkün olan en kısa sürede 450 nm dalga boyunda tespit edin.

8. DIO'nun DAKIKI hücreleri tarafından IgA ve Gd-IgA1 salgılanması üzerindeki etkisini tespit etmek için ELISA

  1. DAKIKI hücrelerini 6x106 hücre/kuyucuk yoğunluğunda 6 oyuklu plakalara tohumlayın ve hücreleri adım 7.2'ye göre gruplandırın ve tedavi edin. Hücreleri 24 saat kültürleyin, daha sonra süpernatanı elde etmek için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 850 x g'da santrifüjleyin.
  2. Kit talimatlarına göre IgA ve Gd-IgA1 konsantrasyonlarını tespit edin.

9.qRT-PCR DIO'nun DAKIKI hücrelerinde C1GALT1 ve Cosmc mRNA seviyeleri üzerindeki etkisini tespit etmek için

  1. DAKIKI hücrelerini 6 oyuklu bir plakada 6x106 hücre / kuyu yoğunluğunda tohumlayın, hücreleri adım 7.2'de belirtilen CCK8 gibi gruplandırın ve tedavi edin ve 24 saat inkübe edin. Toplam RNA ekstraksiyon kitinin talimatlarına göre DAKIKI hücrelerinden toplam RNA'yı çıkarın.
  2. Her numune grubundan 1 μL ekstrakte edilmiş RNA aldıktan ve konsantrasyonunu ölçtükten sonra, kit talimatlarına göre her numuneden 1 μg toplam RNA'yı ters olarak cDNA'ya kopyalayın.
  3. Ardından, her bir genin ekspresyonunu tespit etmek için RT-PCR amplifikasyonu gerçekleştirin (15 dakika boyunca 95 °C, 10 saniye boyunca 95 °C ve 30 saniye boyunca 60 °C). İç referans olarak β-aktin ile 2-ΔΔCT yöntemini kullanarak her bir genin ekspresyon seviyesini hesaplayın.
    NOT: Astar dizileri aşağıdaki gibidir:
    C1GALT1: 5'-AAGGTTGACACCCAGCCTAA-3', 5'-CTTTGACGTGTTTGGCCTTT-3';
    Kozmik: 5'-GCTCCTTTTTGAAGGGTGTG-3', 5'-TACTGCAGCCCAAAGACTCA-3';
    β-aktin: 5'-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3', 5'-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3'.

10. DIO'nun DAKIKI hücrelerinde C1GALT1 ve Cosmc proteinlerinin ekspresyonu üzerindeki etkisini incelemek için Western blotlama

  1. DAKIKI hücrelerini 6 oyuklu bir plakada 6x106 hücre / kuyu yoğunluğunda tohumlayın. Bunları adım 7.2'de belirtildiği gibi gruplandırın ve ele alın. 24 saatlik inkübasyondan sonra, her bir hücre grubunu toplayın.
  2. Uygun miktarda hücre lizis çözeltisi ekleyin (PMSF: fosfataz inhibitörü: RIPA lizis çözeltisi = 1: 1: 100) ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra 13.500 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı toplayın.
  3. BCA protein konsantrasyonu test kitini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.
  4. Protein örneklerini 5x SDS-PAGE yükleme tamponu ile 4: 1'de girdaplama ile karıştırın ve proteini denatüre etmek için karışık örnekleri 100 ° C'de 5 dakika ısıtın.
  5. Farklı moleküler ağırlıklara sahip proteinleri tespit etmek için, protein işaretleyicisini (5 μL/kuyucuk) ve numuneleri (20 μg/kuyucuk) %12'lik bir SDS-PAGE jelin farklı şeritlerine ekleyin, SDS-PAGE elektroforezini çalıştırın ve jeli PVDF membranlarına aktarın.
  6. Membranları RT'de 2 saat boyunca% 5 yağsız sütle bloke edin ve 24 saat boyunca karşılık gelen primer antikorlarla (C1GALT1 [1:1000], Cosmc [1:2000]) inkübe edin. Dahili kontrol olarak β-aktin antikoru (1:100000) kullanın.
  7. Poliviniliden florür (PVDF) membranını 1x Tris-Tamponlu Salin,% 0.1 Tween 20 deterjan (TBST) ile üç kez (10 dakika / saat) yıkayın, ardından karşılık gelen ikincil keçi anti-tavşan IgG antikoru (1: 10000) ile RT'de 2 saat inkübe edin.
  8. Membranı tekrar TBST ile yıkayın (her biri 10 dakika boyunca üç kez) ve protein bandı tespiti için uygun miktarda gelişmiş kemilüminesans (ECL) çalışma solüsyonu (üreticinin talimatlarına göre) ile muamele edin.
  9. Kemilüminesans görüntüleme sistemini kullanarak görüntüleri yakalayın ve Image J görüntü analiz sistemini kullanarak proteinlerin gri değerlerinin yarı kantitatif bir analizini gerçekleştirin.

11. İstatistiksel analiz

  1. Verileri analiz etmek için uygun bir yazılım uygulaması kullanın. Tüm verileri SD (standart sapma) ± ortalama olarak ifade edin ve gruplar arasında karşılaştırma yapmak için tek yönlü bir ANOVA testi ile birden fazla örneği değerlendirin.
    NOT: İstatistiksel analizler için SPSS istatistik programı 26.0 kullanılmıştır. Varyansların eşit olduğu durumlarda gruplar arası iki yönlü karşılaştırmalar için LSD yöntemi, varyansların eşit olmadığı durumlarda gruplar arası iki yönlü karşılaştırmalar için Dunnett T3 yöntemi kullanılmıştır. P<0.05'in istatistiksel olarak anlamlı bir fark olduğu düşünüldü.

Sonuçlar

IgAN fare modelinde DIO'nun böbrek dokusu üzerindeki etkisi

Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, mukozal immün kaynaklı IgAN fare modeli (model grubu) proteinüride önemli bir artışa sahipti (Ek Şekil 2), mezanjiyal bölgede IgA birikimi görüldü, floresan tüm mezanjiyal bölge boyunca kümeler halinde eşit olarak dağıldı (Şekil 1A), böbrek dokusunun PAS boyaması mezanjiyal hücrelerin proliferasyonu ve stromal hiperplazi gösterdi (Şekil 1B), DIO gavaj grubunda (DIO grubu) azaltıldı.

DIO'nun Peyer yamasında B lenfositleri üzerindeki etkisi

Peyer yaması, B lenfositlerinin IgA salgılayan hücrelere dönüşümünün önde gelen bölgesidir. B hücre belirteçleri CD20 ve CXCR5'in ekspresyonunu tespit ederek DIO'nun B lenfositleri üzerindeki etkisini gözlemlemek için Peyer'in yamasını araştırma nesnesi olarak aldık. İmmünohistokimyasal sonuçlar, CD20 ve CXCR5 ekspresyonunun model grubunda kontrol grubuna göre anlamlı olarak daha yüksek olduğunu gösterdi. DIO, yukarıdaki moleküler belirteçlerin ekspresyonunu inhibe edebilir (Şekil 2A, B).

DIO'nun DAKIKI hücreleri üzerindeki güvenli konsantrasyon aralığı

LDH, plazma zarı bütünlüğünün bir belirteci ve hücre ölümünün bir göstergesidir, daha yüksek LDH salınım oranları daha ciddi hücre hasarını gösterir. LDH salınım testi, DIO'nun güvenli konsantrasyon aralığını belirlemek için kullanıldı. Maksimum güvenli DIO konsantrasyonu, 'un altında bir LDH salınım oranı ile belirlendi. Sonuçlar (Şekil 3), 0.25 ila 1.0 μg / mL konsantrasyonlarda DIO tarafından indüklenen önemli bir sitotoksisite göstermedi. Bu nedenle, aşağıdaki çalışmada dozlama seviyesi olarak 0.25, 0.5 ve 1.0 μg/mL DIO kullanılmıştır.

DIO'nun DAKIKI hücre proliferasyonu üzerindeki etkileri

Deneysel sonuçlar (Şekil 4), model grubu (LPS ile uyarılan grup) ile karşılaştırıldığında, DIO'nun LPS ile indüklenen DAKIKI hücre proliferasyonunu konsantrasyona bağlı bir şekilde inhibe ettiğini göstermiştir. 0.5 ve 1.0 μg / mL konsantrasyonlarında DIO, LPS'nin neden olduğu DAKIKI hücre proliferasyonunu önemli ölçüde inhibe etti (P < 0.01).

DIO'nun DAKIKI hücrelerinin salgılama fonksiyonu üzerindeki etkileri

Gd-IgA1 düzeyleri IgAN'ın patolojik süreci ile yakından ilişkilidir ve total IgA, hücresel sekretuar fonksiyonun bir göstergesi olarak birlikte test edilir. DAKIKI hücre kültürünün süpernatantındaki IgA ve Gd-IgA1 içeriğini tespit etmek için bir ELISA testi kullanıldı. Sonuçlar (Şekil 5A,B) LPS tarafından uyarılan DAKIKI hücrelerinin kontrol grubuna kıyasla daha fazla IgA salgıladığını gösterdi (P < 0.01). Buna karşılık, DIO, DAKIKI hücrelerinin konsantrasyona bağlı bir şekilde IgA (P < 0.01) salgılamasını önemli ölçüde inhibe etti. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, LPS tarafından uyarılan DAKIKI hücreleri, istatistiksel bir eğilimle daha fazla Gd-IgA1 salgıladı (P < 0.10) ve DIO, LPS ile uyarılan DAKIKI hücrelerinden konsantrasyona bağlı bir şekilde Gd-IgA1 sekresyonunu inhibe etti (P < 0.05 ve P < 0.01), bunların arasında 1.0 μg / mL'de DIO, Gd-IgA1'in salgılanmasını %'lik inhibe oranı ile önemli ölçüde inhibe etti.

DIO mekanizması, DAKIKI hücreleri tarafından Gd-IgA1 sekresyonunu inhibe eder

DIO'nun DAKIKI hücreleri tarafından aşırı Gd-IgA1 sekresyonunu inhibe etmesinin olası mekanizmasını daha fazla araştırmak için, DAKIKI hücrelerinde glikosile transferaz C1GALT1 ve şaperon proteini Cosmc mRNA seviyeleri qRT-PCR ile tespit edildi ve sonuçlar (Şekil 6A,B) C1GALT1 ve Cosmc'nin nispi mRNA ekspresyonunun model grubundaki DAKIKI hücrelerinde kontrol grubuna kıyasla aşağı regüle olduğunu gösterdi (P < 0.01). DIO, C1GALT1 ve Ccosmc'nin nispi mRNA ekspresyonunu model grubuna kıyasla farklı derecelerde yukarı regüle etti, DIO 1.0 μg /mL ile C1GALT1 ve Cosmc'nin nispi mRNA ekspresyonunu önemli ölçüde yukarı regüle etti (P < 0.05).

Aynı zamanda, DIO'nun DAKIKI hücrelerinde C1GALT1 ve Cosmc'nin protein ekspresyonu üzerindeki etkisini tespit etmek için WB yöntemi kullanılmıştır. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, model grubundaki DAKIKI hücrelerinde C1GALT1 ve Cosmc protein ekspresyonu belirgin bir şekilde azalmıştır (P < 0.05). Model grubu ile karşılaştırıldığında, DIO müdahalesinden sonra C1GALT1 ve Cosmo'nun protein ekspresyonu yukarı regüle edildi. C1GALT1 ve Cosmc'nin protein ekspresyonu, 1.0 μg / mL'lik bir konsantrasyonda DIO tarafından önemli ölçüde yukarı regüle edildi (P < 0.05) (Şekil 7A-C).

figure-results-1
Şekil 1: Böbreklerin histopatolojisi. (A) İmmünofloresan mikroskobu. Her gruptaki farelerin böbrek bölümleri anti-IgA (yeşil) ve DAPI (mavi) ile boyandı. Yukarıdaki resim ölçek çubuğu = 200 μm. Aşağıdaki resim ölçek çubuğu = 50 μm. n = grup başına 6. (B) Kontrol, Model ve DIO gruplarındaki farelerden böbrek dokusunun PAS boyamasının temsili resimleri. Ölçek çubuğu = 30 μm. Aşağı ok mezanjiyal hücreleri gösterir ve yukarı ok stroma'yı gösterir. Ölçek çubuğu = 30 μm. n = grup başına 6. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: DIO'nun B lenfosit belirteçleri üzerindeki etkisi. (A) Peyer yamasında CD20'nin ekspresyonu. Ölçek çubuğu = 200 μm. n = grup başına 6. (B) Peyer'in yamasında CXCR5'in ifadesi. Ölçek çubukları görüntünün sağ alt köşesindedir. Ölçek çubuğu = 200 μm. n = grup başına 6. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3. DAKIKI hücreleri üzerindeki güvenli DIO konsantrasyonunun taranması. İstatistiksel değerler, üç bağımsız deneyden elde edilen ortalama ± SD olarak ifade edilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4. Farklı DIO konsantrasyonları DAKIKI hücrelerinin proliferasyonunu etkiler. Veriler ortalama ±SD. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, **P < 0.01; model grubuyla karşılaştırıldığında, #P < 0.05' ##P < 0.01; Tüm deneylerin sonuçları üç kez tekrarlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5. DIO, DAKIKI hücreleri tarafından IgA ve Gd-IgA1 sekresyonunu inhibe eder. (A) ELISA yöntemi her grupta IgA ekspresyonunu tespit etti. (B) ELISA yöntemi her grupta Gd-IgA1 ekspresyonunu tespit etti. Veriler ortalama ± SD olarak ifade edildi. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, **P < 0.01; model grubu ile karşılaştırıldığında, #P < 0.05, ##P < 0.01; Tüm deneysel sonuçlar üç kez tekrarlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6. DIO mekanizması, DAKIKI hücreleri tarafından aşırı Gd-IgA1 salgılanmasını inhibe eder. (A) QRT-PCR, C1GALT1'ın mRNA ekspresyonunu tespit etti. (B) QRT-PCR, Cosmc'nin mRNA ekspresyonunu tespit etti. Veriler ortalama ± SD olarak ifade edildi. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, **P<0.01; model grubuyla karşılaştırıldığında, #P < 0.05, ##P < 0.01; Tüm deneysel sonuçlar üç kez tekrarlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7. DIO, DAKIKI hücrelerinde C1GALT1 ve Cosmc'nin protein ekspresyonunu etkiler. (A) WB, C1GALT1 ve Cosmo'nun protein ekspresyonunun DIO tarafından yukarı regülasyonunu doğruladı. (B) C1GALT1 ifadesinin yarı kantitatif analizi Resim J kullanılarak gerçekleştirilmiştir. (C) Cosmc ekspresyonunun yarı kantitatif analizi Resim J kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Veriler ortalama ±SD. Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında,*P < 0.05; model grubu ile karşılaştırıldığında, #P < 0.05, ##P < 0.01, tüm deneysel sonuçlar üç kez tekrarlandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1. İn vivo modelin şeması. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2. Proteinürideki değişiklikler. Veriler ortalama ± SD olarak ifade edildi; n = grup başına 6. Bu rakamı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

IgAN'ın karakteristik patolojik özelliği, glomerulusun mezanjiyal bölgesinde IgA1 ve GD-IgA1 içeren immün komplekslerin birikmesidir21,22. İmmün komplekslerin oluşumunu azaltmak, böbrek hasarını azaltabilir ve IgAN'ın klinik semptomlarını hafifletebilir. İn vivo bir deneyde, DIO'nun IgAN üzerindeki terapötik etkilerini inceledik ve DIO'nun IgAN model farelerin böbreğinde IgA birikimini azaltabileceğini bulduk. Böbrekte IgA salgılayan hücrelerin birikiminin IgAN23'ün patogenezi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. B lenfositlerinin önemli bir proliferasyon ve aktivasyon bölgesi olan Peyer yaması, IgA salgılayan hücrelerin önemli bir kaynağıdır, bu nedenle Peyer'in yamasında B lenfosit belirteçlerinin (CD20, CXCR5) ekspresyonunu inceledik ve DIO'nun Peyer'in IgAN fareleri modelindeki B lenfositlerinin ekspresyonunu inhibe edebileceğini bulduk. Bu deneysel sonuçlar, IgAN tedavisinde DIO'nun uygulanması için bir temel sağlayabilir.

Aşağıdaki deneyleri gerçekleştirdik: DIO'nun IgAN üzerindeki etki mekanizmasını daha fazla araştırmak için in vitro olarak. İlk olarak, bir kısmı GD-IgA124 olan IgA1 salgılayan EBV ile ölümsüzleştirilmiş bir B hücre hattı olan DAKIKI'nin, ilacın IgAN üzerindeki etki mekanizmasının in vitro araştırması için ideal olduğu daha önce gösterilmiştir. IgAN tedavisinde DIO'nun moleküler mekanizmasını araştırmak için DAKIKI hücrelerini seçtik. Ek olarak, mukozal inflamatuar immün yanıt, IgAN patogenezinde ayrılmaz bir rol oynar. Yukarıda bahsedildiği gibi, pro-inflamatuar faktörleri serbest bırakabilen ve IgAN'daki mukozal immün yanıtların mekanizmasını daha iyi taklit edebilen inflamatuar yanıtlara aracılık edebilen DAKIKI hücrelerini uyarmak için LPS kullanıyoruz. İn vitro hücresel model, IgAN tedavisi için diğer ilaçların olasılığını ve mekanizmasını araştırmaya yardımcı olabilir. Sonuçlar, DIO'nun LPS tarafından konsantrasyona bağlı bir şekilde uyarılan DAKIKI hücrelerinin proliferasyonunu inhibe ettiğini gösterdi. DIO, LPS stimülasyonunun neden olduğu DAKIKI hücrelerinde IgA ve Gd-IgA1 sekresyonunu inhibe edebilir ve DAKIKI hücrelerinde mRNA ve C1GalT1 proteininin ve şaperonu Cosmoc'un ekspresyonunu yukarı regüle edebilir, bu da DIO'nun C1GALT1/Cosmc ekspresyonunu yukarı regüle ederek Gd-IgA1 salgılanmasını azaltabileceğini ve böylece DAKIKI hücrelerinin aşırı aktivasyonunu inhibe edebileceğini düşündürmektedir.

Deneysel prosedürler sırasında anahtar adımlara dikkat edilmelidir. DAKIKI hücre süpernatantındaki Gd-IgA1 konsantrasyonu, ELISA kitinin (1.56 ~ 100 ng / mL) tespit aralığı içinde değildir ve toplanan süpernatant, konsantre Gd-IgA1'i elde etmek için bir ultrafiltrasyon tüpü ile santrifüjlenmelidir. Ayrıca, her gruptan başlayan süpernatan hacminin aynı olduğundan ve ultrafiltrasyondan sonra elde edilen nihai konsantre hacminin aynı olduğundan emin olun.

Bu çalışmada, farmakolojik etkilerde karşılıklı olarak birbirini destekleyebilen ve bitkisel tıbbın etkilerini ve mekanizmalarını incelemek için örnek teşkil eden hem in vitro hem de in vivo yöntemleri eş zamanlı olarak kullandık. Bu protokolde bazı şeyler geliştirilebilir. İlk olarak, farelerin DIO gavaj grubunda kan konsantrasyonlarını tespit etmedik; bu nedenle, kan konsantrasyonlarına eşdeğer DIO konsantrasyonu in vitro deneylerde kullanılmaz. İkinci olarak, sadece DNR'nin aktif bileşeni olan DIO monomeri araştırıldı; DNR'nin diğer bileşenlerinin IgAN üzerindeki etkileri hala daha fazla çalışmaya ihtiyaç duymaktadır.

Sonuç olarak, bu çalışma IgAN'ın DNR'nin aktif bileşeni olan DIO ile tedavisi için deneysel bir temel oluşturmaktadır. Bu çalışma, IgAN'ın hem in vitro hem de in vivo mukozal immün yanıtını taklit ederek IgAN'ın hücresel patolojik bir modelini oluşturmuştur. IgAN'ı önlemek ve tedavi etmek için geleneksel Çin tıbbını incelemek için yeni bir fikir verir.

Açıklamalar

Yazarlar, rekabet eden herhangi bir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81973675) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Anti-CD20/MS4A1 AntikoruBoster Biyoteknoloji ŞirketiA03780-3
Antifade montaj ortamıBeyotime, Şangay, ÇinP0128S
Balb/c fareleriPekin Weitong Lihua Laboratuvar Hayvanları Teknolojisi Co., Ltd.
bloke edici serumSolarbio, Pekin, ÇinSL038
Sığır gama globuliniShangHai YuanYe Biyoteknoloji ŞirketiS12031
C1GALT1 poliklonal antikorProteintech Group, Inc, ABD27569-1-AP
Sitrat antijen alma çözeltisi (50 kez;)Figene Biyoteknoloji ŞirketiPH0422
COSMC poliklonal antikorProteintech Group, Inc, ABD19254-1-AP
Sitotoksiy tespit kitiRoche Company4744926001
Dako REAL EnVision algılama sistemi, Peroksidaz/DAB+DakoK5007
DAPIInvitrogenD1306
DioscinUlusal Gıda ve İlaç Kontrol Enstitüsü111707-201703
DIO tabletleriChengdu No 1 Pharmaceutical Co., Ltd.
ECL çalışma çözümüMerck Biotechnology, IncWBKLS0100 
Gelişmiş hücre sayma kiti-8Beyotime, Şangay, ÇinC0043
Maskeleme geninin tek adımda çıkarılması cDNA birinci iplikli sentez premiksiTIANGEN, Pekin, ÇinKR118-02
Glikojen Periyodik asit Schiff (PAS) boyama kiti ve nbsp;BaSO Biyoteknoloji ŞirketiBA4080A
Keçi anti-fare IgA-AF488SouthernBiotech1040-30
Keçi anti-tavşan IgG antikoru (H + L), HRP konjugePekin Bioss Biyoteknoloji ŞirketiBS-0295G-HRP
İnsan Gd-IgA1 ELISA kitiIBL27600
İnsan IgA ELISA kitiMultiSciences (LiankeBio)70-EK174-96
Pierce BCA protein test kitiThermo Scientific23227
PMSF çözeltisiBeyotime, Şangay, ÇinST507
Proteinaz K Figene Biyoteknoloji ŞirketiPH1521
Tavşan anti-CXCR5 poliklonal antikoru Pekin Bioss Biyoteknoloji Şirketibs-23570R
RIPA lizis tamponuBeyotime, Şanghay, ÇinP0013B
RNAsimple toplam RNA ekstraksiyon kitiTIANGEN, Pekin, ÇinDP419
RPMI Orta 1640Solarbio, Pekin, Çin31800
Süper Bradford protein test kitiCWBIO, Pekin, ÇinCW0013
Triton  X-100Beyotime, Şangay, ÇinST795
ve beta; -Aktin Tavşan mAbAbclonal, Wuhan, ÇinAC026
110322220101424000H51023866

Kaynaklar

  1. Knoppova, B., et al. The origin and activities of IgA1-containing immune complexes in IgA nephropathy. Frontiers in Immunology. 7, 117(2016).
  2. Suzuki, H., et al. The pathophysiology of IgA nephropathy. Journal of The American Society of Nephrology. 22 (10), 1795-1803 (2011).
  3. He, L., et al. Synthetic double-stranded RNA poly(I:C) aggravates IgA nephropathy by triggering IgA class switching recombination through the TLR3-BAFF axis. American Journal of Nephrology. 42 (3), 185-197 (2015).
  4. Zhao, N., et al. The level of galactose-deficient IgA1 in the sera of patients with IgA nephropathy is associated with disease progression. Kidney International. 82 (7), 790-796 (2012).
  5. Xing, Y., et al. C1GALT1 expression is associated with galactosylation of IgA1 in peripheral B lymphocyte in immunoglobulin a nephropathy. BMC Nephrology. 21 (1), 18(2020).
  6. Qin, W., et al. External suppression causes the low expression of the Cosmc gene in IgA nephropathy. Nephrology Dialysis Transplantation. 23 (5), 1608-1614 (2008).
  7. Sakai, F., et al. Lactobacillus gasseri SBT2055 induces TGF-β expression in dendritic cells and activates TLR2 signal to produce IgA in the small intestine. PLoS One. 9 (8), 105370(2014).
  8. Gutzeit, C., Magri, G., Cerutti, A. Intestinal IgA production and its role in host-microbe interaction. Immunological Reviews. 260 (1), 76-85 (2014).
  9. Serino, G., et al. In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy. Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).
  10. Lu, F., et al. Therapeutic effect of Rhizoma Dioscoreae Nipponicae on gouty arthritis based on the SDF-1/CXCR 4 and p38 MAPK pathway: an in vivo and in vitro study. Phytotherapy research: PTR. 28 (2), 280-288 (2014).
  11. Wang, W., Xu, L., Zhou, L., Wan, S., Jiang, L. A Network pharmacology approach to reveal the underlying mechanisms of Rhizoma Dioscoreae Nipponicae in the treatment of asthma. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2022, 4749613(2022).
  12. Tian, W. W., Wei, Y. Professor TONG Xiaolin used the experience of Dioscoreae Nipponicae. Jilin Journal of Chinese Medicine. 40 (05), 589-592 (2020).
  13. Rao, X. R., Bai, Y. W. Das Xiwen's experience in treating IgA nephropathy. Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine. 9, 691-693 (2008).
  14. Si, Y., Zhang, Y. A data mining study on the pattern of medication use in the treatment of IgA nephropathy by Professor Zhang Yu. Journal of Chinese Physician. 20 (01), 109-111 (2018).
  15. Jiang, H., et al. Optimization of the enzymatic extraction technology of Diosgenin from Dioscorea nipponica. Chinese Traditional Patent Medicine. 39 (03), 621-624 (2017).
  16. Qi, M., et al. Dioscin alleviates lipopolysaccharide-induced inflammatory kidney injury via the microRNA let-7i/TLR4/MyD88 signaling pathway. Pharmacological Research. 111, 509-522 (2016).
  17. Yang, L., et al. Recent advances in the pharmacological activities of Dioscin. BioMed Research International. 2019, 5763602(2019).
  18. Nal Zou, J., et al. Toll-like receptor 4 signaling pathway in the protective effect of Pioglitazone on experimental immunoglobulin A nephropathy. Chinese Medical Journal. 130 (8), 906-913 (2017).
  19. Xu, S. Y., Bian, R. L., Chen, X. Pharmacological experiments methodology. Chinese Pharmacological Bulletin. 1, 19(1992).
  20. Shen, J. C., Ren, Y., Rao, X. R., You, Y., Li, S. Network pharmacology, molecular docking, and in vitro experiments to explore the molecular mechanism of Dioscorea Nipponica Makion in the treatment of IgA nephropathy. World Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 16 (12), 2246-2254 (2021).
  21. Mestecky, J., et al. IgA nephropathy: molecular mechanisms of the disease. Annual Review of Pathology. 8, 217-240 (2013).
  22. Novak, J., et al. IgA1-containing immune complexes in IgA nephropathy differentially affect proliferation of mesangial cells. Kidney International. 67 (2), 504-513 (2005).
  23. Nihei, Y., et al. Identification of IgA autoantibodies targeting mesangial cells redefines the pathogenesis of IgA nephropathy. Science Advances. 9 (12), (2023).
  24. Raska, M., et al. Identification and characterization of CMP-NeuAc: GalNAc-IgA1 alpha2,6-sialyltransferase in IgA1-producing cells. Journal of Molecular Biology. 369 (1), 69-78 (2007).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Dioscin UygulamasPeyer PlaDAKIKI H creleriC1GalT1 EkspresyonuCosmc Ekspresyonumm nohistokimyaWestern Blotting

İlgili makaleler