Yöntem makalesi

Rekombinant RCAS(A) Retrovirüsünün Embriyonik Tavuk Lensine Mikroenjeksiyonu

2.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/65727

⸱

1 Eylül 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, San Antonio

Bu makalede

Özet

Bu protokol belgesi, lens gelişimi sırasında in situ fonksiyon ve proteinlerin ekspresyonunu incelemek için bir araç olarak bir RCAS(A) retrovirüsünün embriyonik tavuk lensi mikroenjeksiyonunun metodolojisini açıklamaktadır.

Özet

Embriyonik tavuk (Gallus domesticus), insan merceği ile yüksek derecede benzerliği göz önüne alındığında, mercek gelişimi ve fizyolojisi çalışmaları için köklü bir hayvan modelidir. RCAS(A), erken gelişim aşamalarında lens vezikülünün boş lümenine mikroenjeksiyon yoluyla lens gelişimi sırasında vahşi tip ve mutant proteinlerin in situ ekspresyonunu ve işlevini incelemek için güçlü bir araç görevi gören, bölünen hücreleri enfekte eden, replikasyona yetkin bir tavuk retrovirüsüdür. Transgenik modeller ve ex vivo kültürler gibi diğer yaklaşımlarla karşılaştırıldığında, RCAS(A) replikasyonuna yetkin bir kuş retrovirüsünün kullanılması, civciv embriyolarında eksojen proteinleri eksprese etmek için oldukça etkili, hızlı ve özelleştirilebilir bir sistem sağlar. Spesifik olarak, hedeflenen gen transferi, dokuya özgü promotörlere ihtiyaç duymadan proliferatif lens lifi hücreleriyle sınırlandırılabilir. Bu yazıda, rekombinant retrovirüs RCAS(A) hazırlığı için gereken adımları kısaca gözden geçireceğiz, mikroenjeksiyon prosedürüne ayrıntılı, kapsamlı bir genel bakış sunacağız ve tekniğin örnek sonuçlarını sunacağız.

Giriş

Bu protokolün amacı, bir RCAS(A)'nın (replikasyona yetkin kuş sarkomu/lökoz retrovirüsü A) embriyonik tavuk lensi mikroenjeksiyonunun metodolojisini tanımlamaktır. Embriyonik bir tavuk merceğinde etkili retroviral uygulamanın, normal mercek fizyolojisi, patolojik koşullar ve gelişiminde mercek proteinlerinin moleküler mekanizması ve yapı-işlevinin in vivo çalışması için umut verici bir araç olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, bu deneysel model, terapötik hedeflerin tanımlanması ve insan konjenital kataraktları gibi durumlar için ilaç taraması için kullanılabilir. Toplamda, bu protokol, lens proteinlerinin incelenmesi için özelleştirilebilir bir platformun geliştirilmesi için gerekli adımları ortaya koymayı amaçlamaktadır.

Embriyonik civcivler (Gallus domesticus), lens yapısı ve insan merceği ile işlev bakımından benzerlikleri nedeniyle, mercek gelişimi ve fizyolojisi çalışmaları için köklü bir hayvan modelidir 1,2,3,4. RCAS(A) replikasyonuna yetkin bir kuş retrovirüsünün kullanımı, civciv embriyolarında eksojen proteinleri eksprese etmek için oldukça etkili, hızlı ve özelleştirilebilir bir sistem olarak kabul edilmiştir. Özellikle, boş lens lümeninin varlığının proliferatif lens fiber hücreleri içinde eksojen proteinlerin ekspresyonu için kısıtlı bölgeye yerinde RCAS (A) mikroenjeksiyonuna izin verdiği benzersiz embriyonik gelişim zaman çerçevesini kullanarak, dokuya özgü proliferatif lens lifi hücrelerine ihtiyaç duymadan hedef gen transferini proliferatif lens lifi hücrelerine sınırlamak için benzersiz bir yeteneğesahiptir 5, 6,7,8.

Burada derinlemesine açıklanan civciv embriyo mikroenjeksiyon prosedürü, başlangıçta kısmen Fekete et. al.6 ve Jiang et. al.8 ve hem viral hem de viral olmayan plazmitleri embriyonik civcivlerinmerceğine sokmanın bir yolu olarak kullanılmıştır 1,9,10,11,12,13. Genel olarak, önceki çalışma, lens gelişimini, farklılaşmasını, hücresel iletişimi ve hastalığın ilerlemesini incelemek ve katarakt gibi lens patolojik durumları için terapötik hedeflerin keşfi ve test edilmesi için bu metodolojiyi kullanma potansiyelini göstermektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu çalışma, Hayvan Refahı Yasası ve Hayvan Refahı Yönetmeliği'nin Uygulama Yönetmeliği'ne uygun olarak, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun ilkelerine uygun olarak yürütülmüştür. Tüm hayvan prosedürleri, San Antonio'daki Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Protokole genel bir bakış için bkz. Şekil 1; Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

figure-protocol-1
Şekil 1: Deneysel taslak. 1 . Protokolün ilk adımı, spesifik bir hedef protein(ler)in belirlenmesi, ilişkili gen dizi(ler)inin tanımlanması ve DNA fragmanı üretimidir. 2 . Gen dizi(ler)inin bir adaptör vektöre ilk klonlama ile retroviral bir vektöre klonlanması, 3. ardından bir viral vektör . 4 . Hasat ve konsantre etmek için paketleme hücreleri kullanılarak yüksek titreli viral partiküllerin hazırlanması. 5 . Son adım ve bu protokolün odak noktası, RCAS (A) viral partiküllerinin lens lümenine tavuk lensi mikroenjeksiyonudur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Yüksek titreli rekombinant retrovirüslerin hazırlanması

  1. Hedef protein DNA fragmanları yapmak için polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)
    NOT: Bu bölüm, hedef lens proteinine karşılık gelen DNA dizisini amplifiye etmeyi amaçlamaktadır. Daha fazla ayrıntı için 7,8'e bakın.
    1. Bir FLAG epitop dizisi (5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3'), bir durdurma kodonu ve bir kısıtlama enzim bölgesi (yani, Eco RI) CLa12NCO'nun polilinker bölgesinde bulunan veya bulunmayan) çerçeve içinde karboksil terminalleri ile çerçeve içinde DNA fragmanları yapmak için ilgilenilen proteine karşılık gelen PCR için primerler tasarlayın, yeterli kısıtlama enzimleri için dizilerle 1, 7,8,10,11.
    2. PCR reaksiyonunu gerçekleştirin10. Tasarlanan primerlerin 100 pmol duyu ve antianlamını 0.5 μg connexin cDNA (Cx50, Cx43 veya kimerik Cx50 * 43L kombinasyonları gibi) ile tercih edilen PCR reaksiyon tamponuna birleştirin. Her biri 1 dakika boyunca 94 °C, 1 dakika boyunca 58 °C ve 1 dakika boyunca 72 °C'den oluşan 30 döngü gerçekleştirin ve ardından 72 °C'de 10 dakika son bir uzatma yapın.
    3. PCR ürünlerini bir jel saflaştırma kiti ile izole edin ve saflaştırın.
    4. Saflaştırılmış PCR ürünlerini, üreticinin talimatlarına göre tercih edilen kısıtlama enzimlerini kullanarak sindirin.
  2. DNA eklerinin adaptör plazmidine klonlanması
    NOT: DNA parçalarının bir adaptör vektörüne eklenmesi, RCAS(A) vektör stabilitesini artırmak için yardımcı hücrelere/virüslere olan ihtiyacı ortadan kaldırır14. Daha fazla ayrıntı için 7,8'e bakın.
    1. Yapışkan uçlu bir ligasyon reaksiyonu kullanarak DNA parçalarını bir adaptör plazmidi olan Cla12NCO'ya alt klonlayın. PCR fragmanlarını restriksiyon enzimleri ve Cla12NCO ile 2-5:1 oranında karıştırın. Yetkili hücreleri kullanarak ligasyon ve DNA dönüşümü gerçekleştirin.
    2. Bir DNA izolasyon kiti kullanarak DNA'yı izole edin.
    3. Doğruluğu sağlamak için DNA'yı sıralayın.
  3. RCAS(A) viral vektörüne klonlama
    NOT: DNA fragmanları, gelişmekte olan civciv embriyosundaki hücrelere bir genin stabil transdüksiyonu için bir araca (RCAS(A) retrovirüs) yerleştirilir14,15. Daha fazla ayrıntı için 7,8,15'e bakın.
    1. İlgilenilen vektörün Cla12NCO-DNA fragmanını ClaI (1 μg DNA başına 1 birim) ile sindirin ve fragmanları jel ile izole edin.
    2. DNA parçalarını ClaI-doğrusallaştırılmış bir RCAS(A) plazmidine alt klonlayın. RCAS(A) plazmidindeki ClaI bölgesini ayırt etmek için kısıtlama enzimi SalI'yi kullanın.
    3. ClaI ve SalI kısıtlama enzimleri ile sindirim yoluyla yapılara eklenen parçaların doğru yönünü onaylayın.
    4. Bir DNA izolasyon kiti kullanarak DNA'yı izole edin.
    5. DNA konsantrasyonunu belirleyin.
  4. Civciv embriyonik fibroblast (CEF) hücrelerinin transfeksiyonu ve RCAS(A) hasadı
    NOT: Virüs paketleme hücreleri, CEF'ler, viral partiküller içeren hücre kültürü ortamını elde etmek/hasat etmek için kullanılır15,16. Daha fazla ayrıntı için 7,8,15'e bakın.
    1. Üreticinin talimatlarına göre transfeksiyon ajanını kullanarak rekombinant retroviral DNA yapılarına sahip CEF hücrelerini transfekte edin.
    2. İlgilenilen proteinin ekspresyonunu incelemek için transfekte edilmiş hücrelerin batı blotlamasını gerçekleştirin.
    3. Transfekte edilen hücreler birleştiğinde, süpernatan ortamı toplamaya, uygun şekilde işlemeye / filtrelemeye (0.22μm filtre kullanarak herhangi bir hücresel kalıntıyı çıkarmak için) başlayın ve konsantrasyona hazır olana kadar -80 ° C'de saklayın.
  5. Viral stokların konsantrasyonu ve titresi
    NOT: Viral partikülleri içeren hücrelerden elde edilen pelet ve büyük hacimli ortamlar filtrelenmelidir. Ek olarak, virüsün konakçı hücrelere karşı gücünü belirlemek için bir viral titre testi yapılmalıdır. Daha fazla ayrıntı için 6,7,8,15'e bakın.
    1. Virionları içeren kültür ortamını çözün.
    2. Kültür ortamını 4 °C'de 2 saat boyunca 72.000 × g'da döndürün.
    3. Süpernatanı boşaltın ve viral peleti artık (~50 μL) ortam ile yeniden süspanse edin ve kullanıma kadar -80 °C'de ~10 μL viral stoklarda saklayın.
    4. Titre için, QT-6 veya CEF hücrelerini kullanarak, hücreleri viral stokların seri seyreltilmesiyle transfekte edin.
    5. Birleşme sonrası,% 4 formaldehit kullanarak hücreleri sabitleyin.
    6. Mililitre başına (koloni oluşturan birimler) CFU (CFU/mL) olarak tanımlanan titreyi elde etmek için viral gag proteinleri için immün boyama veya histokimyasal olarak alkalin fosfataz için işlem.

figure-protocol-2
Şekil 2: Civciv lens mikroenjeksiyonu için aletler ve kurulum . (A) P-30 manuel dikey mikroelektrot mikropipet çektirmesi. (1) bir cam mikropipetin çekildiğini gösteren iç kısım. (b) (2) yumurta kuluçka makinesi. Retrovirüs enjeksiyonu için 18. aşamaya (kapalı, boş bir merkezi lümen ile) ulaşmak için tavuk yumurtasını 37 ° C'lik bir inkübatörde ~ 65-68 saat kuluçkaya yatırın. (C) Mikroenjeksiyon kurulumu. (3) aydınlatma ekipmanı, (4) Pico-Enjektör, (5) diseksiyon mikroskobu, (6) Drummond mikromanipülatörü, (7) görselleştirme için bilgisayar/kamera. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Civciv lens mikroenjeksiyonu

  1. Malzemelerin hazırlanması
    1. Mikroenjeksiyon için cam mikropipetlerin hazırlanması17
      NOT: Cam kılcal damarlar, mikroenjeksiyon için uç noktası ve ~11 μm dış çapa (OD) sahip cam mikropipetler yapmak için kullanılır. Kurulum Şekil 2A'da gösterilmiştir.
      1. Borosilikat cam kılcalını, manuel dikey mikropipet çekicisindeki kauçuk yastıklı klipslere takın.
      2. Isı sıcaklığını (HEAT 1) 950 °C'ye ayarlayın ve daha ince ve yumuşak bir cam kılcal damar elde etmek için ön çekme işlemi gerçekleştirin.
      3. Isı sıcaklığını (HEAT 2) 790 °C'ye ayarlayın ve son mikropipetleri üretmek için ikincil bir çekme işlemi gerçekleştirin.
      4. Bir mikropipet öğütücü ile uç açıklığını ~11 μm'lik bir dış çapa kadar keskinleştirin.
      5. Gelecekteki deneyler için, cam mikropipetleri bir cam kavanozun içindeki sünger sıkıştırma pedinde saklayın.
    2. Döllenmiş yumurtaların gelişme aşamasına kadar kuluçka 18
      NOT: Lens gelişimi sırasında, embriyonik gelişimin ~ 65-68 saatinde, lens ektodermden ayrılır ve merkezi lümenli kapalı bir vezikül oluşturur; Proliferatif lens hücrelerinesınırlı ekspresyon için bu boş lens lümen asallarına enjeksiyon 7,8,18.
      1. Döllenmiş tavuk yumurtalarını 37 °C nemlendirilmiş sallanan inkübatörde ~65-68 saat kuluçkaya yatırın (Şekil 2B).
  2. Tavuk yumurtasının açılması
    NOT: Bu adım, embriyonun mikroenjeksiyon için tanımlanmasını ve maruz kalmasını açıklar. Daha fazla ayrıntı için 7,8'e bakın.
    1. Çalışma alanını p etanol ile iyice silin.
    2. Yumurtaları kuluçka makinesinden çıkarın, üzerlerine p etanol püskürtün ve kurumaya bırakın.
    3. Yumurtayı, yumurtanın büyük ucu yukarı bakacak şekilde bir yumurta tutucusuna yerleştirin.
    4. Bir çift keskin dişli forseps kullanarak, yumurta kabuğuna dikkatlice vurarak ve yumurta kabuğunun parçalarını çıkararak yumurtanın büyük ucunda ~2 cm çapında bir delik açın (Şekil 3A).
    5. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak embriyoyu bulun.
    6. Embriyo ve civciv merceği yerleştirildikten sonra, embriyonun üstünü hemen kaplayan amniyonik zarı kesmek için diseksiyon mikroskobu ve ince diseksiyon forseps ve makas kullanın (Şekil 3B).
      NOT: Çok geniş kesmeyin (sadece embriyoyu ~ 0,5 cm x 0,5 cm açığa çıkaracak kadar), aksi takdirde embriyolar yumurta sarısı kütlesine batabilir; Ayrıca mümkünse kan damarlarına dokunmaktan kaçının.
    7. Sonraki adımlara hazırlanmak için yumurtanın ağzını 60 mm'lik bir Petri kabı ile örtün.
  3. Konsantre viral stoğun mikroenjeksiyonu
    NOT: Transdüksiyon için hedef protein DNA fragmanları içeren viral partiküller, lens lümeninin içindeki hücrelere yerleştirilir. Kurulum Şekil 2C'de gösterilmiştir. Daha fazla ayrıntı için 6,7,8'e bakın.
    1. Viral stok stoklarını buz üzerinde çözün.
    2. Enjeksiyon sırasında viral stoğun görselleştirilmesi için, 1 μL 10x Fast green'i 10 μL içeren bir viral stok şişesine seyreltin.
    3. Cam mikropipeti tıkayabilecek büyük çözünmemiş malzeme parçaları olmadığından emin olmak için, çözeltileri buz üzerinde tutarken "büyük parçaları" peletlemek ve süpernatanları yeni tüplere aktarmak için çözeltileri 4 °C'de 10.000 × g'da 10 saniye santrifüjleyin.
    4. 35 mm x 10 mm'lik bir kültür kabına, gerilmiş bir laboratuvar parafilmi yerleştirin ve filmin üzerine 1 μL steril salin (PBS) ekleyin (sterilize edilmemiş, kapalı tarafı "temiz" olarak kabul edilir).
    5. Hazırlanmış bir cam mikropipeti otomatik bir piko-enjektöre bağlayın.
    6. Steril salini (PBS) bir cam mikropipete doldurmak için doldurma moduna basın ve ardından tahsis edilen 1 μL sıvıyı test etmek için enjeksiyon modunu kullanın.
    7. Yeni bir 35 mm x 10 mm hücre kültürü kabının yüzeyine ikinci bir gerilmiş laboratuvar parafilmi yerleştirin ve filmin üzerine 1 μL Hızlı yeşil lekeli viral stok ekleyin.
    8. Mikropipetin ucunu viral kuyruğa indirin ve cam mikropipeti ~1 μL viral stokla doldurmak için doldurma modeline basın.
      NOT: Kurumasını önlemek için, prosedürde bir duraklama olduğunda doldurulmuş mikropipetin ucunu steril salin (PBS) içine koyun.
    9. Otomatik enjektöre bağlı dolu cam mikropipeti, diseksiyon mikroskobu yardımıyla embriyo lens lümeninin hedef bölgesine indirin.
    10. Lens vezikülünün ana hatlarının net bir şekilde görüntülenmesini sağlamak için ışık kaynağını ayarlayın.
      NOT: Sağ merceğin lümeni (yukarı bakacak şekilde) tipik olarak enjeksiyon için kullanılır ve sol (aşağı bakacak şekilde) kontralateral kontrol olarak bozulmadan tutulur.
    11. Mikropipetin yerleştirilmesinin lens lümeni içinde doğru yerde olduğundan emin olduktan sonra, viral stoğun 5-40 nL'sini enjekte edin (Şekil 3C).
      NOT: Optimal enjeksiyon yerleşimi için pratik yapmak çok gereklidir.
    12. ~45 saniye bekleyin ve ardından cam mikropipeti yavaşça çıkarın.
    13. Lensin boş lümeninde herhangi bir sızıntı olmadan kalması gereken Fast Green boyayı inceleyerek diseksiyon mikroskobu kullanarak lens lümenine başarılı mikroenjeksiyon olup olmadığını kontrol edin.
    14. Enjeksiyon işleminden sonra yumurta kabuğu açıklığını bantla kapatın.
    15. Lens diseksiyonu için istenen embriyonik yaşa ulaşılana kadar embriyoyu herhangi bir dönme hareketi olmadan 37 °C nemlendirilmiş inkübatöre geri koyun.

figure-protocol-3
Şekil 3: Mikroenjeksiyon civciv hazırlığı ve şeması . (A) Tavuk yumurtasının açılması. (B) Amniyotik membranın kesilmesi. (C) Tavuk lens lümen mikroenjeksiyon şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Spesifik bir hedef protein(ler)in belirlenmesinden ve ilişkili gen dizi(ler)inin tanımlanmasından sonra, genel deneysel yaklaşım, gen dizi(ler)inin bir adaptör vektöre ilk klonlama ile bir retroviral RCAS(A) vektörüne klonlanmasını ve ardından bir viral vektörü içerir. İkincisi, yüksek titreli viral partiküller, viryonları hasat etmek ve konsantre etmek için paketleme hücreleri kullanılarak hazırlanır. Bu ilk iki ana adım büyük ölçüde tanımlanmış ve temsili sonuçlar başka yerlerdesunulmuştur 6,7,8...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu deneysel model, bozulmamış mercekte ilgilenilen protein(ler)i ifade etme fırsatı sunar ve bu proteinlerin mercek yapısı ve işlevindeki işlevsel öneminin incelenmesine yol açar. Embriyonik civciv mikroenjeksiyon modeli kısmen Fekete et. al.6 ve Jiang et tarafından daha da geliştirildi. al.8 ve hem viral plazmitleri hem de agonistler, küçük enterferans yapan RNA (siRNA) ve peptitler gibi ajanlarıcivcivlerin merceğine 1,9,10,11,12,13 yerleştirmenin b...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yürütüldüğünü beyan ederler.

Teşekkürler

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) Hibeleri tarafından desteklenmiştir: RO1 EY012085 (JXJ'ye) ve F32DK134051 (FMA'ya) ve Welch Vakfı hibesi: AQ-1507 (JXJ'ye). İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmeyebilir. Figürler kısmen Biorender.com ile oluşturulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.22 ve mikro; m FiltreCorning431118Ortamdan hücresel kalıntıları temizlemek için
35 mm x 10 mm Kültür KabıFisherScientific50-202-030Mikroenjeksiyon sırasında kullanım için
SantrifüjFisherbrand13-100-676Eğirme çözeltisi
YapılarıGENEWIZ-Yapılarınüretilmesi için
Diseksiyon mikroskobuAmScopeSM-4TZ-144AMikroenjeksiyon
DNA PCR primerleriEntegre DNATeknolojileri-Primerüretimi:

Hücre içi döngü (IL) silinmiş Cx50 (kalıntılar 1 – 97 ve 149– 400) ve Cla12NCO vektörü aşağıdaki primer çifti ile elde edildi: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisens, Cccgcatgcccaaagtacac

Cx43'ün IL'leri (kalıntılar 98– 150) ve Cx46 (kalıntılar 98– 166) idi  aşağıdaki primer çiftleri ile elde edilir: sense, TACGTGATGAGGAAAGAG; antisens, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; anlamlı, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisens, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, sırasıyla

Cla12NCO-Cx43 yapı şablonu aşağıdaki primer çifti ile elde edildi: sense, CTGCTTCGTACTTACATCATC; antisens, GAACAC GTGCGCCAGGTAC

Cx50'nin IL'leri (kalıntılar 98– 148) veya Cx46 (kalıntılar 98– 166), Cla12NCO-Cx50 ve Cla12NCO-Cx46 yapıları kullanılarak aşağıdaki primer çifti ile şablon olarak klonlandı: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisens, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; anlamlı, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, sırasıyla
Drummond Nanoject II Otomatik Nanolitre EnjektörDrummond Scientific3-000-204Mikroenjeksiyon Pipet
Çift Deveboynu Işıkları Mikroskop AydınlatıcıAmScopeLED-50WYGörselleştirme için aydınlatma
Dulbecco' Hücre kültürü için s Modifiye Eagle Medium (DMEM)Invitrogen
Yumurta Tutucu-2 inç çapında ve bir buçuk inç yüksekliğinde ev yapımı strafor halkalar
Yumurta Kuluçka MakinesiGQF Manufacturing Company Inc.1502Döllenmiş yumurtaların kuluçkalanması için
Fast GreenFisher scientificF99-10Viral stok enjeksiyonunun görselleştirilmesi için
Döllenmiş beyaz leghorn tavuk yumurtasıTexas A& M ÜniversitesiN/AMikroenjeksiyon için tercih edilen hayvan modeli (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)
Fetal Sığır Serumu (FBS)Hyclone LaboratuvarlarıHücre kültürü için
Floresein-konjuge anti-fare IgGJackson ImmunoResearch115-095-003Anti-FLAG için  1:500
ForsepsFisherScientific22-327379Nesneleri hareket ettirmek için izolasyon
Cam kılcaldamarlar Sutter InstrumentsB100-75-10Mikroenjeksiyon için cam mikropipet (OD 1.0 mm, ID 0.75 mm, 10 cm uzunluk)
Transfeksiyon içinLipofectamineInvitrogenL3000001
Manuel dikey mikropipet çektirme SutterInstrumentsP-30Doğru boyutta cam mikropipet elde etmek için
Mikrosantrifüj TüpleriFisherScientific02-682-004Çözünme çözeltisi
MikroskopKeyenceBZ-X710Görüntüleme boyama Parafilm
için FisherScientific03-448-254Hücre
kültürü içinPenisilin / StreptomisinInvitrogen
Pico-EnjektörHarvard AparatıPLI-100Dijital olarak ayarlanmış bir süre boyunca düzenlenmiş bir basınç uygulayarak küçük sıvı hacimlerini mikropipetler aracılığıyla hassas bir şekilde iletmek için
tavşan civciv önleyici AQP0Kendi kendine üretilen-JiangJX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Civciv lens lifi connexin 45.6'nın moleküler klonlanması ve fonksiyonel karakterizasyonu. Mol Biol Hücresi. 1994 Mart; 5(3):363-73. doi: 10.1091/mbc.5.3.363.
tavşan anti-FLAG antikoruRockland Immunichemicals600-401-383FLAG
Rhodamine konjuge anti-tavşan IgG ve nbsp boyama için;Jackson ImmunoResearch111-295-003Anti-AQP0 için 1:500
Sünger sıkıştırma pediSutter InstrumentsBX10Cam mikropipetin saklanması için
için lensin görselleştirilmesi çözelti

Kaynaklar

  1. Li, Z., Gu, S., Quan, Y., Varadaraj, K., Jiang, J. X. Development of a potent embryonic chick lens model for studying congenital cataracts in vivo. Communications Biology. 4 (1), 325(2021).
  2. Chen, Y., et al. γ-Crystallins of the chicken lens: remnants of an ancient vertebrate gene family in birds. The FEBS Journal. 283 (8), 1516-1530 (2016).
  3. Coulombre, A. J., Coulombre, J. L. Lens development. I. Role of the lens in eye growth. Journal of Experimental Zoology. 156 (1), 39-47 (1964).
  4. McKeehan, M. S. Induction of portions of the chick lens without contact with the optic cup. The Anatomical Record. 132 (3), 297-305 (1958).
  5. Kothlow, S., Schenk-Weibhauser, K., Ratcliffe, M. J., Kaspers, B. Prolonged effect of BAFF on chicken B cell development revealed by RCAS retroviral gene transfer in vivo. Molecular immunology. 47 (7-8), 1619-1628 (2010).
  6. Fekete, D. M., Cepko, C. L. Replication-competent retroviral vectors encoding alkaline phosphatase reveal spatial restriction of viral gene expression/transduction in the chick embryo. Molecular and Cellular Biology. 13 (4), 2604-2613 (1993).
  7. Jiang, J. X. Use of retroviruses to express connexins. Methods in Molecular Biology. , 159-174 (2001).
  8. Jiang, J. X., Goodenough, D. A. Retroviral expression of connexins in embryonic chick lens. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 39 (3), 537-543 (1998).
  9. Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Expression of autofluorescent proteins reveals a novel protein permeable pathway between cells in the lens core. Journal of Cell Science. 113 (11), 1913-1921 (2000).
  10. Liu, J., Xu, J., Gu, S., Nicholson, B. J., Jiang, J. X. Aquaporin 0 enhances gap junction coupling via its cell adhesion function and interaction with connexin 50. Journal of Cell Science. 124 (2), 198-206 (2011).
  11. Li, Z., et al. The second extracellular domain of connexin 50 is important for in cell adhesion, lens differentiation, and adhesion molecule expression. Journal of Biological Chemistry. 299 (3), 102965(2023).
  12. Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Exogenous gene expression and protein targeting in lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 40 (7), 1435-1443 (1999).
  13. Shestopalov, V. I., Bassnett, S. Three-dimensional organization of primary lens fiber cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (3), 859-863 (2000).
  14. Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. Journal of Virology. 61 (10), 3004-3012 (1987).
  15. Yan, R. T., Wang, S. Z. Production of high-titer RCAS retrovirus. Methods in Molecular Biology. 884, 193-199 (2012).
  16. Kingston, R. E. Introduction of DNA into mammalian cells. Current Protocols in Molecular Biology. 64 (1), 1-95 (2003).
  17. Li, Y., et al. Studying macrophage activation in immune-privileged lens through CSF-1 protein intravitreal injection in mouse model. STAR Protocols. 3 (1), 101060(2022).
  18. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
  19. Hallagan, J. B., Allen, D. C., Borzelleca, J. F. The safety and regulatory status of food, drug and cosmetics colour additives exempt from certification. Food and Chemical Toxicology. 33 (6), 515-528 (1995).
  20. Okada, T. S., Eguchi, G., Takeichi, M. The expression of differentiation by chicken lens epithelium in in vitro cell culture. Development, Growth & Differentiation. 13 (4), 323-336 (1971).
  21. Menko, A. S., Klukas, K. A., Johnson, R. G. Chicken embryo lens cultures mimic differentiation in the lens. Developmental Biology. 103 (1), 129-141 (1984).
  22. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 983178(2022).
  23. Edwards, A., Gupta, J. D., Harley, J. D. Photomicrographic evaluation of drug-induced cataracts in cultured embryonic chick lens. Experimental Eye Research. 15 (4), 495-498 (1973).
  24. Musil, L. S. Primary cultures of embryonic chick lens cells as a model system to study lens gap junctions and fiber cell differentiation. Journal of Membrane Biology. 245 (7), 357-368 (2012).
  25. West-Mays, J. A., Pino, G., Lovicu, F. J. Development and use of the lens epithelial explant system to study lens differentiation and cataractogenesis. Progress in Retinal and Eye Research. 29 (2), 135-143 (2010).
  26. Upreti, A., et al. Lens epithelial explants treated with vitreous humor undergo alterations in chromatin landscape with concurrent activation of genes associated with fiber cell differentiation and innate immune response. Cells. 12 (3), 501(2023).
  27. Walker, J. L., Wolff, I. M., Zhang, L., Menko, A. S. Activation of SRC kinases signals induction of posterior capsule opacification. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (5), 2214-2223 (2007).
  28. Briskin, M. J., et al. Heritable retroviral transgenes are highly expressed in chickens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (5), 1736-1740 (1991).
  29. Hughes, S. H. The RCAS vector system. Folia Biologica. 50 (3-4), 107-119 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

RCAS Retrovir sTavuk Lens MikroenjeksiyonuEmbriyonik Tavuk ModeliLens Geli imiGen TransferiEksojen Protein EkspresyonuLens Fiber H crelerimm nofloresan EtiketlemeKonneksin Etkile imiMikropipet Enjeksiyonu

İlgili makaleler