Method Article

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Mezenkimal Stromal Hücrelere Farklılaşması için İki Temsili Yöntemin Karşılaştırılması

DOI:

10.3791/65729

⸱

October 20th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Clinical Research Center for Child Health, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Nephrology, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 3Zhejiang University School of Medicine, 4Liangzhu Laboratory, Zhejiang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, hiPSC'leri mezenkimal stromal hücrelere (MSC'ler) farklılaştırmak için iki temsili yöntemi tanımlar ve karşılaştırır. Tek katmanlı yöntem, daha düşük maliyet, daha basit işlem ve daha kolay osteojenik farklılaşma ile karakterizedir. Embriyoid cisimler (EB'ler) yöntemi, daha düşük zaman tüketimi ile karakterizedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenkimal stromal hücreler (MSC'ler), rejeneratif tıpta yaygın olarak kullanılan yetişkin pluripotent kök hücrelerdir. Somatik doku kaynaklı MSC'ler sınırlı bağış, kalite varyasyonları ve biyogüvenlik ile kısıtlandığından, son 10 yılda insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden (hiPSC'ler) MSC'ler üretme çabalarında büyük bir artış görülmüştür. hiPSC'lerin MSC'lere farklılaşmasına yönelik geçmiş ve son çabalar iki kültür metodolojisi etrafında toplanmıştır: (1) embriyoid cisimciklerin (EB'ler) oluşumu ve (2) tek katmanlı kültürün kullanımı. Bu protokol, hiPSC'lerden MSC türetilmesinde bu iki temsili yöntemi açıklar. Her yöntem, zaman, maliyet, hücre proliferasyon yeteneği, MSC belirteçlerinin ekspresyonu ve in vitro farklılaşma yetenekleri dahil olmak üzere avantaj ve dezavantajlarını sunar. Bu protokol, her iki yöntemin de hiPSC'lerden olgun ve işlevsel MSC'ler türetebileceğini göstermektedir. Tek katmanlı yöntem, daha düşük maliyet, daha basit işlem ve daha kolay osteojenik farklılaşma ile karakterize edilirken, EB yöntemi daha düşük zaman tüketimi ile karakterize edilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenkimal stromal hücreler (MSC'ler) mezoderm kaynaklı yetişkin pluripotent kök hücrelerdir1. MSC'ler hemen hemen tüm bağ dokularında bulunur2. MSC'ler ilk olarak 1970'lerde keşfedildiğinden ve 1987'de Friedenstein ve ark.3,4,5 tarafından kemik iliğinden başarılı bir şekilde izole edildiğinden beri, kemik, kıkırdak, tendon, kas, yağ dokusu ve hematopoietik destekleyici stroma gibi MSC'leri izole etmek için çeşitli insan somatik (fetal ve yetişkin dahil) dokular kullanılmıştır

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hiPSC'lerin bakımı

  1. HiPSC'nin çözülmesi
    1. Hücreleri sıvı nitrojenden çıkarın ve hücreleri 37 ° C'lik bir su banyosunda hızla çözün. Çözdürme hücrelerini 3 mL iPSC bakım ortamı ile hazırlanmış 15 mL'lik bir tüpe aktarın (Malzeme Tablosu). Ortamı yavaşça karıştırın.
    2. 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 10 μM Y-27632 ile 1 mL iPSC bakım ortamında nazikçe yeniden süspanse edin (hücreleri 2-3 kez yukarı ve aşağı pipetleyin).
    3. Hücre süspansiyonunu, büyüme faktörü azaltılmış (GFR) -hücre dışı matris jeli (1:100) ve önceden 10 μM Y-27632 eklenmiş (yaklaşık ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolü takiben (Şekil 1A), hiPSC'ler EB formasyonu ve tek katmanlı kültür yöntemleri ile MSC'lere farklılaştırıldı. Farklılaşma sırasında, hücreler farklı temsili morfolojiler gösterdi (Şekil 1B, C).

Şekil 1B'de gösterildiği gibi, hiPSC kolonileri, sıkıca paketlenmiş hücrelerden oluşan net bir sınırla farklılaşmadan önce tipik kompakt morfoloji sergiler. Çalkalayıcı üzerinde 24 saat bo.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde, hiPSC'leri MSC'lere ayırmanın iki temsili yöntemi incelenmiştir 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Her iki yöntem de MSC'leri hiPSC'lerden türetme yeteneğine sahipti. HiPSC'den.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mao ve Hu Lab'ın geçmişteki ve şimdiki tüm üyelerine, ilginç tartışmalar ve projeye büyük katkıları için son derece minnettarız. Büyük destek için Ulusal Çocuk Sağlığı Klinik Araştırma Merkezi'ne müteşekkiriz. Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Jianhua Mao'ya U20A20351, Lidan Hu'ya 82200784), Çin'in Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (No. LQ22C070004 Lidan Hu'ya).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alizarin kırmızı boyama setiBeyotime  BiyoteknolojiC0148S
Anti-insan-CD105 (PE)Biolegend323206
Anti-insan-CD34 (FITC)Biolegend343503
Anti-insan-CD45 (APC)Biolegend304011
Anti-insan-CD73(APC)Biolegend344006
Anti-insan-CD90 (FITC)Biolegend328108
Askorbik asitSolarbioA8100
BMP-6NovoproteinC012
Karbondioksit seviye çalkalayıcıKristalCO-06UC6
Kompanzasyon BoncuklarıBioLegend424601
CryoStor CS10KÖK HÜCRE Teknolojisi07959
DeksametazonBeyotime  BiyoteknolojiST1254
DMEM / F12 ve nbsp; ortaServicebioG4610
Fetal sığır serumuHAKATAHS-FBS-500
FGF2Kök Hücre78003.1
JelatinSigma-AldrichG2500-100G
GlutaMAXGibco35050061
insan IgG1 izotip kontrolü APCİnsan
FITCBioLegend403507
insan IgG1 izotip kontrolü PEBioLegend403503
İnsan TGF-β 1Kök Hücre78067
İnsan TruStain FcX BioLegend422301
IBMXBeyotime  BiyoteknolojiST1398
İndometasinSolarbioSI9020
İnsülinBeyotime  BiyoteknolojiP3376
iPSC bakım ortamıSTEMCELL Teknolojisi85850
ITS Medya EkiBeyotime  BiyoteknolojiC0341-10mL
Matrigel, büyüme faktörü azaltılmışBD Corning354230
Oli Kırmızı O boyama kitiBeyotime  Biyoteknoloji C0158S
ProlineSolarbioP0011
Sodyum piruvatThermoFisher11360-070
TGF ve beta; 3NovoproteinCJ44
Toluidin mavi boyama kitiSolarbioG2543
TrypLE Express Enzim (1x)  Gibco12604013
Ultra Düşük Ataşman 6 Kuyulu PlakaCostar3471
VerseneGibco15040-66
Y-27632Kök Hücre72304
&alfa;-MEMHiklonSH30265
β-gliserofosfatSolarbioG8100
IgG1 izotip kontrolü 403505

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
  2. Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One n....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Induced Pluripotent Stem CellsMesenchymal Stromal CellsEmbryoid Body FormationMonolayer CultureMSC DifferentiationFlow CytometryOsteogenic DifferentiationSpindle Shaped MorphologyMSC MarkersRegenerative Medicine

Related Articles