Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Gastritli Sıçanlarda Desmodium caudatum'un Gastrointestinal Hormonlar ve Bağırsak Florası Üzerine Etkileri

2.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/65744

⸱

1 Mart 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Mevcut protokol, Illumina bazlı 16S rRNA gen dizilimi kullanılarak bağırsak florasını analiz etme yöntemini açıklar ve bitkisel kaynatmaların etkinliğini değerlendirmek için bir çerçeve sağlar.

Özet

Desmodium caudatum'un sıçanlarda gastrit ve bağırsak florası üzerindeki etkilerini ön olarak araştırmak için, klasik sodyum salisilat yöntemi kullanılarak kronik gastritli bir sıçan modeli oluşturulmuştur. On sekiz SPF sıçanı, kontrol grubu (Grup C), model grup (Grup M) ve tedavi grubu (Grup T) olmak üzere üç gruba ayrıldı. Her gruptaki sıçanlardan mide duvarının patolojik kesitleri alındı. Ayrıca, her gruptaki sıçanların serumundaki gastrin ve malondialdehit konsantrasyonları ELISA ile belirlendi. Ek olarak, D. caudatum'un gastritli sıçanların bağırsak florası üzerindeki etkileri, Illumina bazlı 16S rRNA gen dizilimi kullanılarak üç gruptaki bağırsak bakteri topluluklarının ayrıntılı bir karşılaştırması yoluyla araştırıldı. Sonuçlar, D. caudatum kaynağının malondialdehit içeriğini azaltabileceğini ve gastrin içeriğini artırabileceğini gösterdi. Ayrıca, D. caudatum kaynatma işleminin bağırsak florasının çeşitliliğini ve bolluğunu arttırdığı, bağırsak florasını düzenleyerek ve eski haline getirerek gastrit tedavisi üzerinde olumlu bir etki yarattığı bulunmuştur.

Giriş

En sık görülen klinik hastalıklardan biri olan kronik gastrit (KG), mide mukozası epitelinde kronik ve kalıcı inflamatuar değişikliklerle karakterizedir ve çeşitli patojenik faktörlerin sık ve tekrar tekrar saldırmasına neden olur1. GASTROENTEROLOJI2 Bölümü'nde poliklinik hizmet oranının %40 ila %60'ını oluşturan tüm mide hastalıkları türleri arasında ilk sırada yer almaktadır. Ayrıca, özellikle orta yaş ve üstübireylerde görülme sıklığı genellikle yaşla birlikte artmaktadır 3. Kuşkusuz, CG insanların yaşam kalitesini önemli ölçüde azaltır ve yeni terapötik ajanların keşfedilmesine yönelik kritik ihtiyacı vurgular.

Çok sayıda çalışma, CG'nin oluşumunun ve gelişiminin gastrin (GAS) gibi gastrointestinal hormonların salgılanmasıyla bağlantılı olduğunu bildirmiştir4,5. Sindirim sisteminde yaygın bir gastrointestinal peptit hormonu olan GAS, eozinofillerden histamin salınımını teşvik ederek hücreleri mide asidi salgılamaya teşvik eder. Ek olarak, mide mukozasının beslenmesini ve kanlanmasını iyileştirerek mide mukozası ve parietal hücrelerin çoğalmasını teşvik eder6. Bu nedenle, gastrin, CG'nin gelişim seviyesini değerlendirmek için bir gösterge olarak kullanılabilir. Ayrıca, reaktif oksitler tarafından tetiklenen lipid peroksidasyon ürünleri, enflamatuar hücreleri aktive ederek CG'ye yol açabilir. Bir lipid peroksidasyon belirteci olan malondialdehit (MDA), oksidatif stresin derecesini ölçmek için yaygın olarak kullanılan bir göstergedir. Mide mukozasındaki serbest radikallerin seviyesini belli bir oranda yansıtır. MDA seviyesi, serbest radikallerin neden olduğu lokal mide mukozasındaki doymamış yağ asitlerinin saldırısını gösterebilir 7,8.

Bağırsak mikroekolojisi, konakçı bağırsağında bulunan milyonlarca mikroorganizmadan oluşur ve konakçı sağlığının korunmasında ve konak bağışıklığının düzenlenmesinde hayati bir rol oynar. Yüksek zenginlik, çeşitlilik ve stabil mikrobiyota fonksiyonu ile karakterize edilen sağlıklı bir bağırsak florası, metabolizmaya katılarak patojenik mikroorganizmaların istilasına karşı koruyucu bir bariyer görevi görür. Bağırsak florasındaki bozukluklar, bireyleri akut ve kronik gastrointestinal hastalıklara karşı daha duyarlı hale getirir 9,10. Son yıllarda, gastrointestinal hastalıklar için mikrobiyota tedavisi hızla ilerlemiş ve önemli etkinlik göstermiştir11. Özetle, bağırsak florasının dikkate alınması, gastrointestinal hastalıkların anlaşılması ve ele alınmasında çok önemlidir.

Geleneksel Çin tıbbı hazinesinin vazgeçilmez bir bileşeni olan halk tıbbi materyalleri, klinik uygulama ve ulusal tıbbın modernizasyonu için büyük önem taşımaktadır. Desmodium caudatum'un (Thunb.) DC. Mianyang Şehrinin Beichuan Qiang bölgesinde uzun süredir mide rahatsızlığını gidermek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bazı makaleler, gastrointestinal hastalıkların D. caudatum ile tedavi edilmesinin bilimsel temelini, hemostaz, anti-oksidasyon ve gastrointestinal koruma gibi etkilerine atıfta bulunarakgöstermektedir 12,13,14. Bununla birlikte, derinlemesine araştırma eksikliği nedeniyle, klinik farmakodinamik bir mekanizma oluşturulmamıştır. Bu makale, gastrointestinal hormonlara ve bağırsak florasına dayalı olarak gastrit tedavisinde D. caudatum'un etkilerini incelemeyi ve rasyonel klinik uygulaması için bir temel oluşturmayı amaçlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvanların bakımı ve kullanımına ilişkin prosedürler Mianyang Normal Üniversitesi Etik Kurulu tarafından onaylandı ve hayvanların etik kullanımı ile ilgili tüm ilgili kurumsal ve resmi düzenlemelere sıkı sıkıya uyuldu. Bu çalışmada SPF cinsi sıçanlar (180-220 g ağırlığında, hem erkek hem de dişi Kunming türleri) kullanılmıştır. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz. Tüm hayvanlar patojen içermeyen bir ortamda barındırıldı ve yiyeceğe ad libitum erişim sağlandı.

1. Reaktiflerin hazırlanması

  1. Elektronik bir terazi ile 2,5 g sodyum salisilat tozunu (Malzeme Tablosuna bakınız) tartarak% 5'lik bir sodyum salisilat çözeltisi hazırlayın. Tozu az miktarda damıtılmış su içinde çözün ve toplam 50 mL hacme kadar seyreltin.
  2. D. caudatum (12.8 g / kg) kaynatma hazırlayın. 128 g D. caudatum tartın (Malzeme Tablosuna bakınız), 1000 mL laboratuvar damıtılmış su içeren yuvarlak tabanlı bir şişeye koyun ve 100 mL'lik bir son hacme konsantre edin.

2. Gruplandırma ve yönetim

  1. Sıçanları farklı gruplara ayırın ve gerekli çözeltileri intragastrik olarak uygulayın.
    NOT: Bu çalışmada 18 sıçan (9 erkek, 9 dişi) kontrol grubu (Grup C), model grup (Grup M) ve tedavi grubu (Grup T) olmak üzere üç gruba ayrıldı ve her grupta 6 sıçan vardı. Kontrol grubuna salin solüsyonu verildi ve model grubuna 5 hafta boyunca 10 mL / kg / gün dozunda% 5 sodyum salisilat solüsyonu verildi15. Tedavi grubu, 10 mL / kg / gün dozunda 5 hafta boyunca% 5 sodyum salisilat çözeltisi ile ön işleme tabi tutuldu, ardından 10 gün boyunca 1 mL / 100 g'lık bir dozda D. caudatum kaynatma uygulandı 15,16.
  2. Deneyin son gününde kuyruk taşıma yöntemini17 kullanarak kuru ve steril mikrosantrifüj tüplerinde sıçanlardan dışkı toplayın ve bunları sıvı nitrojen ultra düşük sıcaklıklı bir dondurucuda dondurun.
  3. Örneklemenin bitiminden sonra, sıçanları servikal çıkık ile feda edin (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Abdominal aortu ortaya çıkarmak için karın boşluğunu makasla açın.
    1. İğneyi (23-25 G) karın aortuna neredeyse paralel olarak yerleştirin, serumu toplayın ve ultra düşük sıcaklıklı bir dondurucuda saklayın. Mideleri karın boşluğundan16 çıkarın ve koruma için% 10'luk bir formalin çözeltisine batırın.
      NOT: Grup M'de, lamina propriada az miktarda inflamatuar hücre infiltrasyonu gözlenirken, mide mukozası düzenli glandüler morfoloji15 ile genişlemiş ve tıkanmışsa kronik gastrit modelinin başarılı olduğu kabul edilir.

3. Mide duvarının patolojik kesiti

  1. Patolojik kesitler için her gruptaki sıçanlardan mide duvarı örnekleri alın. Daha sonra, patolojik değişiklikleri gözlemlemek ve analiz etmek için rutin hematoksilen-eozin boyama yapın18.

4. Serum gastrointestinal hormonlarının belirlenmesi

  1. Serum örneğinde, üreticinin talimatlarını izleyerek ELISA kullanarak gastrin (GAS) ve malondialdehit (MDA)19 içeriğini tespit edin (bkz. Malzeme Tablosu). Analiz için bir mikroplaka okuyucu kullanın.

5. Fekal total DNA ekstraksiyonu ve PCR amplifikasyonu ve saflaştırılması

  1. Piyasada bulunan DNA izolasyon kitini kullanarak mikrobiyal DNA ekstraksiyonu gerçekleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve UV-Vis spektrofotometresi16 kullanarak konsantrasyonu ve saflığı belirleyin. Daha sonra,% 1 agaroz jel elektroforezi18 ile DNA bütünlüğünü değerlendirin.
  2. Bir termosikler PCR sistemi kullanarak bakteri 16S rRNA genini 338F (5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′) ve 806R (5′-GAC TAC HVG GGG GTW TCT AT-3′) primerleri ile çoğaltın17. Astarlar ticari kaynaklardan elde edilir (bkz. Malzeme Tablosu).
    NOT: PCR programını izleyin: denatürasyon (3 dk, 95 °C), ardından 27 döngü (30 s, 95 °C; 30 s, 55 °C; 45 s, 72 °C) ve son uzatma (10 dk, 72 °C). Aşağıdaki bileşenlerle PCR reaksiyonları gerçekleştirin: 4 μL 5× DNA polimeraz tamponu, 2 μL 2.5 mM dNTP, her primerden 0.8 μL (5 μM), 0.4 μL DNA polimeraz ve 10 ng şablon DNA (bkz.
  3. PCR ürünlerini sırasıyla% 2 agaroz jel, ticari olarak temin edilebilen DNA jel ekstraksiyon kiti ve florometre kullanarak sırayla ekstrakte edin, saflaştırın ve miktarını belirleyin17.

6. Sıralama

NOT: Adım 6 ve adım 7, daha önce yayınlanmış yöntemler20,21 izlenerek gerçekleştirilir.

  1. Sıralama için Illumina platformunu kullanın.
    NOT: DNA parçasının bir ucu, çipe gömülü konektörün tabanını tamamlar ve onu çipe sabitler. Diğer uç, başka bir bitişik gömülü eklemin tabanını rastgele tamamlayarak bir "köprü" oluşturur.
  2. DNA kümeleri oluşturmak için PCR amplifikasyonu gerçekleştirin. DNA amplifikatörlerini tek iplikçikler halinde doğrusallaştırın.
  3. Dört farklı floresan işaretleyici içeren deoksiribonükleotid trifosfatların (dNTP'ler) yanı sıra değiştirilmiş bir DNA polimeraz ekleyin. Döngü başına yalnızca bir baz sentezleyin.
  4. Reaksiyon plakasının yüzeyini taramak ve her şablon dizisinin ilk reaksiyonu sırasında polimerize olan nükleotid tiplerini belirlemek için bir lazer kullanın.
  5. 3' yapışkan ucu yeniden oluşturmak için "floresan grubunu" ve "sonlandırma grubunu" kimyasal olarak ayırın. Daha sonra, ikinci nükleotidi polimerize etmeye ilerleyin.
  6. Her turda toplanan floresan sinyal sonuçlarını analiz ederek şablon DNA fragmanlarının dizisini elde edin.

7. Sıralama verilerinin işlenmesi

  1. Başlangıçta, Q20 10 bp üst üste binme ile birleştirin.
  2. UPARSE kullanarak %97 benzerlik ile operasyonel taksonomik birimleri (OTU'lar) kümeleyin ve UCHIME20,21 ile kimerik dizileri kaldırın.
  3. %70'lik bir güven eşiği kullanarak Silva (SSU123) 16S rRNA veritabanına karşı her 16S rRNA gen dizisinin taksonomisini analiz etmek için RDP Sınıflandırıcı algoritmasını kullanın.
  4. Sırasıyla Mothur ve Qiime kullanarak Alfa çeşitlilik analizi ve Beta çeşitlilik analizi yapın (bkz.

8. İstatistiksel analiz

  1. Bu çalışmadaki verileri istatistiksel analiz yazılımı kullanarak analiz edin (bkz. Birden fazla grup arasındaki karşılaştırmalar için tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanın ve iki grup arasındaki karşılaştırmalar için en az anlamlı fark (LSD) testini kullanın.
  2. Tüm karşılaştırmalarda P < 0.05'i istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edin. P < 0.01 son derece anlamlı olarak kabul edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Mide duvarının patolojik kesitinin sonuçları Şekil 1'de gösterilmiştir. Grup C'ye kıyasla Grup M'de hafif mide duvarı atrofisi ve hafif inflamasyon izlendi. Bununla birlikte, Grup M ile karşılaştırıldığında, Grup T'de belirgin bir inflamasyon, intestinal metaplazi veya atrofi görülmedi. Bu, D. caudatum kaynatma işleminin gastriti etkili bir şekilde iyileştirebileceğini düşündürmektedir.

Serum gastrointestinal hormon test sonuçları Şek...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Qiang milliyeti12 tarafından yaygın olarak kullanılan bir halk tıbbı olan D. caudatum, gastrointestinal hastalıkların tedavisinde önemli etkinlik göstermiştir. Modern farmakolojik araştırmaların ilerlemesiyle, gastrointestinal mikroekoloji dengesizliğinden kaynaklanan flora dengesizliği, akut ve kronik gastrointestinal hastalıklarda anahtar bir faktör olarak tanımlanmaktadır22,23. Bağırsak sistemindeki bazı mikroorganizmalar vücut...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Sichuan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Departmanının (2020YFS0539) Temel Ar-Ge projeleri tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alfa çeşitlilik analiziMothur 1.30.2
AxyPrep deoksiribonükleik asit (DNA) jel ekstraksiyon kiti ve nbsp;Axygen Biyobilimleri AP-GX-50
Beta çeşitlilik analiziQiime 1.9.1
Kriyojenik buzdolabıForma-86C ULT dondurucu
Desmodium caudatumBeichuan Qiang Özerk İlçesi
E.Z.N.A. toprak kitiOmega Bio-tekD5625-01
Illumina MiSeq PlatformIllumina Miseq PE300/NovaSeq PE250
Multiskan SpektrumspectraMax i3
OTU kümelemeUparse 7.0.1090
OTU istatistikleriUsearch 7.0
PCR cihazıTransGen AP221-02
PCR cihazıABI GeneAmp 9700
QuantiFluor-ST çift sarmallı DNA (dsDNA) sistemiPromega Corp.
Dizi sınıflandırma açıklamasıRDP Sınıflandırıcı 2.11
Sodyum salisilatSichuan Xilong Chemical Co., Ltd54-21-7
SPF sıçanlarıChengdu Dashuo Deneysel Hayvan Co., Ltd
SPSS 18.0IBM
Geleneksel Çin Tıbbı Hastanesi

Kaynaklar

  1. Marginean, C. M., et al. The importance of accurate early diagnosis and eradication in Helicobacter pylori infection: pictorial summary review in children and adults. Antibiotics (Basel). 12 (1), 60(2022).
  2. Sipponen, P., Maaroos, H. I. Chronic gastritis. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 50 (6), 657-667 (2015).
  3. Wang, D. J. Methodological quality and reporting quality evaluation of chinese medicine diagnosis and treatment guidelines for chronic gastritis in China. Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology. 24 (7), 2776-2783 (2022).
  4. Burkitt, M. D., Varro, A., Pritchard, D. M. Importance of gastrin in the pathogenesis and treatment of gastric tumors. World Journal of Gastroenterology. 15 (1), 1-16 (2009).
  5. Hayakawa, Y., Chang, W., Jin, G., Wang, T. C. Gastrin and upper GI cancers. Current Opinion in Pharmacology. 31, 31-37 (2016).
  6. Zhang, C. Z., He, M. X., Jin, L. W., Liu, W. D. Effect of aluminum phosphate gel combined with atropine on patients with acute gastritis and its effect on serum gastrin and malondialdehyde levels. International Journal of Digestive Diseases. 40 (2), 137-140 (2020).
  7. Wang, Y. K., et al. Levels of malondialdehyde in the gastric juice: its association with Helicobacter pylori infection and stomach diseases. Helicobacter. 23 (2), e12460(2018).
  8. Turkkan, E., et al. Does Helicobacter pylori-induced inflammation of gastric mucosa determine the severity of symptoms in functional dyspepsia. Journal of Gastroenterology. 44 (1), 66-70 (2009).
  9. Liu, Y., Cai, C., Qin, X. Regulation of gut microbiota of Astragali Radix in treating for chronic atrophic gastritis rats based on metabolomics coupled with 16S rRNA gene sequencing. Chemico-Biological Interactions. 365, 110063(2022).
  10. Gai, X., et al. Heptadecanoic acid and pentadecanoic acid crosstalk with fecal-derived gut microbiota are potential non-invasive biomarkers for chronic atrophic gastritis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 1064737(2023).
  11. Sgambato, D., et al. Gut microbiota and gastric disease. Minerva Gastroenterologica e Dietologica. 63 (4), 345-354 (2017).
  12. Li, J., et al. Pharmacogenetic study of Desmodium caudatum. Anais Da Academia Brasileira De Ciencias. 91 (2), e20180637(2019).
  13. Xu, Q. N., et al. Phenolic glycosides and flavonoids with antioxidant and anticancer activities from Desmodium caudatum. Natural Product Research. 35 (22), 4534-4541 (2021).
  14. Li, W., et al. Anti-inflammatory and antioxidant activities of phenolic compounds from Desmodium caudatum leaves and stems. Archives of Pharmacal Research. 37 (6), 721-727 (2014).
  15. Shao, X. H., Wang, J. G. Establishment of chronic atrophic gastritis in a rat model. Journal of Zhangjiakou Medical Collage. 19 (2), 11-13 (2002).
  16. Yu, C., et al. Dysbiosis of gut microbiota is associated with gastric carcinogenesis in rats. Biomedicine & Pharmacotherapy. 126, 110036(2020).
  17. Chen, R., et al. Fecal metabolomics combined with 16S rRNA gene sequencing to analyze the changes of gut microbiota in rats with kidney-yang deficiency syndrome and the intervention effect of You-gui pill. Journal of Ethnopharmacology. 224, 112139(2019).
  18. Li, Q., et al. Magnetic anchoring and guidance-assisted endoscopic irreversible electroporation for gastric mucosal ablation: a preclinical study in canine model. Surgical Endoscopy. 35 (10), 5665-5674 (2021).
  19. Xu, H., et al. Therapeutic assessment of fractions of Gastrodiae Rhizoma on chronic atrophic gastritis by 1H NMR-based metabolomics. Journal of Ethnopharmacology. 254, 112403(2020).
  20. Zhang, B. N., et al. Effects of Atractylodes lancea extracts on intestinal flora and serum metabolites in mice with intestinal dysbacteriosis. Proteome Science. 21 (1), 5(2023).
  21. Tian, H., et al. The therapeutic effects of Magnolia officinalis extraction on an antibiotics-induced intestinal dysbacteriosis in mice. Current Microbiology. 77 (9), 2413-2421 (2020).
  22. Wang, J., et al. Tumor and microecology committee of China anti-cancer association. Chinese expert consensus on intestinal microecology and management of digestive tract complications related to tumor treatment (version 2022). Journal of Cancer Research and Therapeutics. 18 (7), 1835-1844 (2022).
  23. Xu, W., Xu, L., Xu, C. Relationship between Helicobacter pylori infection and gastrointestinal microecology. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 938608(2022).
  24. Johnson, J. S., et al. Evaluation of 16S rRNA gene sequencing for species and strain-level microbiome analysis. Nature Communications. 10 (1), 5029(2019).
  25. Callahan, B. J., et al. High-throughput amplicon sequencing of the full-length 16S rRNA gene with single-nucleotide resolution. Nucleic Acids Research. 47 (18), e103(2019).
  26. Langille, M. G., et al. Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nature Biotechnology. 31 (9), 814-821 (2013).
  27. Huang, D., et al. Characteristics of intestinal flora in patients with gastric cancer based on high throughput sequencing technology. Chinese Journal of Clinical Research. 35 (3), 303-306 (2022).
  28. Shi, Y., Luo, J., Narbad, A., Chen, Q. Advances in lactobacillus restoration for β-lactam antibiotic-induced dysbiosis: a system review in intestinal microbiota and immune homeostasis. Microorganisms. 11 (1), 179(2023).
  29. Grigor'eva, I. N. Gallstone disease, obesity and the Firmicutes/Bacteroidetes ratio as a possible biomarker of gut dysbiosis. Journal of Personalized Medicine. 11 (1), 13(2020).
  30. Thorne, G. M. Diagnosis of infectious diarrheal diseases. Infectious Disease Clinics of North America. 2 (3), 747-748 (1988).
  31. Banks, M., et al. British society of gastroenterology guidelines on the diagnosis and management of patients at risk of gastric adenocarcinoma. Gut. 68 (9), 1545-1575 (2019).
  32. Roy-Lachapelle, A., et al. Evaluation of ELISA-based method for total anabaenopeptins determination and comparative analysis with on-line SPE-UHPLC-HRMS in freshwater cyanobacterial blooms. Talanta. 223, 121802(2021).
  33. Shahi, S. K., et al. Microbiota analysis using two-step PCR and next-generation 16S rRNA gene sequencing. Journal of Visualized Experiments. (152), e59980(2019).
  34. Huang, R., et al. Blocking-free ELISA using a gold nanoparticle layer coated commercial microwell plate. Sensors (Basel). 18 (10), 3537(2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Kronik GastritGastrin SeviyeleriMalondialdehit İçeriğiELISA Analizi16S rRNA DizilemeBağırsak MikrobiyotasıSıçan Modeli