Mitokondriyal Oksijen Tüketiminin Plaka Okuyucu Tabanlı Floresan Testi Kullanılarak Değerlendirilmesi

Özet

Oksijen tüketiminin değerlendirilmesi, mitokondriyal fonksiyon hakkında bütünleyici bilgi sağlar. Floresan plaka okuyuculu bir fosforlu prob kullanılarak, özel ekipman olmadan kolayca doğru ve tekrarlanabilir veriler elde edilebilir. Bu test, herhangi bir laboratuvarın izole edilmiş mitokondrinin oksijen tüketimini ölçmesini ve solunum kontrol oranlarını hesaplamasını sağlar.

Özet

Mitokondri, hücresel solunum, ATP üretimi, apoptozu kontrol etme ve metabolik yolların merkezi bir merkezi olarak hareket etme dahil olmak üzere birçok önemli işleve hizmet eder. Bu nedenle, mitokondriyal işlevselliğin deneysel olarak değerlendirilmesi, farklı popülasyonlar veya hastalık durumları arasındaki farklılıklar hakkında fikir verebilir. Ek olarak, izole edilmiş mitokondrinin deneylere devam etmek için yeterince sağlıklı olup olmadığını değerlendirmek değerlidir. Farklı örneklerde mitokondriyal fonksiyonu karşılaştırmak için sıklıkla kullanılan bir özellik, oksijen tüketim oranıdır. Oksijen tüketimi ve ardından dokudan izole edilen sağlam hücrelerde veya mitokondride solunum kontrol oranının hesaplanması her üç amaca da hizmet edebilir. Fırça kertenkelelerinin karaciğerlerinden izole edilen mitokondriyi, bir çözeltinin oksijen konsantrasyonundaki dalgalanmalara duyarlı fosforlu bir prob ile birlikte kullanarak, bir floresan plaka okuyucu kullanarak oksijen tüketimini ölçtük. Bu yöntem sadece hızlı ve verimli olmakla kalmaz, aynı zamanda az miktarda mitokondri ile ve özel ekipmana ihtiyaç duymadan da gerçekleştirilebilir. Burada açıklanan adım adım protokol, mitokondriyal fonksiyonel değerlendirmenin araştırmacılar için erişilebilirliğini artırır.

Giriş

Mitokondri, ökaryotik hücrelerde bulunan yaklaşık bakteri büyüklüğünde organellerdir. DNA içerdikleri ve dış ve iç olmak üzere iki zara sahip oldukları için benzersiz organellerdir. Mitokondrinin dış ve iç zarları, zarlar arası bir boşlukla ayrılır ve iç zar, matris adı verilen en içteki bölmenin etrafında cristae adı verilen yapılara katlanır. Bu kristaller, iç zarın yüzey alanını arttırır, böylece kristali kullanan birden fazla işlem aynı anda gerçekleşebilir. Mitokondri, apoptozu kontrol etmek ve çoklu metabolik yolları barındırmak gibi birçok hücresel fonksiyonda yer alırken, ATP üretimindeki hayati rolleri hücrenin hayatta kalmas....

Protokol

Kertenkeleler, CO₂ boğulması ile ötenazi yapıldı ve ardından Hayvan Laboratuvarı Refah Ofisi ve Elon'un Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi yönergeleri tarafından belirtilen politikalara uygun olarak derhal başlarının kesilmesi izledi.

1. Mitokondri izolasyonu⁶

NOT: Tüm çözeltileri soğuk tutun (Tablo 1) ve sampbu adımlar boyunca buz üzerinde.

1. Karaciğeri çıkarın, tartın ve ardından ~ 3 mL buz gibi soğuk fosfat tamponlu tuzlu su (1x, -/-) ile durulayın.
2. Karaciğeri taze bir tıraş bıçağıyla 1 mL L-MIB'de kıyın.
<....

Sonuçlar

Oksijen tüketim oranı ve mitokondriyal RCR, fosforlu oksijen algılama probu ve standart bir floresan plaka okuyucusu olan bir tahlil kiti kullanılarak üç farklı kertenkelenin mitokondrisinden belirlendi. Önceki araştırmalar, bu kitteki probun, fosforesansın moleküler oksijen tarafından söndürüldüğü ve mitokondriyal solunum^nedeniyle oksijen seviyeleri azaldıkça floresan sinyalinin arttığı oksijen tüketimi ile doğrudan ilişkili olduğunu ortaya koymuştur ^7,11. RFU d.......

Tartışma

Mitokondriyal fonksiyonun ölçülmesi, hastalıklı ve hastalıksız durumlar, aynı hayvandan alınan farklı doku tipleri veya farklı numune türleri gibi farklı numuneleri karşılaştırırken yararlıdır. Daha sonraki karşılaştırmayı, mitokondriye sahip melez ağaç kertenkelelerinin metabolik bir sonucu olduğu hipotezimizi test etmek için kullandık. Mitokondri fonksiyonunu deneysel olarak tespit etmenin, Δψ'nin miktarının belirlenmesi, toplam ATP içeriği, ATP üretimi ve solunum kontrolü ve oksijen t.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
96 oyuklu siyah/optik alt plakalar	Thermo Fisher	265301	Şeffaf tabanlı, işlenmemiş siyah duvar plakaları.
ADP	Sigma	A2754	Seyreltik 100 ve mikro; Kullanmadan hemen önce EB ile M stoğu.
BSA	Thermo Fisher	BP1600-100	Protein tahlili için suda 2 mg / mL stok yapın.
Dulbeccos 1x PBS (-/-)	Sigma	D8537	PBS'nin Mg2+ veya Ca2+ iyonları içermediğinden emin olun.
EGTA	Sigma	E3889
K2HPO4	Sigma	P3786
KH2PO4	Sigma	P0662
L-glutamik asit	Sigma	G1251
L-glutamik asit potasyum tuzu	Sigma	S372226
L-malik asit	Sigma	M8304
L-malik asit mono-potasyum tuzu	Sigma	49601
MitoXpress oksijen tüketim kiti	Agilent	MX-200-4	Kiti, prob stoğu ve HS mineral yağ içerir.
MOPS	Sigma	M3183
Protien Test Boyası (5x)	BioRad	500-0006	Herhangi bir protein tahlili ikame edebilir.
R sürüm 3.3	R Core Geliştirme Ekibi 2016
Thermomax mikroplaka okuyucu EnSpire Çok Modlu Plaka okuyucu ve yazılım	PerkinElmer		Standart floresan plaka okuyucu
Trisma tabanı	Sigma	T6066	Tris tabanının herhangi bir versiyonu kullanılabilir.