Mitokondriyal Oksijen Tüketiminin Plaka Okuyucu Tabanlı Floresan Testi Kullanılarak Değerlendirilmesi

Summary

Oksijen tüketiminin değerlendirilmesi, mitokondriyal fonksiyon hakkında bütünleyici bilgi sağlar. Floresan plaka okuyuculu bir fosforlu prob kullanılarak, özel ekipman olmadan kolayca doğru ve tekrarlanabilir veriler elde edilebilir. Bu test, herhangi bir laboratuvarın izole edilmiş mitokondrinin oksijen tüketimini ölçmesini ve solunum kontrol oranlarını hesaplamasını sağlar.

Abstract

Mitokondri, hücresel solunum, ATP üretimi, apoptozu kontrol etme ve metabolik yolların merkezi bir merkezi olarak hareket etme dahil olmak üzere birçok önemli işleve hizmet eder. Bu nedenle, mitokondriyal işlevselliğin deneysel olarak değerlendirilmesi, farklı popülasyonlar veya hastalık durumları arasındaki farklılıklar hakkında fikir verebilir. Ek olarak, izole edilmiş mitokondrinin deneylere devam etmek için yeterince sağlıklı olup olmadığını değerlendirmek değerlidir. Farklı örneklerde mitokondriyal fonksiyonu karşılaştırmak için sıklıkla kullanılan bir özellik, oksijen tüketim oranıdır. Oksijen tüketimi ve ardından dokudan izole edilen sağlam hücrelerde veya mitokondride solunum kontrol oranının hesaplanması her üç amaca da hizmet edebilir. Fırça kertenkelelerinin karaciğerlerinden izole edilen mitokondriyi, bir çözeltinin oksijen konsantrasyonundaki dalgalanmalara duyarlı fosforlu bir prob ile birlikte kullanarak, bir floresan plaka okuyucu kullanarak oksijen tüketimini ölçtük. Bu yöntem sadece hızlı ve verimli olmakla kalmaz, aynı zamanda az miktarda mitokondri ile ve özel ekipmana ihtiyaç duymadan da gerçekleştirilebilir. Burada açıklanan adım adım protokol, mitokondriyal fonksiyonel değerlendirmenin araştırmacılar için erişilebilirliğini artırır.

Introduction

Mitokondri, ökaryotik hücrelerde bulunan yaklaşık bakteri büyüklüğünde organellerdir. DNA içerdikleri ve dış ve iç olmak üzere iki zara sahip oldukları için benzersiz organellerdir. Mitokondrinin dış ve iç zarları, zarlar arası bir boşlukla ayrılır ve iç zar, matris adı verilen en içteki bölmenin etrafında cristae adı verilen yapılara katlanır. Bu kristaller, iç zarın yüzey alanını arttırır, böylece kristali kullanan birden fazla işlem aynı anda gerçekleşebilir. Mitokondri, apoptozu kontrol etmek ve çoklu metabolik yolları barındırmak gibi birçok hücresel fonksiyonda yer alırken, ATP üretimindeki hayati rolleri hücrenin hayatta kalması için gereklidir. Aslında, bir hücrenin enerjisinin %90'ı mitokondri^1'den elde edilir. ATP üretimi, mitokondriyal zar potansiyeli (Δψ) olarak adlandırılan ve H⁺ iyonlarının matristen zarlar arası boşluğa pompalanmasıyla ortaya çıkan dış ve iç zarlar boyunca bir elektrokimyasal farkın oluşturulmasını içerir. ATP üretimi, nihai olarak, mitokondriyal solunum zinciri (ETC) boyunca elektron hareketi yoluyla indirgeyici eşdeğerlerin oksidasyonu sırasında kullanılır. Son elektron alıcısı moleküler oksijendir (O₂ ). Oksijen tüketildikçe, H⁺ konsantrasyon farkı maksimuma çıkar, bu noktada H⁺ iyonları, ATP sentaz kompleksinden geçerek konsantrasyon gradyanlarını zarlar arası boşluktan matrise doğru hareket ettirir. H⁺ iyonlarının hareketi, ATP sentazda konformasyonel bir değişikliğe neden olur ve ADP, reaksiyona girmek ve ATP oluşturmak için inorganik fosfat ile yakınlaştırılır. Son olarak, ATP, mitokondriyal matristen sitozole translokasyona yerleştirilir ve fosfatlarının hidrolizi sırasında açığa çıkan büyük miktarda serbest enerji nedeniyle reaksiyonları kolaylaştırmak için depolanabilir veya kullanılabilir. Tüm bu süreç oksidatif fosforilasyon olarak adlandırılır ve oksijen tüketildiği için mitokondrinin solunum yaptığı söylenir².

Δψ'nin birikmesi ve gücü, azaltılmış_O2 miktarı (oksijen tüketimi olarak adlandırılır) ve ATP oluşumunun tümü hücre sağlığının göstergeleri olarak kullanılabilir. Δψ ölçümü, toplam ATP içeriği ve üretimi ve oksijen tüketimi gibi mitokondriyal fonksiyonel çalışmalar, geleneksel biyokimyasal yöntemlerle veya plaka bazlı deneylerde floresan ve lüminesans ile ölçülebilir. Örneğin, mitokondriyal zar potansiyeli, spesifik olarak mitokondriye bağlanan tetrametilrodamin etil ester gibi floresan boyalar kullanılarak farklı numuneler arasında karşılaştırılabilir. ATP üretimi, değişiklikleri ATP konsantrasyonu ile ilişkili olan bir reaksiyona ışıldayan bir protein eklenerek izlenebilir. OXPHOS sırasında oksijen tüketim oranlarının veya mutlak solunum oranlarının ölçülmesi, mitokondriyal fonksiyon ve enerji metabolizmasındaki eşitsizliklerin nedenlerini aydınlatmaya yardımcı olabilir. Oksijen tüketimi değerlendirmesi, solunum kontrol oranlarını (RCR'ler) hesaplamak için kullanılabilir. RCR değerleri, mitokondrinin ana işlevi olan ADP akışına yanıt olarak mitokondrinin ATP yapma yeteneğini tanımlar. RCR değerleri, izole mitokondrinin genel durumunu gösterir ve farklı deneysel tedavilere verilen yanıtların karşılaştırılmasına izin verir. RCR değerlerindeki farklılıklar mitokondriyal disfonksiyonu temsil edebilir veya iki veya daha fazla kaynaktan izole edilen farklı mitokondriler arasındaki biyolojik bir farkı gösterebilir. İzole mitokondrideki bir diğer önemli fonksiyon ölçüsü,_O2'nin molleri başına sentezlenen ATP'nin molleri veya P/O oranı³ olarak tanımlanan mitokondriyal verimliliktir.

Mitokondriyal parametrelerin ölçülmesinden toplanabilecek bilgi miktarı ve bu bilgilerin kullanılabileceği çeşitli durumlar göz önüne alındığında, fonksiyonel verileri verimli bir şekilde toplama yeteneği birçok farklı araştırma alanında faydalı olabilir. Mitokondriyal oksijen tüketimi ölçümleri, ölçümleri gerçekleştirmek için gerekli numune boyutu ile sınırlandırılabilen bir Clark elektrodu ve daha yakın zamanda, mitokondriyal solunumu ve diğer birçok parametreyi ölçebilen sofistike aletler kullanılarak çok özel enstrümantasyonla onlarca yıldır gerçekleştirilmiştir. Bu protokol, oksijene duyarlı fosforlu prob (MitoXpress) kullanılarak uyarlanmış alternatif bir ^{yaklaşımdır4,5}. Prob sinyali, zaman içinde sürekli ölçümler için zamana bağlı floresan modunda bir plaka okuyucu ile algılanır. Fosforesans, floresansa kıyasla emilen ve yayılan foton arasında daha büyük bir enerji farkına sahiptir ve bu nedenle, sinyaldeki değişiklikleri sürekli olarak izlemek için daha uygundur. Bu, sadece mitokondriyal metabolizmaya odaklanan veya son derece özel ekipman sağlayabilen laboratuvarların değil, hemen hemen her laboratuvarın bu ölçümleri gerçekleştirmesini sağlar. Kullandığımız model sistem, üç ağaç kertenkelesi, iki ebeveyn türü ve bir içe geçmiş (bir ebeveyn türünden nükleer DNA ve diğerinden mitokondri içeren melezler) izole edilmiş mitokondridir. Bu kertenkeleler, farklı nükleer ve mitokondriyal DNA kaynaklarına sahip melezler için metabolik ve enerji sonuçları olduğunu varsaydığımız için seçildi. Bu tür tahlillere daha fazla araştırmacı ve araştırma alanına erişimi artırabilecek çok modlu bir plaka okuyucuya sahip ticari olarak temin edilebilen bir tahlil kiti kullandık.

Protocol

Kertenkeleler, CO₂ boğulması ile ötenazi yapıldı ve ardından Hayvan Laboratuvarı Refah Ofisi ve Elon'un Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi yönergeleri tarafından belirtilen politikalara uygun olarak derhal başlarının kesilmesi izledi.

1. Mitokondri izolasyonu⁶

NOT: Tüm çözeltileri soğuk tutun (Tablo 1) ve sampbu adımlar boyunca buz üzerinde.

1. Karaciğeri çıkarın, tartın ve ardından ~ 3 mL buz gibi soğuk fosfat tamponlu tuzlu su (1x, -/-) ile durulayın.
2. Karaciğeri taze bir tıraş bıçağıyla 1 mL L-MIB'de kıyın.
3. Toplam doku hacmini artı L-MIB'yi 2 mL'ye getirin ve bir Dounce homojenizatör ile karaciğer hücrelerini dört geçiş boyunca mekanik olarak parçalayın.
4. Homojenatı 300 × g'da (37 °C, 10 dakika) döndürün.
5. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve buzun üzerine yerleştirin.
6. Peleti 2 mL L-MIB içinde yeniden süspanse edin, yeniden homojenize edin ve 300 × g'da (37 °C, 10 dakika) tekrar döndürün.
7. Süpernatanları her iki spinden birleştirin ve 10.000 × g'da (37 °C, 10 dakika) santrifüjleyin.
8. Peleti ~ 0.350 mL L-MIB içinde yeniden süspanse edin.
9. Mitokondriyal içerik ^4,5,6 için yaklaşık olarak kullanılacak toplam protein miktarını (mg mitokondri / mL L-MIB) belirleyin.

2. Oksijen tüketimi

1. Kullanılan tüm solüsyonları (Tablo 1) aşağıdaki adımlarda bir su banyosunda 30 °C'ye kadar önceden ısıtın.
2. LEB'deki mitokondriyi, adım 1.9'daki protein konsantrasyonu testinin sonuçlarına dayanarak 6 mg / mL'ye seyreltin.
3. Tahlili steril 96 oyuklu siyah duvarlı, şeffaf alt plakaya yerleştirin (Tablo 2).
   1. Uygun kuyucuklara 50 μL numune (L-EB tamponu veya mitokondri numunesi) ekleyin.
   2. 50 μL tedavi ekleyin (L-EB, Glutamat / Malat veya Glutamat / Malat w / ADP).
   3. Prob stoğunu 1:10 oranında L-EB oranında seyreltin ve ardından her oyuğa 100 μL floresan prob ekleyin.
   4. Ortam oksijenini dışlamak için her kuyucuğa yavaşça 50 μL ağır mineral yağ ekleyin.
4. 45 dakika boyunca her 1,5 dakikada bir 380/650 nm uyarma/emisyonda plakanın altından floresan ölçümlerini okuyun. 30.000 μs'lik bir zaman gecikmesi ve 100 μs'lik bir ölçüm penceresi ile kinetik modu kullanın.

3. Veri analizi

1. Ham veri dosyasını plaka okuyucu bilgisayardan .xls dosyası olarak dışa aktarın.
2. Dosyayı açın, ardından ham verileri kopyalayıp yeni bir sekmeye yapıştırın ve satırları ve sütunları uygun şekilde etiketleyin.
3. L-EB tamponunu yalnızca kontrol numunesine ve L-EB + G/M'yi zamana karşı bağıl floresan birimler (RFU) olarak çizin.
   NOT: Mitokondri bulunmadığından bu çizgiler nispeten düz olmalıdır ve bu nedenle oksijen konsantrasyonunda herhangi bir değişiklik tespit edilmemelidir.
4. L-EB + G/M örnek değerlerini zamana karşı RFU olarak çizin.
5. Okumaların nerede daha tutarlı hale geldiğini belirleyin ve kontroller için düzleştirin.
   NOT: Deneysel numuneler için veri analizinin başlaması gereken yer burasıdır ( Şekil 1A'da oklarla işaretlenmiştir). Reaksiyonların düzleşmesi ve maksimuma ulaşması 10-15 dakika sürebilir.
6. Yalnızca adım 3.5'te belirlenen zaman noktasından ("kırpılmış" veriler olarak adlandırılır) sonraki verileri içeren yeni bir çizim oluşturun ve analiz edilecek ham verileri görselleştirmek için en uygun çizgiyi ekleyin.
7. Yalnızca kırpılmış kontrol arabelleği verilerinin (sarı renkle vurgulanmıştır) ortalama RFU değerini hesaplayın. Bu değer, aşağıdaki oksijen hesaplamasında temel olarak minimum RFU değeri olarak kullanılır.
8. Oksijen tüketim oranının hesaplanması (μM O₂/dak)
   1. ^Her 7,8,9,10 zaman noktasında G/M + ADP muamelesindeki mitokondriyal numunelerdeki oksijen konsantrasyonunu belirlemek için adım 3.6'daki ham verilerin doğrusal bölgesini (yani kırpılmış veriler) kopyalayıp yapıştırın.
   2. Her zaman noktasındaki oksijen konsantrasyonunu belirlemek için denklem (1)^5'i kullanın. [O₂]_a , havaya doymuş tampondaki oksijen konsantrasyonudur (30 °C'de 235 mM). I(t), Ia ve Io, numune + probun t zamanındaki floresan sinyalidir (örneğin, numune + G/M + ADP), adım 3.7'de hesaplanan havaya doymuş tampondaki probun ortalama sinyali ve oksijeni giderilmiş tampondaki maksimum sinyaldir (elde edilebilecek maksimum sinyale ayarlanmıştır), sırasıyla.
      (1)
   3. Adım 3.8.2'de _hesaplanan [O₂]t değerlerini zamana karşı çizin ve en uygun çizginin denklemiyle birlikte doğrusal bir eğilim çizgisi ekleyin.
      NOT: Oksijen tüketim oranı olarak her çizginin eğimini kullanın. Herhangi bir numune için kopyalar veya üçlüler toplanabilir ve tüketim oranının karşılaştırılması için kullanılabilir.
9. RCR'yi, sırasıyla 3 ve 2 durumlarını temsil eden ADP'li ve ADP'siz mitokondriyal solunumu bölerek hesaplayın.

Results

Oksijen tüketim oranı ve mitokondriyal RCR, fosforlu oksijen algılama probu ve standart bir floresan plaka okuyucusu olan bir tahlil kiti kullanılarak üç farklı kertenkelenin mitokondrisinden belirlendi. Önceki araştırmalar, bu kitteki probun, fosforesansın moleküler oksijen tarafından söndürüldüğü ve mitokondriyal solunum^nedeniyle oksijen seviyeleri azaldıkça floresan sinyalinin arttığı oksijen tüketimi ile doğrudan ilişkili olduğunu ortaya koymuştur ^7,11. RFU değerleri hem kontrol hem de deney numuneleri için zaman içinde kaydedilir ve daha sonra analiz edilir. Kontrol kuyucukları için RFU okumaları (yalnızca tampon, glutamat/malat ile muamele edilmiş tampon ve glutamat/malat + ADP ile muamele edilmiş tampon), deneysel numune kuyucuklarındaki floresanstaki herhangi bir değişikliğin mitokondri varlığından kaynaklandığını belirlemek için zamana karşı çizildi. Ayrıca, glutamat/malat + ADP kontrolü, veri toplama sırasında temel oksijen miktarına izin verir. İzole mitokondri içeren deneysel örnekler de kontrollerle aynı grafik üzerinde çizildi.

Şekil 1A , RFU'ların, kontrollerin nispeten düz RFU değerlerinin aksine, izole edilmiş bir mitokondri örneğinden zamanla arttığını göstermektedir. Reaksiyonların dengelenmesi zaman aldığından, kontrol numunesi okumaları o kadar gürültülü ve düz olmayana kadar ilk 10 veya daha fazla okuma veri setinden çıkarılır (Ek Tablo S1 ve Ek Şekil S1). Daha sonra, glutamat / malat + ADP ile muamele edilen mitokondri örneğinden kalan değerler, denklem (1) kullanılarak her zaman noktasında oksijen konsantrasyonuna dönüştürülür (protokol adımı 3.2'ye bakınız) ve daha sonra zamana karşı çizilir. Şekil 1B , Şekil 1A'da (çaprazlar) görülen ve^R2 değerinin 1'e çok yakın olduğu ve çizginin eğiminin hesaplanabildiği deneysel numunenin sonucunu göstermektedir. Çizginin eğimi negatiftir çünkü oksijen tüketildikçe o numunedeki toplam oksijen konsantrasyonu azalır. Aynı işlem, oksijen tüketim oranlarını elde etmek için ADP içermeyen glutamat/malat ile muamele edilen aynı mitokondriyal numuneler için tekrarlanır (Ek Tablo S2 ve Ek Şekil S2). Daha sonra, sırasıyla 3 ve 2 durumlarını temsil eden ADP'li ve ADP'siz mitokondriyal solunum, her bir numune tipi için RCR'yi hesaplamak için kullanılabilir (Ek Şekil S2). Yan yana karşılaştırıldığında ve üç farklı ağaç kertenkele türü arasındaki ortalama RCR, içe dönük mitokondriye sahip melezin RCR'sinin her iki ebeveyn türünden önemli ölçüde daha düşük olduğunu gösterir (Şekil 1C). Hibrit kertenkele mitokondri, iki ebeveyn tipine göre orta düzeyde oksijen tüketim oranlarına sahipti (Şekil 2).

Şekil 1: Örnek oksijen tüketimi tahlil sonuçları. (A) ADP ilavesi olsun veya olmasın, glutamat ve malat (G / M) ile tedavi edilen izole mitokondri dahil olmak üzere yalnızca tampon kontrol reaksiyonlarından ve reaksiyonlardan elde edilen ham veriler. Floresan zaman içinde izlendi. Oksijen tüketildikçe floresan artar. Yalnızca tampon reaksiyonları (dairelerle gösterilen G / M ve üçgenlerle gösterilen G / M + ADP) ve G / M muameleli mitokondri (karelerle gösterilir) hiçbir değişiklik göstermedi. G / M + ADP ile tedavi edilen mitokondri (artı işaretleri ile gösterilir) oksijen tüketti. (B) A'da sunulan G / M + ADP ile muamele edilen mitokondri için ham verilerden hesaplanan zaman içinde oksijen konsantrasyonundaki değişiklikler. (C) Oda sıcaklığında ölçülen üç farklı kertenkele türünden mitokondri için RCR değerleri. Bu figür Haenel ve Del Gaizo Moore^12'den alınmıştır. İstatistiksel analiz, R'deki ANOVA'lar kullanılarak yapıldı. Kısaltmalar: G = glutamat; M = malat; RCR = solunum kontrol oranı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Üç tür kertenkeleden mitokondrinin oksijen tüketim oranları. Kutu çizimleri, medyan oksijen tüketim oranlarını bir çubuk olarak ve ortalamaları bir nokta olarak gösterir. Ebeveyn tipleri, Urosaurus graciosus ve Urosaurus ornatus, birbirlerinden önemli ölçüde farklıydı. İçe çevrilmiş form (Hibrit), ebeveyn tipleri için orta düzeydeydi ve her ikisinden de önemli ölçüde farklı değildi. Bu figür Haenel ve Del Gaizo Moore^12'den alınmıştır. Kısaltmalar: Ug= Urosaurus graciosus; Uo = Urosaurus ornatus. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Protokolde kullanılan çözeltilerin bileşimi. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: Oksijen tüketimi tahlili için plaka haritası. Her numune için en az 6 kuyucuk ayırın (3 kontrol kuyusu: sadece L-EB, G/M muameleli L-EB, G/M + ADP muameleli L-EB; 3 deneysel kuyu/numune: L-EB muameleli mitokondri, L-EB + G/M ve L-EB G/M +ADP muamelesi). Mümkün olduğunda, her deneysel örneği iki veya üç kopya halinde çalıştırın. Kısaltmalar: G = glutamat; M = malat; L-EB = kertenkeleye özgü deneysel tampon. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S1: Veri grafikleri. (A) Numunelerin ve kontrollerin karşılaştırılması için tüm ham verilerin çizimi. (B) Ek Tablo S1'de vurgulanan sütunlardan alınan çerçeveli ham verilerin grafiği, yalnızca mitokondri örneklerini içeren kuyucukların RFU'larda kayda değer bir artışa sahip olduğunu göstermektedir. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil S2: Oksijen tüketimi ve solunum kontrol oranları. (A) En uygun hatların denklemlerini bularak Durum 2 ve Durum 3 değerlerini belirlemek için Ek Tablo S1'den oksijen tüketimi verilerinin grafiği. (B) Durum 2 ve Durum 3'ü temsil eden (A)'daki çizgilerin eğimleri kullanılarak RCR oranı hesaplaması. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo S1: Ham verilerin temsili örneği. Vurgulanan sütunlar, şekiller ve hesaplamalar için kullanılan verilerdir (yani, kırpılmış veriler). Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo S2: Kırpılmış verilerin ve sonraki oksijen tüketimi hesaplamalarının temsili örneği. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Mitokondriyal fonksiyonun ölçülmesi, hastalıklı ve hastalıksız durumlar, aynı hayvandan alınan farklı doku tipleri veya farklı numune türleri gibi farklı numuneleri karşılaştırırken yararlıdır. Daha sonraki karşılaştırmayı, mitokondriye sahip melez ağaç kertenkelelerinin metabolik bir sonucu olduğu hipotezimizi test etmek için kullandık. Mitokondri fonksiyonunu deneysel olarak tespit etmenin, Δψ'nin miktarının belirlenmesi, toplam ATP içeriği, ATP üretimi ve solunum kontrolü ve oksijen tüketim hızı dahil olmak üzere çeşitli yolları vardır. İzole edilmiş mitokondrinin oksijen tüketimi ölçümleri, Clark elektrodu veya daha sofistike Denizatı XF'leri gibi özel ekipmanlarla gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, bu yöntemler, ölçümleri gerçekleştirmek için gerekli olan örneklem boyutu ile sınırlayıcı veya maliyet engelleyici olabilir. Floresan okuyabilen çok modlu plaka okuyucular, hücre biyolojisi ve biyokimya laboratuvarlarında standart bir ekipman parçası haline gelmiştir. Bu nedenle, mitokondriyal oksijen tüketimini kantitatif olarak analiz etmek için alternatif bir yaklaşım, floresan plaka okuyuculu ticari olarak temin edilebilen bir kit kullanmaktır. Bu adım adım protokol, oksijen tüketiminin nasıl ölçüleceğini ve hesaplamaların nasıl yapılacağını açıklar. ve ekonomik olarak izole mitokondride. Durum 3 solunumu olarak adlandırılan ADP ile beslendiğinde mitokondrinin ATP yapma yeteneğinin hassas bir şekilde ölçülmesi, numuneler arasında OXPHOS'un doğrudan karşılaştırılmasına izin verir ve farklılıklar fonksiyonel eşitsizlikleri gösterebilir. Ayrıca, Durum 3 solunumu aynı zamanda izole edilen mitokondrinin kalitesini de gösterir, bu da bir izolasyon prosedürünün işe yarayıp yaramadığını ve / veya numunenin diğer tahlillerde kullanılmak üzere yeterince iyi olup olmadığını belirleyebilir. Durum 2 (Δψ oluşturmak için yalnızca glutamat ve malat) ve Durum 3 değerleri (Δψ'nin ATP üretimi için kullanılmasına izin vermek için glutamat ve malat artı ADP) kullanılarak hesaplanan RCR değerleri, karşılaştırma ve izole mitokondrinin sağlığı hakkında başka bir bilgi parçası verir. Sunulan veriler, bu belgede sunulan yöntemin, farklı numune türleri arasındaki varyasyonların deşifre edilmesine ve son derece özel ekipmanlara ihtiyaç duymadan oksijen tüketim oranlarının ve RCR değerlerinin ölçülmesine yardımcı olabileceğini ve böylece bu tür ölçümleri daha erişilebilir hale getirebileceğini göstermektedir.

Bu protokolde, kertenkelelerden yeni izole edilmiş mitokondri ve oksijen tüketimi, üreticinin protokolüne uygun olarak bir MitoXpress Xtra Hs testi kullanılarak belirlendi ve Hynes ve ^ark.4 ve Will ve ^ark.5'e göre modifiye edildi Kertenkeleler, ortalama 0.170 g karaciğer dokusu/kertenkele ile toplam vücut kütlesinde 3.3 g ile 5.1 g arasında değişmiştir. bu ~ 0.350 mL konsantre, ham mitokondri verdi. İzole edilen mitokondri, 6 mg / mL proteinde oksijen tüketimi testinde kullanıldı. Protokol adımı 1.7'de belirlendiği gibi mitokondriyal protein konsantrasyonu düşükse, numune 10.000 × g'da yeniden döndürülebilir ve pelet daha küçük bir L-MIB hacminde yeniden süspanse edilebilir. Ayrıca, küçük karaciğer örnekleri için veya karaciğerin tamamının mevcut olmadığı durumlarda 4 mg / mL kadar az bir miktarı başarıyla kullandığımıza da dikkat edilmelidir.

Tahlilin başlangıcında numunelerin gaz ve sıcaklık dengesini sağlamak için, protokol bölüm 2'de kullanılan tüm çözeltiler bir su banyosunda 30 °C'ye kadar önceden ısıtılmalıdır. Protokol bölüm 3'te, çözünmüş oksijenin değişim oranları (mM/dk), her bir numune için azalan oksijen konsantrasyonu profillerinin başlangıç eğimlerinden tahmin edilmektedir (protokol adımı 3.3; Ek Tablo S1 ve Ek Şekil S1). Numune + G/M tedavi oranları Durum 2 mitokondriyal solunumu temsil ederken, G/M + ADP tedavi oranlarına sahip numune Durum 3 mitokondriyal solunumu temsil eder. Bu nedenle, RCR'ler, her numune için durum 3 değerlerinin durum 2 değerlerine bölünmesiyle her numune için hesaplanır (Ek Tablo S2).

Oksijen tüketimi, burada gösterildiği gibi benzersiz numuneler arasında veya tek bir numunedeki farklı işlemler arasında karşılaştırılabilir. İkinci durumda, kimyasal işlemin kendisinin fosforlu prob ile etkileşime girmeme olasılığını dışlamak için yalnızca mitokondrili ve mitokondrisiz araç kontrolü gibi ek kontroller gerekli olabilir. Ayrıca, toplanan oksijen tüketimi ve RCR verileri, diğer tahlillerle aynı numunelerden toplanan verilerle birlikte kullanılabilir. Mitokondri izole edildikten sonra, işlevlerinin daha eksiksiz bir resmini sağlamak için birden fazla tahlilde kullanılabilirler¹². Δψ, toplam ATP içeriği ve ATP devir hızının ölçümü, birleştirilen tahlillerden bazılarıdır. Ayrıca, tahlillerle birlikte ETC, OXPHOS ve ATP sentaz inhibitörlerinin kullanılması, farklı mitokondriyal numune tiplerinin daha da eksiksiz bir şekilde anlaşılmasını sağlayarak üretilen verilerden çıkarılan sonuçları güçlendirir.

İzole mitokondride ölçülebilen bir diğer parametre, O₂³ mol başına sentezlenen ATP mollerinin P/O oranı olarak tanımlanan mitokondriyal verimliliktir. P / O oranları, bu protokolün bir uzantısında, Durum 3 mitokondrinin reaksiyonda sağlanan ADP'yi tüketmesine izin vererek ve daha sonra bir ADP substratı alikotu ekleyerek ve ardından oligomisin ilavesiyle ATP sentazın inhibisyonu ile hesaplanabilir. Bu ek adımlar, mitokondri oksijen tüketmeye devam ettiğinde ve maksimum ATP yapmak için güçlü bir Δψ'yi koruduğunda meydana gelen Durum 4'ün hesaplanmasına izin verir, mitokondrinin sızıntısı hakkında bilgi sağlar (eğer H⁺ iyonları ATP sentaz kullanılmadan matrise geri geçiyorsa ve bu nedenle Δψ'yi dağıtıyorsa), sonuçta mitokondri disfonksiyonunu gösterir. Ayrıca, Durum 4 ölçümleri, yeni oluşan ATP'yi matristen hareket ettirirken aynı zamanda ADP substratını içeri getiren ADP/ATP translokatörünün işlevsel olup olmadığını ve zarlar boyunca herhangi bir ADP ve ATP sızıntısının meydana gelip gelmediğini de ortaya çıkarabilir. ATP sentazı inhibe eden oligomisin ilavesi, gerçek işlev bozukluğu nedeniyle mitokondrinin sızdırıp sızdırmadığını belirlemek için bir kontroldür. P/O oranının hesaplanabilmesi için Durum 4'ün ölçülmesi, üç mitokondriyal numune tipi arasında karşılaştırma yapmak için aradığımız bilgilerin kapsamı dışında olsa da, mitokondriyal fonksiyonla ilgili başka bir veri parçasıdır ve bu protokolün bir uzantısı olarak yapılabilir. Son olarak, mitokondrinin kültürdeki hücrelerden ve diğerlerinin yanı sıra bir fare veya sıçandan (örneğin karaciğer, kalp, omurilik) farklı dokulardan izole edilebileceğini belirtmekte fayda var. MIB ve EB formülasyonlarının yanı sıra izolasyon protokollerinde ayarlamalar gerekli olabilir 4,13,14,15,16. Ayrıca, üreticinin talimatlarına göre, bu test bütün, sağlam hücrelerle gerçekleştirilebilir. Bu nedenle, sunulan yöntem kertenkeleler veya karaciğer mitokondrileri ile sınırlı değildir ve birçok farklı bilimsel alt disiplinde geniş bir deneysel model dizisine uygun olmasını sağlar.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 oyuklu siyah/optik alt plakalar	Thermo Fisher	265301	Şeffaf tabanlı, işlenmemiş siyah duvar plakaları.
ADP	Sigma	A2754	Seyreltik 100 ve mikro; Kullanmadan hemen önce EB ile M stoğu.
BSA	Thermo Fisher	BP1600-100	Protein tahlili için suda 2 mg / mL stok yapın.
Dulbeccos 1x PBS (-/-)	Sigma	D8537	PBS'nin Mg2+ veya Ca2+ iyonları içermediğinden emin olun.
EGTA	Sigma	E3889
K2HPO4	Sigma	P3786
KH2PO4	Sigma	P0662
L-glutamik asit	Sigma	G1251
L-glutamik asit potasyum tuzu	Sigma	S372226
L-malik asit	Sigma	M8304
L-malik asit mono-potasyum tuzu	Sigma	49601
MitoXpress oksijen tüketim kiti	Agilent	MX-200-4	Kiti, prob stoğu ve HS mineral yağ içerir.
MOPS	Sigma	M3183
Protien Test Boyası (5x)	BioRad	500-0006	Herhangi bir protein tahlili ikame edebilir.
R sürüm 3.3	R Core Geliştirme Ekibi 2016
Thermomax mikroplaka okuyucu EnSpire Çok Modlu Plaka okuyucu ve yazılım	PerkinElmer		Standart floresan plaka okuyucu
Trisma tabanı	Sigma	T6066	Tris tabanının herhangi bir versiyonu kullanılabilir.