Method Article

Nükleik Asit Oranlarının Hızlı Araştırılması için Optimize Edilmiş Bir Fare Embriyonik Kök Hücre Tabanlı Ters Poli-Transfeksiyon Tekniği

DOI:

10.3791/65766

⸱

December 8th, 2023

 ,  ,  , 
1School of Biomedical Engineering, University of British Columbia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, 2i ve LIF ortamı ile kültür sırasında fare embriyonik kök hücrelerinin ters poli-transfeksiyonu için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yöntem, geleneksel ileri transfeksiyon protokollerinden daha yüksek canlılık ve verimlilik sağlarken, aynı zamanda plazmit oranlarının tek kap optimizasyonunu da sağlar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Göreceli basitliği ve kullanım kolaylığı nedeniyle, memeli hücre hatlarının nükleik asitlerle geçici transfeksiyonu, biyomedikal araştırmalarda bir dayanak noktası haline gelmiştir. Yaygın olarak kullanılan hücre hatlarının çoğu, yapışık iki boyutlu kültürde transfeksiyon için sağlam protokollere sahip olsa da, bu protokoller genellikle daha az çalışılmış hatlara veya atipik, transfekte edilmesi zor morfolojilere sahip olanlara iyi tercüme edilmez. Rejeneratif tıp için yaygın olarak kullanılan bir kültür modeli olan 2i/LIF ortamında büyütülen fare pluripotent kök hücrelerini kullanan bu yöntem, daha yüksek transfeksiyon verimliliği elde edebilen optimize edilmiş, hızlı bir ters transfeksiyon protokolünü ana hatlarıyla belirtir. Bu protokolden yararlanarak, genişletilmiş bir plazmit stokiyometri aralığını incelemek için plazmit dağıtımındaki normalden daha yüksek verimlilikten yararlanılarak üç plazmit poli-transfeksiyonu gerçekleştirilir. Bu ters poli-transfeksiyon protokolü, kullanıcıların plazmit oranlarını birkaç ko-transfeksiyon yerine tek bir kuyuda optimize etmelerini sağlayan tek kap deneysel bir yönteme izin verir. DNA stokiyometrisinin iletilen genetik devrelerin genel işlevi üzerindeki etkisinin hızlı bir şekilde araştırılmasını kolaylaştırarak, bu protokol embriyonik kök hücre transfeksiyonunun süresini ve maliyetini en aza indirir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DNA ve RNA'nın memeli hücrelerine verilmesi, biyomedikal araştırmaların temel direği olarak hizmet eder1. Ekzojen nükleik asitleri (NA) memeli hücrelerine sokmak için yaygın bir yöntem, geçici transfeksiyon 2,3'tür. Bu teknik, NA'nın alıcı hücrelere iletebilen ticari olarak temin edilebilen transfeksiyon reaktifleri ile karıştırılmasına dayanır. Tipik olarak, NA, iki boyutlu bir yüzeye yapışan hücrelerin transfeksiyon kompleksini aldığı ileri transfeksiyon yoluyla iletilir. En yaygın olarak kurulan hücre hatları için ileri transfeksiyon sağlam ve protokoller iyi ya....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. mPSC kültürü için reaktiflerin hazırlanması

  1. N2 takviyesi hazırlayın.
    1. Steril olmayan koşullarda, bir kimyasal güvenlik çeker ocakta aşağıdaki stok çözeltilerini (adım 1.1.1.1) hazırlayın. Her kimyasalın katı tozunu önceden tartılmış 50 mL'lik bir konik tüpe ekleyin. Tozu ekledikten sonra her bir tüpü tartın ve aşağıdaki konsantrasyonları elde etmek için uygun miktarda çözücü ekleyin. Bir parti medya için, listelenen minimum miktarı hazırlayın.
      NOT: Aşağıdaki reaktifler tehlikelidir ve yerel kimyasal güvenlik yönergelerine uygun olarak kullanılmalıdır. Kullanım sırasında uygun KKD'yi sağlayın ve solunmasını önlemek için yalnızca b....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hem ileri hem de geri transfeksiyonlar, hücre zarı ile gelen transfeksiyon reaktifi-DNA kompleksleri arasındaki etkileşime dayanır ve NA'nın alıcı hücrelere iletilmesine izin verir. Bu tekniklerin farklı olduğu yer, hücrenin doğumdaki durumudur - DNA tipik olarak geleneksel ileri transfeksiyonda yapışık hücre tek katmanlarına iletilirken, ters transfeksiyon bunun yerine reaktif-DNA kompleksinin tek hücreli bir süspansiyon içindeyken hücrelerle buluşmasına dayanır. Bu fark, hücrelerin tekdüze, düz bir tek tabaka olarak bü.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transfeksiyon protokollerinin yaygın olarak benimsenmesinin temel nedeni, tekrarlanabilirlikleri ve erişilebilirlikleridir; Ancak, bu protokoller deneysel bağlamlarda optimizasyon gerektirir. Yukarıda bahsedilmeyen, yeni bir hücre hattını ilk kez kesmeye çalışırken gerekli olan standart testtir. İlk olarak, transfeksiyon reaktifi seçimi çok önemlidir, çünkü ticari olarak temin edilebilen reaktifler herkese uyan tek bir beden değildir ve hücre tipleri arasında NA iletim canlılığının verimliliğinde değişiklik gösterecektir.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması bildirmemiştir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, alan sınırlamaları nedeniyle bu çalışmada atıfta bulunulmayan alana yapılan birçok katkının yanı sıra bu fırsatı sağlayan finansman kuruluşlarına da teşekkür etmek istemektedir. Yazarlar, bu çalışmayı destekleyen Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) ve Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri'nden (CIHR) fon aldığını kabul etmektedir. K.M., NSERC'den CGS-M bursu ve British Columbia Üniversitesi'nden Killam Doktora Bursu almıştır. N.S., Michael Smith Health Research BC Scholar Ödülü'nün sahibidir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Accutase MilliporeSigmaSCR005
Apotransferrin MilliporeSigmaT1147-500MG
B27 takviyesi ThermoFisher Bilimsel 
Beta-merkaptoetanolThermoFisher Scientific 
BSA fraksiyonu V (% 7.5)Gibco15260-037
CHIR99021 MilliporeSigmaSML1046-25MG
DMEM-F12MilliporeSigmaD6421-24X500ML
Akış sitometrisi standardizasyon boncuklarıSpherotechURCP-38-2K
Jelatin ve nbsp;MilliporeSigmaG1890
GlutaMAX takviyesi ThermoFisher Bilimsel 
İnsülin Gibco12585-0014
Lipofiktamin 2000 Invitrogen11668-019Transfeksiyon reaktifi
Nörobazal medyaThermoFisher Scientific 
OptiMEM Invitrogen31985-070
PD0325901 MilliporeSigmaPZ0162-25MG
ProgesteronMilliporeSigmaP8783Kimyasal tehlike - yerel güvenlik yönergelerine danışın, uygun KKD'nin giyildiğinden emin olun ve katı toz formuyla yalnızca kimyasal davlumbazda çalışın
PutrescineMilliporeSigmaP6780Kimyasal tehlike - yerel güvenlik yönergelerine danışın, uygun KKD'nin giyildiğinden emin olun ve katı toz formuyla yalnızca kimyasal davlumbazda çalışın
Rekombinant mLIF BioTechne8878-LF-500 / CF
Sodyum selenit ve nbsp;MilliporeSigmaS5261-25GKimyasal tehlike - yerel güvenlik yönergelerine danışın, uygun KKD'nin giyildiğinden emin olun ve katı toz formuyla yalnızca kimyasal davlumbazda çalışın
Trypsin-EDTAThermoFisher Scientific 
1750404421985023350500612110304925200056

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
  2. Fus-Kujawa, A., et al. An overvie....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Reverse Poly TransfectionMouse Embryonic Stem CellsNucleic Acid RatiosPlasmid DeliveryTransient TransfectionGene DosageFlow CytometryPluripotent Stem CellsDNA StoichiometryLipofectamine Transfection

Related Articles