Yöntem makalesi

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Türetilen Hepatositleri Saflaştırmak İçin Hücre Sıralamasında Canlı Mitokondri Boyamanın Uygulanması

DOI:

10.3791/65777

⸱

1 Aralık 2023

 , 
1Innovative Regenerative Medicine, Graduate School of Medicine, Kansai Medical University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pluripotent kök hücrelerden türetilen hepatositler, mitokondriyal ve aktive edilmiş lökosit hücre adezyon molekülünün (CD166 olarak da bilinen ALCAM) bir kombinasyonu kullanılarak hücre sıralama yoluyla saflaştırılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan embriyonik kök (ES) ve indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücreleri, sınırsız çoğalmaları ve pluripotent özellikleri nedeniyle ciddi şekilde hastalıklı organları tedavi etmek için hücre bazlı rejeneratif tıpta potansiyel uygulamalara sahiptir. Bununla birlikte, insan ES/iPS hücrelerini %100 saf hedef hücre tiplerine ayırmak, çevreye karşı yüksek hassasiyetleri nedeniyle zordur. Transplantasyondan sonra tümörijenez, kontamine olmuş, çoğalan ve farklılaşmamış hücrelerden kaynaklanır ve bu da rejeneratif tıbbın güvenli bir şekilde gerçekleştirilmesi için yüksek saflaştırma teknolojisini gerekli kılar. Tümör oluşumu riskini azaltmak için, insan iPS hücresinden türetilen hepatositler için yüksek saflaştırma teknolojisi geliştirilmiştir. Yöntem, genetik modifikasyon olmadan yüksek mitokondriyal içerik ve hücre yüzeyi işaretleyicisi ALCAM'ın (aktive edilmiş lökosit hücre adezyon molekülü) bir kombinasyonunu kullanarak FACS (floresanla aktive edilen hücre sıralama) kullanır. Bu yöntem kullanılarak saflaştırılan hepatositlerin %97 ± %0.38'i (n=5) albümin protein ekspresyonu sergilemiştir. Bu makale, insan iPS hücreleri için hepatositlere en güncel iki boyutlu farklılaşma yöntemine uygulandığı gibi, bu yöntem için ayrıntılı prosedürler sağlamayı amaçlamaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embriyonik ve indüklenmiş pluripotent kök hücreler (sırasıyla ES ve iPS), rejeneratif tedaviler için umut verici hücre kaynakları olarak kabul edilir. Bununla birlikte, bu hücreleri belirli hedef hücre tiplerine ayırmanın verimliliği, aynı hücre hattını, protokolü ve deneyci 1,2,3,4 kullanıldığında bile değişebilir. Bu değişkenlik, insan ES/iPS hücrelerinin çevrelerine karşı yüksek hassasiyetine bağlanabilir. Bu nedenle, şu anda tutarlı bir şekilde saf hedef hücreler elde etmek zordur. Son derece güvenli rejeneratif tıp elde etmek için, terapötik hücrelerde proliferatif hücreleri ve farklılaşmamış kök hücreleri ortadan kaldırmak çok önemlidir ve hedef hücreler için gelişmiş saflaştırma teknolojisi esastır 5,6,7.

Hücre sıralayıcı, tek tek hücreleri anında analiz eden ve floresan sinyal güçlerine dayalı olarak ilgilenilen canlı hücreleri sıralayan ve umut verici bir çözüm sunan bir cihazdır. Bu, hücre tipine özgü yüzey belirteçlerinin antikor boyaması yoluyla veya hücre tipine özgü raportör gen ekspresyonları kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu tekniği kullanarak, pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler 8,9,10 ve hepatositler 11,12'nin saflaştırılması yöntemleri hakkında birkaç rapor vardır. Hattori ve ark. bir hücre sıralayıcı13 kullanarak yenilikçi bir mitokondriyal saflaştırma yöntemi geliştirdi. Kardiyomiyositlerin mitokondriyal aktivite yoluyla yüksek enerji taleplerine sahip olduğu gerçeğinden yararlanarak, hücrelerin canlı mitokondri gösterge boyası TMRM (tetrametilrodamin metil ester) ile boyanması, çeşitli hücre tipleri içeren insan ES hücresinden türetilmiş embriyoid cisimlerinden FACS ile kardiyomiyositleri etiketlemek ve yüksek oranda saflaştırmak için kullanılabilir. Tümörjenitenin yokluğu, saflaştırılmış kardiyomiyositlerle teratom oluşum testleri ile doğrulandı. Ayrıca, Yamashita ve ark. beklenmedik bir şekilde, yüksek mitokondriyal aktiviteye ve ALCAM pozitif ekspresyona sahip fraksiyonları izole ederek insan ES hücresinden türetilmiş embriyoid cisimlerinden hepatositleri saflaştırmak için bir yöntem keşfettiler14. Bu yöntemin mantığı, hepatositlerin besin metabolizması ve detoksifikasyon için yüksek ATP tüketimleri nedeniyle nispeten yüksek sayıda mitokondriye sahip olmaları15 ve hepatositlerin, hücre yapışması ve göçünde rol oynayan immünoglobulin süper ailesinin bir üyesi olan ALCAM'ı eksprese etmesidir16.

Pluripotent kök hücre türevli hepatositler için önceki yüksek saflaştırma yöntemleri genetik modifikasyonlar gerektiriyordu ve genetik olmayan saflaştırma yöntemleri düşük verimliliğe sahipti17. Mitokondriyal genetik olmayan yöntem, yüksek saflık elde etmek için değer taşır. Hepatik progenitör hücrelere ihtiyaç duyulduğunda CD133 ve CD13 veya Dlk1 tabanlı yöntemler18,19 seçilebilir. Genom düzenleme teknolojisinin doğruluğu ilerlemiş olsa da, öngörülemeyen genomik değişikliklerin (örneğin, karsinogenez) potansiyel riski tamamen ortadan kaldırılamaz. Genetik modifikasyon içermeden mitokondriyal aktiviteye dayalı yöntemler bu tür risklerden muaf olabilir.

Yenidoğan sıçan kardiyomiyositlerinde çeşitli mitokondriyal indikatörlerin incelenmesi sonucunda, TMRM'nin 24 saat içinde tamamen kaybolduğu, diğer boyaların ise en az 5 gün kaldığı gözlenmiştir13. Ayrıca, TMRM ve JC-1'in 3- (4,5-dimetil-tiyazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) testi ile değerlendirildiğinde hücre canlılığını etkilemediğini, diğer boyaların ise hücre canlılığı üzerinde farklı etkiler gösterdiğini belirtmek önemlidir13. TMRM daha yüksek güvenlik gösterir.

Bugüne kadar, üç boyutlu (3D) embriyoid cisim oluşumuna kıyasla farklılaşmayı indüklemek için daha etkili yaklaşımlar olarak birkaç iki boyutlu (2D) farklılaşma yöntemi geliştirilmiştir. Bunun nedeni, kademeli farklılaşmayı indükleyen bileşiklerin veya sitokinlerin, hücrelere 3 boyutlu bir alanda değil, 2 boyutlu bir düzlemde eşit şekilde uygulanabilmesidir. Bu çalışmada, daha önce bildirilen yöntem20 , insan iPS hücresinden türetilmiş hepatositlere farklılaşmayı indüklemek için modifiye edilmiştir. Burada, insan iPS hücrelerinden türetilen hepatositlerin güncel 2D farklılaşması ve saflaştırılması için prosedürlerin ayrıntıları açıklanmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada ticari olarak elde edilen insan iPS hücreleri (253G1 suşu) kullanılmıştır (bkz.

1. İnsan iPS hücrelerinin bakımı

  1. İnsan iPS hücrelerini, 0,25 μg/cm2 iMatrix-511 ile kaplanmış kültür kaplarında AK02 ortamında besleyici içermeyen koşullarda tutun (bkz.

2. 2D kültürlerde insan iPS hücrelerinin hepatik farklılaşması

NOT: Günlük karaciğer farklılaşması programı için Şekil 1A'ya bakın. İşlem boyunca, 6 oyuklu kültür plakaları kullanın ve her bir oyuğa 2 mL belirtilen yıkama veya kültür ortamı ekleyin. Hücre kültürü durumunu 37 °C'de %100 nem, %5 CO2 ve %20 O2'de koruyun.

  1. 6 oyuklu bir plakanın her bir kuyusunu 1 mL bazal membran matrisi (PBS (-) içinde 1/25 seyreltilmiş) ile kaplayın ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin.
  2. İnsan iPS hücrelerini, 10 μM ROCK inhibitörü (Y-27632) ile desteklenmiş AK02N ortamı kullanarak 20.000-30.000 hücre/cm² yoğunlukta kaplanmış tabağa geçirin (bkz. Ertesi gün ortamı Y-27632 olmadan değiştirin ve 2 gün daha kültürleyin.
  3. Hücreleri RPMI-1640 ortamı ile bir kez yıkayın. Ortamı RPMI-B27-Glu (RPMI-1640 +% 2 B27 İnsülin +% 1 Dipeptid L-Alanil-L-Glutamin) ile değiştirerek endoderm farklılaşmasını başlatın 3-6 μM CHIR-99021 ve 24 saat boyunca 100 ng / mL Aktivin A (bkz.
  4. Ortamı 24 saat boyunca 50 ng/mL Aktivin A ile desteklenmiş RPMI-B27-Glu ile değiştirin.
  5. Hepatik progenitör farklılaşmasını indüklemek için, ortamı 5 gün boyunca% 1 dimetil sülfoksit (DMSO) ile desteklenmiş RPMI-B27-Glu ile değiştirin.
  6. Hepatosit olgunlaşmasını teşvik etmek için, hepatosit olgunlaşma ortamına geçin: 10 μM hidrokortizon 21-hemisüksinat,% 8.3 triptoz fosfat suyu, 100 nM deksametazon (DEX), 50 μg / mL sodyum-L-askorbat,% 0.58 insülin-transferrin-selenyum (ITS),% 8.3 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM Dipeptid L-Alanil-L-Glutamin ve 100 nM N-Hekzanoik-Try-Ile-(6)-amino Heksanoik amid (Dihexa) (bkz.
  7. Ortamı 20 gün boyunca her 2 günde bir değiştirin. Farklılaşmaya başladıktan yaklaşık 27 gün sonra hücreleri sıralayın.

3. İnsan iPS hücrelerinden türetilen hepatositlerin saflaştırılması için hücre hazırlığı

  1. Hepatik farklılaşmış hücreleri kuyucuk başına 2 mL PBS (-) ile yıkayın.
  2. Ads tamponunda %0.1 kollajenaz, %0.083 tripsin, 10 μM ROCK inhibitörü (Y-27632), 20 nM siklosporin A ve 50 μg/mL sodyum-L-askorbat içeren kuyucuk başına 1 mL enzim çözeltisi ekleyin (116 mM NaCl, 12.5 mM NaH2PO4, 20 mM HEPES, 5.4 mM KCl, 5.6 mM glikoz ve 0.8 mM MgSO4; pH 7.35) (bkz. Yaklaşık 2 saat boyunca 37 ° C'de yatay olarak döndürerek hücreleri plakalardan ayırın.
  3. Hücrelerin mikroskop altında ayrıldığını ve yuvarlandığını onayladıktan sonra, bunları hafif pipetleme ile tek hücrelere dağıtın ve 50 mL'lik bir tüpte toplayın.
  4. Hücreleri pelet yapmak için 18 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Bir aspiratör kullanarak süpernatanı çıkarın.
  5. Hücrelerin mitokondrilerini, 100 nM TMRM (tetrametilrodamin, methl ester) içeren 5 mL hepatosit olgunlaşma ortamında dağıtarak boyayın (bkz. Malzeme Tablosu). Alüminyum folyoya sararak ışıktan koruyarak 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  6. Hücreleri pelet yapmak için 18 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın.
  7. Hücreleri% 2 FBS içeren 1-5 mL soğuk Ads tamponu ile yeniden süspanse edin.
  8. % 0.4 Tripan mavisi çözeltisi ve bir hücre sayım plakası kullanarak hücre sayısını sayın.
  9. Hücreleri pelet yapmak için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın.
  10. Bir anti-ALCAM antikorunu (birincil antikor, Malzeme Tablosuna bakınız) Ads tamponunda 1:50 oranında seyreltin ve 106 hücre başına 100 μL seyreltilmiş antikor ekleyin. Hücreleri buz üzerinde 50 dakika boyayın. Negatif kontrol olarak birincil antikor ile boyanmamış hücreleri hazırlayın.
  11. Hücreleri iki kez% 2 FBS içeren soğuk Ads tamponu ile yıkayın.
  12. Bir Alexa Fluor 488 eşek anti-keçi IgG'yi (ikincil antikor, Malzeme Tablosuna bakınız) Ads tamponunda 1:100 oranında seyreltin ve 106 hücre başına 100 μL seyreltilmiş antikor ekleyin. Hücreleri buz üzerinde 30 dakika boyayın. İkincil antikoru kullanarak birincil antikorla boyanmamış hücreleri boyayın.
  13. Hücreleri iki kez% 2 FBS içeren soğuk Ads tamponu ile yıkayın.
  14. Ads arabelleğindeki hücreleri yeniden askıya alın ve büyük hücre kümelerini ve kalıntıları gidermek için FACS'ye göre sıralamadan hemen önce bir geçmeli kapaklı hücre süzgecinden (35 μm ağ) süzün.

4. İnsan iPS hücrelerinden türetilen hepatositlerin FACS analizleri ve sınıflandırılması

  1. Üreticinin talimatlarını izleyerek hücre sıralama için FACS makinesini ayarlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
    NOT: Hepatositler için 85 μm veya 100 μm meme boyutu ve 2.0 ND filtresi kullanın. ALCAM için Alexa Flour 488'i algılamak için FITC kanalını ve mitokondri için TMRM floresansını algılamak için PE kanalını kullanın.
  2. Hücre popülasyonunu düzgün bir şekilde görselleştirmek için FSC (ileri saçılma) ve SSC (yan saçılma) voltajlarını ayarlayın.
  3. FITC ve PE floresan kanallarının voltajlarını ayarlayın. Etiketlenmemiş hücrelerle başlayın ve hücre popülasyonunu her kanal grafiğinin altında ortalayın. Etiketli hücrelerin çizim içinde uygun şekilde konumlandırıldığından emin olun.
  4. İkilileri ortadan kaldırmak için ortak bir geçit stratejisi kullanın: Büyük FSC-A'yı geçit vs. SSC-A popülasyonu (Şekil 2A), ardından FSC-H vs. -W ve ardından SSC-H ile karşılaştırılır. -W (Şekil 2B,C).
  5. Hepatositleri sıralamak için TMRMhi ve ALCAM + popülasyonunu ( Şekil 2E'de P2) kapılayın. Hepatosit olmayanları sıralamak için TMRMhi ve ALCAM popülasyonunu ( Şekil 2E'de P1) kapılayın. Sıralanmış hepatositleri ve hepatosit olmayanları, hepatosit olgunlaşma ortamı içeren 15 mL'lik toplama tüplerinde toplayın.
  6. Sıralanmış hücreleri içeren toplama tüpünü 200 x g'da 18 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  7. Süpernatanı çıkarın ve hepatosit olgunlaşma ortamındaki hücreleri yeniden süspanse edin.
  8. Hücreleri, 10 μM Y-27632 ve 20 nM siklosporin A ile desteklenmiş hepatosit olgunlaşma ortamı ile mitomisin C ile muamele edilmiş fare embriyonik fibroblastları (MEF'ler) veya jel benzeri bazal membran matrisi üzerine tohumlayın. Hücreleri 5 gün boyunca 37 ° C CO2 inkübatörde kültürleyin.

5. İnsan iPS hücrelerinden türetilen hepatositlerin tespiti için immünositokimya

  1. Kültürlenmiş hücreleri PBS (-) ile ayırdıktan sonra 5 gün boyunca yıkayın.
  2. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile sabitleyin.
  3. Paraformaldehiti çıkarmak için hücreleri TBS-T tamponu (% 1 Tween 20 ile 1x TBS) ile iki kez yıkayın.
  4. Hücreleri% 0.1 Triton X-100 seyreltilmiş TBS-T tamponu ile oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  5. Triton X-100'ü çıkarmak için hücreleri TBS-T tamponu ile iki kez yıkayın.
  6. Piyasada bulunan engelleme solüsyonunu (Malzeme Tablosuna bakınız) oda sıcaklığında 30 dakika boyunca hücrelere ekleyin.
  7. Albümine (hepatosit markörü) ve insan nükleer antijenine (hNA, bakınız Malzeme Tablosu) karşı birincil antikorlar ekleyin, bloke edici çözelti içinde 1:50 oranında seyreltin.
  8. Hücreleri gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Hücreleri TBS-T tamponu ile iki kez yıkayın.
  9. İkincil antikorlar ekleyin: Alexa Fluor 488 eşek anti-tavşan IgG ve Alexa Fluor 546 eşek anti-fare IgG, bloke edici çözelti içinde 1:100 oranında seyreltilmiş (Malzeme Tablosuna bakınız).
  10. Hücreleri oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Hücreleri TBS-T tamponu ile iki kez yıkayın.
  11. Floresan mikroskobu altında albümin pozitif ve hNA pozitif hücreleri sayarak hepatosit saflığını değerlendirin. Hem P1 hem de P2 popülasyonları için hNA pozitif hücre başına albümin pozitif hücrelerin yüzdesini hesaplayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan iPS hücrelerinin 2D kültür (Şekil 1A) ve temsili hücre özellikleri (Şekil 1B) yoluyla hepatositlere farklılaşmasını indükleyen işlemlerin zaman çizelgesi gösterilmektedir. Yaklaşık olarak farklılaşma 12. günde, hücreler, hepatositlerin karakteristiği olan poligonal hücre şekilleri ve yuvarlak çekirdekler sergilemeye başladı. Bazı hepatositler ayrıca çoklu çekirdeklenme gösterdi.

Farklılaşma 27. günde hücreler kullanılarak FACS a...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Besin metabolizması ve detoksifikasyondaki işlevleri nedeniyle, hepatositler diğer hücre tiplerine kıyasla nispeten daha fazla sayıda mitokondriye sahiptir15. ALCAM, immünoglobulin süper ailesinin bir üyesidir ve hücre yapışması ve göçünde rol oynar. Hepatik, epitelyal, lenfositik, miyeloid, fibroblast ve nöronal hücreler dahil olmak üzere çeşitli hücre tiplerinde eksprese edilir16. Mitokondri bazlı yöntem ve ALCAM antikorunun bir kombinasyonu kullanılarak, insan iPS hücres...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Milli Eğitim, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı hibe numarası [23390072] tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
253G1 insan iPS hücre hattıRIKEN BioResource Araştırma MerkeziHPS0002
%4 paraformaldehitFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation163-20145
Activin A Solüsyonu, İnsan, RekombinantNACALAI TESQUE, INC.18585
Anti-Çekirdek Antikoru, klon 235-1ChemiconMAB1281İnsan nükleer antijenine karşı antikor
B-27 Takviyesi (50x), serum içermezThermo Fisher Scientific17504044
BD FACSAria IIIBD BiosciencesHücre sıralayıcı
CHIR-99021MedChemExpressHY-10182 
Ciclosporin AFUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi035-18961
KollajenazFUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi034-22363
Corning Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bodrum Membran MatrisiCorning354230Jel benzeri bazal membran matrisi
CultureSure Y-27632FUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi036-24023KAYA inhibitörü
DeksametazonFUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi047-18863
Dimetil sülfoksit (DMSO)FUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi047-29353
Eşek Anti-Keçi IgG (H + L) Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11055
Eşek anti-Fare IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 546Thermo Fisher ScientificA10036
Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-21206
Falcon 5 mL Yuvarlak Alt Polistiren Test Tüpü, Hücre Süzgeci Çıtçıtlı KapaklıCorning352235
Fetal Sığır SerumuBiowest51820-500
GlutaMAX TakviyesiThermo Fisher Scientific35050061 Dipeptid L-Alanil-L-Glutamin
İnsan / Fare / Sıçan / Köpek ALCAM / CD166 AntikorR & D SystemsAF1172
Hidrokortizon 21-hemisüksinat sodyum tuzuSigma-AldrichH2270
iMatrix-511 ipekNippi 892021
ImmunoBlockKACCTKN001Engelleme çözümü
ITS-G Takviyesi (ve kez; 100)FUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi090-06741
Leibovitz'in L-15 OrtaFUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi128-06075
N-Heksanoik-Try-Ile-(6)-amino Heksanoik amid (Diheksa)Toronto Araştırma KimyasallarıH293745
Poliklonal Tavşan Anti-İnsan AlbüminiDakoA0001
Polioksietilen Sorbitan Monolaurat (Tween 20)NACALAI TESQUE, INC.28353-85
RPMI-1640FUJIFILM Wako Saf Kimya Şirketi189-02025
Sodyum L-AskorbatNACALAI TESQUE, INC.03422-32
StemFit AK02NREPROCELLRCAK02N
TBS (10x)NACALAI TESQUE, INC.12748-31
Tetrametilrodamin, metil ester (TMRM)Thermo Fisher ScientificT668
Triton X-100NACALAI TESQUE, INC.28229-25
Tripan Mavisi ÇözeltisiNACALAI TESQUE, INC.20577-34
TRYPSIN 250Difco215240
Triptoz fosfat suyu çözeltisiSigma-AldrichT8159

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yamamoto, T., et al. Differentiation potential of pluripotent stem cells correlates to the level of CHD7. Scientific Reports. 8 (1), 241(2018).
  2. Laco, F., et al. Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by the GSK3β inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 10 (6), 1851-1866 (2018).
  3. Anderson, N. C., et al. Balancing serendipity and reproducibility: Pluripotent stem cells as experimental systems for intellectual and developmental disorders. Stem Cell Reports. 16 (6), 1446-1457 (2021).
  4. Chen, C. X. -Q., et al. Standardized quality control workflow to evaluate the reproducibility and differentiation potential of human iPSCs into neurons. bioRxiv. , (2021).
  5. Duinsbergen, D., Salvatori, D., Eriksson, M., Mikkers, H. Tumors originating from induced pluripotent stem cells and methods for their prevention. Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 197-204 (2009).
  6. Nori, S., et al. Long-term safety issues of iPSC-based cell therapy in a spinal cord injury model: oncogenic transformation with epithelial-mesenchymal transition. Stem Cell Reports. 4 (3), 360-373 (2015).
  7. Hentze, H., et al. Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies. Stem Cell Research. 2 (3), 198-210 (2009).
  8. Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Molecular Therapy. 15 (11), 2027-2036 (2007).
  9. Hidaka, K., et al. Chamber-specific differentiation of Nkx2.5-positive cardiac precursor cells from murine embryonic stem cells. The FASEB Journal. 17 (6), 740-742 (2003).
  10. Gassanov, N., Er, F., Zagidullin, N., Hoppe, U. C. Endothelin induces differentiation of ANP-EGFP expressing embryonic stem cells towards a pacemaker phenotype. The FASEB Journal. 18 (14), 1710-1712 (2004).
  11. Duan, Y., et al. Differentiation and enrichment of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells in vitro and in vivo. Stem Cells. 25 (12), 3058-3068 (2007).
  12. Takayama, K., et al. Enrichment of high-functioning human iPS cell-derived hepatocyte-like cells for pharmaceutical research. Biomaterials. 161, 24-32 (2018).
  13. Hattori, F., et al. Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes. Nature methods. 7, 61-66 (2009).
  14. Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA Journal. 2 (2), 174-183 (2019).
  15. Fernandez-Vizarra, E., Enríquez, J., Pérez-Martos, A., Montoya, J., Fernández-Silva, P. Tissue-specific differences in mitochondrial activity and biogenesis. Mitochondrion. 11, 207-213 (2010).
  16. Swart, G. W. M. Activated leukocyte cell adhesion molecule (CD166/ALCAM): Developmental and mechanistic aspects of cell clustering and cell migration. European Journal of Cell Biology. 81 (6), 313-321 (2002).
  17. Peters, D. T., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells. Development. 143 (9), Cambridge, England. 1475-1481 (2016).
  18. Kamiya, A., Inagaki, Y. Stem and progenitor cell systems in liver development and regeneration. Hepatology Research. 45 (1), 29-37 (2015).
  19. Yanagida, A., Ito, K., Chikada, H., Nakauchi, H., Kamiya, A. An In vitro expansion system for generation of human ips cell-derived hepatic progenitor-like cells exhibiting a bipotent differentiation potential. PLOS One. 8 (7), e67541(2013).
  20. Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4 (5), 939-952 (2015).
  21. Hirata, H., et al. ALCAM (CD166) is a surface marker for early murine cardiomyocytes. Cells, Tissues, Organs. 184 (3-4), 172-180 (2006).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Live Mitochondria StainingCell SortingHuman Induced Pluripotent Stem CellsHepatocyte PurificationFluorescence Activated Cell SortingHepatic DifferentiationALCAM MarkerTMRM StainingAlbumin ExpressionHepatic Progenitor Cells

İlgili makaleler