Kimerik Küçük Kodlamayan RNA için Hesaplamalı Analiz Eğitimi: Hedef RNA Dizileme Kitaplıkları

Küçük kodlamayan RNA'lar, farklılaşma ve gelişme, sinyal işleme ve hastalık ^1,2,3 gibi çeşitli süreçlerde gen paketlerinden ekspresyonun koordinasyonunda transkripsiyon sonrası rolleri nedeniyle oldukça incelenmiştir. MikroRNA'lar (miRNA'lar) dahil olmak üzere gen düzenleyici küçük kodlamayan RNA'ların (sncRNA'lar) hedef transkriptlerini doğru bir şekilde belirleme yeteneği, hem temel hem de translasyonel seviyelerde RNA biyolojisi çalışmaları için önemlidir. miRNA tohum dizisi ile potansiyel hedefleri arasında beklenen tamamlayıcılıktan yararlanan biyoinformatik algoritmalar, miRNA:hedef RNA etkileşimlerinin tahmini için sıklıkla kullanılmıştır. Bu biyoinformatik algoritmalar başarılı olsa da, başka bir yerde gözden geçirildiği gibi, hem yanlış pozitif hem de yanlış negatif sonuçları barındırabilirler ^4,5,6. Son zamanlarda, in vivo sncRNA:hedef RNA etkileşimlerinin in vivo çapraz bağlanması ve ardından sncRNA'yı tek bir kimerik RNA 4,5,7,8,9,10 oluşturmak üzere hedefine fiziksel olarak bağlamak için bir ligasyon adımının dahil edilmesi yoluyla açık ve yarı kantitatif olarak belirlenmesine izin veren çeşitli biyokimyasal yaklaşımlar tasarlanmış ve uygulanmıştır.. Kimerik RNA'lardan dizileme kitaplıklarının daha sonra hazırlanması, dizileme verilerinin hesaplamalı işlenmesiyle sncRNA:hedef RNA etkileşimlerinin değerlendirilmesine izin verir. Bu video, kimerik RNA dizileme kitaplıklarından sncRNA:hedef RNA etkileşimlerinin sağlam ve tekrarlanabilir analizine izin vermek için tasarlanmış, küçük kimerik RNA analiz boru hattı (SCRAP) olarak adlandırılan bir hesaplama işlem hattının kurulması ve kullanılması için bir eğitim sağlar⁶.

Bu eğitimin amacı, sncRNA'nın kimerik moleküler okumalarını sağlayan biyokimyasal yaklaşımlar yoluyla üretilen verilerin analizinin önündeki engelleri azaltarak, araştırmacılara tamamen tahmine dayalı biyoinformatik algoritmalara aşırı güvenmekten kaçınmalarında yardımcı olmaktır: hedef RNA etkileşimleri. Bu eğitim, giriş seviyesi hesaplamalı bilim insanlarına, hibritlerin çapraz bağlanması, ligasyonu ve dizilenmesi (CLASH) ve endojen Argonaute'ye bağlı RNA'ların kovalent ligasyonu (CLEAR-CLIP)^7,9 dahil olmak üzere mevcut birkaç biyokimyasal protokol tarafından üretilebilen kimerik RNA dizileme verilerini analiz etmek için geliştirilmiş bir boru hattı olan SCRAP'ın kullanımı yoluyla rehberlik edecek pratik adımlar ve ipuçları sağlar.

SCRAP kullanımı, diğer hesaplama boru hatlarına kıyasla kimerik RNA dizileme verilerinin analizi için çeşitli avantajlar sunar⁶. Göze çarpan bir avantaj, boru hattındaki adımlar için genellikle özel ve/veya desteklenmeyen komut dosyalarına dayanan alternatif işlem hatlarına kıyasla, kapsamlı ek açıklaması ve boru hattı içindeki iyi desteklenen ve rutin olarak güncellenen biyoinformatik komut dosyalarına çağrıların dahil edilmesidir. Bu özellik, SCRAP'a istikrar kazandırarak, araştırmacıların boru hattını tanımalarını ve kullanımını iş akışlarına dahil etmelerini daha değerli hale getirir. SCRAP'in ayrıca, önceki bir yayında^{ayrıntılı olarak açıklandığı} gibi, sncRNA:hedef RNA etkileşimlerinin tepe noktalarını çağırmada alternatif boru hatlarından daha iyi performans gösterdiği ve platformlar arası işlevselliğe sahip olduğu gösterilmiştir 6.

Bu eğitimin sonunda, kullanıcılar (i) SCRAP için platform gereksinimlerini öğrenebilecek ve SCRAP boru hatlarını kurabilecek, (ii) referans genomları kurabilecek ve SCRAP için komut satırı parametreleri ayarlayabilecek ve (iii) tepe çağrı kriterlerini anlayabilecek ve tepe çağrı ve tepe ek açıklaması gerçekleştirebilecektir.

Bu video, RNA biyolojisini inceleyen araştırmacıların, dizileme kütüphanesi hazırlığına yönelik tartışılan biyokimyasal yaklaşımlardan biri aracılığıyla elde edilen kimerik RNA dizileme verilerinde haberci RNA'lar gibi hedef RNA'larla sncRNA etkileşimlerini analiz etmek için hesaplama boru hattı SCRAP'ı nasıl kurabileceklerini ve en uygun şekilde nasıl kullanabileceklerini pratik olarak ayrıntılı olarak açıklayacaktır.

SCRAP bir komut satırı yardımcı programıdır. Genel olarak, aşağıdaki kılavuzu izleyerek, kullanıcının (i) SCRAP'ı (https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP) indirip yüklemesi, (ii) referans genomları kurması ve SCRAP'yi çalıştırması ve (iii) en yüksek çağrı ve açıklama gerçekleştirmesi gerekir.

Bu yordamdaki hesaplama adımlarıyla ilgili daha fazla ayrıntı https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP'da bulunabilir. Bu makale, giriş seviyesi hesaplama becerilerine sahip araştırmacıların kimerik RNA dizileme kitaplığı veri kümelerinde SCRAP yüklemesine, optimize etmesine ve kullanmasına izin vermek için kurulum ve arka plan bilgileri sağlayacaktır.

NOT: Protokol, SCRAP kullanarak kimerik RNA dizileme kitaplıklarını analiz etmek için gereken yazılımın indirilmesi ve yüklenmesiyle başlayacaktır.

1. Kurulum

1. SCRAP'ı kurmadan önce, analizler için kullanılacak makineye Git ve Miniconda bağımlılıklarını kurun. Git büyük olasılıkla zaten yüklüdür. Örneğin, Mac OSX platformunda, "git" yardımcı programının bu dizinde mevcut olduğunu ve yüklü olduğunu görmek için hangi git'i kullanarak bunu doğrulayın. Miniconda'nın hangi conda kullanılarak kurulup kurulmadığını kontrol edin. Hiçbir şey döndürülmezse, Miniconda'yı yükleyin. Miniconda'yı yüklemek için 400 MB disk alanı gerekir.
   1. Miniconda'yı kurmanın birkaç yöntemi vardır ve bunlar platforma göre farklılık gösterir. Windows, MacOS ve Ubuntu'ya yüklemek için daha fazla talimatın bulunduğu Meffert Lab GitHub deposundaki [https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md] PLATFORM-SETUP markdown dosyasına bakın. Linux kullanıcıları için, Linux'un kendi varsayılan paket yöneticisi (apt) vardır. Bu çalışmaya özgü durumda, mevcut bir paket yöneticisi olan brew'u kullanarak Miniconda'yı kurmak için brew install Miniconda komutunu kullanın.
      NOT: 'Brew' olarak adlandırılan 'Homebrew', Apple'ın işletim sistemi macOS'a yazılım yüklenmesini basitleştiren açık kaynaklı bir yazılım paketi yönetim sistemidir.
   2. conda ilk kez yükleniyorsa, kullanımda olan belirli bir kabuk için komutunu çalıştırın conda init . Buradaki örnekte, kullanılan kabuk zsh'dir. Ardından, kabuğu kapatın ve yeniden açın. Conda başarıyla yüklendiyse, terminal oturumu içinde etkinleştirilen temel ortam görülecektir.
2. SCRAP kaynağını indirin ve bağımlılıklarını yükleyin.
   1. SCRAP kaynağı elde etmek için tercih edilen yöntem Git kullanmaktır. Kaynak kodun en son kopyasını almak için git clone https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP komutunu çalıştırarak buna erişin.
   2. Conda için geliştirilmiş bir paket çözücü olan mamba'yı kurun ve aşağıdaki komutları kullanarak SCRAP için tüm bağımlılıkları SCRAP_environment.yml'den kendi conda ortamına yükleyin:
      conda install -n tabanı conda-forge::mamba
      mamba env oluştur -f HURDA/SCRAP_environment.yml -n HURDA
3. Ardından, SCRAP için başvuru yüklemesini çalıştırın. Referans kurulumunda kullanılan argümanlar, sncRNA-mRNA etkileşimleri analiz edilen organizmaya özgü olacaktır.
   bash HURDA/çöp kutusu/Reference_Installation.sh -r dolu/yol/için/HURDA/ -m -g hg38 -s insan var
   1. Referans kurulumu için SCRAP kaynak klasörünün dizinini sağlayın. Kurulum adımları daha sonra fasta ve açıklama klasörlerindeki dosyalar kullanılarak gerçekleştirilecektir. Herhangi bir kısayol olmadan tam yolu listeleyin. Eğik çizgi ile bitirin.
   2. Doğru miRbase tür kısaltmaları için README.md'deki tablolara bakın. Güncel referans genomlar https://genome.ucsc.edu/ veya https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/'da bulunabilir. Bu örnekte, fare GRCm38 genomu için hg38 kullanılacaktır.
   3. Şu anda açıklama için dahil edilen türler insan, fare ve solucandır. SCRAP kaynak klasöründeki ek açıklama dizininde karşılık gelen species.annotation.bed dosyalarını görüntüleyin. Analiz için farklı bir türün kullanılması isteniyorsa, aynı adlandırma şemasını izleyen bir annotation.bed dosyası sağlayın species.annotation.bed.

2. HURDA Çalıştırma

1. Bağımlılıklar ve SCRAP yüklendiğine göre, - betiği çalıştırın SCRAP.sh
   bash HURDA/çöp kutusu/SCRAP.sh -d dolu/yol/için/CLASH_Human/ -a dolu/yol/için/CLASH_Human/CLASH_Human_Adapters.txt -p hayır -f evet -r dolu/yol/için/HURDA/ -m -g hg38'e sahiptir
   1. Herhangi bir kısayol olmadan örnek dizinlere giden tüm yolu listeleyin. Örnek dizinleri, Şekil 1'de gösterildiği gibi, örnek adla tam olarak eşleşen klasör adıyla biçimlendirin.
   2. Listelenen yolun, tek bir örnek klasörün veya örnek dosyanın yolu değil, tüm örnek klasörleri içeren dizinin yolu olduğunu unutmayın (adım 2.1'deki komut satırına bakın).
   3. Ardından, bağdaştırıcı dosyasının tüm yolunu listeleyin. Bağdaştırıcı dosyasındaki örnek adların daha önce bahsedilen klasör adları ve dosya adlarıyla eşleştiğinden emin olun (adım 2.1'deki komut satırına bakın).
   4. Numunelerin eşleştirilmiş uç olup olmadığını ve pre-miRNA'lar ve/veya tRNA'lar için filtreleme yapılıp yapılmayacağını belirtin. İsterseniz rRNA temizliği için bir filtre ekleyin (adım 2.1'deki komut satırına bakın).
      NOT: Kullanıcılar, örnek türlerine ve deneysel hedeflere bağlı olarak bu filtreleri kullanmaya karar verebilir veya vermeyebilir. Deneysel tasarıma bağlı olarak, pre-miRNA'lar, tRNA'lar ve rRNA'lar, gerçek sncRNA:hedef RNA kimeraları için mevcut dizileme derinliğini tüketebilir ve kullanıcılar bunları dışlamak için filtreler kullanabilir. Bununla birlikte, kullanıcılar belirli durumlarda bu tür filtrelemeden kaçınmak isteyebilir (örneğin, sncRNA hedeflerini mitokondriyal rRNA'ları içeren mitokondriyal genoma eşlemek).
   5. Ardından, başvuru dizininin tüm yolunu, miRbase kısaltmasını ve başvuru genom kısaltmasını listeleyin (adım 2.1'deki komut satırına bakın).
      NOT: Komut dosyasının tamamlanması, veri kümesi boyutuna ve kullanılan bilgisayarın CPU'suna bağlı olarak birkaç saat sürebilir.

3. Tepe arama ve açıklama

1. SCRAP'ın çalışması bittiğinde, çıktının diğer dosyaların yanı sıra bir SAMPLE.aligned.unique.bam dosyası içerip içermediğini kontrol edin. Bu, hedef RNA'ların kullanıcı tarafından sağlanan referans genom üzerindeki hizalamalarını içeren bir ikili dosyadır.
2. Şimdi Peak_Calling.sh çalıştırarak yoğun arama gerçekleştirin.
   bash HURDA/çöp kutusu/Peak_Calling.sh -d CLASH_Human/ -a CLASH_Human/CLASH_Human_Adapters.txt -c 3 -l 2 -f no -r HURDA/ -m -g hg38
   NOT: Tepe çağrısı, araştırmacıların kimerik RNA kütüphaneleri içindeki en sağlam ve tekrarlanabilir küçük kodlamayan RNA'yı kolayca değerlendirmelerini sağlamak için tasarlanmış bir SCRAP özelliğidir: hedef RNA etkileşimleri. Örneğin bu özellik, araştırmacıların daha fazla araştırma için seçmek isteyebilecekleri etkileşimleri belirlemelerine yardımcı olabilir. Aşağıdaki Adım 3.2.2, kullanıcının bir tepe noktasının çağrıldığı sıkılığı tanımlamak için kullanılmasını istediği kriterleri nasıl belirlediğini açıklar - bu, çağrılacak tepe noktası için meydana gelmesi gereken benzersiz etkileşimlerin veya sıralama okumalarının sayısını ve bu belirli etkileşimin gerçekleşmesi gereken kitaplıkların sayısını içerir.
   1. Yine, örnek klasörleri ve bağdaştırıcı dosyasını içeren dizinin tam yollarını listeleyin (adım 3.2'deki komut satırına bakın).
   2. Ardından, çağrılacak bir tepe noktası için gereken en düşük sıralama okuma sayısını ayarlayın (adım 3.2'deki komut satırına bakın).
   3. Çağrılması için bir tepe noktası içermesi gereken en az farklı sıralama kitaplığı sayısını ayarlayın (adım 3.2'deki komut satırına bakın).
      NOT: Hem 3.2.2 hem de 3.2.3 için değer seçimi, sıralanan numunelerin doğasına ve numunelerin veya numune tiplerinin sayısına bağlı olacaktır. Burada, bir zirveyi çağırmak için bir örnekte en az 3 kimerik dizileme okuması gerekir ve tepe noktası en az 2 örnek tarafından desteklenmelidir. Örneğin, belirli bir koşul için birçok sıralama kitaplığı yinelemesinin bulunduğu bir veri kümesini değerlendiren bir araştırmacı, okumaların daha fazla sayıda örnek sıralama kitaplığında bulunmasını gerektirmeye karar verebilir.
   4. Aynı ailenin sncRNA'larının aynı zirveye katkıda bulunması gerekip gerekmediğini belirtin. Örneğin, aynı aileden miRNA'lar tohum dizilerini paylaştığından, bu miRNA'lar paylaşılan ve örtüşen gen hedefleri kümelerini bağlayabilir; Bir kullanıcı, bir ailenin bu hedefler üzerindeki tam etkisini, kolektif zirvelerini değerlendirerek belirlemek isteyebilir (Adım 3.2'deki komut satırına bakın).
   5. Ardından, başvuru dizininin tam yolunu, miRBase kısaltmasını ve başvuru genom kısaltmasını belirtin (adım 3.2'deki komut satırına bakın).
3. Yoğun çağrı tamamlandıktan sonra yoğun ek açıklamayı çalıştırın.
   bash HURDA/çöp kutusu/Peak_Annotation.sh -p CLASH_Human/tepeler.yatak -r HURDA/ -s insan
   1. Tepe çağrısından elde edilen peaks.bed (veya peaks.family.bed ) dosyasının tam yolunu, başvuru dizininin tam yolunu ve ek açıklama için istenen türü listeleyin.

4. Verileri görselleştirme

NOT: SCRAP kullanarak analiz için tüm adımlar tamamlanmıştır. Verileri görselleştirmek için çeşitli yaklaşımlar önerilir:

1. Birlikte görselleştirmek istenecek tüm .bam (ikili SAM dosyası) dosyalarını birleştirin (samtools birleştirme).
2. Elde edilen birleştirilmiş .bam dosyasını sıralayın (samtools sıralaması). Dosya içeriği, samtools'un dizine ekleyebilmesi için satır satır sıralanır.
3. Sıralanan .bam dosyasını (samtools dizini) dizine ekleyin. Bütünleştirici genomik görüntüleyicide (IGV) görselleştirmeye izin vermek için bir BAI (ikili samtools biçim dizini) dosyası oluşturulur.
4. Son olarak, ortaya çıkan sıralanmış .bam ve dizine alınmış .bai dosyasını IGV'de açın.
   NOT: SncRNA: İlgilenilen hedef RNA etkileşimleri, araştırmaya özgü bir dizi yolla takip için önceliklendirilebilir. Genel bir başlangıç yaklaşımı, zirvelerin en kimerik sıralama okumaları tarafından desteklendiği etkileşimleri değerlendirmektir. İlgilenilen etkileşimler, tespit edilen etkileşimden hem sncRNA hem de hedef RNA için dizi girilerek RNAstructure paketinden DuplexFold Web Sunucusu kullanılarak da görselleştirilebilir¹¹. Her tepe noktası için, kromozom (ilk sütun) ve genomik koordinatlar (başlangıç: 1. sütun sonu: 2. sütun), tepe ek açıklamasında oluşturulan peaks.bed.species.annotation.txt dosyasında bulunabilir. Özellikle miRNA'lar için, tekrarlanabilir ve fonksiyonel etkileşimler kapsamlı tohum uyumlu bağlanmadan yoksun olabilirken (örneğin, etkileşimler 3' telafi edici bağlanma kullanabilir), hedef RNA'nın eş kökenli bir bağlanma motifinde tohum eşleşen bölgelerin varlığı yine de işlevsel olarak önemli tespit edilen etkileşimlerin doğrulayıcı bir özelliği olarak değerlendirilebilir ^4,12. Yardımcı veri işleme, farklı biyolojik koşullardaki pikler arasındaki diferansiyel okuma kapsamının karşılaştırmalarını ve bir yol analiz aracı kullanılarak düzenlenmiş genlerin yollara kümelenmesinin potansiyel olarak değerlendirilmesini içerebilir.

CLEAR-CLIP9 kullanılarak hazırlanan daha önce yayınlanmış dizileme veri kümelerinde SCRAP'nin değiştirilmiş bir sürümü (rRNA filtrelemesi için modifikasyonları uygulayan SCRAP sürüm 2.0) tarafından tespit edilen sncRNA sonuçları: hedef RNA Şekil 2 ve Tablo 1'de gösterilmektedir. Kullanıcılar, SCRAP'de pik çağrısı ile yüksek güvenilirlikli etkileşimlerin izolasyonunu takiben meydana gelen intron bölgeleri ile nispi fraksiyon miRNA etkileşimlerindeki azalmayı takdir edebilirler. SCRAP kullanılarak yapılan analizlerden elde edilen ek veriler, bu boru hattının ilk yayınında da mevcuttur6. Deneysel yaklaşıma bağlı olarak, sonuçlardaki artefaktları azaltmak için hazırlanan kimerik RNA kütüphanelerinden dizileme verilerinin filtrelenmesi gerekebilir. Dizileme kütüphanesinin yetersiz biyokimyasal hazırlığı ve/veya dizileme verilerinin yetersiz filtrelenmesi, sncRNA'ların ve Argonaute tarafından bağlanan hedef RNA'ların bağlanmasından kaynaklanmayan okumaların yanlış dahil edilmesine neden olma potansiyeline sahiptir. Bu artefakt okumaları, primer dimerleri veya adaptör dimerleri, rRNA'ları ve pre-miRNA'ları içerebilir. Tablo 2 , sonuçlarda tespit edilebilecek olası artefaktları ve olası çözümleri açıklamaktadır.

Şekil 1: Veri dizinleri için biçimlendirme. Her sıralama kitaplığı için ham okumaları içeren dosyalar .fastq.gz biçiminde sağlanmalıdır. (A) Kütüphaneler eşleştirilmiş uç değilse, analizde tek bir .fastq.gz dosyası kullanılacaktır. Bu dosya 'SAMPLE.fastq.gz' olarak adlandırılmalıdır, burada SAMPLE, bağdaştırıcı dosyasında kullanıcı tarafından sağlanan tam örnek addır. Dosya, örnek adla tam olarak eşleşen bir klasörde yer almalıdır. (B) Eşleştirilmiş uç sıralama kitaplıkları için iki .fastq.gz dosyası kullanılacaktır. Bu dosyalar 'SAMPLE-R1.fastq.gz' ve 'SAMPLE-R2.fastq.gz' olarak adlandırılmalı ve örnek adla tam olarak eşleşen bir klasörde bulunmalıdır. SAMPLE adlı tüm bu dizinler, kullanıcının SCRAP'a "örnek dizin" olarak sağlayacağı aynı üst dizin içinde yer almalıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Hedef Tipi ve Tepe Çağrısı yöntemlerine göre miRNA:hedef RNA etkileşimlerinin oranı. Kimerik sncRNA: hedef RNA dizilimi CLEAR-CLIP (SRR2413277 - SRR2413295)9 kullanılarak hazırlanan kütüphanelerden yayınlanan veriler, rRNA filtrelemesi uygulanmış değiştirilmiş bir SCRAP sürümü (SCRAP sürüm 2.0) kullanılarak analiz edildi. Pre-miRNA'lar, tRNA'lar ve rRNA'lar filtrelendi ve 'yüksek güvenilirlik' (en az 3 okuma ve 2 kitaplık) ve 'tüm etkileşimler' (en az 1 okuma ve 1 kitaplık) için farklı tepe çağrı ayarları kullanıldı. Etkileşimler miRNA ailesine göre gruplandırıldı veya gruplandırılmadı. Kategoriler (CDS, 5' UTR, intergenik, intron, 3'UTR) için kimerik RNA okumalarının nispi fraksiyonları hesaplandı ve grafiklendirildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: MiRNA'nın kimerik okuma Sayıları: Hedef Tipine ve Tepe Çağrı Yöntemine Göre Hedef RNA Etkileşimleri. Kimerik sncRNA: CLEAR-CLIP (SRR2413277 - SRR2413295)9 kullanılarak hazırlanan kütüphanelerden yayınlanan hedef RNA dizileme verileri, rRNA filtrelemesi uygulanmış değiştirilmiş bir SCRAP versiyonu (SCRAP sürüm 2.0) kullanılarak analiz edildi. Pre-miRNA'lar, tRNA'lar ve rRNA'lar filtrelendi ve miRNA ailesine göre gruplandırılmış veya gruplandırılmamış yüksek güvenilirlikli (en az 3 okuma ve 2 kitaplık) ve tüm (en az 1 okuma ve 1 kitaplık) etkileşimler için farklı tepe çağrı ayarları kullanıldı. Her koşul için, hedef RNA etkileşiminin kodlama dizisi (CDS), 5' çevrilmemiş bölge (5' UTR), intergenik bölge, intron veya 3' çevrilmemiş bölge (3'UTR) kategorisine eşlendiği toplam tespit edilen miRNA: hedef RNA etkileşimlerinin sayıları listelenir.

Tablo 2: Potansiyel kirletici dizilim okumaları ve çözümleri.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.