Method Article

Bir Orman Ağaç Kurdundan Entomopatojenik Mantarların İzolasyonu, Davranışsal Tanımlama ve Patojenite Değerlendirmesi

DOI:

10.3791/65782

⸱

September 29th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Forestry and Biotechnology, Zhejiang A&F University, 2Key Laboratory of Vector Biology and Pathogen Control of Zhejiang Province, Huzhou University, 3Department of Biology, Lund University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, bir orman odun kurdundan entomopatojenik mantarlar elde etmek için bir protokol ve bir Coleopteran model böcek kullanarak entomopatojenik aktivitelerini değerlendirmek için ikame edici bir yol sunuyoruz. Bu yöntem, doğal ormanlardaki odun delici böcek zararlılarından entomopatojenik mantar kaynaklarını keşfetmek için etkili ve kullanışlıdır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Orman odun delicileri (FWB) dünya çapında ciddi ağaç hasarına ve ekonomik kayıplara neden olur. FWB ortaya çıkma döneminde entomopatojenik mantarların (EPF) salınması, kimyasal kontrole kabul edilebilir bir alternatif olarak kabul edilir. Bununla birlikte, EPF kaynakları, tarımsal böcek zararlılarının aksine, FWB'ler için önemli ölçüde daha az araştırılmıştır. Bu makale, örnek olarak yabani Monochamus alternatus popülasyonlarını kullanarak FWB'lerden EPF kaynaklarını keşfetmek için bir protokol sunmaktadır. Bu protokolde M ile yemlenen tuzakların atanması. Farklı popülasyonlara alternatif cezbediciler, böceğin ortaya çıkma dönemlerinde doğal enfeksiyon semptomları olan yeterli örneklerin toplanmasını garanti etti. Bütünleşmelerin ince bir şekilde incelenmesi ve seçici bir ortama yerleştirilmesinin ardından, mantar türleri böcek gövdelerinin her bir parçasından izole edildi ve hem moleküler hem de morfolojik özelliklere dayalı olarak tanımlandı.

Birkaç mantar türü, sağlıklı M. alternatus'un spor süspansiyonları ile yeniden enfeksiyonu yoluyla parazitik EPF'ler olarak onaylanmıştır. M. alternatus üzerindeki davranışsal fenotipleri, taramalı elektron mikroskobu kullanılarak gözlemlendi ve ayrıca Coleopteran model böcek Tribolium castaneum üzerindekilerle karşılaştırıldı. Her iki böcek türü üzerinde tutarlı parazitizm fenotipleri sunan EPF'ler için, T üzerindeki aktivitelerinin değerlendirilmesi. castaneum , M. alternatus ile ilgili gelecekteki çalışmalar için ölümcüllük hakkında değerli bilgiler sağlamıştır. Bu protokol, Çin'deki M. alternatus popülasyonları hakkında yeni bildirilen EPF'nin keşfine yardımcı oldu ve bu, diğer FWB'lerden daha fazla EPF kaynağını keşfetmek için etkili bir yaklaşım olarak uygulanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Böcek zararlılarının neden olduğu tahribat, hem orman hem de tarım ekosistemlerinde büyük ekolojik ve ekonomik kayıplara yol açmıştır. Çoğu tarım zararlısı, konukçu bitkilere zarar verirken kendilerini doğal düşmanlara veya yapay kontrol ajanlarına maruz bırakır. Bunun yerine, orman odun delicileri (FWB), konakçı ağaç gövdeleri 1 içinde neredeyse tüm gelişim döngülerini tamamlarve bu da vahşi alanda FWB'den verimli biyokontrol organizmalarını keşfetmek için büyük zorluklar doğurur. Daha da kötüsü, FWB'lerin çok sayıda fitopatojen2 taşıması veya potansiyel vektörleri 3,4 olarak bu patojenlerle yakın bir ilişkiye sahip olması ve FWB'nin orman sağlığı üzerindeki olumsuz etkilerini önemli ölçüde artırmasıdır. Kimyasal böcek öldürücülerin aşırı kullanımı FWB şiddetini hafifletebilir, ancak böcek öldürücü direncinortaya çıkması 5,6 çevresel uygulamalarını sınırlar. Bazı durumlarda, böcek parazitoidleri, predatör eklembacaklılar ve entomopatojenik mikroplar, FWB7'nin dağıtım alanlarına biyokontrol ajanları olarak salındı ve kimyasal kontrole etkili ve ekonomik olarak kabul edilebilir alternatifler oldukları kanıtlandı 8,9,10.

Entomopatojenik mantarların (EPF), diğer mikrobiyal grupların çoğuna göre FWB'yi kontrol etmede avantaja sahip olduğu düşünülmektedir. Sporları böcek konakçıları tarafından taşınabilir ve kütikül veya bütünlüğe nüfuz ederek vücut yüzeylerine stabil bir şekilde sabitlenebilir 8,11. EPF ayrıca çevresel streslere mükemmel uyum sağlar ve bazı türler ağaçların dokusunda endofitler12,13 olarak iyi kolonize olur ve büyümelerini, hayatta kalmalarını ve bulaşmalarını kolaylaştırır. Bununla birlikte, tarım endüstrilerindekiyle karşılaştırıldığında, doğal orman ekosistemlerinde kullanılan EPF'nin tür çeşitliliği önemli ölçüde sınırlıdır 14,15,16. Beauveria bassiana (PPRI 5339 suşu), Güney Afrika'daki Okaliptüs bitlerine yönelik bir IPM programını teşvik etmek için en umut verici tür olarak kanıtlanmıştır17 ve iki umut verici B izolatının kombinasyonu. Bassiana, kırmızı palmiye böceği Rhynchophorus ferrugineus'un palmiye ağacı tarlalarında farklı yaşam evrelerinde pratik mikrobiyal kontrolü için bir fırsat sağladı18. Beauveria ve iyi bilinen Metarhizium'a ek olarak, Hypocreales takımının diğer EPF cinsleri, özellikle Lecanicillium türleri (birçoğu şimdi Akanthomyces19,20 cinsine göre sınıflandırılmıştır), Şili'deki Selvi yaprak biti gibi orman zararlılarının yönetiminde güçlü patojenite ve yüksek potansiyel göstermiştir21.

Çam testere böceği Monochamus alternatus, Çin'de ve komşu ülkelerde, besinlerin ve suyun taşınmasını engellemek için çam ağaçlarının dallarına ve gövdelerine giren kötü şöhretli bir çam ormanı zararlısıdır 22,23,24. Ayrıca, M. alternatus ayrıca ana vektör böceği olarak bitki paraziti çam ağacı nematodunun (Bursaphelenchus xylophilus, PWN) istilasını da teşvik eder. Böceğin bir başka türdeş türü, M. galloprovincialis, son yıllarda Avrupa'nın birçok ülkesinde PWN'yi yaymıştır25. Önceki araştırmalar, İspanya, Japonya ve Çin'in Anhui/Zhejiang Eyaletlerinde Beauveria, Metarhizium ve Lecanicillium (Verticillium, Lecanicillium'un daha da eski bir adı olan Verticillium) gibi Monochamus spp.'den birkaç doğal EPF cinsi bildirmiştir 26,27,28,29. Bununla birlikte, bu EPF koleksiyonları, Monochamus böceklerinin doğal alanlardaki geniş oluşumuna kıyasla, belirli bir yerde yaygın olarak kısıtlı görünmektedir. M. alternatus böceği Çin'de geniş bir coğrafi dağılıma sahip olduğundan, farklı popülasyonlar arasında daha fazla potansiyel EPF'yi keşfetmek için temsili bir ağaç delici olarak kabul edilebilir.

Mevcut protokolde, M'nin çeşitli coğrafi popülasyonlarından EPF'leri araştıran özel bir prosedür sunuyoruz. güney Çin'de alternatus . Bu protokol, test edilen mantar türünün her iki böcek türü üzerinde tutarlı bir davranışsal fenotipe sahip olması koşuluyla, entomopatojenite deneylerini gerçekleştirmek için bir model Coleopteran böceği kullanır. Bu protokol aynı zamanda, entomopatojenik mantar türlerinin çeşitliliğinin hafife alındığı veya daha az araştırıldığı diğer orman odun delicileri için EPF araştırmaları hakkında bilgi sağlayabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mantarların M. alternatus'tan izolasyonu (Şekil 1)

  1. Böcek örneğini toplayın
    1. Çam testere böcekleri M'yi toplayın. doğal olarak enfekte olmuş çam ormanlarında böcek popülasyonlarının tahmin edilen ortaya çıkma dönemlerinden önce cezbedici maddelerle yemlenmiş ticari tuzaklar kullanan alternatus (Malzeme Tablosuna bakınız).
      NOT: Bu çalışmada, böcekler güney Çin'in beş coğrafi bölgesinden (Huzhou / Zhejiang, Liangshan / Sichuan, Xiamen / Fujian, Shaoguan / Guangdong, Yulin / Guangxi) toplanmıştır. Tuzak ayarı yukarıdan aşağıya doğru şu şekildedir: yuvarlak bir üst (50 cm çapında), çapraz şekilli bir panel (35 cm genişliğinde ve 66 cm uzunluğunda), bir huni (üst yuvarlak çapında 35,5 cm ve alt yuvarlak çapında 5,5 cm), bir toplama kabı (10,5 cm çapında ve 26,5 cm uzunluğunda). Konak uçucular (örneğin, etanol ve α-pinen) ve agregasyon feromonu (2-undesilikoksi-1-etanol) yem30 olarak kullanılır.
    2. Numuneyi laboratuvara aktarmadan önce etiketleyin. Her böceği taze dallarla ayrı ayrı sterilize edilmiş tüplere koyun. Dalları 2 günde bir yenileriyle değiştirin.
    3. Canlı böcekleri nemlendirilmemiş bir inkübatörde (16-8 L/D döngü) 25 ± 1 °C'de geri alın ve günlük olarak gözlemleyin.
    4. Beslenme ve hareketliliğin azaldığını gösteren örnekleri kaydedin. Ölü M'yi aktarın. mantar miselleri ve conidia'nın büyümesini gözlemlemek için ıslak odalara sertleşen ve sertleşen alternatus .
      NOT: Entomopatojenik mantarlar tarafından enfekte olduktan sonra, böcekler enfeksiyonun ilk aşamasında beslenme ve hareketlilikte bir azalma göstermiştir31,32. Ölümden sonra vücutları sertleşti ve sertleşti, misel ve conidia ıslak bir odada saklandıktan birkaç gün sonra ortaya çıktı33.
    5. Mantar enfeksiyonu olan böcek kadavralarını ileride kullanmak üzere 4 °C'de saklayın. Bu protokolü takip etmek için, daha saprotrofik mantarlarla kontaminasyonu önlemek için numuneleri birkaç saat içinde hemen işleyin.
  2. Büyüme ortamının hazırlanması
    1. 1 L saf suya 39 g patates dekstroz agar (PDA) tozu ekleyin ve 121 °C'de 30 dakika otoklavlayın.
    2. Çalışabilir bir sıcaklığa (~ 50 ° C) soğutun, 0.05 g streptomisin, 0.05 g penisilin G ve 0.05 g tetrasiklin ekleyin ve ortamı dağıtmak için çalkalayın.
    3. Ortamı temiz bir tezgah altında Petri kaplarına yerleştirin ve katılaştıktan sonra kullanın.
      NOT: Antibiyotikli PDA ortamı, böceklerden izolasyon için kullanılır, bu da izolasyon sırasında mantar büyümesini etkilemeden bakteri üremesini önler. Bununla birlikte, antibiyotiksiz PDA ortamı günlük yetiştirme ve koruma için kullanılır.
    4. 35 g patates dekstroz suyu (PDB) tozunu 1 L ddH2O içine koyun ve 121 ° C'de 30 dakika otoklavlayın. Kullanmak için soğutun.
  3. Mantar enfeksiyonu semptomları olan böcek örneğinin diseksiyonu
    1. Sterilize edilmiş makas, neşter ve böcek iğneleri hazırlayın; Ardından, alkol brülörü ile temiz bir tezgah altında çalışın.
      NOT: Diseksiyon aletlerinin kullanımı kişisel tercihlere göre ayarlanabilir. Böcek pimleri standart diseksiyon iğnelerinden daha keskindir ve farklı özellikler diseksiyon ihtiyacını karşılayabilir.
    2. Böcek gövdesi bütünlüklerini steril ve tek kullanımlık Petri kaplarındaki aletlerle inceleyin. İç içeriği açığa çıkarabilecek orta bağırsak ve arka bağırsak dokularına olası hasarları önlemek için dikkatli olun.
    3. Böcek gövdelerini aşağıdaki gibi ana pozisyonlara bölün: antenler, baş, göğüs, karın, kanatlar (her çift) ve bacaklar.
  4. Mantar arıtma
    1. Her pozisyonun bütünlüklerini makasla küçük parçalar halinde kesin. Dış yüzeyi antibiyotikli PDA plakalarının yüzeyine hafifçe bastırın.
      NOT: Bütünleşmelerdeki mantar misellerinin plakaya aşılandığından emin olun.
    2. Parafilm ile dikkatlice kapatın ve dokular miselyum ile tamamen kaplanana kadar 25 ± 1 ° C'de bir inkübatörde kültürleyin.
    3. Tek kolonileri fenotipik özelliklere (renk, şekil) göre 25 ± 1 ° C'de kültür için antibiyotikli yeni bir PDA'ya aktarın.
    4. Saf koloniler ayrı ayrı izole edilene kadar antibiyotikli PDA üzerinde 1.4.3 adımını iki veya üç kez tekrarlayın.
      NOT: Orijinal plakalarda birden fazla mantar türü büyürse, daha fazla mantar türünün sınıflandırılmasını kolaylaştırmak için miselyumu tam olarak çıkarın.
  5. Mantar izolatlarının depolanması
    1. Agar bloklarını (~ 5 mm çapında) kolonilerden yeni PDA plakalarına aktarın.
    2. 1-2 hafta boyunca 25 ± 1 ° C'de bir inkübatörde kültür.
    3. Daha sonra kullanmak üzere günlük saklama için 4 °C'lik bir buzdolabına koyun.
    4. Mantar suşlarını 250 mL'lik bir şişede 50 mL steril PDB'ye aşılayın, 5-7 gün boyunca 25 ° C'de 180 rpm / dk'da çalkalayın.
    5. Taze yetiştirilmiş mantar miselyumundan 1 mL hasat edin ve 2 mL steril dondurucu tüplerinde 1 mL sterilize edilmiş %20 gliserol içinde süspanse edin (nihai gliserol konsantrasyonu %10'dur).
    6. Tüpleri parafilm ile kapatın ve -20 °C ve -40 °C'de önceden soğutun. Ardından, tüpleri stok olarak -80 ° C'de tutun.

2. Mantar izolatlarının moleküler ve morfolojik olarak tanımlanması

  1. Mantar genomik DNA'sının ekstraksiyonu
    1. Adım 1.5.4'te açıklandığı gibi PDB'deki kültür mantarları.
    2. Miselyumu hasat edin ve PDB'den ayırmak için süzün. Önceden soğutulmuş bir havan ve havaneli kullanarak sıvı nitrojen içinde homojenize edin.
    3. Üreticinin talimatlarına göre Mantar Genomik DNA İzolasyon Kitini kullanarak genomik DNA'yı çıkarın (bkz. Malzeme Tablosu).
  2. PCR amplifikasyonu ve DNA dizilimi
    1. PCR reaksiyon karışımını şu şekilde hazırlayın: 25 μL Taq DNA polimeraz, 1 μL şablon, 2 μL ileri ve geri primer ve toplam 50 μL hacme kadar ddH2O.
    2. Aşağıdaki prosedürle ITS1 ve ITS434 primer çiftlerini kullanarak DNA örneğinin rDNA-ITS bölgesini amplifiye edin (bkz. Tablo 1): ilk denatürasyon 95 ° C'de 4 dakika, ardından 35 döngü denatüre etme 94 ° C'de 60 s, 58 ° C'de 60 s tavlama, 72 ° C'de 2 dakika uzama, ve 72 ° C'de 10 dakika boyunca son bir uzama.
    3. 100 V, 100 mA'da% 1.5 agaroz jel kullanılarak amplifiye edilmiş ürünlerin elektroforezi.
    4. PCR'yi sıralayın.
    5. Clustal X2.0 ve MEGA 6.0 kullanarak diziyi hizalayın.
      NOT: Sıra hizalaması sırasında, belirsiz hizalamaya sahip siteler hariç tutulur ve boşluklar eksik veri olarak kabul edilir.
    6. Elde edilen sekansı, Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI) web sitesinde BLAST kullanarak GenBank'taki ITS dizi veritabanındakilerle karşılaştırın. Mantar suşu tür bilgilerini önceden tanımlayın.
  3. Morfolojik Tanımlama
    1. PDA plakalarının hem ön hem de arka taraflarındaki olgun mantar saf koloni morfolojisini yakalamak için bir kamera kullanın.
    2. Saf kültür mantar kolonilerinden conidia'yı bir aşılama iğnesi ile koparın ve bir damla steril su ile bir cam slayta aktarın.
    3. Kapak fişini tutun ve ~ 45 ° 'lik bir açıyla yavaşça aşağı koyun, böylece kapak fişi numuneyi kabarcıklar olmadan kaplayabilir.
    4. Mantar kolonisinin kenarındaki kolonilerden bir neşter ile 5 mm'lik2 agar bloğu kesin ve bir damla steril su ile temiz bir cam slayta aktarın. Belirli yapıları görmek için mantarları ince bir iğne ile dikkatlice ayırın.
    5. Adım 2.3.3'ü tekrarlayın.
    6. Hiflerin, konidioforların, fialitlerin ve konidiaların şekli, şeffaflığı ve duruşu dahil olmak üzere mantarların aseksüel morfunu optik mikroskop (OM) altında gözlemleyin. Farklı mantar izolatlarını birbirinden ayırt etmek için aseksüel özelliklerin şeklini ve boyutunu kaydedin ve ölçün.
      NOT: Mantar yapılarını gözlemleme yeteneğini en üst düzeye çıkarmak için lekeler ve montaj ortamı35 kullanın.

3. Davranışsal fenotiplerini gözlemlemek için M. alternatus üzerinde mantar enfeksiyonu semptomlarının indüksiyonu

  1. Konidiyal süspansiyonun hazırlanması
    1. % 0.01 Tween-80'i saf su ile hazırlayın ve 121 ° C'de 25 dakika otoklavlayın. Soğuduktan sonra kullanın.
    2. 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne uygun miktarda steril küçük cam boncuk ve %0.01 Tween-80 solüsyonu ekleyin.
    3. Mantar kolonilerini tüpe kazıyın ve koloni parçalanana kadar bir girdap çalkalayıcı ile yeterince çalkalayın. Miselyumu çıkarmak için iki kat gazlı bezden süzün.
      NOT: Konidiyosporun %0.01 Tween-80 çözeltisinde süspansiyonunu sağlamak için çalkalama yapılır.
    4. OM altındaki spor sayısını bir hemositometre ile sayın, steril% 0.01 Tween-80 ile 1 ×10 8 konidiyal / mL'ye ayarlayın ve kullanım için 4 ° C'de tutun.
  2. Böceklerin hazırlanması
    1. Çam dallarını (yaklaşık aynı boyutta) otoklavlayın ve fırında (~ 60 °C) kurutun.
    2. Sahada toplanan M'yi saklayın. 25 ± 1 °C'de bir inkübatörde çam dalları olan alternatus yetişkinleri.
    3. Böcekleri 24 saat aç bırakın ve kullanmadan önce böceklerin yüzeyini çamaşır suyu, etanol ve damıtılmış su [10:10:80 (v:v)] ile sterilize edin.
  3. Mantar enfeksiyonunun indüksiyonu
    1. Temiz bir tezgah altında çalışın, çam dallarını 10 saniye boyunca konidiyal süspansiyona daldırın ve havada kurutun.
    2. Böcekleri 10 saniye boyunca konidiyal süspansiyona batırın, ardından 50 mL steril tüplere aktarın (tüp başına bir böcek ve bir dal). Dalları 2 günde bir yenileriyle değiştirin.
    3. Negatif kontrol için, konidiyal süspansiyonu sadece steril% 0.01 Tween-80 çözeltisine değiştirin. Her mantar suşu ve kontrol grubu için beş kopya yapın.
    4. Çam dallarında üretilen frass miktarına bağlı olarak böceklerin aktivitesini değerlendirin. Beslenme durduğunda, onları ölü olarak kabul edin.
    5. Ölü böcekleri yeni steril 50 mL'lik tüplere aktarın ve bir parça steril nemli pamuk yerleştirin. 25 ± 1 °C'de inkübe edin.
      NOT: Islak pamuk, nemi korumak için kullanılır, çünkü mantarların büyümesi uygun nem gerektirir, ancak çok fazla değildir.
    6. Böcek yüzeyinin değişimini her gün aynı saatte gözlemleyin ve fotoğraflayın.
  4. Mantar türlerini yeniden izole edin ve onaylayın
    1. Böceklerin yüzeyinde açık mantar enfeksiyonu fenotipleri görünene kadar, farklı dokulardan miselyumları ayrı ayrı yeni PDA plakalarına alın.
    2. 25 ± 1 °C'de kültürleyin ve morfolojinin aşılanmış mantarlarınkiyle tutarlı olduğundan emin olmak için gözlemleyin.
  5. Model böceğin tedavisi
    1. Yiyecek olarak buğday kepeği kullanarak model böcek Tribolium castaneum üzerinde 3.2.1-3.3.6 adımlarını tekrarlayın ve buğday kepeğini UV ışığı ile sterilize edin.
    2. Steril cımbızla böceklere hafifçe dokunun. Yanıt gelmezse öldüklerini varsayalım.

4. M. alternatus ve model böceği üzerindeki mantarların enfeksiyon fenotiplerini doğrulayın

  1. Gözlem için numune hazırlama
    1. Enfekte M'yi inceleyin. Alternatus kadavraları adım 1.3'teki gibi dikkatli bir şekilde.
    2. T'yi seçin. mantar enfeksiyonunun belirgin semptomları olan kastane cisimleri.
    3. PDA üzerinde büyüyen dört olgun mantar kolonisinin 5 mm'lik disk tapalarını kesin.
  2. Numune ön işlemi
    1. Tıaçları, enfekte böcek dokularını ve gövdeleri 2 gün boyunca 4 ° C'de önceden soğutulmuş %2,5 glutaraldehit içine koyun.
    2. Numuneleri 5 dakika boyunca% 0.1 fosfat tamponunda (pH 7.2-7.4) üç kez yıkayın ve% 30,% 50,% 70,% 80,% 90,% 95,% 100 etanolde 10 dakika boyunca dehidre edin.
    3. Numuneleri vakumlu dondurarak kurutucuda kurutun.
      NOT: Numune hasarını önlemek için kesme, ıslatma, dehidrasyon, yıkama ve kurutma dahil olmak üzere tüm ön işlem süreci dikkatli olmalıdır.
  3. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) gözlemi
    1. Ön işleme tabi tutulmuş numuneleri bir püskürtme kaplayıcı kullanarak platin ile kaplayın ve bir taramalı elektron mikroskobu36 altında gözlemleyin.
    2. PDA, M'de büyüyen hif ve conidia'nın morfolojik özelliklerini kaydedin. alternatus dokuları ve model böcek gövdeleri.
    3. Sonuçların adım 2.3'teki OM altındaki sonuçlarla tutarlı olup olmadığını karşılaştırın.

5. Entomopatojenik aktivitenin değerlendirilmesi

  1. Konidiyal süspansiyonun hazırlanması
    1. Konidiyal süspansiyonun hazırlanması, 3.1.1-3.1.4 adımlarındaki ile aynıdır.
  2. Model böceğin ön muamelesi
    1. Kültür, bes, sterilize ve aç bırak T. Adım 3.5.1'deki gibi kastaneum .
    2. Buğday kepeğini UV ile sterilize edin ve steril Petri kaplarına eşit ağırlık verin.
  3. Entomopatojenik aktivite testi
    1. Buğday kepeğine konidiyal süspansiyon uygulayın ve oda sıcaklığında temiz bir tezgah altında havada kurutun.
    2. daldırmak T. kastaneum böcekleri 10 saniye boyunca konidiyal süspansiyonda ve bunları bir Petri kabına aktarın (her Petri kabında n = 20). Yeni buğday kepeğini her 4 günde bir aynı konidiyal işlemle değiştirin.
    3. Negatif kontrol için sadece steril% 0.01 Tween-80 solüsyonu uygulayın.
      NOT: Her tedavi grubu ve kontrol için en az üç kopya ayırın.
    4. Ölü böcekleri günlük olarak sayın.
      NOT: Böceklere steril cımbızla hafifçe dokunun. Yanıt eksikliği varsa öldüklerini varsayalım.
  4. Çok genli filogenetik analiz
    1. Adım 2.1'de açıklandığı gibi entomopatojenik fungal genomik DNA'yı çıkarın.
      NOT: Model böceğe karşı önemli enfeksiyon fenotipleri ve güçlü entomopatojenik aktiviteler gösteren parazitik EPF'ler için çoklu gen tanımlaması yapılmıştır.
    2. Nükleer ribozomal SSU34 genini kapsayan bir bölge, büyük alt birim rRNA geninin (LSU37,38) bir segmenti, uzama faktörü 1-alfa (tef-1α39) geninin bir parçası, RNA polimeraz ІІ'nin (rpb240) ikinci en büyük alt birim dizileri ve β-tubulin41'in bir kısmı dahil olmak üzere aşağıdaki genleri amplifiye edin gen, sırasıyla NS1 / NS4, LR7 / LROR, EF-983F / EF-2218R, RPB2-5'F / RPB2-5'R ve TUB1 / TUB22 primer çiftleri kullanılarak (bkz. Tablo 1).
      1. PCR reaksiyon karışımını adım 2.2.1'deki gibi hazırlayın.
      2. Amplifikasyonu şu şekilde gerçekleştirin: 4 dakika boyunca 95 ° C'de ilk denatürasyon, ardından 35 döngü (tef-1α, rpb2, SSU), 38 döngü (LSU) veya 39 döngü (β-tübülin) 60 saniye boyunca 94 ° C'de denatüre etme, 60 saniye boyunca 47 ° C'de tavlama (LSU), 60 saniye için 55 ° C (tef-1α), 40 saniye için 54 ° C (β-tübülin) ve 30 saniye boyunca 50 ° C (rpb2, SSU), 72 °C'de 1 dakika uzama ve 72 °C'de 10 dakika son uzama.
    3. Adım 2.2.4-2.2.5'te gösterildiği gibi aynı adımları izleyerek sıralayın ve hizalayın.
    4. Maksimum Olabilirlik (ML) yöntemine42 dayalı olarak MEGA 6.0 ile filogenetik analizi gerçekleştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M'den mantar izolatlarının izolasyonu ve tanımlanması. alternatif
Cezbedici tuzakların yardımıyla, çok sayıda (toplamda yaklaşık 500 böcek) M. Alternatus beş coğrafi bölgeden toplanmıştır. Entomopatojenik mantarların neden olduğu tipik enfeksiyon semptomları olan böcek kadavraları toplandı; Daha sonra, her böceğin vücut bütünlükleri, protokol adımı 1.3'te açıklandığı gibi birkaç pozisyona diseke edildi. Sonuç olarak, farklı vücut pozisyonlarından 600'den fazla mant...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FWB'nin farklı coğrafi popülasyonları, EPF türlerinin yerel iklim faktörlerine uzun vadeli çevresel adaptasyonu ve konakçı böceğin spesifik genotipik popülasyonu nedeniyle doğal entomopatojenik mantarlarla çeşitli etkileşimler geliştirebilir44,45. Örnekleme alanlarının birden fazla böcek oluşum bölgesine genişletilmesi, tarımsal böcek zararlıları46 ile ilgili önceki çalışmalarda açıklandığı gibi, doğal kon...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma, Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2021YFC2600100) ve Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (LY21C040001) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL, 2 mL santrifüj tüpleriBiosharpBS-15-M
10 & mikro; L pipet uçlarıSangon BiotechF601216
10 & L, 20 ve mikro; L, 100 ve mikro; L, 200 ve mikro; L, 1.000 ve mikro; L pipetlerRainin
1.000 & mikro; L pipet uçlarıSangon BiotechF630102
2 mL kriyojenik şişelerCorning430659
20x PBS tamponuSangon BiotechB548117-0500
200 & mikro; L pipet uçlarıSangon BiotechF601227
2.000 bp yapıcıTaKaRarSD0531
50 mL tüplerNest602052
%50 glutaraldehit çözeltisiSangon BiotechG916054
50x TAE tamponuSangon BiotechB548101
6x yükleme tamponuTaKaRarSD0503
AgaroseSangon BiotechA610013
Susuz etanolJkchemicalLB10V37
Biyokimya Yetiştirme KabiniShanghaiyihengLRH-250F
KloroformJuhua61553
Ticari böcek tuzaklarıFEIMENGDIBF-8www.yinyouji.com
Jel görüntüleyiciBio-RadGelDoc XR +
GliserolSangon BiotechA600232
Yüksek hızlı soğutmalı santrifüjSigmaD-37520
Yüksek Basınçlı Buhar Sterilizasyon KabıMettler ToledoJA5003
İzopropil alkolGenel reaktifG75885B
Nükleik asit boyasıSangon BiotechA616696
Optik Mikroskop, OMLeicaDM2000
Parafilm ParafilmPM996
PCR metreİyileşme KuvvetiTrident960
Penisilin GMarklinGB15743
Patates dekstroz agar, PDAOxoidCM0139
Patates dekstroz suyu, PDBSolarbioP9240
PrimerSangon Biotech/
Primers TaqTaKaRarRR902A
Hızlı Mantarlar Genomik DNA İzolasyon KitiSangon BiotechB518229
Taramalı Elektron Mikroskobu, SEMHitachiS-3400N
StreptomisinMarklinS6153
TetrasiklinMarklinT829835
Tween-80MarklinT6336
Vakumlu dondurarak kurutucuYamatoDC801
Vorteks ÇalkalayıcıHLDWH-861
ve beta;-MerkaptoetanolMarklinM6230

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hajek, A. E., Bauer, L. S. Microbial control of wood-boring insects attacking forest and shade trees. Field Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. 10, 505-525 (2007).
  2. Linnakoski, R., Forbes, K. M. Pathogens-the hidden face of forest invasions by wood-boring insect pests. Frontiers in Plant Science. 10, 90(2019).
  3. Hulcr, J., Dunn, R. R. The sudden emergence of pathogenicity in insect-fungus symbioses threatens naive forest ecosystems. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 278 (1720), 2866-2873 (2011).
  4. Humble, L. M., Allen, E. A. Forest biosecurity: alien invasive species and vectored organisms. Canadian Journal of Plant Pathology. 10, 90(2006).
  5. Ahmed, R., Freed, S. Biochemical resistance mechanisms against chlorpyrifos, imidacloprid and lambda-cyhalothrin in Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Curculionidae). Crop Protection. 143, 105568(2021).
  6. Al-Ayedh, H., Hussain, A., Rizwan-Ul-Haq, M., Al-Jabr, A. M. Status of insecticide resistance in field-collected populations of Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Curculionidae). International Journal of Agriculture and Biology. 18 (01), 103-110 (2015).
  7. Garcia, F. R. M., Ovruski, S. M., Suarez, L., Cancino, J., Liburd, O. E. Biological control of Tephritid fruit flies in the Americas and Hawaii: a review of the use of parasitoids and predators. Insects. 11 (10), 662(2020).
  8. Lacey, L. A., Shapiro-Ilan, D. I. Microbial control of insect pests in temperate orchard systems: potential for incorporation into IPM. Annual Review of Entomology. 53, 121-144 (2008).
  9. Wang, Z. Z., Liu, Y. Q., Shi, M., Huang, J. H., Chen, X. X. Parasitoid wasps as effective biological control agents. Journal of Integrative Agriculture. 18 (4), 705-715 (2019).
  10. Islam, W., et al. Insect-fungal-interactions: a detailed review on entomopathogenic fungi pathogenicity to combat insect pests. Microbial Pathogenesis. 159, 105122(2021).
  11. Ali, S., Huang, Z., Ren, S. Production of cuticle degrading enzymes by Isaria fumosorosea and their evaluation as a biocontrol agent against diamondback moth. Journal of Pest Science. 83 (4), 361-370 (2010).
  12. Vidal, S., Jaber, L. R. Entomopathogenic fungi as endophytes: plant-endophyte-herbivore interactions and prospects for use in biological control. Current Science. 109 (1), 46-54 (2015).
  13. Rasool, S., et al. Seed inoculations with entomopathogenic fungi affect aphid populations coinciding with modulation of plant secondary metabolite profiles across plant families. New Phytololgist. 229 (3), 1715-1727 (2021).
  14. Dara, S. K., Montalva, C., Barta, M. Microbial control of invasive forest pests with entomopathogenic fungi: a review of the current situation. Insects. 10 (10), 341(2019).
  15. Rajula, J., Rahman, A., Krutmuang, P. Entomopathogenic fungi in Southeast Asia and Africa and their possible adoption in biological control. Biological Control. 151, 104399(2020).
  16. Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: a case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 16(2020).
  17. Echeverri-Molina, D., Santolamazza-Carbone, S. Toxicity of synthetic and biological insecticides against adults of the Eucalyptus snout-beetle Gonipterus scutellatus Gyllenhal (Coleoptera: Curculionidae). Journal of Pest Science. 83 (3), 297-305 (2010).
  18. Yang, T. H., et al. Entomopathogenic fungi-mediated biological control of the red palm weevil Rhynchophorus ferrugineus. Journal of Asia-Pacific Entomology. 26 (1), 102037(2023).
  19. Kepler, R. M., et al. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
  20. Zhou, Y. M., Zhi, J. R., Qu, J. J., Zou, X. Estimated divergence times of Lecanicillium in the family Cordycipitaceae provide insights into the attribution of Lecanicillium. Frontiers in Microbiology. 13, 859886(2022).
  21. Montalva, C., et al. Lecanicillium attenuatum isolates affecting the invasive cypress aphid (Cinara cupressi) in Chile. BioControl. 62 (5), 625-637 (2017).
  22. Futai, K. Pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 61-83 (2013).
  23. Kobayashi, F., Yamane, A., Ikeda, T. The Japanese pine sawyer beetle as the vector of pine wilt disease. Annual Review of Entomology. 29 (1), 115-135 (1984).
  24. Zhao, L., Sun, J. Pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus. (Steiner and Buhrer) Nickle. Biological invasions and its management in China. 13, 3-21 (2017).
  25. Akbulut, S., Stamps, W. T. Insect vectors of the pinewood nematode: a review of the biology and ecology of Monochamus species. Forest Pathology. 42 (2), 89-99 (2012).
  26. Shimazu, M. Effects of temperature on growth of Beauveria bassiana F-263, a strain highly virulent to the Japanese pine sawyer, Monochamus alternatus, especially tolerance to high temperatures. Applied Entomology and Zoology. 39 (3), 469-475 (2004).
  27. Han, B., Piao, C. G., Wang, L. F., Li, Y., Zheng, R. Z. Survey, identification and virulence test of pathogens of the pine sawyer beetle, Monochamus alternatus, at forest farm of maanshan, anhui province. Forest Research. 20 (20), 204-208 (2007).
  28. Ma, L., Zhang, L., Lin, H., Mao, S. Investigation of pathogens of Monochamus alternatus in east China and virulence. Chinese Journal of Biological Control. 25 (3), 220-224 (2009).
  29. Alvarez-Baz, G., Fernandez-Bravo, M., Pajares, J., Quesada-Moraga, E. Potential of native Beauveria pseudobassiana strain for biological control of pine wood nematode vector Monochamus galloprovincialis. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 48-56 (2015).
  30. Dong, Y., Xie, P., Zheng, K., Gu, Y., Fan, J. Teflon coating and anti-escape ring improve trapping efficiency of the longhorn beetle, Monochamus alternatus. Applied Sciences. 13 (3), 1664(2023).
  31. Gul, H. T., Saeed, S., Khan, F. Z. A. Entomopathogenic fungi as effective insect pest management tactic: a review. Applied Sciences and Business Economics. 1 (1), 10-18 (2014).
  32. Takuji Noma Strickler, K. Effects of Beauveria bassiana on Lygus hesperus (Hemiptera: Miridae) feeding and oviposition. Environmental Entomology. 29 (2), 394-402 (2000).
  33. Thakur, R., Sandhu, S. S. Distribution, occurrence and natural invertebrate hosts of indigenous entomopathogenic fungi of Central India. Indian Journal of Microbiology. 50 (1), 89-96 (2010).
  34. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols. 18 (1), 315-322 (1990).
  35. Zaman, G., Chayen, J. An aqueous mounting medium. Journal of Clinical Pathology. 34 (5), 567-568 (1981).
  36. Koon, M. A., et al. Preparation of prokaryotic and eukaryotic organisms using chemical drying for morphological analysis in scanning electron microscopy (SEM). Journal of Visualized Experiments. (143), e58761(2019).
  37. Vilgalys, R., Hester, M. Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species. Journal of Bacteriology. 172 (8), 4238-4246 (1990).
  38. Rehner, S. A., Samuels, G. J. Taxonomy and phylogeny of Gliocladium analysed from nuclear large subunit ribosomal DNA sequences. Mycological Reasearch. 98 (6), 625-634 (1994).
  39. Aphidech, S., Kusavadee, S. Isolation, identification, culture and production of adenosine and cordycepin from cicada larva infected with entomopathogenic fungi in Thailand. African Journal of Microbiology Research. 7 (2), 137-146 (2013).
  40. Wang, Y., et al. Polycephalomyces yunnanensis (Hypocreales), a new species of Polycephalomyces parasitizing Ophiocordyceps nutans and stink bugs (hemipteran adults). Phytotaxa. 208 (1), (2015).
  41. Qi, M., Xie, C. X., Chen, Q. W., Yu, Z. D. Pestalotiopsis trachicarpicola, a novel pathogen causes twig blight of Pinus bungeana (Pinaceae) in China. Antonie Van Leeuwenhoek. 114 (1), 1-9 (2021).
  42. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution. 30 (12), 2725-2729 (2013).
  43. Wu, S., et al. Discovery of entomopathogenic fungi across geographical regions in southern China on pine sawyer beetle Monochamus alternatus and implication for multi-pathogen vectoring potential of this beetle. Frontiers in Plant Science. 13, 1061520(2022).
  44. Brodeur, J. Host specificity in biological control: insights from opportunistic pathogens. Evolutionary Applications. 5 (5), 470-480 (2012).
  45. Croll, D., Mcdonald, B. A. The genetic basis of local adaptation for pathogenic fungi in agricultural ecosystems. Molecular Ecology Resources. 26 (7), 2027-2040 (2017).
  46. Perez-Gonzalez, V. H., et al. Specific diversity of the entomopathogenic fungi Beauveria and Metarhizium in Mexican agricultural soils. Journal of Invertebrate Pathology. 119, 54-61 (2014).
  47. Debono, M., Gordee, R. S. Antibiotics that inhibit fungal cell wall development. Reviews of Microbiol. 48, 471-497 (1994).
  48. Li, S., et al. Exploring the accuracy of amplicon-based internal transcribed spacer markers for a fungal community. Molecular Ecology Resources. 20 (1), 170-184 (2019).
  49. Wan, J., Dai, Z., Zhang, K., Li, G., Zhao, P. Pathogenicity and metabolites of endoparasitic nematophagous fungus Drechmeria coniospora YMF 1.01759 against nematodes. Microorganisms. 9 (8), 1735(2021).
  50. Ammon, V., Wyllie, T. D., Brown, M. F. Investigation of the infection process of macrophomina phaseolina on the surface of soybean roots using scanning electron microscopy. Mycopathologia. 55 (2), 77-81 (1975).
  51. Throne, J. E., Hallman, G. J., Johnson, J. A., Follett, P. A. Post-harvest entomology research in the United States department of agriculture-agricultural research service. Pest Management Science. 59 (6-7), 619-628 (2003).
  52. Silver, K., et al. The Tribolium castaneum cell line TcA: a new tool kit for cell biology. Scientific Reports. 4 (1), 6840(2014).
  53. Fatehi, S., et al. Characterization of iflavirus in the red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera; Tenebrionidae). Insects. 14 (3), 220(2023).
  54. Li, C., et al. Identification and characterization of development-related microRNAs in the red flour beetle, Tribolium castaneum. International Journal of Molecular Sciences. 24 (7), 6685(2023).
  55. Li, J., et al. The TGF-β receptor gene saxophone influences larval-pupal-adult development in Tribolium castaneum. Molecules. 27 (18), 6017(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Entomopathogenic FungiForest Wood BorersMonochamus AlternatusFungal IsolationPathogenicity AssessmentScanning Electron MicroscopyMolecular IdentificationParasitic FungiPhylogenetic AnalysisInsect Pathogenicity

Related Articles