Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Serebral Kan Pıhtılarının Hücre Bileşenlerini Analiz Etmek İçin Kapsamlı Bir Yaklaşım

1.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/65791

⸱

21 Temmuz 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Emergency Department, Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University, 2Medicine School, Huaqiao University, 3Department of Haematology, Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University, 4Department of Laboratory Medicine, Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu çalışma, pıhtı eritme, hücre boyama ve rutin kan muayenesi yoluyla serebral kan pıhtılarının hücre bileşen analizi için hızlı ve etkili bir yöntemi tanımlamaktadır.

Özet

Serebral arter veya damardaki bir kan pıhtısı olan serebral tromboz, en yaygın serebral enfarktüs türüdür. Serebral kan pıhtılarının hücre bileşenlerinin incelenmesi tanı, tedavi ve prognoz için önemlidir. Bununla birlikte, pıhtıların hücre bileşenlerini incelemeye yönelik mevcut yaklaşımlar, esas olarak, hücreler pıhtılara sıkıca sarıldığı için hücre bileşenlerinin kapsamlı çalışması için uygun olmayan in situ boyamaya dayanmaktadır. Önceki çalışmalar, çapraz bağlı fibrini doğrudan parçalayarak hücre bileşenlerini serbest bırakabilen bir fibrinolitik enzimi (sFE) Sipunculus nudus'tan başarıyla izole etmiştir. Bu çalışma, serebral trombüsün hücre bileşenlerini incelemek için sFE'ye dayalı kapsamlı bir yöntem oluşturmuştur. Bu protokol pıhtı eritme, hücre salma, hücre boyama ve rutin kan incelemesini içerir. Bu yönteme göre, hücre bileşenleri nicel ve nitel olarak incelenebilir. Bu yöntemi kullanan deneylerin temsili sonuçları gösterilmektedir.

Giriş

Serebrovasküler hastalık, insan sağlığını tehdit edebilen üç ana hastalıktan biridir ve bunların arasında iskemik serebrovasküler hastalık% 80'den fazlasını oluşturur. Serebral tromboz ve serebral ven trombozu, günümüzde en çok endişe duyulan iskemik serebrovasküler hastalıklardırve esas olarak serebral kan pıhtılarının neden olduğu 1,2. Tedavi uygun şekilde yapılmazsa, yüksek sakatlık ve mortalite oranlarına ve taburculuk sonrası yüksek nüks oranına sahip olacaktır3.

Son zamanlarda, giderek artan sayıda çalışma, serebral kan pıhtılarının hücre bileşenlerinin serebral trombozun tanısı, tedavisi ve prognozu ile sıkı bir şekilde ilişkili olduğunu göstermiştir 4,5,6. Bu nedenle, trombüs bileşimi, özellikle hücre bileşenleri ile ilgili verilerin mevcudiyeti klinik tanı ve tedavi için önemlidir. Ne yazık ki, şu anda mevcut olan yöntemler, kan pıhtısı bileşenini nicel ve nitel olarak kapsamlı bir şekilde analiz edememektedir. Örneğin, Martius Scarlett Blue bazlı in-situ boyama, pıhtının yalnızca belirli dilimlerinin kırmızı/beyaz kan hücrelerini inceleyebilir7. İmmünohistokimya (IHC) tabanlı in-situ boyama, antikorlarını kullanarak pıhtının yalnızca belirli dilimlerinin sınırlı kan bileşenlerini inceleyebilir8. Mikroskobik görüntüye dayalı yöntemler sadece pıhtının spesifik yapısıyla ilgilidir9. Üstelik tüm bu yöntemler zahmetli ve zaman alıcıdır10. Bugüne kadar, serebral trombüs hücre bileşenlerini kantitatif ve kalitatif olarak incelemek için prosedürler bildirilmemiştir. Çapraz bağlı fibrinin pıhtılardaki kan hücrelerini sıkıca sardığı yaygın olarak kabul edilmektedir11. Sonuç olarak, çapraz bağlı fibrinin spesifik bozunması ve sağlam hücrelerin salınması, hücre bileşenlerinin doğru analizi için kritik öneme sahiptir.

Önceki çalışmalar, fibrini spesifik ve hızlı bir şekilde parçalayabilen Sipunculus nudus'tan (sFE) bir fibrinolitik enzimi izole etti12. Burada, sFE'nin benzersiz aktivitesine dayalı olarak serebral trombüsün hücre bileşenlerini analiz etmek için bir yöntem önerilmiştir. Bu protokol, önce pıhtıların fibrinini parçalamak için sFE'yi kullandı ve daha sonra hücre bileşenlerini Wright'ın Boyama ve rutin kan muayenesiile analiz etti 13,14. Bu yönteme göre, serebral trombüsün hücre bileşenleri kantitatif ve kalitatif olarak incelenebilir. Bu basit ve etkili protokol, diğer kan pıhtılarının hücre bileşen analizi için uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Araştırma, Huaqiao Üniversitesi Tıbbi Etik Komitesi'nin kurumsal yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi. Serebral kan pıhtıları cerrahi olarak çıkarıldı ve Fujian Tıp Üniversitesi'ne bağlı Quanzhou Birinci Hastanesi'nde hastalardan bilgilendirilmiş onam alınarak toplandı.

1. Kan pıhtısı ön tedavisi

  1. Pıhtıları temiz bir tabağa koyun, cımbızla 5 mL fizyolojik salin ekleyin, tabağı hafifçe sallayın ve salini bir pipetle çıkarın.
    NOT: Durulamayı üç kez tekrarlayın.
  2. Pıhtıları bir makasla daha küçük parçalar halinde (5 mm x 5 mm x 5 mm'den küçük) kesin. 5 mL fizyolojik salin ekleyin, tabağı hafifçe çalkalayın ve salini bir pipetle çıkarın.
    NOT: Durulamayı üç kez tekrarlayın. Durulama sırasında pıhtı parçalarının aspire edilmediğinden emin olun.
  3. Pıhtıları başka bir temiz U plakasına aktarın.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir (plakayı 2-8 °C'de saklayın) ve daha sonra yeniden başlatılabilir.

2. Tromboliz

  1. Fizyolojik salin ile sFE konsantrasyonunu 2000 U/mL'ye ayarlayarak sFE çalışma solüsyonunu hazırlayın.
    NOT: sFE, Tang Lab15'in köklü protokollerine göre hazırlanmıştır.
  2. Ön işlem görmüş pıhtılara 300 μL sFE çalışma solüsyonu ekleyin.
  3. İlk bozulma turunu gerçekleştirin.
    1. sFE ve pıhtı karışımını 37 °C'de 0,5 saat inkübe edin.
      NOT: Serum fizyolojik ile tedavi edilen leke negatif kontrol olarak ayarlandı. S'yi döndürmeyinampçalkalayıcı üzerinde.
    2. Numuneyi yavaşça karıştırın. Sıvı parçayı temiz bir pipetle başka bir temiz tüpe aktarın.
      NOT: Kalan pıhtılar başka bir bozunma turu için kullanıldı.
    3. Sıvı kısmı 200 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
    4. Geri kazanılan sFE çözeltisini elde etmek için süpernatanı bir pipetle başka bir temiz tüpe aktarın.
    5. Hücre çökelmesini 50 μL fizyolojik salin ile hafifçe karıştırın.
      NOT: Hücre karışımı daha sonra kullanılmak üzere 2-8 °C saklanmıştır.
  4. Sonraki bozulmayı gerçekleştirin.
    1. Kalan pıhtıları (adım 2.3.2) geri kazanılan sFE çözeltisi (adım 2.3.4) ile 37 °C'de 0,5 saat boyunca bozun.
      NOT: Geri kalan adımlar ilk bozma turuyla aynıydı. Tüm pıhtılar parçalanana kadar bozunma işlemi tamamlandı.
  5. Hücre toplama işlemini gerçekleştirin.
    1. Her bozunma turunun hücre karışımını toplayarak kan hücresi örneğini hazırlayın.

3. Wright'ın lekelenmesi

  1. Hücre yayması yapın.
    1. Hücreleri 1 x 106 hücre/mL yoğunluğa ayarlayın.
    2. Poli-L lizin kaplı cam slayta 5 μL hücre ekleyin, ardından kapak fişini kullanarak bunları sürün.
    3. Sıvıyı oda sıcaklığında buharlaştırın.
  2. Boyamayı gerçekleştirin.
    1. Hücre yaymasına nazikçe 200 μL Wright boyası ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve eşit şekilde karıştırmak için 600 μL Wright boyası B ekleyin.  Oda sıcaklığında 10 dakika boyayın.
    2. Boyayı temiz suyla nazikçe durulayın.
      NOT: Lekeli hücre yayması daha sonra kullanılmak üzere oda sıcaklığında saklanabilir.
  3. Mikroskobik görüntüleme yapın.
    1. Lekeli hücreleri bir ışık mikroskobu kullanarak inceleyin (bkz.

4. Rutin kan muayenesi

  1. Hücreleri 1 x 106 hücre/mL yoğunluğa ayarlayın.
  2. Trombositler, eritrositler, beyaz kan hücreleri, lenfositler, nötrofiller, monositler, eozinofiller, bazofiller ve olgunlaşmamış granülositler gibi hücre bileşenlerini üreticinin talimatlarına göre bir otohematoloji analizörü kullanarak analiz edin (bkz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bozunma sürecinin ilk aşamasında, kan pıhtılarının kırmızı kompakt bir yapıya sahip olduğu ve çalışma çözeltisinin renksiz olduğu bulundu. 30 dakika inkübasyondan sonra, çalışma çözeltisi açık kırmızıya döndü, bu da çapraz kan hücrelerinin çalışma çözeltisine salındığını gösterdi. Kuluçka süresi 5 saate uzatıldığında çoğu pıhtı çözüldü ve çalışma çözeltisi açık kırmızı oldu. Aksine, 10 saatlik inkübasyondan sonra bile fizyolojik salin grubunda (NC) önemli bir değişiklik olmadı (Şekil 1). Bu ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

sFE, fibrini doğrudan ve etkili bir şekilde parçalayabilen fibrinolitik bir ajandır12,16. Burada, serebral kan pıhtılarının çapraz bağlı fibrinini parçalamak, pıhtıların içindeki kapalı hücreleri serbest bırakmak ve pıhtıların hücre bileşenlerini kalitatif ve kantitatif olarak analiz etmek için sFE kullanıldı. Mikroskopi verileri ve rutin kan muayenesi, kapalı hücrelerin kan pıhtılarından salındığını gösterdi. Ayrıca, salınan hücrelerin hücre tipleri ve yapıları ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu araştırma, Xiamen Şehri Bilim ve Teknoloji Bürosu (3502Z20227197) ve Fujian Eyaleti Bilim ve Teknoloji Bürosu (No. 2019J01070, No.2021Y0027) tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Aglütinasyon Reaksiyon PlakasıROTESTRTB-4003
Otomatik Hematoloji Analiz CihazıSYSMEXXNB2
Otomatik Dikey Basınçlı Buhar Sterilizatörü  SANYOMLS-3750
Santrifüj Tüpü (1.5 mL)BiosharpBS-15-M Temiz
tezgahAIRTECHBLB-1600
Sabit Sıcaklık İnkübatörüJINGHONGJHS-400
Kültür Kabı (100 mm)NEST704001
DHG Serisi Isıtma ve Kurutma Fırını SENXINDGG-9140AD
Elektronik Analitik TeraziDENVERTP-213
Filtre Membranı (0.22 & mikro; m)Millex GPSLGP033NK
Mikro Soğutmalı Santrifüj & nbsp;CenceH1650-W
Mikroskop SlaytlarıCITOGLAS01-30253-50
Mili-Q ReferansMilliporeZ00QSV0CN
Normal SalinCISENH37022337
Optik MikroskopNikonECLIPSE E100
ParafilmBemisPM-996
Fosfat Tamponlu SalinBeyotimeC0221A
Pipet Ucu (1 mL )AxygeneT-1000XT-C
Pipet Ucu (200 & mikro; L)AxygeneT-200XT-C
Pipetleyici (1 mL)Thermo Fisher ScientificZY18723
; L)Thermo Fisher ScientificZY20280
NeşterMARTOR23111
Küçük Boyutlu Vorteks OsilatörüKylin-BellVORTEX KB3
CımbızHipstikHKQS-180
Wright Boyama SolüsyonuBeyotimeC0135-500ml
Pipetleyici (200 & mikro

Kaynaklar

  1. Park, D. W., et al. Edoxaban versus dual antiplatelet therapy for leaflet thrombosis and cerebral thromboembolism after TAVR: The ADAPT-TAVR Randomized clinical trial. Circulation. 146 (6), 466-479 (2022).
  2. Devasagayam, S., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. Cerebral venous sinus thrombosis incidence is higher than previously thought: a retrospective population-based study. Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).
  3. Sacco, R. L., et al. An updated definition of stroke for the 21st century: a statement for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 44 (7), 2064-2089 (2013).
  4. Thalin, C., Hisada, Y., Lundstrom, S., Mackman, N., Wallen, H. Neutrophil extracellular traps: villains and targets in arterial, venous, and cancer-associated thrombosis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 39 (9), 1724-1738 (2019).
  5. Mocsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. Journal of Experimental Medicine. 210 (7), 1283-1299 (2013).
  6. Dhanesha, N., et al. PKM2 promotes neutrophil activation and cerebral thromboinflammation: therapeutic implications for ischemic stroke. Blood. 139 (8), 1234-1245 (2022).
  7. Ducroux, C., et al. Thrombus neutrophil extracellular traps content impair tpa-induced thrombolysis in acute ischemic stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
  8. Solomon, C., Ranucci, M., Hochleitner, G., Schochl, H., Schlimp, C. J. Assessing the methodology for calculating platelet contribution to clot strength (platelet component) in thromboelastometry and thrombelastography. Anesthesia and Analgesia. 121 (4), 868-878 (2015).
  9. Daraei, A., et al. Automated fiber diameter and porosity measurements of plasma clots in scanning electron microscopy images. Biomolecules. 11 (10), 1536(2021).
  10. Abbasi, M., et al. Diverse thrombus composition in thrombectomy stroke patients with longer time to recanalization. Thrombosis Research. 209, 99-104 (2022).
  11. C W Francis, a, Marder, V. J. Concepts of clot lysis. Annual Review of Medicine. 37 (1), 187-204 (1986).
  12. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
  13. Fotso Fotso, A., Drancourt, M. Laboratory Diagnosis of tick-borne african relapsing fevers: latest developments. Front Public Health. 3, 254(2015).
  14. Liou, G. Y., Byrd, C. J. Diagnostic bioliquid markers for pancreatic cancer: What we have vs. what we need. Cancers (Basel). 15 (9), 2446(2023).
  15. Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. Journal of Visualized Experiments. 196, e65631(2023).
  16. Ge, Y. H., et al. A Novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus Nudus. International Journal Of Molecular Sciences. 19 (10), 3023(2018).
  17. Talukder, M. A., Menyuk, C. R., Kostov, Y. Distinguishing between whole cells and cell debris using surface plasmon coupled emission. Biomedical Optics Express. 9 (4), 1977-1991 (2018).
  18. Shapiro, D. J., Hicks, L. A., Pavia, A. T., Hersh, A. L. Antibiotic prescribing for adults in ambulatory care in the USA, 2007-09. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (1), 234-240 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Serebral TrombozKan P ht s AnaliziH cre Bile eni AnaliziFibrinolitik EnzimP ht z nmesiH cre BoyamaWright BoyamaI k MikroskobisiKantitatif H cre AnaliziTrombosit Tan mlama
Serebral Kan Pıhtılarının Hücre Bileşenlerini Analiz Etmek İçin Kapsamlı Bir Yaklaşım
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.