SARS-CoV-2 Varyantlarının Hızlı Miktar Tayini ve Nötralize Edici Antikorlar için Ha-CoV-2 Psödovirüsünün Uygulanması

Mayıs 2023 itibariyle, şu anda 766 milyondan fazla COVID-19 vakası olmuştur¹. Dünya çapındaki aşılama kampanyalarına rağmen, SARS-CoV-2, büyük ölçüde Delta (B.1.617.2) ve Omicron (B.1.1.529) gibi yeni enfeksiyon dalgalarına neden olan yeni varyantların ortaya çıkması nedeniyle sürekli olarak dolaşır ve insanları enfekte eder ^2,3,4. SARS-CoV-2'nin sürekli geliştiği göz önüne alındığında, ortaya çıkan varyantların bulaşıcılığını ve bu varyantlara karşı aşı kaynaklı nötralize edici antikorların etkinliğini doğru bir şekilde ölçebilen hızlı tahliller geliştirmek önemlidir. Bu tahliller, pandemik sürveyans ve aşıların ve varyanta özgü güçlendiricilerin etkinliğini belirlemek için gereklidir.

SARS-CoV-2'nin son derece bulaşıcı doğası nedeniyle, Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezi (CDC), SARS-CoV-2 ve varyantlarının incelenmesinin biyogüvenlik seviyesi (BSL) 3 tesislerinde ^5,6 yürütülmesini şart koşmaktadır. Bu BSL-3 gereksinimi, yaygın araştırma ve klinik laboratuvarlarda viral varyantların bulaşıcılığını ve bunların nötralize edici antikorlarını ölçmek için canlı virüslerin kullanımını sınırlar. Ek olarak, replikasyona yetkin canlı virüsler kullanan plak veya sitopatik etkiye dayalı testler gibi geleneksel SARS-CoV-2 nötralizasyon testleri zaman alıcıdır ve uzun kuluçka süreleri gerektirir⁷. Nötralize edici antikorların etkinliğini ölçmek için birkaç spike (S) proteini psödotipli SARS-CoV-2 psödovirüsü^{geliştirilmiştir} 8,9,10,11,12. SARS-CoV-2'de S proteini, viral giriş^13'e aracılık eden ana proteindir ve SARS-CoV-2 aşılarında kullanılan ana antijendir 9,10,14,15,16. Veziküler stomatit virüsü (VSV-G) veya lentivirüs gibi S proteini psödotipli viryonlar, nötralize edici antikorların ^17,18,19 miktar tayini için kullanılmıştır. Bununla birlikte, lentivirüs bazlı psödovirüs, raportör sinyallerini ölçmek için normalde 2 ila 3 günlük enfeksiyon gerektirir. VSV tabanlı psödovirüs sistemleri genellikle yüksek oranda yanlış pozitif sonuçlara neden olabilen ve tipik olarak 24 saat enfeksiyon gerektiren kalıntı VSV virüsleri içerir²⁰.

Yeni bir SARS-CoV-2 psödovirüs sistemi, hibrit alfavirüs-SARS-CoV-2 psödovirüsü (Ha-CoV-2), yakın zamanda Hetrick ve ark.¹² tarafından geliştirilmiştir. Ha-CoV-2, yaygın BSL-2 laboratuvarlarında virüs enfektivitesinin ve nötralize edici antikorlara karşı virüs duyarlılığının hızlı bir şekilde ölçülmesi için yeni bir araç sağlar. Yapısal olarak Ha-CoV-2, S proteini (S), zar (M), nükleokapsid (N) ve zarf (E) dahil olmak üzere SARS-CoV-2 yapısal proteinlerinden oluşan SARS-CoV-2 virion partikülüne benzer ve diğer virüslerden yapısal protein yoktur. Ek olarak, Ha-CoV-2 partikülü, hücrelerde hızlı raportör ekspresyonu için bir alfavirüsten hızlı eksprese eden bir RNA genomu içerir. Ha-CoV-2'nin aşılanmış ve iyileşen bireylerin serumlarındaki antikorların nötralize edici aktivitesini hızlı bir şekilde ölçtüğü gösterilmiştir¹². Hetrick ve arkadaşları tarafından gösterildiği gibi, bir zaman seyri tahlilinde lentivirüs bazlı SARS-CoV-2 psödovirüsü ile karşılaştırıldığında, Ha-CoV-2, Luc muhabirini enfeksiyondan 2-4 saat sonra eksprese ederken, lentivirüs-psödovirüs Luc'u 24 saat sonra^{eksprese etti 12}. Ek olarak, nötralize edici antikorların miktarını belirlemek için Ha-CoV-2 varyantlarının potansiyel uygulaması, standart bir monoklonal nötralize edici antikor olan 27BV kullanılarak daha da gösterilmiştir ( Bkz. Ek Şekil 1)¹². Bu çalışma, Delta (B.1.617.2) ve Omicron (B.1.1.529) varyantlarını örnek olarak kullanarak, SARS-CoV-2 varyantlarının bulaşıcılığının hızlı bir şekilde ölçülmesi için Ha-CoV-2 platformunun kullanımını detaylandırmaktadır. Ek olarak, nötralize edici antikorların miktarını belirlemek için Ha-CoV-2 varyantlarının potansiyel uygulaması, standart bir monoklonal nötralize edici antikor olan 27BV¹² kullanılarak daha da gösterilmiştir.

1. Virüs ve viral parçacık montajı

1. Vektörler: SARS-CoV-2 M, E veya N'nin yanı sıra SARS-CoV-2 S (Vahşi tip, Wt), Delta (B.1.617.2) ve Omicron (B.1.1.529) için ticari olarak ekspresyon vektörleri satın alın.
   NOT: Ekspresyon vektörlerinin protein dizileri Ek Dosya 1'de verilmiştir. Bu ifade vektörlerinin satıcısı Malzeme Tablosu altında da bulunabilir.
2. Hücreler ve hücre kültürü: Dulbecco'nun %10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS), 50 birim / mL penisilin ve 50 μg / mL streptomisin içeren modifiye Eagle ortamında (DMEM) HEK293T hücreleri koruyun.
   NOT: Tüm hücre kültürü çalışmalarının laminer hava akımı biyogüvenlik kabininde yapılması gerekir. Polietilenimin (PEI) transfeksiyonu tipik olarak 5-6 saat inkübasyon gerektirir. Başlangıç zamanları önceden dikkatlice düşünülmelidir.
3. Virüs montajı ve PEI bazlı kotransfeksiyon: Ha-CoV-2 partiküllerini HEK293T hücrelerin birlikte transfeksiyonu ile birleştirin. Kotransfeksiyondan bir gün önce 10 mL tam DMEM ortamında 10 cm'lik bir hücre kültürü Petri kabında (tabak başına^{4-5 x 10 6} hücre) tohum hücreleri. Bu çalışma için, sırasıyla Ha-CoV-2 vahşi tip, Delta ve Omicron'un montajı için hücreleri tohumlamak için üç Petri kabı kullanılmıştır.
4. Petri kaplarını gece boyunca 37 °C'de bir CO₂ inkübatöründe inkübe edin. Hücrelerin %80 oranında birleştiğinden emin olmak için ertesi sabah bulaşıkları kontrol edin. Ortamın tamamını çıkarın ve 9 mL DMEM serumsuz besiyeri ile değiştirin.
5. Her yemek için, SARS-CoV-2 yapısal protein ekspresyon vektörlerinin (N, E, M) her birinden 2,5 μg, 10 μg pAlphaPro-Luc-GFP-PreΨ (HaCoV2 Genomu) ve 2,5 μg S protein ekspresyon vektörü, Delta veya Omicron S varyantları ve 45 μL PEI bazlı transfeksiyon reaktifi içeren bir kotransfeksiyon karışımı hazırlayın. Kotransfeksiyon karışımının 13 dakika inkübe ederek kompleksler oluşturmasına izin verin (30 dakikadan fazla inkübe etmeyin).
6. İnkübasyondan sonra, kotransfeksiyon karışımını her bir Petri kabına yavaşça, damla damla ekleyin. Bulaşıkları 37 °C'de 6 saat boyunca bir CO₂ inkübatörüne yerleştirin. 6 saat sonra serumsuz DMEM'i çıkarın ve tam DMEM ortamı ile değiştirin. Kotransfeksiyondan 48-60 saat sonra virüsü hasat edin.
7. Virüs toplama ve depolama: Kotransfeksiyondan 48 saat sonra parçacıkları hasat edin. Tek tabakanın yüzeyine tekrar tekrar pipetleyerek hücreleri ayırın ve her bir tabaktan hücreleri toplayın, 15 mL'lik santrifüj tüplerine koyun ve 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı toplayın ve 0.22 μM'lik bir filtreden geçirin. Ha-CoV-2 psödovirüsünü -80 °C'de saklayın.

2. Viral enfektivite testi

1. Hücreler ve hücre kültürü: Dulbecco'nun %10 ısıyla etkisiz hale getirilmiş FBS, 50 birim / mL penisilin ve 50 μg / mL streptomisin içeren modifiye Eagle ortamında (DMEM) HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücrelerini koruyun.
2. Tohumlama HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücreleri: Viral enfektivite testinden bir gün önce, 50 μL tam DMEM ortamında 96 oyuklu bir plakada tohum HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücreleri. Her 96 oyuklu plaka için, her oyuğa 2,5 x 10⁴ hücre tohumlayın ve bir plaka için toplam 2,5 x 10⁶ hücre gerekir. 96 oyuklu plakayı gece boyunca 37 °C'de bir CO₂ inkübatöre yerleştirin.
3. HEK293T enfeksiyonu (ACE2 / TMPRSS2): HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücrelerini enfekte etmek için Ha-CoV-2 varyant partiküllerini kullanın. Enfeksiyon sabahı, önceden tohumlanmış 96 oyuklu plakadan 50 μL DMEM çıkarın. Ortamı 37 °C'de 18 saat boyunca 50 μL Ha-CoV-2 Wild tipi, Delta veya Omicron ile değiştirin.
   NOT: Enfeksiyon 18 saatlik inkübasyona ulaşana ve plaka Luciferaz Testi ile analiz edilmeye hazır olana kadar protokol burada durdurulabilir. Enfeksiyonun başarısı, enfekte hücrelerde eksprese edilen Luciferase raportör geninden kaynaklanan Luciferaz testi ile belirlenir, bu nedenle ne kadar çok sinyal üretilirse, Ha-CoV-2 varyantının enfeksiyonu o kadar başarılı olur.
4. Lusiferaz deneyi: 18 saatlik inkübasyondan sonra, her bir oyuğa doğrudan 7.5 μL hücre lizis tamponu ekleyin ve 2 dakika boyunca orbital çalkalayarak karıştırın. Lizis içindeki hücreler, oda sıcaklığında en az 5 dakika bekletilir.
5. D-lusiferin çözeltisini Firefly lusiferaz test çözeltisi ile 1:50 oranında karıştırarak Firefly lusiferaz test çözeltisini hazırlayın. 96 oyuklu bir plaka için, 3 mL lusiferaz substrat çözeltisini 60 μL D-lusiferin çözeltisi ile 2940 μL Firefly lusiferaz tampon çözeltisi ile birleştirin.
6. Hücre lizatlarına 25 μL Firefly lusiferaz tahlil çözeltisi ekleyin ve plakayı 1 dakika boyunca yörüngesel çalkalayarak karıştırın. Ticari bir lusiferaz mikroplaka okuyucu kullanarak lusiferaz aktivitesini analiz edin.

3. Ha-CoV-2 ve kantitatif ters transkriptaz PCR'nin (RT-qPCR) RNA ekstraksiyonu

1. Viral RNA ekstraksiyonu: Üreticinin talimatlarını izleyerek ticari bir viral RNA ekstraksiyon kiti kullanarak Ha-CoV-2 Wild tipi ve Ha-CoV-2 Delta ve Omicron varyant parçacıklarından viral RNA'yı çıkarın. Ekstrakte edilen viral RNA'yı -80 °C'de saklayın veya RT-qPCR için hemen kullanın.
2. RT-qPCR: Tek adımlı bir ana karışım kullanarak viral RNA üzerinde RT-qPCR gerçekleştirin. Reaksiyonu ticari bir PCR makinesinde gerçekleştirin. Amplifikasyon hedefinin Ha-CoV-2'nin genomik RNA'sı olduğunu lütfen unutmayın. Standart bir eğri oluşturmak ve her varyantın RNA kopya sayısını hesaplamak için standart olarak Ha-CoV-2 vektör DNA'sını kullanın.

4. Nötralize edici antikor testi

1. Tohumlama HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücreleri: Testten bir gün önce, 50 μL tam DMEM ortamında 96 oyuklu bir plakada HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücrelerini tohumlayın. HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücreleri ticari olarak satın alınır.
2. Hücreleri saymak için, HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücreleri içeren bir T75 şişesinden 20 μL hücre elde edin ve 20 μL tripan mavisi çözeltisi ile karıştırın. Bu karışımdan 20 μL'yi hücre sayma odasına ekleyin ve mL'deki hücre sayısını sayın. Enfeksiyon için 96 oyuklu bir plakayı tohumlamak için, oyuk başına 2,5 x 10⁴ hücre kullanın ve toplamda 2,5 x 10⁶ hücreye ihtiyaç duyulacaktır. 96 oyuklu plakayı gece boyunca 37 °C'de bir CO₂ inkübatöre yerleştirin.
3. Nötralize edici antikor testi: Steril bir polipropilen 96 oyuklu plakada, standart 27BV nötralize edici antikor ve Ha-CoV-2 karışımını hazırlayın. Plakaya 8 μL 27BV (45 mg / mL) ekleyin ve 6 μL serumsuz DMEM ile antikorun seri dilüsyonlarını gerçekleştirin.
   NOT: Kuyu transferleri arasında pipet uçlarını değiştirdiğinizden ve doğru sonuçlar elde etmek için antikor ile serumsuz ortamın iyice karıştırıldığından emin olun.
4. Seri olarak seyreltilmiş antikora 54 μL Ha-CoV-2 partikülü ekleyin ve virüs ile antikoru karıştırın. Ha-CoV-2 partiküllerini seri olarak seyreltilmiş 27BV ile 37 °C'de %5 CO_2'de 1 saat önceden inkübe edin. 1 saatlik inkübasyondan sonra, bir gün önce tohumlanan HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücrelerini (oyuk başına 2.5 x 10⁴ hücre) içeren 96 oyuklu plakaya 50 μL antikor ve Ha-CoV-2 karışımı uygulayın.
5. Kontroller için, yalnızca HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücrelerini içeren en az üç kuyu bırakın. Lusiferaz tahlil okumalarının arka plan sinyali için enfekte olmayan kuyucuklar olarak hizmet etmek üzere bu kuyucuklara 50 μL tam ortam ekleyin.
   NOT: Enfeksiyon 37 ° C'de 18 saatlik inkübasyona ulaşana kadar protokol burada durdurulabilir ve daha sonra plaka lusiferaz testi ile analiz edilmeye hazır hale gelir.
6. Lusiferaz deneyi: 18 saatlik inkübasyondan sonra, her bir oyuğa doğrudan 7.5 μL lizis tamponu ekleyin ve 2 dakika boyunca yörüngesel çalkalayarak karıştırın. Lizis içindeki hücreler, oda sıcaklığında en az 5 dakika bekletilir.
7. D-lusiferin çözeltisini Firefly lusiferaz test çözeltisi ile 1:50 oranında karıştırarak Firefly lusiferaz test çözeltisini hazırlayın. 96 oyuklu bir plakanın tamamı için, 3 mL lusiferaz substrat çözeltisini 60 μL D-lusiferin çözeltisi ile 2940 μL ateşböceği lusiferaz tampon çözeltisi ile birleştirin.
8. Hücre lizatlarına 25 μL Firefly lusiferaz tahlil çözeltisi ekleyin ve plakayı 1 dakika boyunca yörüngesel çalkalayarak karıştırın. Ticari bir lusiferaz mikroplaka okuyucu kullanarak lusiferaz aktivitesini analiz edin.

5. Niceleme ve istatistiksel analiz

1. Veri toplama: Enfeksiyon ve lusiferaz testlerini belirtildiği gibi üç kopya halinde gerçekleştirin (Şekil 1). Lusiferaz tahlil okumaları ile lusiferaz ekspresyonunu ölçün. Ortalama, üç lusiferaz tahlil okumasının ortalama değeridir. Enfekte olmayan kuyulardan alınan arka plan sinyal okumaları bu ortalama değerden çıkarılır. Standart sapma (SD), lusiferaz tahlil okumalarının ortalama değerinden belirlenir.
2. Veri analizi: Ticari grafik yazılımı kullanarak antikor nötralizasyon aktivitesini çizin ve ID₅₀ (%50 inhibisyon dozu) değerlerini hesaplayın. ID₅₀ değeri, HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücrelerinin enfeksiyonunda (lusiferaz test okumalarına dayanarak) %50'lik bir azalmanın elde edildiği antikor inhibitör dilüsyonları olarak tanımlanır.

Ha-CoV-2 parçacıkları, HEK293T hücrelerde Ha-CoV-2 RNA genomunu ve SARS-CoV-2'nin yapısal proteinlerini (M, N, E ve S) eksprese eden beş farklı DNA vektörü kullanılarak birleştirildi. S protein vektörü, S varyantına bağlı olarak değişir. Orijinal Ha-CoV-2 Wuhan suşundan (Wild tipi, Wt) elde edilen S proteini pozitif kontrol olarak kullanıldı ve diğer iki varyantın her birinden S proteini ile birlikte birleştirildi: Delta (B.1.617.2) veya Omicron (B.1.1.529). Tüm varyantlarda aynı M, N, E kullanılmıştır. Ha-CoV-2 (Wt) ve varyant partiküller, kotransfeksiyondan 48 saat sonra toplandı ve daha sonra HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücrelerini enfekte etmek için kullanıldı. Enfektivite, enfeksiyondan 18 saat sonra lusiferaz ekspresyonu ile ölçüldü. Bu sistemde, lusiferaz sinyalinin daha yüksek ekspresyon seviyeleri, Ha-CoV-2 tarafından daha yüksek hücre enfeksiyonunu yansıtır. Lusiferaz sinyali, her varyant için RT-qPCR ile genomik RNA kopyaları ile normalize edildi. Şekil 1'de gösterildiği gibi, Ha-CoV-2 Omicron varyantı, orijinal Ha-CoV-2'den (Wt) 4 ila 10 kat daha yüksek sinyal üretti ve bu da daha yüksek bir bulaşıcılık olduğunu düşündürdü.

Ayrıca, 27BV'nin HaCoV-2(Wt), Delta ve Omicron varyantlarını nötralize etme kapasitesi ölçüldü. 27BV, SARS-COV-2 S1 proteininin RBD alanına karşı geliştirilmiş bir tavşan monoklonal antikorudur. Nötralizasyon deneyleri için, Ha-CoV-2 ile önceden inkübe edilmiş 96 oyuklu bir plakada 27BV'lik seri dilüsyonlar gerçekleştirildi ve daha sonra HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hedef hücrelerine eklendi. Sonuçlar, 27BV'nin test edilen tüm varyantlara karşı nötralize edici aktiviteye sahip olduğunu göstermiştir (Şekil 2). İlginç bir şekilde, Omicron için 27VB'nin ID50'si, Ha-CoV-2(WT) ve Ha-CoV-2(Delta; Şekil 2). Bu sonuçlar, Ha-COV-2 platformunun, ortaya çıkan varyantlarda aşı kaynaklı nötralize edici antikorların miktarını belirlemek için hızlı bir yöntem olarak kullanılabileceğini göstermektedir.

Şekil 1. Ha-CoV-2 varyantlarının montajı ve miktarının belirlenmesi. (A) Ha-CoV-2 ve varyant parçacıkların montajının gösterimi. Ha-CoV-2 raportör genomunu ve yapısal proteinleri (M, S, N ve E) eksprese eden vektörler HEK293T hücrelerde birlikte transfekte edilir. Parçacıklar, kotransfeksiyondan 48 saat sonra toplandı (virion partikülünün görüntülenmesi ve Biorender.com ile HEK293T hücreleri oluşturuldu). (B) Ha-CoV-2 varyantlarının enfektivitesinin ölçülmesi. İki varyantın (Delta ve Omicron) nispi enfektivitesi, bireysel Ha-CoV-2 (Luc) varyantlarının genomik RNA kopyaları kullanılarak ölçülür ve normalleştirilir. Vahşi tip, karşılaştırma için bir kontrol olarak kullanılan Ha-COV-2'dir (Wt). Enfeksiyon ve lusiferaz testleri 3x. RU, bağıl birim. Ortalama ve standart sapma (SD) gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2. Ha-CoV-2 (Luc) varyantlarına karşı 27BV nötralizasyon aktivitesinin ölçülmesi 27BV'nin nötralizasyon aktivitesi, HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücrelerinin enfeksiyonundan 18 saat sonra analiz edildi. ID50 , 27BV konsantrasyonuna karşı nispi enfeksiyon oranı (lusiferaz aktivitesi) kullanılarak hesaplandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3. HEK293T(ACE2/TMPRSS2)'nin Ha-CoV-2(GFP) ile enfeksiyonu. Ha-CoV-2 (GFP) partikülleri birleştirildi ve daha sonra HEK293T (ACE2 / TMPRSS2) hücrelerini enfekte etmek için kullanıldı. GFP ekspresyonu, floresan mikroskobu kullanılarak enfeksiyondan 48 saat sonra gözlendi. Enfekte hücrelerin beyaz alanı solda gösterilir ve GFP görüntüleme sağda gösterilir. Beyaz çubuk 100 μm'yi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1. Grafik Özet. Ha-CoV-2 psödovirüs yapısı ve uygulaması. Biorender.com ile oluşturulan görüntü. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1. Protein Dizileri. SARS-CoV-2 S, M, N ve E proteinlerinin dizilerinin listesi. S protein dizileri ayrıca SARS-CoV-2 varyantları Omicron (B.1.1.529) ve Delta'yı (B.1.617.2) içerir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

George Mason Üniversitesi tarafından bir patent başvurusu yapıldı ve ürün geliştirme için Virongy Biosciences Inc.'e lisanslandı. YW, Virongy Biosciences'ın kurucusu ve danışma kurulu üyesidir. BH şu anda Virongy Biosciences'ın CEO'su ve Baş Bilim Sorumlusudur. Yazarların başka bir çıkar çatışması yoktur.