Yöntem makalesi

SARS-CoV-2, Influenza A/B ve MERS-CoV'nin Tespiti için Multipleks Gerçek Zamanlı RT-qPCR Testlerinin Geliştirilmesi

DOI:

10.3791/65822

⸱

10 Kasım 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaygın solunum yolu virüsleri için iki prob tabanlı kurum içi tek adımlı RT-qPCR kiti sunuyoruz. İlk test SARS-CoV-2 (N), İnfluenza A (H1N1 ve H3N2) ve İnfluenza B içindir. İkincisi SARS-Cov-2 (N) ve MERS (UpE ve ORF1a) içindir. Bu testler herhangi bir özel laboratuvarda başarıyla uygulanabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koronavirüs hastalığı 2019'a (COVID-19) neden olan şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2), genel halk sağlığı için ciddi bir tehdittir. Grip mevsimlerinde, SARS-CoV-2 ve diğer solunum yolu virüslerinin yayılması, yönetilmesi zor olan popülasyon çapında bir solunum yolu hastalığı yüküne neden olabilir. Bunun için, solunum yolu virüsleri SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B ve Orta Doğu solunum sendromu (MERS-CoV), özellikle duyarlı popülasyonlar, bulaşma şekli ve klinik sendromlar gibi benzer epidemiyolojik faktörleri paylaşan SARS-CoV-2, Influenza A ve Influenza B söz konusu olduğunda, önümüzdeki sonbahar ve kış mevsimlerinde dikkatle izlenmelidir. Hedefe özgü tahliller olmadan, benzerlikleri nedeniyle bu virüslerin vakaları arasında ayrım yapmak zor olabilir. Buna göre, bu viral hedefleri kolayca ayırt edebilen hassas ve hedefe yönelik bir multipleks tahlil, sağlık pratisyenleri için faydalı olacaktır. Bu çalışmada, SARS-CoV-2, İnfluenza A, İnfluenza B ve SARS-CoV-2, MERS-CoV'nin aynı anda tespiti için kurum içinde geliştirilen bir R3T tek adımlı RT-qPCR kitini kullanarak gerçek zamanlı bir ters transkriptaz-PCR tabanlı test geliştirdik. Sentetik RNA'larının en az 10 kopyasıyla, SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B ve MERS-CoV hedeflerini aynı anda %100 özgüllükle başarılı bir şekilde tanımlayabiliriz. Bu tahlilin doğru, güvenilir, basit, hassas ve spesifik olduğu bulunmuştur. Geliştirilen yöntem, hastanelerde, tıp merkezlerinde ve tanı laboratuvarlarında optimize edilmiş SARS-CoV-2, İnfluenza A, İnfluenza B ve SARS-CoV-2, MERS-CoV tanı testi olarak kullanılabileceği gibi araştırma amaçlı da kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Devam eden koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19) pandemisine, şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2)1 olarak bilinen yeni koronavirüs neden olur. SAR-CoV-2'nin güçlü bulaşıcılığı ve hızlı bulaşma kapasitesi nedeniyle, COVID-19 salgını Çin'in Wuhan Şehrinde ortaya çıktı ve tüm dünyaya hızla yayıldı. Bu sonunda solunum sıkıntısı belirtilerinin başlamasına ve hattaölüme yol açtı 2,3,4. COVID-19, 213'ten fazla ülkede pandemi ilan edildi ve farklı araştırma çalışmaları tarafından yayınlanan makalelerin kanıtladığı gibi, teyit edilen vakaların sayısında keskin bir artış bekleniyor 3,5. COVID-19, öncelikle enfekte bireylerin çevreye saldığı ve daha sonra soluma veya kontamine yüzeylerle yakın temas yoluyla savunmasız bireylere maruz kaldığı küçük solunum damlacıkları yoluyla bulaşır. Bu damlacıklar göz, ağız veya burun mukozası ile temas ettiğinde, bir kişi enfekte olabilir6. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından yayınlanan istatistikler, dünya çapında 76 milyondan fazla doğrulanmış pandemi vakası olduğunu ve şaşırtıcı bir şekilde 7 milyon ölüm olduğunu göstermektedir7. Bu nedenle Birleşmiş Milletler, COVID-19 hastalığının neden olduğu pandemiyi, dünya çapında milyarlarca insanın yaşamı üzerindeki doğrudan etkisi ve geniş kapsamlı ekonomik, çevresel ve sosyal etkileri nedeniyle bir felaket olarak sınıflandırdı.

Kapsamlı testler, erken teşhis, temas takibi ve vaka izolasyonu dahil olmak üzere halk sağlığı girişimlerinin tümünün bu salgını kontrol altında tutmada çok önemli olduğu gösterilmiştir 8,9,10,11. Kış ayları, COVID-19 benzeri semptomlarla birlikte İnfluenza A ve B gibi diğer solunum yolu virüslerinin dolaşımını artıracak ve COVID-19 vakalarını erkenden tespit etmeyi, izlemeyi ve izole etmeyi zorlaştıracaktır. Her yıl, İnfluenza A ve B salgını sonbaharın sonlarında veya Ocak ayının başlarında öngörülebilir bir mevsimsellik ile başlar12. SARS-CoV-2 ve İnfluenza virüsleri tarafından çok sayıda epidemiyolojik özellik paylaşılmaktadır. Ayrıca, çocuklar, yaşlılar, bağışıklığı baskılanmış ve astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı, kalp ve böbrek yetmezliği veya diyabet gibi kronik komorbiditeleri olan bireyleri içeren duyarlı popülasyonlarda benzerliklerin paylaşılması12,13. Bu virüsler sadece savunmasız popülasyonları değil, aynı zamanda temas ve solunum damlacıklarının bulaşma yollarını da paylaşır14. Grip mevsimi yaklaşırken hastaların bu solunum yolu virüslerinden birden fazlasına yakalanabileceği tahmin edilmektedir14. Bunun için semptomatik hastalarda izole edilmeden önce SARS-CoV-2 ve İnfluenza virüslerinin taranması yapılmalıdır. Üç virüs (SARS-CoV-2, Influenza A ve Influenza B) için ayrı testler yapmak, nükleik asit ekstraksiyonu ve teşhisi için küresel kaynak eksikliği nedeniyle mümkün değildir. Hepsini tek bir reaksiyonda taramak için bir yöntem veya test geliştirilmelidir.

Orta Doğu solunum sendromu (MERS)-CoV, insan koronavirüs (CoV) ailesinin bir üyesidir. İlk MERS-CoV virüsü izolatları, Eylül 2012'de akut solunum sorunları nedeniyle ölen Suudi Arabistan'da hastanede yatan bir hastadan geldi15. MERS-CoV için belirgin bir rezervuar konakçısının tek hörgüçlü develer olduğunu gösteren kanıtlar vardır. Enfekte tek hörgüçlü develerden gelen virüslerin zoonotik olduğu ve bu nedenle insanları enfekte edebileceği kanıtlanmıştır16,17. Bu virüsle enfekte olan insanlar, yakın temas yoluyla başkalarına yayabilir18. 26 Ocak 2018 itibariyle, dünya çapında 750 ölüm dahil olmak üzere laboratuvarca doğrulanmış2143 MERS-CoV enfeksiyonu vakası olmuştur 19. En tipik MERS-CoV semptomları öksürük, ateş ve nefes darlığıdır. MERS-CoV enfeksiyonlarının ayrıca pnömoni, ishal ve gastrointestinal hastalık semptomları sergilediği bildirilmiştir20. Şu anda, MERS-CoV için ticari bir aşı veya spesifik bir tedavi mevcut değildir. Bu nedenle, yaygın MERS-CoV salgınlarını önlemek ve MERS-CoV'yi SARS-CoV-2 hastalığından ayırt etmek için hızlı ve kesin tanı şarttır.

Bugüne kadar, bu virüsleri tespit etmek için multipleks RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928 ve CRISPR/Cas329, yanal akış immünolojik testi30, kağıt tabanlı biyomoleküler sensörler31, bir kapta SHERLOCK testi 32, DNA aptamer33, döngü aracılı izotermal gibi birçok yaklaşım önerilmiştir amplifikasyon (LAMBA)19,34, vb. Yukarıda belirtilen yöntemlerin her birinin, duyarlılık ve özgüllük açısından benzersiz yararları ve sakıncaları vardır. Bu yöntemler arasında nükleik asit amplifikasyonuna dayalı test: multipleks qRT-PCR, en yaygın olanıdır ve SARS-CoV-2, İnfluenza A, İnfluenza B ve MERS-CoV tanısı için altın standart olarak kabul edilir.

Bu çalışmada, standart bükümlü sentetik viral RNA'ları kullanarak SARS-CoV-2, İnfluenza A, İnfluenza B ve SARS-CoV-2, MERS-CoV'nin etkili, doğru ve eş zamanlı tespiti için çeşitli primer kombinasyonları ve probları tasarladık ve değerlendirdik. MERS-CoV veya SARS-CoV-2 hedef genleri için geliştirilen çoğullanmış testler Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından önerilmektedir. Bu genler genellikle bir replikasyon/transkripsiyon kompleksinin (RTC) oluşumuna katkıda bulunan proteinleri ve kompleksleri kodlar.35 MERS-CoV testi için kullanılan açık okuma çerçevesi 1a (ORF1a) içindeki bölge gibi. Ek olarak, yapısal proteinler, sırasıyla MERS-CoV ve SARS-Cov-2 testleri için kullanılan zarf geninin yukarı akış bölgesi (upE) ve nükleokapsid geni (N) gibi tanısal testlerde kullanılan genler tarafından kodlanır35,36. Virüslerin tespiti için RT-qPCR'yi oluşturmak için kurum içi R3T tek adımlı RT-qPCR kitini kullandık37. R3T tek adımlı RT-qPCR kitimizin ve primer setlerimizin virüs tespiti, duyarlılığı, özgüllüğü ve dinamik aralığı, standart bükümlü sentetik RNA'ların 10 kat seri dilüsyonları kullanılarak test edildi ve değerlendirildi. En düşük pratik saptama sınırı, reaksiyon başına yaklaşık 10 transkript kopyasıydı. Sonuç olarak, kurum içi R3T tek adımlı RT-qPCR kiti ve primer/prob setleri, SARS-CoV-2, İnfluenza A, İnfluenza B ve SARS-CoV-2, MERS-CoV'nin rutin eşzamanlı teşhisi için başarıyla kullanılabilir ve uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Taq polimeraz ekspresyonu ve saflaştırılması

  1. Enzimin C-terminalinde katlanabilir bir heksa-histidin etiketine sahip bir plazmit oluşturun.
  2. Ekspresyon vektörünün 50 ng'sini standart protokol38'i izleyerek E. coli BL21-(DE3) suşuna dönüştürün.
  3. Dönüştürülmüş hücreleri, her biri 37 ° C'de 2 L 2YT ortam suyu içeren dört adet 6 L'lik şişede, 0.8'lik OD 600'e veya 6.4 x 108 hücre numarasına ulaşılana kadar 170 rpm'de çalkalayarak aşılayın.
  4. 0.5 mM izopropil-β-d-tiyogalaktopiranosid (IPTG) ile Taq polimeraz ekspresyonunu indükleyin ve ayrıca çalkalama ile 18 saat boyunca 16 ° C'de inkübe edin.
  5. Hücreleri 4 °C'de 7808 x g'da 10 dakika döndürerek hasat edin. Peletleri 200 mL buz gibi soğuk bir Taq polimeraz lizis tamponunda (Tablo 1) 5 mL / g hücre peletinde yeniden süspanse edin.
  6. Hücreleri lizozim (2 mg / mL lizis tamponu) ve proteaz inhibitörleri ile 45 dakika inkübe edin ve daha sonra lizatı 30 kPsi'de bir hücre bozucudan geçirin ve hücre kalıntılarını ayırmak için 4 ° C'de 30 dakika boyunca 22.040 x g'de santrifüjleyin.
  7. Süpernatanı 85 °C'de 15 dakika ısıtın. 4 °C'de 1 saat boyunca 95.834 x g'da döndürün. Süpernatanı toplayın ve 0.45 μm filtre kullanarak buz üzerinde filtreleyin.
  8. Hızlı Protein Sıvı Kromatografisi (FPLC) kullanarak, numuneyi önce Taq polimeraz tamponu A kullanarak 4 mL/dak akış hızında bir Ni-NTA HP 5 mL kolonundan geçirerek protein saflaştırması gerçekleştirin (Tablo 2; Şekil 1A).
  9. 10 kolon hacmi (CV) Taq polimeraz tamponu A ve %4 Taq polimeraz tamponu B ile yıkayın (Tablo 2). 100 mL'lik bir şişede 20 CV üzerinde Taq polimeraz Tampon B kullanarak bağlı proteini doğrusal bir gradyan ile elute edin.
  10. 100 mL'lik şişedeki eluenti, Taq polimeraz tamponu C kullanarak 4 mL/dk'da 5 mL'lik bir katyon değişimi kolonundan geçirin (Tablo 2; Şekil 1A).
  11. 20 CV %100 Taq polimeraz tamponu C ve %5 Taq polimeraz tamponu D ile yıkayın (Tablo 2).
  12. %5'ten %100'e kadar başlayan Taq polimeraz tamponu D (Tablo 2) kullanarak doğrusal bir gradyan ile elute edin.
  13. SDS-PAGE jel elektroforezi 39 ve ardından daha önce tarif edildiği gibi jel boyama 40 gerçekleştirerek ayrıştırılmış fraksiyonları kontrol edin. Kısaca, her fraksiyondan 10 μL alın ve eşit hacimde 2x SDS yükleme boyası ekleyin. Numuneyi 90°C'de 10 dakika denatüre edin. Numuneleri %10 SDS-PAGE jel üzerine yükleyin ve jeli 200 V'ta 25 dakika çalıştırın.
  14. Saflaştırılmış Taq polimeraz içeren tüm fraksiyonları toplayın ve 4 °C'de taq polimeraz depolama tamponuna (Tablo 3) karşı diyalize edin. Kısaca, 2 L saklama tamponu hazırlayın ve diyaliz kasetini nemlendirmek için 2 dakika tampona daldırın. Toplanan fraksiyonları bir iğne kullanarak diyaliz kasetine enjekte edin ve bir gece diyaliz tamponunda karıştırıcıda 200 rpm'de bırakın.
  15. Diyalizden sonra, bir spektrofotometre kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün, 10 μL'lik alikotlar yapın, sıvı nitrojende dondurun ve -80 °C'de saklayın.
    NOT: FPLC sistemine yüklemeden önce 0.45 μm'lik bir filtre kullanarak saflaştırma için tüm tamponları filtreleyin.

2. Böcek hücresi ekspresyon sisteminde MMLV-RT ekspresyonu ve saflaştırma

  1. Bacmid DNA üretimi ve izolasyonu
    1. MMLV-RT dizisini, daha önce açıklandığı gibi bir C-terminali bölünebilir TEV-8xHis-Strep etiketiyle klonlayın41.
    2. 100 ng ekspresyon vektörünü 50 μL DH10Bac hücresine karıştırın ve tüpe vurarak hafifçe karıştırın.
    3. Hücreleri buz üzerinde 15 dakika inkübe edin. Hücreleri 42 °C'de 1 dakika boyunca ısı şoku uygulayın.
    4. Hemen buz üzerine aktarın ve 400 μL SOC ortamı ekleyin. 37 °C'de çalkalayarak 4 saat inkübe edin.
    5. Plaka 10 μL ve 15 μL karışımın üç antibiyotik içeren LB Agar plakaları üzerinde; Mavi-beyaz seçim için 50 μg/mL Kanamisin, 10 μg/mL Tetrasiklin ve 7 μg/mL Gentamisin ile birlikte 40 μg/mL IPTG ve 100 μg/mL X-Gal.
    6. Plakaları 37 °C'de 48 saat inkübe edin. Kontrol olarak birkaç beyaz koloni ve bir mavi koloni seçin ve bunları yukarıdaki antibiyotikleri içeren taze LB agar plakalarına yeniden çizin. Plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
    7. Beyaz fenotipi doğruladıktan sonra, birkaç koloni seçin ve bunları 50 mL tüplerde 50 μg/mL Kanamisin, 10 μg/mL Tetrasiklin ve 7 μg/mL Gentamisin içeren 10 mL LB ortamına aşılayın.
    8. Kültürü 37 ° C'de gece boyunca 170 rpm'de çalkalayarak inkübe edin. Hücreleri 10 dakika boyunca 22.040 x g'da döndürerek peletleyin.
    9. Süpernatanı boşaltın ve peleti miniprep kitinden 250 μL yeniden süspansiyon çözeltisi içinde yeniden süspanse edin (bu çözeltinin üreticinin talimatlarına uygun olarak kullanılması gerekir), ardından çözeltiyi 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    10. 250 μL lizis çözeltisi ekleyin, hafifçe karıştırın ve 3 dakika inkübe edin. 350 μL nötralize edici çözelti ekleyin, 2x-3x ters çevirin ve 10 dakika boyunca 22.040 x g'da santrifüjleyin.
    11. Süpernatanı taze bir tüpe aktarın ve eşit hacimde buz gibi soğuk izopropanol ekleyin ve -20 °C'de 30 dakika inkübe edin.
    12. Çökeltilmiş DNA'yı 10 dakika boyunca 22.040 x g'da döndürerek aşağı doğru peletleyin. Süpernatanı atın ve peleti 700 μL% 70 buz gibi etanol, 2x ile yıkayın.
    13. Süpernatanı pelete dokunmadan bir pipetle çıkarın. Pelet havasını laminer akış başlığında 5-10 dakika veya tüpte sıvı görülmeyene kadar kurumaya bırakın. Peleti 100 μL EB tamponunda çözün.
  2. Bacmid transfeksiyonu ve virüs amplifikasyonu
    1. P1 virüsü hazırlama
      1. 6 oyuklu bir doku kültürü plakasında, 2 mL böcek hücre kültürü ortamında ~ 9 x 105 hücre/kuyu tohumlayın.
      2. Hücrelerin yapışmasını sağlamak için plakayı oda sıcaklığında ~ 30 dakika inkübe edin.
      3. Bacmid/Fugene karışımını şu şekilde hazırlayın: 1 μg Bacmid DNA ve 300 μL böcek hücresi ortamını bir tüpte karıştırın. Başka bir tüpte, 8 μL transfeksiyon reaktifi ve 300 μL böcek hücresi ortamını karıştırın. Her iki karışımı da nazikçe pipetleyerek karıştırın ve bakmid/transfeksiyon reaktif kompleksinin oluşması için oda sıcaklığında ~30 dakika bekletin.
      4. Her bir kuyucuğa damla damla bakmid kompleks karışımı (~ 210 μL) ekleyin ve plakayı şeffaf bir filmle kapatın.
      5. Plakayı 27 °C'de 3-4 gün inkübe edin.
      6. Virüsü içeren besiyerini alın, FBS (son konsantrasyon %2) ekleyin, 0.45 μm filtre kullanarak süzün ve karanlıkta 4°C'de P1 virüs stoğu olarak saklayın.
    2. P2 virüsü hazırlama
      1. Bir kültür şişesinde 3 mL P1 virüsü ile 2 x 106 hücre / mL'de 50 mL böcek hücresini transfekte edin.
      2. Ölü hücre yüzdesi %25-30'a ulaşana kadar 4-6 gün boyunca 100 rpm'de çalkalayarak 27 °C'de inkübe edin.
      3. 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve virüsü içeren süpernatanı toplayın.
      4. FBS'yi %2'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin, 0.45 μm filtreden süzün ve her biri 1 mL alikot edin ve -80 ° C'de P2 virüs stoğu olarak saklayın.
    3. P3 virüsü hazırlama
      1. 100 mL böcek hücresini 2 x 106 hücre / mL'de 2 mL P2 virüsü ile bir kültür şişesinde transfekte edin.
      2. Ölü hücre yüzdesi %15-20'ye ulaşana kadar 3-4 gün boyunca 100 rpm'de çalkalayarak 27 °C'de inkübe edin.
      3. Hücreleri 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve virüsü içeren süpernatanı toplayın.
      4. FBS'yi %2'lik bir son konsantrasyona ekleyin. 0,45 μm'lik bir filtreden süzün. Karanlıkta 4 °C'de 1 ay saklanabilir.
  3. Böcek hücrelerinde MMLV-RT'nin ekspresyonu ve saflaştırılması
    1. Taze böcek hücrelerine 2 x 106 hücre/mL (700 mL/2L şişe) yoğunlukta toplam 6 şişede 5 mL P3 virüsü ekleyin.
    2. Transfeksiyondan 55-60 saat sonra, 10 dakika boyunca 7808 x g'da döndürerek hücreleri hasat edin.
    3. Hücre peletlerini 200 mL MMLV-RT lizis tamponunda yeniden süspanse edin (Tablo 4). Lizatı 15 kPsi'de bir hücre bozucudan geçirin ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca 22.040 x g'da santrifüjleyin.
    4. Süpernatanı yeni tüplere aktarın ve 1 saat boyunca 4 ° C'de 95.834 x g'de tekrar döndürün. Süpernatanı toplayın ve 0,45 μm'lik bir filtre kullanarak buz üzerinde filtreleyin.
    5. MMLV-RT tamponu A kullanarak numuneyi önce 4 mL/dk akış hızında Ni-NTA Excel 5 mL kolonundan (Şekil 1B) geçirerek FPLC kullanarak protein saflaştırmasına başlayın (Tablo 5).
    6. Kolonu 10 CV MMLV-RT tamponu A ve %4 MMLV-RT tamponu B ile yıkayın (Tablo 5) ve proteini 100 mL'lik bir şişede 20 CV üzerinde MMLV-RT tamponu B'nin doğrusal gradyanı ile elüte edin.
    7. Ayrıştırılmış numuneyi MMLV-RT tamponu C ile dengelenmiş Strep 5 mL kolonundan (Şekil 1B) geçirin (Tablo 5).
    8. Kolonu 10 CV% 100 MMLV-RT tamponu C ile yıkayın ve proteini 20 CV tampon D ile doğrusal bir gradyan ile elüte edin (Tablo 5).
    9. 1.13.-1.14 adımlarında olduğu gibi SDS-PAGE gerçekleştirerek ayrıştırılmış kesirleri kontrol edin. ve 4 ° C'de MMLV-RT depolama tamponuna (Tablo 6) karşı diyalize edilecek saflaştırılmış MMLV-RT içeren fraksiyonları toplayın.
    10. Nanodrop, alikot, sıvı nitrojen içinde dondurun ve -80 °C'de saklayın.
      NOT: FPLC sistemine yüklemeden önce 0.45 μm'lik bir filtre kullanarak saflaştırma için tüm tamponları filtreleyin.

3. Kurum içi multipleks R3T tek adımlı RT-qPCR kit bileşenlerinin hazırlanması

  1. Tampon karışım hazırlama
    1. Daha önce 2'de gösterilen reaktifleri içeren RT-qPCR reaksiyonu için37x tamponu hazırlayın. Tüm reaktifleri DNase/RNase içermeyen suda ve -20 °C'lik bir dondurucuda saklanan tampon karışımında hazırlayın.
  2. Astar ve Prob Setleri ve astarlar karışım hazırlama
    NOT: Kullanılan problar ve primerler Tablo 7'de listelenmiştir. Influenza ve SARS-CoV-2 çoğullanmış kiti, 3 prob ve 4 ileri ve geri primer seti içerir. Problar, InfA için 6-karboksifloresein (FAM), SARS-CoV-2 (N geni) için Texas Red-XN ve InfB için Yakima Yellow muhabirleri kullanılarak 5' uçlarda etiketlenir. MERS-CoV ve SARS-CoV-2 çoğullanmış kiti, 3 prob ve 3 ileri ve geri primer seti içerir. Problar ayrıca MERS-CoV (ORF1a geni) için Texas Red-XN, MERS-CoV (UpE geni) için VIC ve 6-karboksifloresein (FAM) SARS-CoV-2 (N geni) raportörleri kullanılarak 5' uçlarda etiketlenir.
    1. Tablo 7'de listelenen tüm primerleri ve probları içeren, her bir ileri ve geri primer için 6.7 μM nihai konsantrasyona sahip bir primer karışımı hazırlayın ve 1.5 mL'lik bir tüpte her prob için 1.25 μM. Astar karışımını -20 °C dondurucuda saklayın. Gerekli hacmi oluşturmak için elüsyon tamponu kullanın.
  3. Enzim karışımı hazırlama
    1. Gerekli hacmi oluşturmak için Taq polimeraz (30 U/μL) ve MMLV-RT (60 ng/μL) enzim karışımını Tablo 3'te gösterildiği gibi Taq polimeraz depolama tamponunda hazırlayın. Bu adımı buz üzerinde gerçekleştirin ve enzim karışımını -20 °C'de saklayın.
  4. RNA şablonu
    1. SARS-CoV-2, İnfluenza A H1N1, İnfluenza A H3N2, İnfluenza B ve MERS-CoV'nin sentetik RNA'larını 100 μL 1x Tris-EDTA tamponunda (10 mM Tri-Cl ve 1 mM EDTA (pH 8.0) ayrı ayrı yeniden süspanse ederek 1 x 106 RNA kopyası/μL'lik bir stok yapın.
    2. RT-qPCR için sentetik RNA'ları aşağıdaki konfigürasyonlarda karıştırın: 1) SARS-CoV-2, İnfluenza A ve İnfluenza B, 1 x 105 RNA kopyası/μL yapmak için 50 μL hacme her virüs stoğundan 5 μL ekleyerek; 2) SARS-CoV-2, MERS-CoV, 1 x 105 RNA kopyası/μL yapmak için 50 μL hacme her virüs stoğundan 5 μL ekleyerek. 1 x 105 RNA kopyası/μL ila 10 RNA kopyası/μL arasında değişen her bir sentetik RNA karışımının 10 kat seri dilüsyonunu yapın.
      NOT: Şablonların seri seyreltmesini hazırlamak için buz gibi soğuk DNase/RNase-Free su kullandığınızdan emin olun.

4. Kurum içi çoğullanmış SARS-CoV-2, İnfluenza A, İnfluenza B ve SARS-CoV-2, MERS-CoV tek adımlı RT-qPCR testi

NOT: İş istasyonu yüzeylerini dezenfekte edin ve PCR plaka düzenini planlamak için 96 oyuklu bir plaka şablonu kullanın.

  1. 96 oyuklu plakanın hazırlanması
    1. 2x tampon ve astar karışımını çözün. Enzim karışımını buz üzerinde tutun.
    2. Her bir oyuğa 10 μL 2x tampon karışımı, 1.5 μL primer karışımı, 1 μL enzim karışımı, 6.5 μL DNaz/RNaz İçermeyen Su ve test edilmesi gereken 1 μL karşılık gelen RNA karışımı ekleyin. Her oyuktaki son hacim 20 μL'dir. Bu adımla ilgili yardım için lütfen hazırlanan düzene bakın.
      NOT: Pipetleme yanlılığını önlemek için RNA numunesi dışındaki tüm reaktifleri içeren reaksiyon sayısına göre bir ana karışım yapılması önerilir. Ek olarak, teknik hataları önlemek için reaksiyonları iki veya üç kopya halinde gerçekleştirin.
    3. Plakayı yapışkan bir PCR plaka contası ile kapatın ve plakanın altındaki tüm sıvıyı toplamak için 1 dakika kısa bir süre santrifüjleyin. Numuneleri qPCR makinesine aktarmadan önce her kuyucuğun aynı hacimde sıvıya sahip olduğundan ve kabarcık içermediğinden emin olun.
      NOT: Tüm PCR reaksiyonlarının buz üzerinde ayarlanması gerekir.
  2. PCR programı
    1. Gerçek zamanlı qPCR makine programını açın ve aşağıdaki deneysel özellikleri seçin:
      Blok tipi: Hızlı 96 kuyulu (0.1 mL)
      Deney düzeneği: Standart eğri
      Reaktifler: TaqMan reaktifleri
      Çalıştırma özellikleri: Standart.
    2. Tablo 7'de gösterildiği gibi tüm gen hedeflerini ve raportör boyalarını tanımlayın. Ek olarak, amplifikasyon eğrilerinin daha kolay analizi için test edilecek her reaksiyon için numune adlarını tanımlayın.
    3. 96 oyuklu plakaya dayalı olarak programın plaka düzenine hedefler ve numuneler atayın.
    4. PCR cihazında aşağıdaki döngü programını aşağıdaki gibi ayarlayın:
      esnasında 55 °C esnasında 10 dk
      40 döngü: 1 dakika boyunca 94 °C
      10 sn boyunca 94 °C
      esnasında 68 °C 10 sn
      20 saniye boyunca 68 °C; Burada floresan elde edin.
    5. Plakayı gerçek zamanlı qPCR makinesine aktarın ve plakanın doğru yönlendirilmesini sağlayarak tutucuya yerleştirin ve çalıştırmayı başlatın.
    6. Deneysel verileri kaydetmek için dosya konumunu seçin.
  3. Veri analizi
    1. Öncelikle qPCR programı tarafından üretilen amplifikasyon grafiklerinin incelenmesi esastır. Tespit edilebilecek minimum RNA konsantrasyonunu değerlendirmek için tespit sınırını analiz edin.
    2. Testin hassasiyetini değerlendirmek için x ekseninde RNA kopya sayısının günlüğünü ve y ekseninde karşılık gelen ortalama Ct değerini çizin. Eğim veR2 , reaksiyonun güvenilirliğini ve verimliliğini gösterir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yıllarda, PCR yaklaşımları 21,22,23,24,25 kullanılarak yaygın solunum yolu virüslerini saptamaya yönelik tanı yaklaşımında önemli ilerlemeler olmuştur. Bununla birlikte, bu gelişmelere rağmen, tek bir testte birden fazla virüsün tespit edilmesini sağlayan çoğullama yaklaşımı, özellikle RT-qPCR platformunda yaygın olarak uygulanmamıştır. Bu yöntem, sentetik...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SARS-CoV-2, Influenza A/B ve MERS-CoV varyantları gibi yaygın solunum yolu virüslerinin yayılmasına bağlı yüksek enfeksiyon ve ölüm oranlarından kaynaklanan dünya çapında sağlık sistemi üzerinde ağır bir ekonomik yük bulunmaktadır 12,19,20. Bu yükü hafifletmeye yönelik sorumluluk duygusuyla motive olarak, bu yaygın virüsleri tek bir testte ayırt etmek için RT-qPCR gibi hızlı, kesin ve erişilebilir bir tanı testine ihtiyaç olduğu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Kral Abdullah Bilim ve Teknoloji Üniversitesi tarafından çekirdek finansman ve S.M.H.'ye Ulusal Dönem Büyük Mücadelesi (NTGC) yoluyla desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.45 μ m filtre kaplarıThermo Scientific291-4545
10X Tris-Glisin SDS çalışma tamponuNovexLC2675
6 kuyulu doku kültür plakalarıCorning353046
Amonyum sülfatFisher ScientificA701-3
AmpisilinCorning61-238-RH
Katyon değişimi (HiTrap SP HP) 5 mLCytiva17-1152-01
D-(+)-Biotin, %98+ThermoScientificA14207.60
DH10Bac yetkin hücrelerFisher Scientific10361012
Diyaliz torbası (Yılan Derisi 10.000 MWC)Thermo Scientific68100
Dithiothreitol (DTT)Thermo ScientificR0862
Dnase/Rnase Ücretsiz Damıtılmış SuAmbionAM9930
dNTP'lerThermo ScientificR0192
E. coli< / em> BL21 (DE3) yetkin hücrelerInvitrogenC600003
EDTAFisher ScientificBP120-1
Elüsyon TamponuQiagen19086
ESF 921 böcek hücre kültürü ortamı (Böcek hücreleri ortamı)İfade Sistemleri96-001-01
FBS ÇözeltisiGibcoA38400-01
Fugene (transfeksiyon reaktifi)PromegaE2311
GentamisinFisher Scientific15750060
GliserolSigma AldrichG5516-500
IGEPAL CA-630SigmaAldrich I8896-100ml
İmidazolSigma Aldrich56750-1Kg
İnfluenza A (H1N1) sentetik RNABüküm Biyobilim103001
Influenza A (H3N2)  sentetik RNABüküm Biyobilim103002
Influenza B sentetik RNABüküm Biyobilim103003
IPTGAltın BiyoteknolojiI3481C100
KanamisinGibco11815-032
LB AgarFisher ScientificBP1425-500
LB Et suyu ortamıFisher ScientificBP1426-500
LizozimSigma AldrichL6876-10G
Magnezyum KlorürSigma Aldrich13152-1Kg
MERS-CoV sentetik RNABüküm Biyobilim103015
MicroAmp Barkodlu Hızlı Optik 96 kuyulu Reaksiyon plakaları (0.1 mL)Uygulamalı Biyosistemler10310855
Mini- PROTEAN TGX Prekast JelBio-Rad456-1093
Miniprep kitiQiagen27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mLCytiva17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mLCytiva17-5248-02
Optik Yapışma Kapakları (PCR Uyumlu, DNA/Rnase/PCR İnhibitörleri SerbestUygulamalıBiyosistemler 4311971
Potasyum KlorürFisher BiyoreaktifleriBP366-1
Primerleri ve ProblarıEntegre DNA Teknolojileri, Inc.
Proteaz İnhibitörü Mini tabletler EDTA İçermeyenThermo ScientificA32955
Protein işaretleyiciFermentas26616
RT-qPCR makinesi (QuantStudio 7 Flex)Applied Biosystems
S.O.C ortamıFisher Scientific15544034
SARS-CoV-+A2:C442 sentetik RNATwist Bioscience102024
Sf9 böcek hücreleriGibcoA35243
Sodyum KlorürSigma AldrichS3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mLCytiva29401323
TetrasiklinIBI BilimselIB02200
Tris Tabanı Moleküler Biyoloji SınıfıPromegaH5135
Tris-HClAffymetrix22676
Tween 20Sigma AldrichP1379-100ml
X-GalInvitrogenB1690

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 382 (8), 727-733 (2019).
  3. Huang, C., et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 395 (10223), 497-506 (2020).
  4. Wu, F., et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 579 (7798), 265-269 (2020).
  5. Yang, S., et al. Deep learning for detecting corona virus disease 2019 (COVID-19) on high-resolution computed tomography: a pilot study. Ann Transl Med. 8 (7), 450(2020).
  6. El Hassan, M., et al. A review on the transmission of COVID-19 based on cough/sneeze/breath flows. Eur Phys J Plus. 137 (1), 1(2022).
  7. World Health Organization. WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. , https://covid19.who.int (2023).
  8. Kucharski, A. J., et al. Effectiveness of isolation, testing, contact tracing, and physical distancing on reducing transmission of SARS-CoV-2 in different settings: a mathematical modelling study. Lancet Infect Dis. 20 (10), 1151-1160 (2020).
  9. Reddy, K. P., et al. Cost-effectiveness of public health strategies for COVID-19 epidemic control in South Africa: a microsimulation modelling study. Lancet Glob Health. 9 (2), e120-e129 (2021).
  10. Cheng, H. Y., et al. Contact tracing assessment of COVID-19 transmission dynamics in Taiwan and risk at different exposure periods before and after symptom onset. JAMA Intern Med. 180 (9), 1156-1163 (2020).
  11. Kretzschmar, M. E., et al. Impact of delays on effectiveness of contact tracing strategies for COVID-19: a modelling study. Lancet Public Health. 5 (8), e452-e459 (2020).
  12. Krammer, F., et al. Influenza. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 3(2018).
  13. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in patients infected with SARS-CoV-2: a systematic review and meta-analysis. Int J Infect Dis. 94, 91-95 (2020).
  14. Lansbury, L., Lim, B., Baskaran, V., Lim, W. S. Co-infections in people with COVID-19: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 81 (2), 266-275 (2020).
  15. Zaki, A. M., van Boheemen, S., Bestebroer, T. M., Osterhaus, A. D., Fouchier, R. A. Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia. N Engl J Med. 367 (19), 1814-1820 (2012).
  16. Azhar, E. I., et al. Evidence for camel-to-human transmission of MERS coronavirus. N Engl J Med. 370 (26), 2499-2505 (2014).
  17. Ling, Y., Qu, R., Luo, Y. Clinical analysis of the first patient with imported Middle East respiratory syndrome in China. Zhonghua Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue. 27 (8), 630-634 (2015).
  18. Nazer, R. I. Outbreak of Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus causes high fatality after cardiac operations. Ann Thorac Surg. 104 (2), e127-e129 (2017).
  19. Huang, P., et al. A rapid and specific assay for the detection of MERS-CoV. Front Microbiol. 9, 1101(2018).
  20. Ezhilan, M., Suresh, I., Nesakumar, N. SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2: A diagnostic challenge. Measurement (Lond). 168, 108335(2021).
  21. Ulloa, S., et al. A simple method for SARS-CoV-2 detection by rRT-PCR without the use of a commercial RNA extraction kit. J Virol Methods. 285, 113960(2020).
  22. Kudo, E., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA by multiplex RT-qPCR. PLoS Biol. 18 (10), e3000867(2020).
  23. Norz, D., Hoffmann, A., Aepfelbacher, M., Pfefferle, S., Lutgehetmann, M. Clinical evaluation of a fully automated, laboratory-developed multiplex RT-PCR assay integrating dual-target SARS-CoV-2 and influenza A/B detection on a high-throughput platform. J Med Microbiol. 70 (2), 001295(2021).
  24. Yun, J., et al. Evaluation of three multiplex real-time reverse transcription PCR assays for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and Respiratory Syncytial virus in nasopharyngeal swabs. J Korean Med Sci. 36 (48), e328(2021).
  25. Lu, X., et al. Real-time reverse transcription-PCR assay panel for Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 52 (1), 67-75 (2014).
  26. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  27. Ali, Z., et al. iSCAN: An RT-LAMP-coupled CRISPR-Cas12 module for rapid, sensitive detection of SARS-CoV-2. Virus Res. 288, 198129(2020).
  28. Ali, Z., et al. Bio-SCAN: A CRISPR/dCas9-based lateral flow assay for rapid, specific, and sensitive detection of SARS-CoV-2. ACS Synth Biol. 11 (1), 406-419 (2022).
  29. Yoshimi, K., et al. CRISPR-Cas3-based diagnostics for SARS-CoV-2 and Influenza virus. iScience. 25 (2), 103830(2022).
  30. Chen, Z., et al. Rapid and sensitive detection of anti-SARS-CoV-2 IgG, using Lanthanide-doped nanoparticles-based lateral flow immunoassay. Anal Chem. 92 (10), 7226-7231 (2020).
  31. Kasetsirikul, S., et al. Detection of the SARS-CoV-2 humanized antibody with paper-based ELISA. Analyst. 145 (23), 7680-7686 (2020).
  32. Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).
  33. Chen, Z., Wu, Q., Chen, J., Ni, X., Dai, J. A DNA aptamer based method for detection of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Virol Sin. 35 (3), 351-354 (2020).
  34. Jang, W. S., et al. Development of a multiplex Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assay for on-site diagnosis of SARS CoV-2. PLoS One. 16 (3), e0248042(2021).
  35. McBride, R., Fielding, B. C. The role of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-Coronavirus accessory proteins in virus pathogenesis. Viruses-Basel. 4 (11), 2902-2923 (2012).
  36. AlBalwi, M. A., et al. Evolving sequence mutations in the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV). J Infection Public Health. 13 (10), 1544-1550 (2020).
  37. Takahashi, M., et al. Quick and easy assembly of a One-Step qRT-PCR Kit for COVID-19 diagnostics using In-House enzymes. ACS Omega. 6 (11), 7374-7386 (2021).
  38. Sambrook, J., Fritsch, E. R., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual (2nd ed.). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY, USA. (1989).
  39. Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  40. Simpson, R. J. Staining proteins in gels with Coomassie blue. CSH Protoc. 2007, (2007).
  41. Takumi Yano, J. M. L., et al. Expression of the thermostable Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase by silkworm-baculovirus expression system. J Asia-Pac Entomol. 22 (2), 453-457 (2019).
  42. van Kasteren, P. B., et al. Comparison of seven commercial RT-PCR diagnostic kits for COVID-19. J Clin Virol. 128, 104412(2020).
  43. Shu, B., et al. Multiplex Real-Time reverse transcription PCR for Influenza A virus, Influenza B virus, and Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Emerg Infect Dis. 27 (7), 1821-1830 (2021).
  44. Engelke, D. R., Krikos, A., Bruck, M. E., Ginsburg, D. Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Anal Biochem. 191 (2), 396-400 (1990).
  45. Pabbaraju, K., Wong, A. A., Ma, R., Zelyas, N., Tipples, G. A. Development and validation of a multiplex reverse transcriptase-PCR assay for simultaneous testing of Influenza A, Influenza B and SARS-CoV-2. J Virol Methods. 293, 114151(2020).
  46. Hirotsu, Y., et al. Analysis of COVID-19 and non-COVID-19 viruses, including Influenza viruses, to determine the influence of intensive preventive measures in Japan. J Clin Virol. 132, 104634(2020).
  47. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse-Transcriptase inhibits Taq Polymerase-Activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Multiplex RT qPCRGer ek Zamanl PCRSARS CoV 2 Tespitinfluenza A Tespitinfluenza B TespitiMERS CoV TespitiSolunum Yolu Vir s AnaliziViral RNA TespitiTaq Polimeraz96 Kuyucuklu Plaka

İlgili makaleler