SARS-CoV-2, Influenza A/B ve MERS-CoV'nin Tespiti için Multipleks Gerçek Zamanlı RT-qPCR Testlerinin Geliştirilmesi

Devam eden koronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19) pandemisine, şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2 (SARS-CoV-2)¹ olarak bilinen yeni koronavirüs neden olur. SAR-CoV-2'nin güçlü bulaşıcılığı ve hızlı bulaşma kapasitesi nedeniyle, COVID-19 salgını Çin'in Wuhan Şehrinde ortaya çıktı ve tüm dünyaya hızla yayıldı. Bu sonunda solunum sıkıntısı belirtilerinin başlamasına ve hatta^{ölüme yol} açtı ^2,3,4. COVID-19, 213'ten fazla ülkede pandemi ilan edildi ve farklı araştırma çalışmaları tarafından yayınlanan makalelerin kanıtladığı gibi, teyit edilen vakaların sayısında keskin bir artış bekleniyor ^3,5. COVID-19, öncelikle enfekte bireylerin çevreye saldığı ve daha sonra soluma veya kontamine yüzeylerle yakın temas yoluyla savunmasız bireylere maruz kaldığı küçük solunum damlacıkları yoluyla bulaşır. Bu damlacıklar göz, ağız veya burun mukozası ile temas ettiğinde, bir kişi enfekte olabilir⁶. Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından yayınlanan istatistikler, dünya çapında 76 milyondan fazla doğrulanmış pandemi vakası olduğunu ve şaşırtıcı bir şekilde 7 milyon ölüm olduğunu göstermektedir⁷. Bu nedenle Birleşmiş Milletler, COVID-19 hastalığının neden olduğu pandemiyi, dünya çapında milyarlarca insanın yaşamı üzerindeki doğrudan etkisi ve geniş kapsamlı ekonomik, çevresel ve sosyal etkileri nedeniyle bir felaket olarak sınıflandırdı.

Kapsamlı testler, erken teşhis, temas takibi ve vaka izolasyonu dahil olmak üzere halk sağlığı girişimlerinin tümünün bu salgını kontrol altında tutmada çok önemli olduğu gösterilmiştir 8,9,10,11. Kış ayları, COVID-19 benzeri semptomlarla birlikte İnfluenza A ve B gibi diğer solunum yolu virüslerinin dolaşımını artıracak ve COVID-19 vakalarını erkenden tespit etmeyi, izlemeyi ve izole etmeyi zorlaştıracaktır. Her yıl, İnfluenza A ve B salgını sonbaharın sonlarında veya Ocak ayının başlarında öngörülebilir bir mevsimsellik ile başlar¹². SARS-CoV-2 ve İnfluenza virüsleri tarafından çok sayıda epidemiyolojik özellik paylaşılmaktadır. Ayrıca, çocuklar, yaşlılar, bağışıklığı baskılanmış ve astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı, kalp ve böbrek yetmezliği veya diyabet gibi kronik komorbiditeleri olan bireyleri içeren duyarlı popülasyonlarda benzerliklerin paylaşılması^12,13. Bu virüsler sadece savunmasız popülasyonları değil, aynı zamanda temas ve solunum damlacıklarının bulaşma yollarını da paylaşır¹⁴. Grip mevsimi yaklaşırken hastaların bu solunum yolu virüslerinden birden fazlasına yakalanabileceği tahmin edilmektedir¹⁴. Bunun için semptomatik hastalarda izole edilmeden önce SARS-CoV-2 ve İnfluenza virüslerinin taranması yapılmalıdır. Üç virüs (SARS-CoV-2, Influenza A ve Influenza B) için ayrı testler yapmak, nükleik asit ekstraksiyonu ve teşhisi için küresel kaynak eksikliği nedeniyle mümkün değildir. Hepsini tek bir reaksiyonda taramak için bir yöntem veya test geliştirilmelidir.

Orta Doğu solunum sendromu (MERS)-CoV, insan koronavirüs (CoV) ailesinin bir üyesidir. İlk MERS-CoV virüsü izolatları, Eylül 2012'de akut solunum sorunları nedeniyle ölen Suudi Arabistan'da hastanede yatan bir hastadan geldi¹⁵. MERS-CoV için belirgin bir rezervuar konakçısının tek hörgüçlü develer olduğunu gösteren kanıtlar vardır. Enfekte tek hörgüçlü develerden gelen virüslerin zoonotik olduğu ve bu nedenle insanları enfekte edebileceği kanıtlanmıştır^16,17. Bu virüsle enfekte olan insanlar, yakın temas yoluyla başkalarına yayabilir¹⁸. 26 Ocak 2018 itibariyle^{, dünya} çapında 750 ölüm dahil olmak üzere laboratuvarca doğrulanmış²¹⁴³ MERS-CoV enfeksiyonu vakası olmuştur 19. En tipik MERS-CoV semptomları öksürük, ateş ve nefes darlığıdır. MERS-CoV enfeksiyonlarının ayrıca pnömoni, ishal ve gastrointestinal hastalık semptomları sergilediği bildirilmiştir²⁰. Şu anda, MERS-CoV için ticari bir aşı veya spesifik bir tedavi mevcut değildir. Bu nedenle, yaygın MERS-CoV salgınlarını önlemek ve MERS-CoV'yi SARS-CoV-2 hastalığından ayırt etmek için hızlı ve kesin tanı şarttır.

Bugüne kadar, bu virüsleri tespit etmek için multipleks RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas12^26,27, CRISPR/Cas9²⁸ ve CRISPR/Cas3²⁹, yanal akış immünolojik testi³⁰, kağıt tabanlı biyomoleküler sensörler³¹, bir kapta SHERLOCK testi 32, DNA aptamer³³, döngü aracılı izotermal gibi birçok yaklaşım önerilmiştir amplifikasyon (LAMBA)^19,34, vb. Yukarıda belirtilen yöntemlerin her birinin, duyarlılık ve özgüllük açısından benzersiz yararları ve sakıncaları vardır. Bu yöntemler arasında nükleik asit amplifikasyonuna dayalı test: multipleks qRT-PCR, en yaygın olanıdır ve SARS-CoV-2, İnfluenza A, İnfluenza B ve MERS-CoV tanısı için altın standart olarak kabul edilir.

Bu çalışmada, standart bükümlü sentetik viral RNA'ları kullanarak SARS-CoV-2, İnfluenza A, İnfluenza B ve SARS-CoV-2, MERS-CoV'nin etkili, doğru ve eş zamanlı tespiti için çeşitli primer kombinasyonları ve probları tasarladık ve değerlendirdik. MERS-CoV veya SARS-CoV-2 hedef genleri için geliştirilen çoğullanmış testler Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından önerilmektedir. Bu genler genellikle bir replikasyon/transkripsiyon kompleksinin (RTC) oluşumuna katkıda bulunan proteinleri ve kompleksleri ^kodlar.35 MERS-CoV testi için kullanılan açık okuma çerçevesi 1a (ORF1a) içindeki bölge gibi. Ek olarak, yapısal proteinler, sırasıyla MERS-CoV ve SARS-Cov-2 testleri için kullanılan zarf geninin yukarı akış bölgesi (upE) ve nükleokapsid geni (N) gibi tanısal testlerde kullanılan genler tarafından kodlanır^35,36. Virüslerin tespiti için RT-qPCR'yi oluşturmak için kurum içi R3T tek adımlı RT-qPCR kitini kullandık³⁷. R3T tek adımlı RT-qPCR kitimizin ve primer setlerimizin virüs tespiti, duyarlılığı, özgüllüğü ve dinamik aralığı, standart bükümlü sentetik RNA'ların 10 kat seri dilüsyonları kullanılarak test edildi ve değerlendirildi. En düşük pratik saptama sınırı, reaksiyon başına yaklaşık 10 transkript kopyasıydı. Sonuç olarak, kurum içi R3T tek adımlı RT-qPCR kiti ve primer/prob setleri, SARS-CoV-2, İnfluenza A, İnfluenza B ve SARS-CoV-2, MERS-CoV'nin rutin eşzamanlı teşhisi için başarıyla kullanılabilir ve uygulanabilir.

1. Taq polimeraz ekspresyonu ve saflaştırılması

1. Enzimin C-terminalinde katlanabilir bir heksa-histidin etiketine sahip bir plazmit oluşturun.
2. Ekspresyon vektörünün 50 ng'sini standart protokol^38'i izleyerek E. coli BL21-(DE3) suşuna dönüştürün.
3. Dönüştürülmüş hücreleri, her biri 37 ° C'de 2 L 2YT ortam suyu içeren dört adet 6 L'lik şişede, 0.8'lik OD 600'e veya 6.4 x 10⁸ hücre numarasına ulaşılana kadar 170 rpm'de çalkalayarak aşılayın.
4. 0.5 mM izopropil-β-d-tiyogalaktopiranosid (IPTG) ile Taq polimeraz ekspresyonunu indükleyin ve ayrıca çalkalama ile 18 saat boyunca 16 ° C'de inkübe edin.
5. Hücreleri 4 °C'de 7808 x g'da 10 dakika döndürerek hasat edin. Peletleri 200 mL buz gibi soğuk bir Taq polimeraz lizis tamponunda (Tablo 1) 5 mL / g hücre peletinde yeniden süspanse edin.
6. Hücreleri lizozim (2 mg / mL lizis tamponu) ve proteaz inhibitörleri ile 45 dakika inkübe edin ve daha sonra lizatı 30 kPsi'de bir hücre bozucudan geçirin ve hücre kalıntılarını ayırmak için 4 ° C'de 30 dakika boyunca 22.040 x g'de santrifüjleyin.
7. Süpernatanı 85 °C'de 15 dakika ısıtın. 4 °C'de 1 saat boyunca 95.834 x g'da döndürün. Süpernatanı toplayın ve 0.45 μm filtre kullanarak buz üzerinde filtreleyin.
8. Hızlı Protein Sıvı Kromatografisi (FPLC) kullanarak, numuneyi önce Taq polimeraz tamponu A kullanarak 4 mL/dak akış hızında bir Ni-NTA HP 5 mL kolonundan geçirerek protein saflaştırması gerçekleştirin (Tablo 2; Şekil 1A).
9. 10 kolon hacmi (CV) Taq polimeraz tamponu A ve %4 Taq polimeraz tamponu B ile yıkayın (Tablo 2). 100 mL'lik bir şişede 20 CV üzerinde Taq polimeraz Tampon B kullanarak bağlı proteini doğrusal bir gradyan ile elute edin.
10. 100 mL'lik şişedeki eluenti, Taq polimeraz tamponu C kullanarak 4 mL/dk'da 5 mL'lik bir katyon değişimi kolonundan geçirin (Tablo 2; Şekil 1A).
11. 20 CV %100 Taq polimeraz tamponu C ve %5 Taq polimeraz tamponu D ile yıkayın (Tablo 2).
12. %5'ten %100'e kadar başlayan Taq polimeraz tamponu D (Tablo 2) kullanarak doğrusal bir gradyan ile elute edin.
13. SDS-PAGE jel elektroforezi ³⁹ ve ardından daha önce tarif edildiği gibi jel boyama ⁴⁰ gerçekleştirerek ayrıştırılmış fraksiyonları kontrol edin. Kısaca, her fraksiyondan 10 μL alın ve eşit hacimde 2x SDS yükleme boyası ekleyin. Numuneyi 90^°C'de 10 dakika denatüre edin. Numuneleri %10 SDS-PAGE jel üzerine yükleyin ve jeli 200 V'ta 25 dakika çalıştırın.
14. Saflaştırılmış Taq polimeraz içeren tüm fraksiyonları toplayın ve 4 °C'de taq polimeraz depolama tamponuna (Tablo 3) karşı diyalize edin. Kısaca, 2 L saklama tamponu hazırlayın ve diyaliz kasetini nemlendirmek için 2 dakika tampona daldırın. Toplanan fraksiyonları bir iğne kullanarak diyaliz kasetine enjekte edin ve bir gece diyaliz tamponunda karıştırıcıda 200 rpm'de bırakın.
15. Diyalizden sonra, bir spektrofotometre kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün, 10 μL'lik alikotlar yapın, sıvı nitrojende dondurun ve -80 °C'de saklayın.
    NOT: FPLC sistemine yüklemeden önce 0.45 μm'lik bir filtre kullanarak saflaştırma için tüm tamponları filtreleyin.

2. Böcek hücresi ekspresyon sisteminde MMLV-RT ekspresyonu ve saflaştırma

1. Bacmid DNA üretimi ve izolasyonu
   1. MMLV-RT dizisini, daha önce açıklandığı gibi bir C-terminali bölünebilir TEV-8xHis-Strep etiketiyle klonlayın⁴¹.
   2. 100 ng ekspresyon vektörünü 50 μL DH10Bac hücresine karıştırın ve tüpe vurarak hafifçe karıştırın.
   3. Hücreleri buz üzerinde 15 dakika inkübe edin. Hücreleri 42 °C'de 1 dakika boyunca ısı şoku uygulayın.
   4. Hemen buz üzerine aktarın ve 400 μL SOC ortamı ekleyin. 37 °C'de çalkalayarak 4 saat inkübe edin.
   5. Plaka 10 μL ve 15 μL karışımın üç antibiyotik içeren LB Agar plakaları üzerinde; Mavi-beyaz seçim için 50 μg/mL Kanamisin, 10 μg/mL Tetrasiklin ve 7 μg/mL Gentamisin ile birlikte 40 μg/mL IPTG ve 100 μg/mL X-Gal.
   6. Plakaları 37 °C'de 48 saat inkübe edin. Kontrol olarak birkaç beyaz koloni ve bir mavi koloni seçin ve bunları yukarıdaki antibiyotikleri içeren taze LB agar plakalarına yeniden çizin. Plakaları gece boyunca 37 °C'de inkübe edin.
   7. Beyaz fenotipi doğruladıktan sonra, birkaç koloni seçin ve bunları 50 mL tüplerde 50 μg/mL Kanamisin, 10 μg/mL Tetrasiklin ve 7 μg/mL Gentamisin içeren 10 mL LB ortamına aşılayın.
   8. Kültürü 37 ° C'de gece boyunca 170 rpm'de çalkalayarak inkübe edin. Hücreleri 10 dakika boyunca 22.040 x g'da döndürerek peletleyin.
   9. Süpernatanı boşaltın ve peleti miniprep kitinden 250 μL yeniden süspansiyon çözeltisi içinde yeniden süspanse edin (bu çözeltinin üreticinin talimatlarına uygun olarak kullanılması gerekir), ardından çözeltiyi 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
   10. 250 μL lizis çözeltisi ekleyin, hafifçe karıştırın ve 3 dakika inkübe edin. 350 μL nötralize edici çözelti ekleyin, 2x-3x ters çevirin ve 10 dakika boyunca 22.040 x g'da santrifüjleyin.
   11. Süpernatanı taze bir tüpe aktarın ve eşit hacimde buz gibi soğuk izopropanol ekleyin ve -20 °C'de 30 dakika inkübe edin.
   12. Çökeltilmiş DNA'yı 10 dakika boyunca 22.040 x g'da döndürerek aşağı doğru peletleyin. Süpernatanı atın ve peleti 700 μL% 70 buz gibi etanol, 2x ile yıkayın.
   13. Süpernatanı pelete dokunmadan bir pipetle çıkarın. Pelet havasını laminer akış başlığında 5-10 dakika veya tüpte sıvı görülmeyene kadar kurumaya bırakın. Peleti 100 μL EB tamponunda çözün.
2. Bacmid transfeksiyonu ve virüs amplifikasyonu
   1. P1 virüsü hazırlama
      1. 6 oyuklu bir doku kültürü plakasında, 2 mL böcek hücre kültürü ortamında ~ 9 x 10⁵ hücre/kuyu tohumlayın.
      2. Hücrelerin yapışmasını sağlamak için plakayı oda sıcaklığında ~ 30 dakika inkübe edin.
      3. Bacmid/Fugene karışımını şu şekilde hazırlayın: 1 μg Bacmid DNA ve 300 μL böcek hücresi ortamını bir tüpte karıştırın. Başka bir tüpte, 8 μL transfeksiyon reaktifi ve 300 μL böcek hücresi ortamını karıştırın. Her iki karışımı da nazikçe pipetleyerek karıştırın ve bakmid/transfeksiyon reaktif kompleksinin oluşması için oda sıcaklığında ~30 dakika bekletin.
      4. Her bir kuyucuğa damla damla bakmid kompleks karışımı (~ 210 μL) ekleyin ve plakayı şeffaf bir filmle kapatın.
      5. Plakayı 27 °C'de 3-4 gün inkübe edin.
      6. Virüsü içeren besiyerini alın, FBS (son konsantrasyon %2) ekleyin, 0.45 μm filtre kullanarak süzün ve karanlıkta 4°C'de P1 virüs stoğu olarak saklayın.
   2. P2 virüsü hazırlama
      1. Bir kültür şişesinde 3 mL P1 virüsü ile 2 x 10⁶ hücre / mL'de 50 mL böcek hücresini transfekte edin.
      2. Ölü hücre yüzdesi %25-30'a ulaşana kadar 4-6 gün boyunca 100 rpm'de çalkalayarak 27 °C'de inkübe edin.
      3. 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve virüsü içeren süpernatanı toplayın.
      4. FBS'yi %2'lik bir nihai konsantrasyona ekleyin, 0.45 μm filtreden süzün ve her biri 1 mL alikot edin ve -80 ° C'de P2 virüs stoğu olarak saklayın.
   3. P3 virüsü hazırlama
      1. 100 mL böcek hücresini 2 x 10⁶ hücre / mL'de 2 mL P2 virüsü ile bir kültür şişesinde transfekte edin.
      2. Ölü hücre yüzdesi %15-20'ye ulaşana kadar 3-4 gün boyunca 100 rpm'de çalkalayarak 27 °C'de inkübe edin.
      3. Hücreleri 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve virüsü içeren süpernatanı toplayın.
      4. FBS'yi %2'lik bir son konsantrasyona ekleyin. 0,45 μm'lik bir filtreden süzün. Karanlıkta 4 °C'de 1 ay saklanabilir.
3. Böcek hücrelerinde MMLV-RT'nin ekspresyonu ve saflaştırılması
   1. Taze böcek hücrelerine 2 x 10⁶ hücre/mL (700 mL/2L şişe) yoğunlukta toplam 6 şişede 5 mL P3 virüsü ekleyin.
   2. Transfeksiyondan 55-60 saat sonra, 10 dakika boyunca 7808 x g'da döndürerek hücreleri hasat edin.
   3. Hücre peletlerini 200 mL MMLV-RT lizis tamponunda yeniden süspanse edin (Tablo 4). Lizatı 15 kPsi'de bir hücre bozucudan geçirin ve 4 ° C'de 30 dakika boyunca 22.040 x g'da santrifüjleyin.
   4. Süpernatanı yeni tüplere aktarın ve 1 saat boyunca 4 ° C'de 95.834 x g'de tekrar döndürün. Süpernatanı toplayın ve 0,45 μm'lik bir filtre kullanarak buz üzerinde filtreleyin.
   5. MMLV-RT tamponu A kullanarak numuneyi önce 4 mL/dk akış hızında Ni-NTA Excel 5 mL kolonundan (Şekil 1B) geçirerek FPLC kullanarak protein saflaştırmasına başlayın (Tablo 5).
   6. Kolonu 10 CV MMLV-RT tamponu A ve %4 MMLV-RT tamponu B ile yıkayın (Tablo 5) ve proteini 100 mL'lik bir şişede 20 CV üzerinde MMLV-RT tamponu B'nin doğrusal gradyanı ile elüte edin.
   7. Ayrıştırılmış numuneyi MMLV-RT tamponu C ile dengelenmiş Strep 5 mL kolonundan (Şekil 1B) geçirin (Tablo 5).
   8. Kolonu 10 CV% 100 MMLV-RT tamponu C ile yıkayın ve proteini 20 CV tampon D ile doğrusal bir gradyan ile elüte edin (Tablo 5).
   9. 1.13.-1.14 adımlarında olduğu gibi SDS-PAGE gerçekleştirerek ayrıştırılmış kesirleri kontrol edin. ve 4 ° C'de MMLV-RT depolama tamponuna (Tablo 6) karşı diyalize edilecek saflaştırılmış MMLV-RT içeren fraksiyonları toplayın.
   10. Nanodrop, alikot, sıvı nitrojen içinde dondurun ve -80 °C'de saklayın.
       NOT: FPLC sistemine yüklemeden önce 0.45 μm'lik bir filtre kullanarak saflaştırma için tüm tamponları filtreleyin.

3. Kurum içi multipleks R3T tek adımlı RT-qPCR kit bileşenlerinin hazırlanması

1. Tampon karışım hazırlama
   1. Daha önce 2'de gösterilen reaktifleri içeren RT-qPCR reaksiyonu için^37x tamponu hazırlayın. Tüm reaktifleri DNase/RNase içermeyen suda ve -20 °C'lik bir dondurucuda saklanan tampon karışımında hazırlayın.
2. Astar ve Prob Setleri ve astarlar karışım hazırlama
   NOT: Kullanılan problar ve primerler Tablo 7'de listelenmiştir. Influenza ve SARS-CoV-2 çoğullanmış kiti, 3 prob ve 4 ileri ve geri primer seti içerir. Problar, InfA için 6-karboksifloresein (FAM), SARS-CoV-2 (N geni) için Texas Red-XN ve InfB için Yakima Yellow muhabirleri kullanılarak 5' uçlarda etiketlenir. MERS-CoV ve SARS-CoV-2 çoğullanmış kiti, 3 prob ve 3 ileri ve geri primer seti içerir. Problar ayrıca MERS-CoV (ORF1a geni) için Texas Red-XN, MERS-CoV (UpE geni) için VIC ve 6-karboksifloresein (FAM) SARS-CoV-2 (N geni) raportörleri kullanılarak 5' uçlarda etiketlenir.
   1. Tablo 7'de listelenen tüm primerleri ve probları içeren, her bir ileri ve geri primer için 6.7 μM nihai konsantrasyona sahip bir primer karışımı hazırlayın ve 1.5 mL'lik bir tüpte her prob için 1.25 μM. Astar karışımını -20 °C dondurucuda saklayın. Gerekli hacmi oluşturmak için elüsyon tamponu kullanın.
3. Enzim karışımı hazırlama
   1. Gerekli hacmi oluşturmak için Taq polimeraz (30 U/μL) ve MMLV-RT (60 ng/μL) enzim karışımını Tablo 3'te gösterildiği gibi Taq polimeraz depolama tamponunda hazırlayın. Bu adımı buz üzerinde gerçekleştirin ve enzim karışımını -20 °C'de saklayın.
4. RNA şablonu
   1. SARS-CoV-2, İnfluenza A H1N1, İnfluenza A H3N2, İnfluenza B ve MERS-CoV'nin sentetik RNA'larını 100 μL 1x Tris-EDTA tamponunda (10 mM Tri-Cl ve 1 mM EDTA (pH 8.0) ayrı ayrı yeniden süspanse ederek 1 x 10⁶ RNA kopyası/μL'lik bir stok yapın.
   2. RT-qPCR için sentetik RNA'ları aşağıdaki konfigürasyonlarda karıştırın: 1) SARS-CoV-2, İnfluenza A ve İnfluenza B, 1 x 10⁵ RNA kopyası/μL yapmak için 50 μL hacme her virüs stoğundan 5 μL ekleyerek; 2) SARS-CoV-2, MERS-CoV, 1 x 10⁵ RNA kopyası/μL yapmak için 50 μL hacme her virüs stoğundan 5 μL ekleyerek. 1 x 10⁵ RNA kopyası/μL ila 10 RNA kopyası/μL arasında değişen her bir sentetik RNA karışımının 10 kat seri dilüsyonunu yapın.
      NOT: Şablonların seri seyreltmesini hazırlamak için buz gibi soğuk DNase/RNase-Free su kullandığınızdan emin olun.

4. Kurum içi çoğullanmış SARS-CoV-2, İnfluenza A, İnfluenza B ve SARS-CoV-2, MERS-CoV tek adımlı RT-qPCR testi

NOT: İş istasyonu yüzeylerini dezenfekte edin ve PCR plaka düzenini planlamak için 96 oyuklu bir plaka şablonu kullanın.

1. 96 oyuklu plakanın hazırlanması
   1. 2x tampon ve astar karışımını çözün. Enzim karışımını buz üzerinde tutun.
   2. Her bir oyuğa 10 μL 2x tampon karışımı, 1.5 μL primer karışımı, 1 μL enzim karışımı, 6.5 μL DNaz/RNaz İçermeyen Su ve test edilmesi gereken 1 μL karşılık gelen RNA karışımı ekleyin. Her oyuktaki son hacim 20 μL'dir. Bu adımla ilgili yardım için lütfen hazırlanan düzene bakın.
      NOT: Pipetleme yanlılığını önlemek için RNA numunesi dışındaki tüm reaktifleri içeren reaksiyon sayısına göre bir ana karışım yapılması önerilir. Ek olarak, teknik hataları önlemek için reaksiyonları iki veya üç kopya halinde gerçekleştirin.
   3. Plakayı yapışkan bir PCR plaka contası ile kapatın ve plakanın altındaki tüm sıvıyı toplamak için 1 dakika kısa bir süre santrifüjleyin. Numuneleri qPCR makinesine aktarmadan önce her kuyucuğun aynı hacimde sıvıya sahip olduğundan ve kabarcık içermediğinden emin olun.
      NOT: Tüm PCR reaksiyonlarının buz üzerinde ayarlanması gerekir.
2. PCR programı
   1. Gerçek zamanlı qPCR makine programını açın ve aşağıdaki deneysel özellikleri seçin:
      Blok tipi: Hızlı 96 kuyulu (0.1 mL)
      Deney düzeneği: Standart eğri
      Reaktifler: TaqMan reaktifleri
      Çalıştırma özellikleri: Standart.
   2. Tablo 7'de gösterildiği gibi tüm gen hedeflerini ve raportör boyalarını tanımlayın. Ek olarak, amplifikasyon eğrilerinin daha kolay analizi için test edilecek her reaksiyon için numune adlarını tanımlayın.
   3. 96 oyuklu plakaya dayalı olarak programın plaka düzenine hedefler ve numuneler atayın.
   4. PCR cihazında aşağıdaki döngü programını aşağıdaki gibi ayarlayın:
      esnasında 55 °C esnasında 10 dk
      40 döngü: 1 dakika boyunca 94 °C
      10 sn boyunca 94 °C
      esnasında 68 °C 10 sn
      20 saniye boyunca 68 °C; Burada floresan elde edin.
   5. Plakayı gerçek zamanlı qPCR makinesine aktarın ve plakanın doğru yönlendirilmesini sağlayarak tutucuya yerleştirin ve çalıştırmayı başlatın.
   6. Deneysel verileri kaydetmek için dosya konumunu seçin.
3. Veri analizi
   1. Öncelikle qPCR programı tarafından üretilen amplifikasyon grafiklerinin incelenmesi esastır. Tespit edilebilecek minimum RNA konsantrasyonunu değerlendirmek için tespit sınırını analiz edin.
   2. Testin hassasiyetini değerlendirmek için x ekseninde RNA kopya sayısının günlüğünü ve y ekseninde karşılık gelen ortalama Ct değerini çizin. Eğim ve^R2 , reaksiyonun güvenilirliğini ve verimliliğini gösterir.

Son yıllarda, PCR yaklaşımları 21,22,23,24,25 kullanılarak yaygın solunum yolu virüslerini saptamaya yönelik tanı yaklaşımında önemli ilerlemeler olmuştur. Bununla birlikte, bu gelişmelere rağmen, tek bir testte birden fazla virüsün tespit edilmesini sağlayan çoğullama yaklaşımı, özellikle RT-qPCR platformunda yaygın olarak uygulanmamıştır. Bu yöntem, sentetik RNA virüsleri ve reaksiyon bileşenlerinin kurum içi optimizasyonu kullanılarak başarıyla uygulanmıştır37. Tanısal testin özgüllüğü, duyarlılığı ve güvenilirliği, bir saptama analizi sınırı kullanılarak yüksek olarak değerlendirildi. Sunulan yaklaşım, solunum virüsü teşhisinin etkinliğini ve doğruluğunu büyük ölçüde artırabilir, çoklu testlere olan ihtiyacı azaltabilir ve43'te olduğu gibi yanlış teşhis riskini en aza indirebilir. Hasta örneklerini kullanarak bu yaklaşımın faydalarını araştırmak ve klinik uygulamada benimsenmesini teşvik etmek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.

Histidin etiketli Taq DNA polimerazın ekspresyonu ve saflaştırılması
Taq DNA polimeraz ekspresyonu ve saflaştırma44'ün yerleşik protokolüne dayanarak, N-terminal histidin etiketli Taq DNA polimeraz plazmidi, yukarıda açıklandığı gibi ekspresyonunu ve saflaştırma sürecini kolaylaştırmak için bir soğuk şok promotörü kontrolü altında oluşturulmuştur (Şekil 1A ve Şekil 2A). Böylece, sadece IPTG konsantrasyonunu ve sıcaklığını değiştirerek, bu yeni yapının ekspresyon seviyesi kolayca kontrol edilebilir. Taq DNA polimeraz plazmidini içeren hücrelerin 16 ° C'de 1 mM IPTG ile inkübasyonu, His-Taq DNA polimerazın gelişmiş ekspresyonunu gösterdi. Ek olarak, daha önce kurulan protokol44 , nihai ürün saflığı etkilenmediği ve ticari olarak temin edilebilen Taq polimeraz ile karşılaştırılabilir olduğu için burada kullanılan yapı ile atlanabilen, zaman alıcı polietilenimin (PEI) çökeltme adımlarını gerektiriyordu (Şekil 2B). Saflaştırılmış Taq polimeraz, N-terminalinde enzim ve histidin etiketi arasındaki bağlayıcı peptitlerin varlığından dolayı ticari olandan daha yavaş göç etti. Taq DNA polimeraz, saf proteinin 0.98 mg/L E. coli kültürü ile başarıyla üretildi.

Çift His- ve Strep-Etiketli MMLV ters transkriptazın ekspresyonu ve saflaştırılması
Bakulovirüs ekspresyon sistemi, Şekil 2A'da tarif edildiği gibi böcek hücrelerinde (Sf9) bir C-terminali çift His ve Strep-tag ile MMLV-RT'yi eksprese etmek için kullanıldı. Daha önceki bir çalışma, C-terminal etiketli MMLV-RT'nin, ipekböceği-bakulovirüs ekspresyon vektör sistemi (ipekböceği-BEVS) kullanılarak ipekböceklerinde hem N-terminal etiketli proteinin hem de C-terminal etiketli proteinin sentezlendiği daha yüksek aktivite gösterdiğini göstermiştir41. Homojen bir MMLV-RT proteini üretmek için, yukarıda belirtilen çalışmada sunulanla aynı stratejiler ve protokol kullanılmıştır. Sonuç olarak, SDS-PAGE jel sonucu ile gösterildiği gibi 7.5 mg / L böcek hücre kültürü verimi ile gelişmiş ekspresyon ve% 95'ten fazla saf protein elde edildi (Şekil 2C).

Çoğullanmış qRT-PCR'nin optimizasyonu ve standardizasyonu
Optimize edilmiş ve geliştirilmiş bir kurum içi çoğullanmış RT-qPCR testi, aynı anda üç farklı yaygın solunum yolu virüsünü tespit etmek için tampon ve primer karışımı optimizasyonu turlarından sonra başarıyla monte edildi ve üretildi (Şekil 3)37. İlk kit, SARS-CoV-2 N geni, İnfluenza A H1N1 ve H3N2 ve İnfluenza B genini hedeflemek için tasarlandı; ikinci kit ise SARS-CoV-2 N geni, MERS ORF1a ve upE genleri içindir. Böylece, her iki kit de burada sunulan iş akışı olarak üç hedefi de başarılı ve aynı anda tespit edebilir (Şekil 3). Bu protokolde kullanılan virüslerin her birinin sentetik RNA örnekleri, yaygın solunum yolu virüslerinin tespiti için çoğullanmış bir kit gibi kullanma olasılığını gösterecek şekilde çoğaltıldı. Bu tanı testinin duyarlılığı, hasta örneklerinde daha önce bildirilen sonuçlara benzer. Hastaların influenza benzeri semptomlar gösterdiği durumlarda, çoğullanmış gerçek zamanlı RT-qPCR kullanımı, SARS-CoV-2, influenza A ve influenza B çoğullanmış test45 ile karşılaştırılabilir sonuçlar göstermiştir.

Kurum içi çoğullanmış RT-qPCR kitinin yaygın solunum yolu virüslerine karşı duyarlılığı ve tespit limiti
Kurum içi çoğullanmış kitin etkinliği, çoğullanmış RT-qPCR iş akışında gösterildiği gibi iki set primer karışımı ve her kit için karşılık gelen sentetik RNA kullanılarak değerlendirildi (Şekil 3). Şablon olarak 10 ila 105 kopya/μL arasında değişen her bir sentetik RNA karışımının 10 kat seri seyreltilmesi ile her bir primer karışımı kullanılarak, geliştirilen her iki çoğullanmış RT-qPCR'nin duyarlılığı, özgüllüğü ve tespit limiti standart eğri analizi kullanılarak belirlenebilir. Bu, çoğullanmış RT-qPCR kitinin etkinliğini ve tutarlılığını doğrulamak için her testin üç bağımsız kopyasında yapılır. Sonuç olarak, burada geliştirilen iki kit, amplifikasyon eğrisi ve tespit limiti (LoD) tarafından görüldüğü gibi 10 RNA kopyası/reaksiyonu kadar düşük bir oranda üç hedef genin tümünü aynı anda başarılı bir şekilde amplifiye edebilir (Şekil 4 ve Şekil 5). Her bir eğrinin eğim ve R2 değerleri, bireysel tahlillerin verimliliğini değerlendirmek için kullanılmıştır (Şekil 4 ve Şekil 5). R2 değerleri, veri noktalarına doğrusal uyumun iyiliğinin bir tahminini sağladı. Etkili bir qPCR testinde,R2

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.