Yöntem makalesi

Bitki dokularında kallosun enzimle bağlı immünosorbent testi/immünoflüoresans spektrofotometrisi ile nicelendirilmesi

112 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/65833

⸱

22 Mayıs 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Sciences, Microbiology, and Biotechnology, College of Natural Sciences, Makerere University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3The Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 4International Potato Center (CIP)

Bu makalede

Özet

Bu protokol, bitki örneklerindeki kallosun kalloza özgü yöntem olan immünoflüresans spektrootometrisi/ELISA ile kallozu niceliklerini nicelleştirir; bu yöntem, bitki örneklerindeki kallosun kalloza özgü antikorlara bağlanmasını ve ardından bağlı kallosun enzim etiketli algılama antikorlarıyla ortaya çıkan enzimatik aktivitenin ölçülmesiyle nicelendirilmesini sağlar.

Özet

Bitki dokularından kallos nicelik ölçeme yöntemleri arasında epifloresans mikroskobi, floresans spektrofotometrisi, immünoflüosans mikroskopisi ve hem kallos sentaz hem de β-(1,3)-glukanaz aktivitelerinin dolaylı değerlendirmesi yer almaktadır. Ancak, bu yöntemlerin bazılarının önemli sınırlamaları vardır; bunlar zaman alıcı, naslize özgü olmayan, emek yoğun olmuş, öznel, yüksek otofloresanslı, düşük hassasiyet, niceliksel yerine daha niteliksel olması ve yazılım kaynakları ile teknik becerilerin edinilmesini gerektirmeleri vardır. Bu nedenle, bitki dokularında kallos niceliği için alternatif yöntemlerin araştırılması acil bir ihtiyaç vardır. Kalloz-spesifik antikorlar kullanan immünoflüoresans spektrofotometrisi veya enzimle bağlantılı immünosorbent testin (ELISA), mevcut kallos niceleme yöntemlerinin bazı sınırlamalarını aşabileceği varsayımlıydı. Biyotik stres, doku kültüründen türetilen muz bitkileri Xanthomonas vasicola pv ile aşılanarak uygulandı. kallos üretimini tetikleyen musacearum (Xvm) bakterileri. Muz somuğu doku örnekleri, yeni immünoflüoresans spektrofotometri yöntemiyle kallos niceliği için aşıdan 14 gün sonra (dpi) alındı. Xvm aşılanmış ve kontrol gruplarının kormlarındaki kallos üretimi, her iki muz genotipinde de anlamlı şekilde değişiklik gösterdi (bağımsız örnek t-testi, p < 0.05). Burada tanımlanan immünoflüoresans spektrofotometri yöntemi, kalloza yüksek özbaşlılık, hassasiyet, güvenilirlik ve tekrarlanabilirlik sahip farklı bitki dokularında kallosun nicelendirilmesi için uygulanabilir. Ayrıca, 96 kuyuyla plaka kullanımı bu yöntemi, minimum örnekleme ve analiz yanlılıklarıyla yüksek verimli kallos nicelik çalışmaları için uygun kılar.

Giriş

Callos, çeşitli yüksek bitkilerin hücre duvarlarında bulunan doğal olarak bulunan β-1,3-glukanın polisakkaridi olan bir polisakkarittir. Kalloz, kallos sintazları (CalS) tarafından sentezlenir ve β-(1,3)-glukanazlar 1,2,3 tarafından parçalanır. Büyüme, gelişim ve abiotik ve biyotik streslere yanıt dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçlerde yer alır 4,5,6. Patojen enfeksiyonu sırasında, papillalarda kallos birikiminin artması, komşu bitki hücreleri arasında geçirgenlik bariyeri olarak görev yaparak daha fazla mikrobiyal kolonizasyonu önlemeyeyardımcı olur 2,4,7,8,9,10,11,12 . Saldırıya uğrayan dokuda patojenin invazını yavaşlatarak, kalloz birikintisi ek savunma yanıtlarının indüklenmesi için zamantanır 13. Bitki dokularındaki kallosun doğru uzaylı-zamansal nicelenmesi, çeşitli fizyolojik süreçlerdeki rolünü anlamak için gereklidir. Ancak, bitki dokularından kallos nicelik ölçeme yöntemleri olan epifloresan mikroskopisi, immünoflüoresans mikroskopisi ve floresan spektrofometrisi gibi önemli sınırlamalar ve nicelik zorlukları bulunmaktadır. Bu nedenle, bu dezavantajları aşmak için kallos niceliği için alternatif yöntemlerin araştırılması acil bir ihtiyaç vardır. İmmünoflüoresans spektrofotometrisi veya enzimle bağlantılı immünosorbent testi (ELISA) ile bitki örneklerinde yüksek özbaşıklık, hassasiyet, güvenilirlik, tekrarlanabilirlik ve yüksek verimlilik içeren kallos niceliklendirme yöntemini daha verimli bir yöntem sunabileceği öne sürüldü.

Kallos nicelendirmesi için altın standart yöntem, anilin mavisi boyalı kalloz parçacıklarının epifloresansmikroskopisi 14,15,16,17 ile görüntülenmesini içerir. Anilin mavisi boyalı kalloz, mavi veya UV ışığı uyarımına maruz kaldığında sarı floresan parçacıklar olarak görünür; bu parçacıklar ya elle14,15 floresan kallos parçacıkları sayılabilir ya da otomatik kallos sayma yazılımıyla sayılabilir. Kallos parçacıklarının manuel sayımı zahmetli, zaman alıcı ve araştırmacıiçin öznel bir konudur; oysa otomatik sayma yazılım kaynakları ve önemli teknik beceriler edinmeyi gerektirir. Otomatik kallose sayımı için kullanılan bazı yazılımlar arasında ImageJ 19,20,21,22, photoshop 23, CalloseMeasurer24, Icy18,25 ve Ilastik26 bulunmaktadır. Anilin mavisi boyalı kallos ayrıca floresans spektrofotometrisi 17,19,27,28,29 kullanılarak da nicelendirilebilir. Ancak, epifloresans mikroskobu ve floresans spektrofotometrisiyle ilişkili yüksek arka plan/otofloresans, düşük sinyal-gürültüoranı 26 nedeniyle bu yöntemleri zor ve güvenilmez hale getirir. Ayrıca, anilin mavisi, kallos30 dışında diğer β-1,3-glukanları da boyayabilir; bu da hem epifloresans mikroskopisi hem de kallos algılama ve nicelik için floresans spektrofotometri yöntemlerini kısmen spesifik olmayan ve güvenilmez hale getirir. Kalloza özgü antikorlara dayanan bir immünoflüoresans mikroskopi yöntemi, kalloza özgü antikorlara dayanan bir yöntem de çeşitli çalışmalardakullanılmıştır 31,32,33. Bu yöntem, anilin mavisi boyanmış kallozun epifloresan mikroskopisiyle bazı dezavantajları paylaşsa da, burada kullanılan antikorlar sayesinde kalloza özgü olma avantajına sahiptir. Kalloz niceliği de enzim aktivite temelli yöntemlerle gerçekleştirilmiştir. Kallos nicelendirilmesi için enzim aktivitesine dayalı yöntemler, kalloz sentazı (CalS)20,33 ve β-(1,3)-glukanazaktivitelerinin 34,35 değerlendirilmesini içerir. Enzim aktivitesine dayalı yöntemlerin, epifloresan mikroskopisi, immünofluoresans mikroskopisi ve floresan spektrotometrisine kıyasla birkaç dezavantajı vardır. Bunlar arasında kallosun dolaylı tahmini, enzim çıkarma ve enzim aktivite testlerinin zorluğu ve bitki dokularında kallosun eşit dağılımın olmaması yer alır.

Epifloresan mikroskobi, immünoflüoresans mikroskopisi, floresan spektrofotometrisi, CalS ve β-(1,3)-glukanaz testleri gibi mevcut kallos nicelik yöntemlerinin dezavantajları nedeniyle, 1) yüksek özgüllük, hassasiyet, güvenilirlik ve tekrarlanabilirlik ile 2) yüksek verimlilik yeteneğine sahip daha kolay kallos niceliklendirme gibi birçok avantaj sunacak yeni bir kallos nicelendirme yöntemi geliştirilmesi gerekmiştir. Kallos nicelendirme için immünoflüoresans spektrofotometrisinin kullanımı henüz araştırılmamıştır. Burada, immünoflüoresans spektrofotometrisine dayalı yeni bir kallos nicelik yöntemi, daha spesifik olarak Enzim Bağlantılı İmmünosorbent Testi (ELISA) rapor edilmiştir. Yöntem, kallosun farklı bitkilerde veya dokularında kallosun niceliklendirilmesi için optimize edilebilir; nasır, hassasiyet, tekrarlanabilirlik ve yüksek verimli deneysel yetenekliliğe sahiptir. Bu yöntem, eğer o analite karşı antikor mevcutsa, herhangi bir bitki bazlı analitin niceliyebileceği şekilde de değiştirilebilir. Kallosun bitki dokularında doğru, verimli ve güvenilir uzaylı-zaman dağılımını sağlamak için, mikroskopi, spektrofotometri ve enzim aktivitesine dayalı yöntemler dahil olmak üzere farklı kallos nicelendirme yöntemlerinin aynı anda kullanılması önerilir. Sonuç olarak, bu durum kallos'un çeşitli fizyolojik ve stres tepkilerindeki rolünün doğru ve verimli şekilde anlaşılmasını sağlayacaktır.

Protokol

1. Deneysel bitkilerin aşılanması

  1. Xvm aşısını standartprosedürler 36,37 kullanarak izole edin, hazırlanın ve onaylayın. Rastgele 10, 2 aylık doku kültüründen türetilen Musa balbisiana ve Mbwazirume bitkilerini rastgele seçin ve en genç, tamamen açık yaprak sapının dorsal tarafına PCR ile onaylanmış 200 μL (1 x 108 hücre) Xvm inokulumu aşılayın (Şekil 1)38.
  2. Benzer şekilde, rastgele olarak 10 Musa balbisiana ve Mbwazirume muz bitkisi seçip 200 μL steril damıtılmış su (SDW) ile aşılayın.
  3. Xvm aşılanmış muz bitkilerini benzer koşullarda korumak, 25 °C'de 12 saat ışık/12 saat karanlık fotoperiyot ile kontrol etmek, her 3 günde bir sulamak.
    NOT: Malzemeler ve ekipman listesi ile tampon tarifi için Materyal Tablosu ve Tablo 1'e bakınız.

2. Corm dokularının örneklenmesi ve örnek hazırlanması

  1. Deneysel bitkilerden somun örnekleri elde etmek için yıkıcı örnekleme alın (Şekil 1).
  2. Aşıdan 14 gün sonra steril cerrahi bıçaklarla yaklaşık 2 g somurka örneklerini hızlıca çıkarın ve etiketli 50 mL tüplere tek tek yerleştirin. Bunu, Xvm aşılanmış bitkilerden ve kontrol tesislerinden toplanan 10 örnek için yapın.
  3. Örnekleri içeren 50 mL'lik tüpleri hemen sıvı azota daldırın.
  4. Örnekleri laboratuvara taşıyın ve hazır olana kadar -80 °C'de saklayın. Örnekleri −80 °C'de en fazla 1 yıl veya daha uzun süre saklayın; minimum donma-erime döngüleri yaşanır.
  5. Örnekleri 72 saat boyunca dondurucu kurutucu ile kurutun (Şekil 1).
  6. Dondurulmuş kurutulmuş örneklerden tam olarak 30 mg'yi, içinde 2 çelik bisiklet boncuk bulunan 2 mL'lik tüplere yerleştirin ve ince toz haline getirin; hız 5'e ayarlanarak 1 dakika boyunca (Şekil 1).
  7. Toz haline getirilen örnekleri oda sıcaklığında, soğuk, kuru bir ortamda, iyi mühürlenmiş şekilde saklamaya hazır hale getirilir. Toz haline getirilen örnekleri oda sıcaklığında en fazla 4 ay veya −80 °C'de en fazla 1 yıl boyunca minimum donma-erimedöngüleriyle saklayın 39,40.

3. Kallosun çıkarılması ve laminarin standartları ile blankların hazırlanması

  1. Toz haline getirilmiş korm örneğinin 30 mg'ından kallos çıkarmak için 800 μL 1 M NaOH ekleyin ve 80 °C'de su banyosunda 30 dakika kuluçka edin, ara sıra her 10 dakikadan sonragirdablar yapılabilir (Şekil 1, Adım 6).
  2. Örneklerin oda sıcaklığına (yaklaşık 5 dakika) soğumasına izin verin ve ardından 15.294 x g sıcaklığında 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
  3. Süpernatantı (kallos ekstraktı) steril 2 mL tüplere aktarın ve bloklama tamponu (Tablo 1) ile 1:2 oranında seyreltin.
    NOT: Ön deney ve optimizasyona dayalı seyreltme faktörünü seçin. Kallos ekstraktının seyreltilmesi gerekli olabilir veya olmayabilir. Gerektiğinde, seyreltme bloklama tamponunda yapılmalı ve farklı örnek türleri için standart eğri aralığında optimize edilmiş seyreltme oranı olmalıdır.
  4. Kallos ekstraktlarını hazır olana kadar -20 °C'de sakla. Kallos ekstraktını en az donma-erime döngüsiyle 6 aya kadar saklayın.
  5. 1 M NaOH 6,42,43,44,45 içinde 100 mg/mL ile konsantre bir laminarin standardı stoku hazırlayın.
    NOT: Laminarin 1-3-β-glukan polimeridir ve immünoflüosans spektromotometrisinde kalloz eşdeğerleri için standart olarak kullanılabilir.
  6. Elde edilen standart süspansiyonunu 80 °C'de bir su banyosunda inkubasyon edin, aralıklarla nazikçe sallayın, tüm laminarin tamamen çözünene kadar (yaklaşık 20-40 dakika).
  7. Çözülmüş standardı oda sıcaklığına (yaklaşık 10 dakika) soğutun.
  8. Bloklama tamponu kullanılarak 80 mg/mL, 60 mg/mL, 40 mg/mL, 20 mg/mL, 10 mg/mL, 10 mg/mL, 1 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,1 mg/mL ve 0,01 mg/mL konsantrasyonlarda laminarin standartları hazırlanır; 100 mg/mL konsantre stoktan başlayarak.
  9. Boşlukları 1 M NaOH ve bloklama tamponu ile 1:2 oranında karıştırarak hazırlayın. Eğer seyreltme gerekiyorsa, kallos ekstraktını hazırlamak için kullanılan aynı seyreltme oranını kullanın.
  10. Laminarin standartlarını ve boşlukları −20 °C'de sakla. Standartları ve boşlukları minimum donma-erime döngüleriyle 6 aya kadar saklayın.

4. İmmünofluoresans spektrofotometrisiyle kallos nicelenmesi

  1. Kaplama tamponu kullanılarak hazırlanan birincil antikordan (1-3-β-glukan yönlendirilmiş fare IgG) 100 μL ekle, polistiren ELISA plakalarının 96 kuyusunun her birine (Şekil 2).
  2. Tabağı parafin filmiyle sıkıca kapatın ve gece boyunca 4 °C'de buzdolabında kuluçka yapın.
  3. Ertesi gün, tabağı tezgaha koyun ve yaklaşık 10 dakika oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin.
  4. Plakayı standart bulaştırma ve yıkama prosedürleriyleyıkayın 46. Kısaca, 200 μL yıkama tamponu (Tablo 1) kuyruklara ekleyin, dijital bir shaker ile 500 rpm'de 30 saniye girdabla vurup kağıt kağıdına lekeleyin. Bu yıkama sürecini 2 kez tekrarlayın (Şekil 2). Kuyular tamamen kurumadığından emin olun ve kuyulardan oluşan kabarcıkları alt ve duvarlara dokunmadan temizlemek için steril bir mikropipet ucu kullanın.
  5. Her bir kuyuya 200 μL bloklama tamponu ekleyin (Şekil 2) ve plakayı parafin filmiyle sıkıca kapatın. 37 °C'de 4 saat kuluçka yapın. Plakayı yukarıda belirtildiği gibi yıkayın (Şekil 2).
  6. Belirlenen kuyulara 10 Xvm aşılanmış ve 10 kontrol tesisinden 100 μL kallos ekstraktı eklenin. Diğer kuyruklara 100 μL laminarin standartları ekleyin. Diğer kuyulara 100 μL boşluk ekleyin (Şekil 2).
  7. Plakayı parafin filmiyle sıkıca kapatın ve 4 °C'de buzdolabında gece boyunca kuluçka yapın. Plakayı yukarıda belirtildiği gibi tekrar yıkayın (Şekil 2).
  8. Her bir kuyuya bloklama tamponu kullanılarak hazırlanan birincil antikordan (1-3-β-glukan yönlendirilmiş fare IgG) 100 μL ekleyin (Şekil 2).
  9. Plakayı parafin filmiyle sıkıca kapatın ve 37 °C'de 4 saat kuluçka yapın, ardından yukarıda belirtildiği gibi plakayı yıkayın (Şekil 2).
  10. Her kuyu 46,47'ye 100 μL anti-Fare IgG-Alkalin fosfataz ikincil antikoru ekleyin (Şekil 2).
  11. Plakayı parafin filmiyle sıkıca kapatın ve gece boyunca 4 °C'de buzdolabında inkübe yapın. Sonra, yukarıda belirtildiği gibi plakayı yıkayın (Şekil 2).
  12. Kuyulara 1 mg/mL konsantrasyonda (Tablo 1) taze hazırlanmış para-nitrofenil fosfat (pNPP) çözeltisi 100 μL ekleyin (Şekil 2)
  13. Tabağı tezgahta oda sıcaklığında 30 dakika48 dakika kuluçka yapın.
    NOT: Kuluçka süresi, kullanılan bitki örneklerine ve standarda bağlı olarak değişebilir. Bu çalışmada, laminarin en iyi ölçüm süresi 30 dakika oldu.
  14. Her kuyu48'e 100 μL taze hazırlanmış stop çözeltisi (0,5 M NaOH) ekleyerek reaksiyonu sonlandırın (Şekil 2).
  15. Plakayı mikroplaka okuyucuya (37 °C ile dengelenmiş) aktarın, orta hızda 1 dakika sallayın ve 405 nm48 soğukkanlıklarını okuyun (Şekil 1, Şekil 2).

5. Veri analizi

  1. Standart eğri elde etmek için laminarin soğurgunluğunun 405 nm'de basit doğrusal regresyonunu laminarin konsantrasyonuna (μg/mL) karşı gerçekleştirin. Standart eğrinin denklemi şudur:
    Y = β1X + β0
    burada Y, 405 nm'deki laminarin soğurgunluğunu,β 1 regresyon çizgisinin eğimi (Pearson korelasyon katsayısı), X Log10'dur (laminarin konsantrasyonu μg/mL) ve β0 y-kesişimidir.
  2. Boşluk emilimini örneklerin emiliminden çıkararak mantrak örneklerindeki kallos konsantrasyonlarını hesaplayın. Daha sonra standart eğri kullanarak μg/mL cinsinden kallos konsantrasyonunu laminarin eşdeğeri (LE) olarak tahmin edin.
  3. Shapiro-Wilk testi ile dağılımın normalliği için tüm verileri inceleyin ve Levene testi ile varyansların homoskedastisitesini kontrol edin (α > 0.05).
  4. Xvm aşılanmış ve kontrol grupları arasındaki kallos üretimini karşılaştırmak için bağımsız örnek t-testini kullanın (s≤ 0.05).

Sonuçlar

Laminarin standartlarının bilinen konsantrasyonları spektrofotometri ile analiz edildi ve ilgili soğurma değerleri kaydedildi. Bu veriler kullanılarak, laminarin standartlarının x ekseninde konsantrasyonları ve y ekseninde emilimi çizerek bir Beer-Lambert grafigi oluşturuldu. Regresyon çizgisinin denklemi y = 0.5079x − 0.04534 (Şekil 3)49 idi. Beer-Lambert grafigi, yüksek korelasyon katsayısı (r) 0.9988 ve belirlenme katsayısı (r2) olarak 0.9975 olarak gösterdi; bu da konsantrasyon ile soğurma arasında güçlü doğrusal bir ilişki olduğunu gösteriyor ve bağımlı değişkendeki (absorbans) varyansın 0.9975'e kadar varyansı bağımsız değişken (konsantrasyon; Şekil 3; s<0.0001). Bu nedenle, bu model laminarin ve kalloz konsantrasyonunu tahmin etmek için uygun, doğru ve güvenilirdi. Muz somuğu örneklerindeki kallos konsantrasyonu, spektrofotometri ile somuğ örneklerinin emilimi ölçülerek ve denklem kullanılarak kallos konsantrasyonları hesaplanarak belirlenmiştir.

İmmünoflüoresans spektrofotometri testi, Xvm aşılanmış bitkilerde kontrol grubuna kıyasla indüklenmiş kallosda hem muz genotiplerinde (bağımsız örnek t-testi, p < 0.05; Şekil 4). Kontrol tesislerinde 14 dpi ile kalloz üretimi sırasıyla 1474,34 mg/mL ve Mbwazirume ile M. balbisiana için 1037,11 mg/mL idi (Şekil 4). Xvm ile aşılandığında, Xvm aşılanmış Mbwazirume ve M. balbisiana bitkilerinin kormlarında sırasıyla 14 dpi ile 4190,78 mg/mL ve 1996,07 mg/mL kallos elde edilmiştir (Şekil 4). Xvm aşılama, kontrol tesislerine kıyasla 1,9 ila 2,8 kat daha yüksek kallos üretimine neden oldu (bağımsız örnek t-testi, p < 0,001; Şekil 4).

figure-results-1
Şekil 1: Yeni immünofluoresans spektrofotometri yöntemiyle kallos nicelendirilmesinde yer alan ana adımların şematik illüstrasyonu. Bu şekil, muz dokularından kallos miktarının belirlenmesinde yer alan başlıca adımları göstermektedir; bunlar arasında doku kültüründen elde edilen bitkiçiklerin yetiştirilmesi, Xvm ile aşılanma, korm dokularının yıkıcı örneklenmesi, örneklerin dondurularak kurutulması, kallosun çıkarılması ve yeni immünofluoresans spektrofotometri yöntemiyle kallosun nicelendirilmesi yer almaktadır. Bu rakam50 numaralı yeniden basıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Kallos nicelenmesi için immünoflüoresans spektrofotometri yönteminin ayrıntılı şematik illüstrasyonu. Bu şekil, KALLOS nicel için immünoflüoresans spektrofotometri yönteminin ayrıntılı bir gösterimini sunar ve ELISA plakasının çeşitli bileşenlerle nasıl yüklendiğini ve kallosun spektrofotometri ile nihayetinde nasıl nicelendirildiğini gösterir. Bu rakam50 numaralı yeniden basıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Protein niceliklendirmesi. Beer-Lambert grafiki, bilinen konsantrasyonların ve 405 nm'de absorbans ölçümlerinin laminarin standartlarına dayanarak, corm örneklerinin emilimi ölçümlerinden kallose konsantrasyonlarının (laminarin eşdeğerleri olarak, LE) hesaplanması için kullanılmıştır. Bu rakam49 kez yeniden basıldı. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Kallos konsantrasyonu karşılaştırılması. Yeni immünoflüoresans spektrofotometri yöntemiyle (bağımsız örnek t-testi, 0.05) belirlenen Xvm ile aşılanmış M. balbisiana ve Mbwazirume muz bitkiciğindeki ortalama kallos konsantrasyonlarının (ortalama ± SEM, n α ≤= 9) karşılaştırılması. Bu şekilin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

BufferBileşimDepolama
Engelleme tamponu10 g sığır serum albümini (BSA; %1 w/v), 1 litre PBS'de çözülmüştür.-20 °C 6 aya kadar
Kaplama tamponu1,59 g sodyum karbonat (Na2CO3), 2,93 g sodyum bikarbonat (NaHCO3), 0,2 g sodyum azid (NaN3), 1 L deionize H2O içinde çözünür, pH 9,6.-20 °C 12 aya kadar
Konjuge tampon2 g PVP (%2 w/v), 1 L bloklama tamponunda çözülmüştür.-20 °C 6 aya kadar
Para-nitrofenil fosfat (pNPP) çözeltisiPara-nitrofenil fosfatı (pNPP) substrat tamponu içinde 1 mg/mL çalışma konsantrasyonuna kadar çözün-20 °C 12 aya kadar
Fosfatla tamponlanmış tuzlu (PBS)8,0 g sodyum klorür (NaCl), 0,2 g monobazik potasyum fosfat (KH2PO4), 1,15 g dibazik sodyum fosfat (Na2HPO 4), 0,2 g potasyum klorür (KCl), 0,2 g sodyum azid (NaN 3), 1 L deionize H2O içinde çözünmüş, pH 7,4.-20 °C 12 aya kadar
Bloklama tamponu içindeki birincil antikorLiyofilize birincil antikoru üreticinin talimatlarına göre yeniden yapılandırarak yoğun stok elde edin. Elde edilen yeniden oluşturulmuş birincil antikor stokunu bloklama tamponunda 2 μg/mL çalışma konsantrasyonuna kadar seyreltirin.-20 °C 6 aya kadar
Kaplama tamponunda birincil antikorLiyofilize birincil antikoru üreticinin talimatlarına göre yeniden yapılandırarak yoğun stok elde edin. Elde edilen yeniden oluşturulmuş birincil antikor stokunu kaplama tamponunda 2 μg/mL çalışma konsantrasyonuna kadar seyreltirin.-20 °C 6 aya kadar
İkincil antikor1:1000 ikincil antikor konsantresi: konjuge tampon-20 °C 6 aya kadar
Substrat tamponu97 mL dietanolamin, 0,2 g sodyum azid (NaN3), 1 L deionize H2O'da çözünür, pH 9,8-20 °C 12 aya kadar
Yıkama tamponu0.5 mL Tween 20 (%0.05 v/v), 1 L PBS'de çözünmüş, pH 7.5-20 °C 12 aya kadar

Tablo 1: Tamponlar için tarif.

Tartışma

İmmünoflüoresans spektrofotometri yöntemi, muz kormlarında kallosun nicelendirilmesinde ilk kez uygulanmıştır. Bu yöntem, kalloza özgüantikorlar 47,51,52 kullanılarak ham 1 M NaOH muz ekstraktında kallosun nicelendirilmesinde kullanılan enzim immünotahliline (EIA) dayanır. Kısaca, bu yeni immünoflüoresans spektromotometri temelli, kalloza özgü nicelik testi, mikroplakanın kalloza özgü antikor ile kaplanmasını ve ardından kalloza özgü kalloza bağlanmasını ve ardından kalloza özgü ikincil bir antikor ile kaplanmasını içeriyordu. Bir enzimle bağlantılı bir antikorun (alkalin fosfataz) tespit edilmesi daha sonra eklenir ve ikincil antikorla bir kompleks oluşturur. Daha sonra bir alt katman olan para-nitrofenil fosfat (pNPP) eklenir. Numunedeki kallosun nicelendirilmesi, alkali fosfatazın pNPP moleküllerinden fosfat gruplarını parçalayabilme yeteneğine dayanır ve bu da sarı renkli bir bileşiğin (p-nitrofenol) oluşumuna yol açar. Sarı rengin yoğunluğunun tespiti, 405 nm'de bir spektrofotometre kullanılarak yapıldı ve emilim, örneğindeki kallos konsantrasyonuyla doğrudan orantılı olan alkalin fosfataz aktivitesiyle ilişkilendirildi. Reaksiyon, pH artırılmasıyla 0,5 M NaOH eklenerek durduruldu; bu da daha fazla alkali fosfataz aktivitesini önledi.

Buna karşılık, kallosların lokalizasyonu ve nicelenmesi için standart altın yöntemi, kallosun anilin mavisi florokrom53 ile boyamaya dayanan iyi köklü bir yöntem olan epifloresans mikroskopi yöntemidir. Kısacası, bu yöntem anilin mavisi boyanın beta-1,3-glukanlara (kalloz) özgü bağlanmasına ve bir kompleks oluşturmasına dayanır. Bu kompleksteki anilin mavisi daha sonra ultraviyole ışık kullanılarak uyarılır (dalga boyu 365-375 nm). Anilin mavisi boya uyarıldığında, bitki dokularında kallos'un özel görselleştirilmesine olanak tanımak için yakalanan mavi floresansyayır 53. Anilin mavisi boyalı kallosun nicelendirilmesi, bitki dokularından gelen floresans miktarını niceleyen bir dizi görüntüleme tekniklerini takip eder. Flüoresans, bitki dokularındaki kallos miktarıyla orantılıdır. Epifloresans mikroskopisi, biyotik streste kallosun görselleştirilmesi ve nicelendirilmesindekullanılmıştır 54.

Ayrı bir çalışmada, kallos birikimi hem epifloresan mikroskopisi hem de immünoflüoresans spektrofotometrisi49 kullanılarak belirlendi. Verilerde birkaç fark gözlemlense de, istatistiksel analiz epifloresans mikroskopisi ile immünoflüofotometri verilerinin büyük ölçüde uyumluluğunu gösterdi ve bu da kallos tespitiyönteminin tutarlılığını gösterdi 49. İki yöntemin sonuçları büyük ölçüde örtüşse de, epifloresan mikroskopisi ile immünoflüoresans spektrofotometrisinin daha güvenilir değerlendirme için birbirini tamamlaması tavsiye edilir. ELISA tabanlı yöntem kalloza özel, hassas ve güvenilir olsa da, protokolün optimizasyonu ve tüm konsantrasyonlar ile emilimlere uyan en iyi standart eğri elde edilmesi başlangıçta zaman alıcıdır.

Kallos nicellendirme yöntemlerinden bazıları zahmetlidir 17,32,55, zaman alıcı26,56, kalloza özgü değildir çünkü anilin mavisi kalloza özgü diğer β-1,3-glukanları da boyayabilir; bu da pahalı ve gelişmiş kallos sayma yazılımı gerektirir 23,24,26 , dikkate değer miktarda teknik beceri gerektirir ve floresans spektrofotometrisiyle ilişkili yüksek arka plan/otofloresans kallos niceleme sürecini zorlaştırır ve güvenilmezyapar 26. ImageJ yazılımı gibi otomatik görüntü analizi iş akışına dayalı Callose niceltif yöntemleri, ImageJ için Trainable Weka Segmentation (TWS) gibi görüntü analiz eklentisinin uygun eğitimini gerektirir ve bu oldukçazahmetlidir 57.

İmmünofluoresans spektrofotometri tabanlı testler, özgüllükleri, hassasiyetleri, kullanım kolaylığı ve tekrarlanabilirlikleri nedeniyle oldukça tercih edilir. Ancak, tespit sistemi ve hassasiyetinin, belirli test protokolü ve kullanılan ekipmana bağlı olarak değişebileceğini belirtmek önemlidir.

Burada, immünoflüoresans spektrofotometrisine dayalı yeni bir kallos nicelendirme yöntemi tanımlanmıştır. Burada açıklanan yöntem, kallosun farklı bitki dokularında ve türlerinde kalloza özgü tatmin edici bir özgüllük, yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlikle nicelendirilmesi için uygulanabilir. Bu yöntem, çeşitli kallos nicelik yöntemlerine ek olarak sunulur ve bitkilerde büyüme ve gelişim sırasında kallos seviyelerindeki değişiklikleri izlemek ve çeşitli uyaranlar veya tedavilere yanıt olarak kullanılabilir. Ayrıca, 96 kuyuyla plaka kullanımı, öznel örnekleme ve analizi azaltır ve bu yöntemi yüksek verimli kallos niclemi için uygun kılar. Kallos taze hasat edilmiş bitkidokularından kolayca çıkarılabilse de, bu yeni protokole göre dondurulma ile kurutma aşamasının örneklerin çok uzun süre (1 yıla kadar) saklanmasını sağladığı ve uzak laboratuvarlar arasında ortam sıcaklığında bozulma biyolojik örneklerin depolanıp sevk edilmesini sağladığı dikkat çekicidir. Bu, tüm deneyi taze örnek toplamak için defalarca ayarlamaya gerek kalmadan kallos çıkarımlarının tekrarlanmasını sağlar.

İmmünofluoresans spektrofotometrisi, yüksek verimli kallos nicellendirme deneyleri için önerilirken, epifloresans mikroskopisi ve immünoflüoresans mikroskopisi hem kallosun nicelendirilmesi hem de bitki dokularındaki kallosun histolokalizasyonu için kullanılabilir. Kallosun bitki dokularında doğru, verimli ve güvenilir uzaylı-zaman dağılımını sağlamak için, mikroskopi, spektrofotometri ve enzim aktivitesine dayalı yöntemler dahil olmak üzere farklı kallos nicelendirme yöntemlerinin aynı anda kullanılması önerilir. Sonuç olarak, bu durum kallos'un çeşitli fizyolojik ve stres tepkilerindeki rolünün doğru ve verimli şekilde anlaşılmasını sağlayacaktır. Gelecekteki araştırmalar, epifloresans mikroskopisi, immünfloresans mikroskopisi, floresan spektrofotometrisi, immünofluoresans spektrofotometrisi ve enzimatik aktiviteye dayalı yöntemler gibi kallos niceliklendirme yöntemlerini kapsamlı ve eşzamanlı değerlendirebilir.

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını belirtmektedir.

Teşekkürler

Bu araştırma, Bill & Melinda Gates Vakfı tarafından finanse edilmiştir, hibe numarası INV 009894/OPP1134098. Fon sağlayıcıların çalışmanın tasarımında hiçbir rolü yoktu; veri toplama, analiz veya yorumlama; el yazması yazımında; veya sonuçların yayımlanma kararında.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alüminyum folyo Kim-Fay EA Limited, Nairobi, Kenya
Analitik denge  Mettler-Toledo AG, Greifensee, İsviçreML204/01
Boncuk Dövücü 96BioSpec Products Inc., Bartlesville, OK, ABD1001EUR
Kağızı lekeleme Kim-Fay EA Limited, Nairobi, Kenya
Sığır Serum Albümini (BSA) & nbsp;Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, ABDB14
Santrifüj, 5425REppendorf, Hamburg, Almanya5406000240
Kombine buzdolabı-dondurucu (4 derece ve derece; C ve & eksi; 20 derece ve derece; C) Haier Medical and laboratory Co. Ltd., Qingda, ÇinHYCD-282
Dietanolamin PanReac AppliChem ITW Reagentleri, Quí Mica SLU, Barselona, İspanya191287
Dijital Titreme, MixMateEppendorf, Hamburg, Almanya5353000529
Di-sodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4)PanReac AppliChem ITW Reagentleri, Quí Mica SLU, Barselona, İspanya141679
ELISA plakaları, 96 kuyruklu, düz tabanlı, şeffaf, polistiren, yüksek bağlamaSarstedt AG & Co. KG, Nü mbrecht, Almanya82.1581.200
iMark mikroplaka okuyucu için filtre, iMark 680, 405 nmLasec International Pty. Ltd., Cape Town, Güney AfrikaBRD1681011
Dondurucu kurutucu, VirTis— BenchTop " K” seri; Model: 4KBTXLLabWrench, Kanada, ABD448053
Hidroklorik asit (HCl) PanReac AppliChem ITW Reagentleri, Quí Mica SLU, Barselona, İspanya141020
İzotermik Zorunlu Konveksiyon Kuluçka Makinesi, IFA-54-8Esco Lifesciences Group, Singapur2100002
Laminarin Alfa Aesar, Massachusetts, ABDJ66193
Mikrosantrifüj tüpleri 1.5 mL Eppendorf, Hamburg, Almanya022363204
Mikrosantrifüj tüpleri 2 mL Genesee Scientific Corp., Kaliforniya, ABD24– 283
Mikropipet (30&ntir; 300 μ L), 12 kanallı, 2100 seri ve nbsp;Eppendorf, Hamburg, AlmanyaEP-12-300R
Mikropipet uçları epT.I.P.S.  Single'larEppendorf, Hamburg, Almanya022363204
Mikropipetler (0.5&ntir; 1000 μ L), Research  artıEppendorf, Hamburg, Almanya3123000900
Mikroplaka absorbans okuyucu, iMarkBio-Rad Laboratuvarları, Inc., Kaliforniya, ABD1681135EDU
Microplate Manager 6 Sürüm 6 yazılım Bio-Rad Laboratuvarları, Inc., Kaliforniya, ABD1689520
ParafilmPaul Marienfeld GmbH & Şirket KG, Lauda-Kö nigshofen, Almanya740751
Para-nitrofenil fosfat (pNPP)Merck KGaA, Darmstadt, Almanya20-106
pH ölçer, HI9126Hanna Enstrümanları, Woonsocket, RI, ABD02310048991
Polivinilpirrolidon (PVP) & nbsp;PanReac AppliChem ITW Reagentleri, Quí Mica SLU, Barselona, İspanyaA2260
Potasyum klorür (KCl)PanReac AppliChem ITW Reagentleri, Quí Mica SLU, Barselona, İspanyaA2939
Potasyum di-hidrojen fosfat (KH2PO4) PanReac AppliChem ITW Reagentleri, Quí Mica SLU, Barselona, İspanya141509
Hassas su banyosu, GP10Thermo Fisher Scientific Inc., Newinton, CT, ABDTSGP10
Birincil antikor (1-3-β-glukan yönlendirilmiş fare IgG) Bio, Australia Pty Ltd., Melbourne, Avustralya'ya tedarik sağlar400-2
Reaktif rezervuarlar Thermo Fisher Scientific Inc., Massachusetts, ABD15075
İkincil antikor, Alkalin Fosfataza (anti-Fare IgG-Alkalin Fosfataz) ve nbsp ile konjuge edilmiştir;Sigma Yaşam Bilimleri, New Jersey, ABDA5153
Sodyum azid (NaN3) PanReac AppliChem ITW Reagentleri, Quí Mica SLU, Barselona, İspanyaA1430
Sodyum karbonat (Na2CO3) PanReac AppliChem ITW Reagentleri, Quí Mica SLU, Barselona, İspanya141648
Sodyum klorür (NaCl) PanReac AppliChem ITW Reagentleri, Quí Mica SLU, Barselona, İspanyaA2942
Sodyum hidrojen karbonat (NaHCO3) PanReac AppliChem ITW Reagentleri, Quí Mica SLU, Barselona, İspanya141638
Sodyum hidroksit (NaOH)PanReac AppliChem ITW Reagentleri, Quí Mica SLU, Barselona, İspanya141687.1210
Tween-20Biomatik Şirketi, Ontario, KanadaA4031
Ultrasaf damıtılmış suThermo Fisher Scientific, Massachusetts, ABD10-977-015

Kaynaklar

  1. Kelly, R., Register, E., Hsu, M. J., Kurtz, M., Nielsen, J. Isolation of a gene involved in 1,3-beta-glucan synthesis in Aspergillus nidulans and purification of the corresponding protein. J Bacteriol. 178 (15), 4381-4391 (1996).
  2. Ellinger, D., Voigt, C. A. Callose biosynthesis in arabidopsis with a focus on pathogen response: What we have learned within the last decade. Ann Bot. 114 (6), 1349-1358 (2014).
  3. Jacobs, A. K., et al. An Arabidopsis callose synthase, GSL5, is required for wound and papillary callose formation. Plant Cell. 15 (11), 2503-2513 (2003).
  4. Piršelová, B., Matušíková, I. Callose: the plant cell wall polysaccharide with multiple biological functions. Acta Physiol Plant. 35 (3), 635-644 (2013).
  5. Nedukha, O. M. Callose: Localization, functions, and synthesis in plant cells. Cytol Genet. 49 (1), 49-57 (2015).
  6. Chen, X. Y., Kim, J. Y. Callose synthesis in higher plants. Plant Signal Behav. 4 (6), 489-492 (2009).
  7. Beckman, C. H., Mueller, W. C., Tessier, B. J., Harrison, N. A. Recognition and callose deposition in response to vascular infection in Fusarium wilt-resistant or susceptible tomato plants. Physiol Plant Pathol. 20 (1), 1-10 (1982).
  8. Cheval, C., Faulkner, C. Plasmodesmal regulation during plant-pathogen interactions. New Phytol. 217 (1), 62-67 (2018).
  9. Cohen, Y., Eyal, H., Hanania, J. Ultrastructure, autofluorescence, callose deposition and lignification in susceptible and resistant muskmelon leaves infected with the powdery mildew fungus Sphaerotheca fuliginea. Physiol Mol Plant Pathol. 36 (3), 191-204 (1990).
  10. Kashyap, A., Planas-Marques, M., Capellades, M., Valls, M., Coll, N. S. Blocking intruders: inducible physico-chemical barriers against plant vascular wilt pathogens. J Exp Bot. 72 (2), 184-198 (2021).
  11. Nishimura, M. T., et al. Loss of a callose synthase results in salicylic acid-dependent disease resistance. Science. 301 (5635), 969-972 (2003).
  12. Underwood, W. The plant cell wall: A dynamic barrier against pathogen invasion. Front Plant Sci. 3, 85(2012).
  13. Wang, Y., Li, X., Fan, B., Zhu, C., Chen, Z. Regulation and function of defense-related callose deposition in plants. Int J Mol Sci. 22 (5), 2393(2021).
  14. Ali, M. A., Abbas, A., Kreil, D. P., Bohlmann, H. Overexpression of the transcription factor RAP2.6 leads to enhanced callose deposition in syncytia and enhanced resistance against the beet cyst nematode Heterodera schachtii in Arabidopsis roots. BMC Plant Biol. 13 (1), 47(2013).
  15. Böhlenius, H., Morch, S. M., Godfrey, D., Nielsen, M. E., Thordal-Christensen, H. The multivesicular body-localized GTPase ARFA1b/1c is important for callose deposition and ROR2 syntaxin-dependent preinvasive basal defense in barley. Plant Cell. 22 (11), 3831-3844 (2010).
  16. Currier, H. B., Strugger, S. Aniline blue and fluorescence microscopy of callose in bulb scales of Allium cepa L. Protoplasma. 45 (4), 552-559 (1956).
  17. Voigt, C. A., Schäfer, W., Salomon, S. A comprehensive view on organ-specific callose synthesis in wheat (Triticum aestivum L.): glucan synthase-like gene expression, callose synthase activity, callose quantification and deposition. Plant Physiol Biochem. 44 (4), 242-247 (2006).
  18. Kohari, M., Yashima, K., Desaki, Y., Shibuya, N. Quantification of stimulus-induced callose spots on plant materials. Plant Biotechnol. 33 (1), 11-17 (2016).
  19. Mason, K. N., Ekanayake, G., Heese, A. Staining and automated image quantification of callose in Arabidopsis cotyledons and leaves. Methods Cell Biol. 160, 181-199 (2020).
  20. Ellinger, D., et al. Elevated early callose deposition results in complete penetration resistance to powdery mildew in Arabidopsis. Plant Physiol. 161 (3), 1433-1444 (2013).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Zavaliev, R., Epel, B. L. Imaging callose at plasmodesmata using aniline blue: quantitative confocal microscopy. Methods Mol Biol. 1217, 105-119 (2015).
  23. Luna, E., et al. Callose deposition: A multifaceted plant defense response. Mol Plant Microbe. 24 (2), 183-193 (2011).
  24. Zhou, J., Spallek, T., Faulkner, C., Robatzek, S. CalloseMeasurer: a novel software solution to measure callose deposition and recognise spreading callose patterns. Plant Methods. 8 (1), 49(2012).
  25. Kimori, Y., Baba, N., Morone, N. Extended morphological processing: a practical method for automatic spot detection of biological markers from microscopic images. BMC Bioinformatics. 11, 373(2010).
  26. Welker, S., Levy, A. Comparing machine learning and binary thresholding methods for quantification of callose deposits in the citrus phloem. Plants (Basel). 11 (5), 624(2022).
  27. Kohler, A., Schwindling, S., Conrath, U. Extraction and quantitative determination of callose from Arabidopsis leaves. Biotechniques. 28 (6), 1084-1086 (2000).
  28. Tahara, K., Norisada, M., Hogetsu, T., Kojima, K. Aluminum tolerance and aluminum-induced deposition of callose and lignin in the root tips of Melaleuca and Eucalyptus species. J For Res. 10 (4), 325-333 (2005).
  29. De Ascensao, A. R., Dubery, I. A. Panama disease: Cell wall reinforcement in banana roots in response to elicitors from Fusarium oxysporum f. sp. cubense Race Four. Phytopathology. 90 (10), 1173-1180 (2000).
  30. Smith, M. M., McCully, M. E. A critical evaluation of the specificity of aniline blue induced fluorescence. Protoplasma. 95 (3), 229-254 (1978).
  31. Herburger, K., Holzinger, A. Aniline blue and Calcofluor white staining of callose and cellulose in the streptophyte green algae Zygnema and Klebsormidium. Bio Protoc. 6 (20), 1969(2016).
  32. Meikle, P. J., Boing, I., Hoogenraad, N. J., Clarke, A. E., Stone, B. A. The location of (1→3)-β-glucans in the walls of pollen tubes of Nicotiana alata using a (1→3)-β-glucan-specific monoclonal antibody. Planta. 185 (1), 1-8 (1991).
  33. Shedletzky, E., Unger, C., Delmer, D. P. A microtiter-based fluorescence assay for (1,3)-β-glucan synthases. Anal Biochem. 249 (1), 88-93 (1997).
  34. Piršelová, B., Mistrikova, V., Libantova, J., Moravcikova, J., Matusikova, I. Study on metal-triggered callose deposition in roots of maize and soybean. Biologia. 67 (4), 698-705 (2012).
  35. Siefert, F., Grossmann, K. Induction of chitinase and β-1,3-glucanase activity in sunflower suspension cells in response to an elicitor from Phytophthora megasperma f. sp. glycinea (Pmg). Evidence for regulation by ethylene and 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC). J Exp Botany. 48 (12), 2023-2029 (1997).
  36. Tripathi, L., Tripathi, J. N., Tushemereirwe, W. K., Bandyopadhyay, R. Development of a semi-selective medium for isolation of Xanthomonas campestris pv. musacearum from banana plants. Eur J Plant Pathol. 117 (2), 177-186 (2007).
  37. Adriko, J., et al. Molecular diagnostic tools targeting different taxonomic levels of Xanthomonads aid in disease management. Uganda J Agri Sci. 13 (2), 1-19 (2015).
  38. Ssekiwoko, F., Tushemereirwe, W. K., Batte, M., Ragama, P. E., Kumakech, A. Reaction of banana germplasm to inoculum with Xanthomonas campestris pv. musacearum. African Crop Sci J. 14 (2), 151-156 (2006).
  39. de Castro, M. D., Izquierdo, A. Lyophilization: a useful approach to the automation of analytical processes. J Automat Chem. 12 (6), 267-279 (1990).
  40. Pearson, G., Lago-Leston, A., Valente, M., Serrao, E. Simple and rapid RNA extraction from freeze-dried tissue of brown algae and seagrasses. Eur Journal Phycol. 41 (1), 97-104 (2006).
  41. Khaledi, N., Taheri, P., Falahati-Rastegar, M. Evaluation of resistance and the role of some defense responses in wheat cultivars to Fusarium head blight. J Plant Protection Res. 57 (4), 398-408 (2017).
  42. Zhang, H., et al. Transgenic Arabidopsis thaliana plants expressing a β-1,3-glucanase from sweet sorghum (Sorghum bicolor L.) show reduced callose deposition and increased tolerance to aluminium toxicity. Plant Cell Environ. 38 (6), 1178-1188 (2015).
  43. Nelson, T. E., Lewis, B. A. Separation and characterization of the soluble and insoluble components of insoluble laminaran. Carbohydr Res. 33 (1), 63-74 (1974).
  44. Zvyagintseva, T. N., et al. A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds. Carbohydr Res. 322 (1), 32-39 (1999).
  45. Rioux, L. E., Turgeon, S. L., Beaulieu, M. Characterization of polysaccharides extracted from brown seaweeds. Carbohydr Polymers. 69 (3), 530-537 (2007).
  46. Hosseini, S., Vazquez-Villegas, P., Rito-Palomares, M., Martinex-Chapa, S. O. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) From A to Z. , Springer Nature. Singapore. (2017).
  47. Engvall, E., Perlmann, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).
  48. Reen, D. J. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods Mol Biol. 32, 461-466 (1994).
  49. Mustafa, A. S., et al. Xanthomonas campestris pv. musacearum bacterial infection induces organ-specific callose and hydrogen peroxide production in banana. PhytoFrontiers. 2 (3), 202-217 (2022).
  50. Mustafa, A. S., et al. Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for quantification of callose. Methods Protoc. 5 (4), 54(2022).
  51. Van Weemen, B. K., Schuurs, A. H. Immunoassay using antigen-enzyme conjugates. FEBS Lett. 15 (3), 232-236 (1971).
  52. Anderson, G. L., McNellis, L. A. Enzyme-linked antibodies: A laboratory introduction to the ELISA assay. J Chemical Edu. 75 (10), 1275(1998).
  53. Stone, B. A., Evans, N. A., Boing, I., Clarke, A. E. The application of Sirofluor, a chemically defined fluorochrome from aniline blue for the histochemical detection of callose. Protoplasma. 122 (3), 191-195 (1984).
  54. Chowdhury, J., et al. Down-regulation of the glucan synthase-like 6 gene (HvGsl6) in barley leads to decreased callose accumulation and increased cell wall penetration by Blumeria graminis f. sp. hordei. New Phytol. 212 (2), 434-443 (2016).
  55. Dahiya, P., Brewin, N. J. Immunogold localization of callose and other cell wall components in pea nodule transfer cells. Protoplasma. 214 (3), 210-218 (2000).
  56. Herburger, K., Holzinger, A. Localization and quantification of callose in the streptophyte green algae Zygnema and Klebsormidium: Correlation with desiccation tolerance. Plant Cell Physiol. 56 (11), 2259-2270 (2015).
  57. Leslie, M. E., Rogers, S. W., Heese, A. Increased callose deposition in plants lacking DYNAMIN-RELATED PROTEIN 2B is dependent upon POWDERY MILDEW RESISTANT 4. Plant Signal Behav. 11 (11), 1244594(2016).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Kalloz KantifikasyonuKalloza zg AntikorlarFloresan SpektrofotometrisiEpifloresan MikroskobuMuz K r k DokusuBiyotik StresY ksek Kapasiteli Kantifikasyon
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.