Mevcut protokolün amacı, yetişkin zebra balığı için bir sosyal tercih testi oluşturmak ve kullanmak için gerekli adımları ana hatlarıyla belirtmek ve etanolün neden olduğu sosyal kusurları karakterize etmek için kullanılabileceğini göstermektir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Olumsuz Bir Embriyonik Ortamın Yetişkin Sosyal Davranışı Üzerindeki Etkisini Karakterize Etmek için Zebra Balıklarında Fetal Alkol Spektrum Bozukluklarının Modellenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Fetal alkol spektrum bozuklukları (FASD), alkole bağlı tüm doğum kusurlarını tanımlar. Büyüme eksiklikleri, kraniyofasiyal, davranışsal ve bilişsel anormallikler gibi doğum kusurları FASD ile ilişkilidir. Sosyal zorluklar, FASD ile ilişkili yaygın davranışsal anormalliklerdir ve sıklıkla ciddi sağlık sorunlarına neden olur. Hayvan modelleri, etanolün neden olduğu sosyal kusurlardan sorumlu mekanizmaları anlamak için kritik öneme sahiptir. Zebra balığı, dışarıdan döllenmiş şeffaf yumurtalar üreten sosyal omurgalılardır; bu özellikler, araştırmacılara FASD fenotipini oluşturmak için kesin ama basit bir prosedür ve FASD ile ilişkili sosyal eksiklikleri modellemek için kullanılabilecek doğuştan gelen bir davranış sağlar. Bu nedenle, zebra balığı FASD'nin sosyal eksikliklerini karakterize etmek için idealdir. Mevcut protokolün amacı, kullanıcıya, gelişimin erken dönemlerinde olumsuz bir ortamın sonuçlarını ve yetişkinlikte sosyal davranış üzerindeki etkilerini karakterize etmek için kullanılabilecek basit bir davranış testi sağlamaktır. Protokol, mutasyonların veya teratojenlerin yetişkin sosyal davranışı üzerindeki etkisini karakterize etmek için kullanılabilir. Burada özetlenen protokol, 20 dakikalık bir sosyal test sırasında bireysel balıkların sosyal davranışlarının nasıl karakterize edileceğini göstermektedir. Ayrıca, mevcut protokol kullanılarak elde edilen veriler, protokolün yetişkin zebra balıklarında embriyonik etanolün neden olduğu sosyal kusurların etkilerini karakterize etmek için kullanılabileceğine dair kanıt sunmaktadır.
Giriş
Doğum öncesi alkole maruz kalma, topluca fetal alkol spektrum bozuklukları (FASD) olarak bilinen çeşitli doğum kusurlarına yol açabilir1. Sosyal zorluklar gibi bozulmuş davranışlar, FASD2,3 ile ilişkili yaygın doğum kusurlarıdır. Ne yazık ki, sosyal zorluklar sıklıkla ciddi ruh sağlığı sorunlarına4 yol açar ve bu da FASD'li bireylerin yaşam kalitesini olumsuz yönde etkileyebilir. Bu nedenle, etanolün neden olduğu sosyal kusurlardan sorumlu mekanizmaları anlamak çok önemlidir.
Zebra balıkları, etanolün neden olduğu sosyal kusurlardan sorumlu mekanizmalar hakkındaki anlayışımızı ilerletmek için onları çok uygun kılan biyolojik ve davranışsal özelliklere sahiptir. Örneğin, zebra balığı büyük miktarlarda şeffaf dış döllenmiş yumurta üretir; bu biyolojik özellikler, araştırmacıların kolayca kesin ve tekrarlanabilir FASD fenotipleri oluşturmasına olanak tanır5. Embriyoları döllenmeden 24 saat sonra (hpf) etanole maruz bırakmak için, şeffaf yumurtayı incelemek ve embriyoyu Kimmel ve ark.6 gibi daha önce yayınlanmış çalışmalara dayanarak evrelemek için bir diseksiyon mikroskobu kullanmak ve ardından yumurtayı istenen süre boyunca istenen etanol konsantrasyonuna yerleştirmek gerekir. Koryon, alkol7'ye karşı zayıf bir bariyer olduğundan, etanol embriyoyu kolayca yıkar. Maruz kalmayı durdurmak için, yumurtaları etanol çözeltisinden çıkarmak yeterlidir. Zebra balığı, araştırmacılara FASD fenotipleri oluşturmak için basit ama doğru bir yöntem sağlamanın yanı sıra, araştırmacıların insanlarla genetik karşılaştırmalar yapmasına da olanak tanır, çünkü insan genlerinin %70'i bir zebra balığı ortologuna sahiptir, bu nedenle insan hastalıklarıyla ilgili genleri anlamak için değerli bir araçtır8. Ek olarak, diğer hayvan modellerinden farklı olarak, zebra balığı sürü10 adı verilen sosyal grupları9 oluşturur. Sürü davranışı, embriyonik etanol maruziyetinin sosyal davranış üzerindeki etkilerini karakterize etmek için kullanılabilir11. Ayrıca, zebra balıklarında bilgisayar kontrollü sosyal uyaranlar12 veya canlı bir sosyal uyaran13 kullanılarak sosyal bir tepki ortaya çıkarılabilir.
Önceki çalışmalar, yetişkin zebra balıklarının14. gruplardaki sosyal tepkisini karakterize etmiştir, ancak bu yaklaşımın bir sınırlaması, bireysel bir balığın davranışını, nörotransmitter seviyelerindeki11 değişiklikler gibi belirli bir önlemle ilişkilendirememesidir. Aşağıdaki protokol, kullanıcılara bireysel bir yetişkin zebra balığının sosyal davranışını karakterize etme yeteneği verecektir. Bireysel balıklar için sosyal davranış edinildiğinden, protokolün kullanıcıları artık her balığın edinilen davranış profilini bağımlı bir sonuçla ilişkilendirebilir. Örneğin, önceki çalışmalar, embriyonik etanol maruziyetinin bir sosyal uyarana karşı dopaminerjik tepkiyi bozduğunu göstermiştir11. Burada gösterilen veriler bağımsız değişken olarak embriyonik etanol maruziyetini kullanmış olsa da, protokol kullanıcıları diğer farmakolojik tedavilerin veya genetik mutasyonların sosyal davranış üzerindeki etkilerini karakterize edebilir. Ayrıca, protokol kullanıcıları, embriyonik tedavilerin davranışı nasıl değiştirdiğini incelemekle sınırlı değildir, aynı zamanda yetişkin zebra balıklarında akut farmakolojik tedavilerin sosyal davranışı nasıl etkilediğini de belirleyebilir15.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Burada açıklanan tüm yöntemler, Güney Dakota Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Zebra balığı barınması, bakımı ve embriyonik etanol maruziyeti
- Zebra balığını tarif edildiği gibi yetiştirin ve yetiştirin16.
- Etanol maruziyeti
- Etanol maruziyetinin gerçekleştirileceği uygun gelişim aşamasını seçin. Bu protokolde embriyolar 24 hpf'de etanole maruz bırakıldı.
- Yumurtaları 2 saat15 boyunca% 1.0 etanol hacmi/hacmine koyun. EM'nin mL başına 1 yumurta oranı iyi bir uygulamadır. Spesifik olarak, embriyoları 50 mL embriyo ortamına yerleştirin (EM; EM tarifi için lütfen Westerfield16'ya bakınız), ardından 500 μL EM'yi çıkarın ve 500 μL etanol ile değiştirin.
- Etanole maruz kaldıktan sonra, embriyoları tarif edildiği gibi yükseltin17. Balıklar 16 haftalıkken sosyal davranışı test edin.
2. Rastgeleleştirme ve tank kurulumu
- Çevrimiçi bir rastgele dizi üreteci kullanarak, davranışsal tahlilleri yürütmek için tüm denemeleri a priori olarak randomize edin. Uyarıcı tarafın ve tedavi gruplarının rastgele değiştiğinden emin olun.
- Günün saati veya test günü gibi kafa karıştırıcı faktörlerden kaçınmak için, davranış testini her gün aynı saatte başlatın ve bitirin ve tüm deney balıkları test edilene kadar davranış testini ardışık günlerde yapın.
- Bu test için (Şekil 1), 37 L'lik bir tank (50 cm x 25 cm x 30 cm, U x G x Y) kullanın ve daha önce açıklandığı gibi tankın genişliği boyunca dışarıya yerleştirilmiş1.4 L tanklar 17.
- Video izlemeyi iyileştirmek için deney balığı ile arka plan arasındaki kontrastı artırmak için 37 L'lik tankın arkasını ve altını beyaz oluklu plastikle kaplayın.
- Deneysel balıklar için sosyal uyaranın kontrastını artırmak için oluklu plastiği 1,4 L'lik tankların dış duvarına yerleştirin. Son olarak, 1,4 L'lik tanklar ile 37 L'lik tanklar arasına beyaz oluklu plastik yerleştirin; Bu opak bariyer, deney balığının alışkanlık sırasında sosyal uyaranı görmesini önlemek için kullanılır.
- Kamerayı, 37 L'lik tankın tüm uzunluğunu ve 1,4 L'lik tankların yarısını yakalayacak kadar uzak bir mesafeye yerleştirin ve yetişkin deney balıklarını doğru bir şekilde takip edin.
NOT: Uyaranı hangi tarafın tuttuğunu görmek, araştırmacıların izleme bölgelerini doğru bir şekilde etiketlemesini sağlar ve yedek olarak yedeklilik sağlar. - Kızılötesi izleme kullanılmıyorsa, 37 L deposunu aydınlattığınızdan emin olun. Piyasada bulunan herhangi bir akvaryum davlumbaz ışığını 15 W T8 tam spektrum lambası ile kullanın.
NOT: Birden fazla arena kuruluyorsa, aynı lambalara sahip aynı akvaryum davlumbazlarını kullanın.
3. Sosyal tahlilin yapılması
- Davranışsal test için kullanılan 37 L'lik tankı, muhafaza rafında kullanılan suyla aynı olan suyla doldurarak başlayın. Su sıcaklığının muhafaza rafından 2 °C içinde olduğundan emin olun.
- Günün sonunda 37 L'lik depoyu boşaltın. Her test gününe temiz su ile başlayın. 37 L'lik tanktaki su seviyesi ile 1.4 L'lik tanktaki su seviyesinin aynı olduğundan emin olun. Odanın sıcaklığı 37 L'lik tanktaki suyu 28,5 °C 2 °C'de tutmuyorsa, suyu 28,5 °C'de ılık suyla değiştirin.
- Ardından, ilgi alanlarını ayarlayın. Bölgeler oluşturmak için kullanıcının tercih ettiği manuel izleme yazılımına danışın. Bu protokolde, 37 L'lik tankın uzunluğu boyunca, üstte ve altta, 5 cm'lik artışları işaretlemek için bir mezura kullanıldı. Test tankının 50 cm olduğu göz önüne alındığında, 5 cm'lik artışlar, her biri 5 cm olan 10 bölgeye yol açar.
- 37 L'lik tank üzerinde yapılan işaretleri referans olarak kullanarak, üstteki 5 cm'lik noktayı alttaki karşılık gelen 5 cm'lik noktaya bağlayarak bölgeleri oluşturmak için yazılımı kullanın. Ek olarak, alt kısım boyunca ve uyaran boyunca bir bölge oluşturun. İlgi alanlarını özelleştirin.
- Bir bölgeye olan mesafeyi ve bölgede geçirilen süreyi ölçmek için bu protokoldeki izleme yazılımını kullanın. Bu protokolde 12 bölge kullanılmıştır.
- 1'den 10'a kadar olan bölgelerde geçirilen süreyi ve uyarana olan mesafeyi ve dibi Bölge 1 olarak, uyarana en yakın bölge olarak ölçün, Bölge 10 ise uyarana en uzak olan bölgedir.
- Ardından, sosyal uyaran için kullanılacak iki erkek ve iki kadını seçin. En iyi uygulama, deney balıklarıyla aynı kohorttan erkek ve dişileri kullanmak olacaktır. Bu mümkün değilse, deney balığının türüne, yaşına ve boyutuna uygun balıkları bulmaya çalışın.
- Deney balıklarını muhafaza tankından test alanına (37 L tank) aktarın. Muhafaza tankındaki balıkları yakalamak için bir ağ kullanın. Ağı, içinde balık bulunan ağı, balık suyu olan bir kaba yerleştirin.
NOT: Bu yaklaşımın kullanılması, tanklar arasında hareket ederken deney balıkları üzerindeki stresi azaltacaktır. - Deney balığını test alanının ortasına yerleştirin.
- Kullanıcının tercih ettiği yazılıma göre algılama ayarları tatmin edici olduğunda (kullanım kılavuzuna bakın), 20 dakikalık denemeye başlayın. İlk 10 dakika boyunca, 37 L'lik tank ile 1,4 L'lik tanklar arasındaki opak bariyeri yerinde bırakın. Bu, deney balığının iki erkek ve iki dişi zebra balığından oluşan sosyal uyaranı görmesini engelleyecek ve balığın test alanına13,17 alışmasını sağlayacaktır.
- 10 dakika sonra, opak bariyerleri tankın arkasından çekerek dikkatlice çıkarın; Bu, deney balığının sosyal uyaranı görmesini sağlayacaktır.
- Kullanıcının tercihlerine ve yazılım kılavuzuna dayalı olarak deney balığının 11, 12, 17 davranışını izlemek ve ölçmek için izleme yazılımı kullanın. Mevcut protokolde, sosyal uyarana ve tankın dibine olan mesafeyi ve tüm bölgelerde geçirilen süreyi ölçün.
- Geleneksel veri analizi araçlarını kullanarak verileri analiz edin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 2, Fernandes ve ark.17'den modifiye edilmiştir ve embriyonik etanol maruziyetinin, uyarana olan mesafeyi inceleyerek sığlaşma tepkisini körelttiğini göstermektedir. Şekil 2'deki veriler, 20 dakikalık deneme sırasında sosyal uyarana olan mesafeyi temsil etmektedir. Y ekseni mesafeyi santimetre cinsinden gösterirken, X ekseni 20 dakikalık denemeyi 1 dakikalık aralıklara bölünmüş olarak gösterir. X ekseni boyunca uzanan siyah çubuk, op...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Zebra balıklarının bir dizi biyolojik ve davranışsal özelliği vardır, bu da onları genleri, çevreyi ve davranışı içeren araştırmalar için oldukça çekici bir organizma haline getirir 5,19. Bu protokol, son kullanıcıya sosyal davranışı analiz etmek için nispeten basit bir kılavuz, sosyal davranışı ölçmenin birden fazla yolunu sunar ve bireysel balıkların davranışsal tepkilerini embriyonik etanol maruziyeti, genetik mutasyonlar veya...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu araştırmayı desteklemek için finansman, Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) / Ulusal Alkol Suistimali Enstitüsü (NIAAA) [R00AA027567] tarafından YF'ye sağlandı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1.4-l ZT140 Aquaneering tankları | Aquaneering | ZT140 | Sosyal teşvik için tanklar |
| Aqueon 20 "Deluxe Floresan Tam Kaput akvaryum ışığı | https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aqueon-aquarium-black-24-fluorescent-deluxe-full-hood-215740 | 37-I tankı için | |
| ışık Aqueon Standart Açık Cam Cam Akvaryum Tankı, 10 Galon | https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aga-10g-20x10x12bk-tank-170917 | sosyal tahlil için 37 l tank | |
| Etanol ve nbsp; | Fisher Bilimsel | ||
| Ethovision XT izleme sistemi | https://www.noldus.com/ethovision-xt | ||
| R-Özellikli Renkli Basler GigE Kamera | https://www.noldus.com/ethovision-xt | ||
| Beyaz oluklu plastik | 37-I tankının arkasını ve altını ve sosyal teşvik için kullanılan tankların arkasını kaplamak için plastik |
Kaynaklar
- Institue Med. Fetal alcohol syndrome: diagnosis, epidemiology, prevention, and treatment. , National Academies Press. Washington, D.C. (1996).
- Abel, E. L. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol effects. , Springer. (1984).
- Stevens, S. A., Clairman, H., Nash, K., Rovet, J. Social perception in children with fetal alcohol spectrum disorder. Child Neuropsychol. 23 (8), 980-993 (2017).
- Streissguth, A. P., et al. Risk factors for adverse life outcomes in fetal alcohol syndrome and fetal alcohol effects. J Dev Behav Pediatr. 25 (4), 228-238 (2004).
- Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for fetal alcohol spectrum disorders: zebrafish as a model for ethanol teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. BMC Neurosci. 11 (1), 90(2010).
- Pitcher, T. J. Heuristic definitions of fish shoaling behaviour. Animal Behav. 31 (2), 611-613 (1983).
- Fernandes, Y., Rampersad, M., Gerlai, R. Embryonic alcohol exposure impairs the dopaminergic system and social behavioral responses in adult zebrafish. Int J Neuropsychopharmacol. 18 (6), pyu089(2015).
- Fernandes, Y., Gerlai, R. Long-term behavioral changes in response to early developmental exposure to ethanol in zebrafish. Alcohol Clin Exp Res. 33 (4), 601-609 (2009).
- Fernandes, Y., Rampersad, M., Jones, E. M., Eberhart, J. K. Social deficits following embryonic ethanol exposure arise in post-larval zebrafish. Addict Biol. 24 (5), 898-907 (2019).
- Buske, C., Gerlai, R. Early embryonic ethanol exposure impairs shoaling and the dopaminergic and serotoninergic systems in adult zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 33 (6), 698-707 (2011).
- Pannia, E., Tran, S., Rampersad, M., Gerlai, R. Acute ethanol exposure induces behavioural differences in two zebrafish (Danio rerio) strains: A time course analysis. Behav Brain Res. 259, 174-185 (2014).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)/Monte Westerfield. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2007).
- Fernandes, Y., Rampersad, M., Eberhart, J. K. Social behavioral phenotyping of the zebrafish casper mutant following embryonic alcohol exposure. Behav Brain Res. 356, 46-50 (2019).
- Fernandes, Y., Rampersad, M., Gerlai, R. Impairment of social behaviour persists two years after embryonic alcohol exposure in zebrafish: A model of fetal alcohol spectrum disorders. Behav Brain Res. 292, 102-108 (2015).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochem Cell Biol. 96 (2), 88-97 (2018).
- Park, J. S., et al. Innate color preference of zebrafish and its use in behavioral analyses. Mol Cells. 39 (10), 750-755 (2016).
- Gerlai, R., et al. Forward genetic screening using behavioral tests in zebrafish: a proof of concept analysis of mutants. Behav Genet. 47 (1), 125-139 (2017).
- Scerbina, T., Chatterjee, D., Gerlai, R. Dopamine receptor antagonism disrupts social preference in zebrafish: a strain comparison study. Amino Acids. 43 (5), 2059-2072 (2012).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
