Olumsuz Bir Embriyonik Ortamın Yetişkin Sosyal Davranışı Üzerindeki Etkisini Karakterize Etmek için Zebra Balıklarında Fetal Alkol Spektrum Bozukluklarının Modellenmesi

Doğum öncesi alkole maruz kalma, topluca fetal alkol spektrum bozuklukları (FASD) olarak bilinen çeşitli doğum kusurlarına yol ^açabilir1. Sosyal zorluklar gibi bozulmuş davranışlar, FASD^2,3 ile ilişkili yaygın doğum kusurlarıdır. Ne yazık ki, sosyal zorluklar sıklıkla ciddi ruh sağlığı sorunlarına⁴ yol açar ve bu da FASD'li bireylerin yaşam kalitesini olumsuz yönde etkileyebilir. Bu nedenle, etanolün neden olduğu sosyal kusurlardan sorumlu mekanizmaları anlamak çok önemlidir.

Zebra balıkları, etanolün neden olduğu sosyal kusurlardan sorumlu mekanizmalar hakkındaki anlayışımızı ilerletmek için onları çok uygun kılan biyolojik ve davranışsal özelliklere sahiptir. Örneğin, zebra balığı büyük miktarlarda şeffaf dış döllenmiş yumurta üretir; bu biyolojik özellikler, araştırmacıların kolayca kesin ve tekrarlanabilir FASD fenotipleri oluşturmasına olanak tanır⁵. Embriyoları döllenmeden 24 saat sonra (hpf) etanole maruz bırakmak için, şeffaf yumurtayı incelemek ve embriyoyu Kimmel ve ^ark.6 gibi daha önce yayınlanmış çalışmalara dayanarak evrelemek için bir diseksiyon mikroskobu kullanmak ve ardından yumurtayı istenen süre boyunca istenen etanol konsantrasyonuna yerleştirmek gerekir. Koryon, alkol^7'ye karşı zayıf bir bariyer olduğundan, etanol embriyoyu kolayca yıkar. Maruz kalmayı durdurmak için, yumurtaları etanol çözeltisinden çıkarmak yeterlidir. Zebra balığı, araştırmacılara FASD fenotipleri oluşturmak için basit ama doğru bir yöntem sağlamanın yanı sıra, araştırmacıların insanlarla genetik karşılaştırmalar yapmasına da olanak tanır, çünkü insan genlerinin %70'i bir zebra balığı ortologuna sahiptir, bu nedenle insan hastalıklarıyla ilgili genleri anlamak için değerli bir araçtır⁸. Ek olarak, diğer hayvan modellerinden farklı olarak, zebra balığı sürü¹⁰ adı verilen sosyal grupları⁹ oluşturur. Sürü davranışı, embriyonik etanol maruziyetinin sosyal davranış üzerindeki etkilerini karakterize etmek için kullanılabilir¹¹. Ayrıca, zebra balıklarında bilgisayar kontrollü sosyal uyaranlar¹² veya canlı bir sosyal uyaran¹³ kullanılarak sosyal bir tepki ortaya çıkarılabilir.

Önceki çalışmalar, yetişkin zebra balıklarının¹⁴. gruplardaki sosyal tepkisini karakterize etmiştir, ancak bu yaklaşımın bir sınırlaması, bireysel bir balığın davranışını, nörotransmitter seviyelerindeki¹¹ değişiklikler gibi belirli bir önlemle ilişkilendirememesidir. Aşağıdaki protokol, kullanıcılara bireysel bir yetişkin zebra balığının sosyal davranışını karakterize etme yeteneği verecektir. Bireysel balıklar için sosyal davranış edinildiğinden, protokolün kullanıcıları artık her balığın edinilen davranış profilini bağımlı bir sonuçla ilişkilendirebilir. Örneğin, önceki çalışmalar, embriyonik etanol maruziyetinin bir sosyal uyarana karşı dopaminerjik tepkiyi bozduğunu göstermiştir¹¹. Burada gösterilen veriler bağımsız değişken olarak embriyonik etanol maruziyetini kullanmış olsa da, protokol kullanıcıları diğer farmakolojik tedavilerin veya genetik mutasyonların sosyal davranış üzerindeki etkilerini karakterize edebilir. Ayrıca, protokol kullanıcıları, embriyonik tedavilerin davranışı nasıl değiştirdiğini incelemekle sınırlı değildir, aynı zamanda yetişkin zebra balıklarında akut farmakolojik tedavilerin sosyal davranışı nasıl etkilediğini de belirleyebilir¹⁵.

Burada açıklanan tüm yöntemler, Güney Dakota Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Zebra balığı barınması, bakımı ve embriyonik etanol maruziyeti

1. Zebra balığını tarif edildiği gibi yetiştirin ve yetiştirin¹⁶.
2. Etanol maruziyeti
   1. Etanol maruziyetinin gerçekleştirileceği uygun gelişim aşamasını seçin. Bu protokolde embriyolar 24 hpf'de etanole maruz bırakıldı.
   2. Yumurtaları 2 saat^{15 boyunca% 1.0} etanol hacmi/hacmine koyun. EM'nin mL başına 1 yumurta oranı iyi bir uygulamadır. Spesifik olarak, embriyoları 50 mL embriyo ortamına yerleştirin (EM; EM tarifi için lütfen Westerfield^16'ya bakınız), ardından 500 μL EM'yi çıkarın ve 500 μL etanol ile değiştirin.
   3. Etanole maruz kaldıktan sonra, embriyoları tarif edildiği gibi yükseltin¹⁷. Balıklar 16 haftalıkken sosyal davranışı test edin.

2. Rastgeleleştirme ve tank kurulumu

1. Çevrimiçi bir rastgele dizi üreteci kullanarak, davranışsal tahlilleri yürütmek için tüm denemeleri a priori olarak randomize edin. Uyarıcı tarafın ve tedavi gruplarının rastgele değiştiğinden emin olun.
2. Günün saati veya test günü gibi kafa karıştırıcı faktörlerden kaçınmak için, davranış testini her gün aynı saatte başlatın ve bitirin ve tüm deney balıkları test edilene kadar davranış testini ardışık günlerde yapın.
3. Bu test için (Şekil 1), 37 L'lik bir tank (50 cm x 25 cm x 30 cm, U x G x Y) kullanın ve daha önce açıklandığı gibi tankın genişliği boyunca dışarıya yerleştirilmiş^{1.4 L tanklar 17}.
4. Video izlemeyi iyileştirmek için deney balığı ile arka plan arasındaki kontrastı artırmak için 37 L'lik tankın arkasını ve altını beyaz oluklu plastikle kaplayın.
5. Deneysel balıklar için sosyal uyaranın kontrastını artırmak için oluklu plastiği 1,4 L'lik tankların dış duvarına yerleştirin. Son olarak, 1,4 L'lik tanklar ile 37 L'lik tanklar arasına beyaz oluklu plastik yerleştirin; Bu opak bariyer, deney balığının alışkanlık sırasında sosyal uyaranı görmesini önlemek için kullanılır.
6. Kamerayı, 37 L'lik tankın tüm uzunluğunu ve 1,4 L'lik tankların yarısını yakalayacak kadar uzak bir mesafeye yerleştirin ve yetişkin deney balıklarını doğru bir şekilde takip edin.
   NOT: Uyaranı hangi tarafın tuttuğunu görmek, araştırmacıların izleme bölgelerini doğru bir şekilde etiketlemesini sağlar ve yedek olarak yedeklilik sağlar.
7. Kızılötesi izleme kullanılmıyorsa, 37 L deposunu aydınlattığınızdan emin olun. Piyasada bulunan herhangi bir akvaryum davlumbaz ışığını 15 W T8 tam spektrum lambası ile kullanın.
   NOT: Birden fazla arena kuruluyorsa, aynı lambalara sahip aynı akvaryum davlumbazlarını kullanın.

3. Sosyal tahlilin yapılması

1. Davranışsal test için kullanılan 37 L'lik tankı, muhafaza rafında kullanılan suyla aynı olan suyla doldurarak başlayın. Su sıcaklığının muhafaza rafından 2 °C içinde olduğundan emin olun.
2. Günün sonunda 37 L'lik depoyu boşaltın. Her test gününe temiz su ile başlayın. 37 L'lik tanktaki su seviyesi ile 1.4 L'lik tanktaki su seviyesinin aynı olduğundan emin olun. Odanın sıcaklığı 37 L'lik tanktaki suyu 28,5 °C 2 °C'de tutmuyorsa, suyu 28,5 °C'de ılık suyla değiştirin.
3. Ardından, ilgi alanlarını ayarlayın. Bölgeler oluşturmak için kullanıcının tercih ettiği manuel izleme yazılımına danışın. Bu protokolde, 37 L'lik tankın uzunluğu boyunca, üstte ve altta, 5 cm'lik artışları işaretlemek için bir mezura kullanıldı. Test tankının 50 cm olduğu göz önüne alındığında, 5 cm'lik artışlar, her biri 5 cm olan 10 bölgeye yol açar.
4. 37 L'lik tank üzerinde yapılan işaretleri referans olarak kullanarak, üstteki 5 cm'lik noktayı alttaki karşılık gelen 5 cm'lik noktaya bağlayarak bölgeleri oluşturmak için yazılımı kullanın. Ek olarak, alt kısım boyunca ve uyaran boyunca bir bölge oluşturun. İlgi alanlarını özelleştirin.
5. Bir bölgeye olan mesafeyi ve bölgede geçirilen süreyi ölçmek için bu protokoldeki izleme yazılımını kullanın. Bu protokolde 12 bölge kullanılmıştır.
6. 1'den 10'a kadar olan bölgelerde geçirilen süreyi ve uyarana olan mesafeyi ve dibi Bölge 1 olarak, uyarana en yakın bölge olarak ölçün, Bölge 10 ise uyarana en uzak olan bölgedir.
7. Ardından, sosyal uyaran için kullanılacak iki erkek ve iki kadını seçin. En iyi uygulama, deney balıklarıyla aynı kohorttan erkek ve dişileri kullanmak olacaktır. Bu mümkün değilse, deney balığının türüne, yaşına ve boyutuna uygun balıkları bulmaya çalışın.
8. Deney balıklarını muhafaza tankından test alanına (37 L tank) aktarın. Muhafaza tankındaki balıkları yakalamak için bir ağ kullanın. Ağı, içinde balık bulunan ağı, balık suyu olan bir kaba yerleştirin.
   NOT: Bu yaklaşımın kullanılması, tanklar arasında hareket ederken deney balıkları üzerindeki stresi azaltacaktır.
9. Deney balığını test alanının ortasına yerleştirin.
10. Kullanıcının tercih ettiği yazılıma göre algılama ayarları tatmin edici olduğunda (kullanım kılavuzuna bakın), 20 dakikalık denemeye başlayın. İlk 10 dakika boyunca, 37 L'lik tank ile 1,4 L'lik tanklar arasındaki opak bariyeri yerinde bırakın. Bu, deney balığının iki erkek ve iki dişi zebra balığından oluşan sosyal uyaranı görmesini engelleyecek ve balığın test alanına^13,17 alışmasını sağlayacaktır.
11. 10 dakika sonra, opak bariyerleri tankın arkasından çekerek dikkatlice çıkarın; Bu, deney balığının sosyal uyaranı görmesini sağlayacaktır.
12. Kullanıcının tercihlerine ve yazılım kılavuzuna dayalı olarak deney balığının ^{11, 12, 17} davranışını izlemek ve ölçmek için izleme yazılımı kullanın. Mevcut protokolde, sosyal uyarana ve tankın dibine olan mesafeyi ve tüm bölgelerde geçirilen süreyi ölçün.
13. Geleneksel veri analizi araçlarını kullanarak verileri analiz edin.

Şekil 2, Fernandes ve ark.17'den modifiye edilmiştir ve embriyonik etanol maruziyetinin, uyarana olan mesafeyi inceleyerek sığlaşma tepkisini körelttiğini göstermektedir. Şekil 2'deki veriler, 20 dakikalık deneme sırasında sosyal uyarana olan mesafeyi temsil etmektedir. Y ekseni mesafeyi santimetre cinsinden gösterirken, X ekseni 20 dakikalık denemeyi 1 dakikalık aralıklara bölünmüş olarak gösterir. X ekseni boyunca uzanan siyah çubuk, opak engellerin kaldırıldığı ve sosyal uyaranın test balığı tarafından görülebildiği zamanı temsil eder. Başlangıçta tüm gruplarda, görünür hale getirildikten sonra sosyal uyarana doğru hızlı bir azalma olur, bu da 9. ve 10. dakikalar arasındaki mesafedeki keskin azalma ile belirlenebilir, ancak kontrol balıkları sosyal uyarana çok yakın kalırken, tedavi edilen alkol değildir; Bu, embriyonik etanol maruziyetinin yetişkin sosyal davranışını etkilediğini göstermektedir12,18.

Şekil 3 , Fernandes ve ark.17'den modifiye edilmiştir ve embriyonik etanol maruziyetinin sığlaşma tepkisi üzerindeki etkisini daha fazla göstermek için uyarana olan mesafenin ölçülmesinden elde edilen verileri kullanır. Şekil 3'teki veriler, görünür hale geldiğinde sosyal uyarana olan mesafedeki azalmayı temsil etmektedir. Uyarana olan mesafedeki ortalama azalmayı hesaplamak için; Uyaran döneminde (uyaranın görünür olduğu zaman) uyarana olan ortalama mesafe, alışma sırasında (sosyal uyaran görünür olmadığında) uyarana olan ortalama mesafeden çıkarıldı, bu nedenle daha büyük bir negatif değer, daha güçlü bir sosyal tepkiyi temsil eder.

Şekil 4 , uyarana olan mesafeye karşı bölgelerde geçirilen süreyi göstermektedir. Şekil 4 , Fernandes ve ark.17'den değiştirilmiştir. Şekil 4A , uyaran görünürken balıkların her bölgede (X ekseni) harcadıkları süreyi (Y ekseni) göstermektedir. Tüm gruplardan balıklar, sosyal uyaran kontrolüne en yakın bölgeyi tercih ediyor gibi görünse de, balıklar alkolle tedavi edilen balıklara kıyasla bölge 1'de neredeyse iki kat daha fazla zaman harcarlar (Şekil 4B). Şekil 4C , embriyonik etanol maruziyetinin hareketliliği bozmadığını göstermektedir, çünkü bölgeler arasında gruplar arasında bir fark yoktu. Son olarak, Şekil 4D , bir sosyal uyaranın yokluğunda balıkların sosyal uyarana en yakın bölgede zaman geçirmediğini göstermektedir. Bu nedenle, sonuçlar, kontrol balıklarının görünür olduğunda sosyal uyarana çok yakın olduğunu ve çok yakın kaldığını, etanol ile muamele edilen balıkların ise olmadığını göstermektedir. Ayrıca, Şekil 2 ve Şekil 4C'de gösterilen veriler, embriyonik etanol maruziyetinin balıkların sosyal uyaranı görme (Şekil 2) veya hareket etme (Şekil 4C) yeteneğini bozmadığını, dolayısıyla embriyonik etanol maruziyetinin yetişkin zebra balıklarında sosyal davranışı bozduğuna dair güçlü kanıtlar sağladığını göstermektedir.

Şekil 1: Davranış aygıtının şeması. Embriyonik etanol maruziyeti olan ve olmayan yetişkin zebra balıklarının (ZT140 olarak adlandırılır) sosyal davranışlarını test etmek için 37 L'lik bir tank kullanıldı. Bu rakam Fernandes ve ark.17'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Embriyonik etanol maruziyeti, yetişkin zebra balıklarında sosyal davranışı köreltir. Yetişkin deney balığı ile canlı sürü arasındaki ortalama mesafe, 20 dakikalık davranış seansının 1 dakikalık aralıkları için çizilmiştir. Ortalama ± SEM gösterilir. Kontrol (n = 12); % 1 etanol (EtOH; n = 11). X ekseninin üzerindeki 10 ila 20 dakika arasındaki yatay çubuk, canlı sürünün deney denekleri tarafından görülebildiği bir zaman çizelgesini gösterir. Alkol konsantrasyonu grafiklerin üzerinde gösterilmiştir. Bu rakam Fernandes ve ark.17'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Alkolle tedavi edilmiş balıklar canlı sürüden önemli ölçüde daha uzaktadır. Çubuklar, canlı sürük görünmeden önce ve sonra balığın canlı sürüden uzaklığı arasındaki farkı temsil eder. Daha büyük negatif değerler, özelliklere daha güçlü bir yanıt olduğunu gösterir. Ortalama ± SEM gösterilir. Ortalama ± SEM gösterilir. Kontrol (n = 12); % 1 etanol (EtOH; n = 11). Bu rakam Fernandes ve ark.17'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Embriyonik etanol maruziyeti, yalnızca canlı sürü görünür olduğunda bölge 1'de geçirilen süreyi değiştirir. (A) Çubuklar, uyaran sunumu sırasında 10 bölgenin tamamında geçirilen süreyi temsil eder. (B) Çubuklar, uyaran sunumu sırasında 1. bölgede geçirilen süreyi temsil eder. Bölge 1, canlı sürüye en yakın bölgedir, bölge 10 ise canlı sürüye en uzak bölgedir. Balıkların bölgede geçirdikleri süreyi kontrol etme miktarındaki önemli farka dikkat edin. (C) Çubuklar, alışma sırasında tüm bölgelerde geçirilen sürenin ortalama yüzdesini, ilk 10 dakikayı temsil eder. (D) Çubuklar, alışkanlık sırasında bölge 1'de geçirilen süreyi temsil eder. Ortalama ± SEM gösterilir. Örneklem büyüklükleri aşağıdaki gibidir: Kontrol (n = 12); etanol (EtOH; n = 11). Bu rakam Fernandes ve ark.17'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.