Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Özet

Bu makale, bir lentiviral vektör ve bir 2D biyoreaktör aracılığıyla tek eksenli germe kullanarak Skleraxis’in kombine aşırı ekspresyonu ile iPSC’den türetilmiş mezenkimal stromal hücreler üreterek iTenositler üretme prosedürünü açıklamaktadır.

Abstract

Günümüzün tendon ve bağ onarımındaki zorlukları, tendon rejenerasyonunu desteklemek için hücre bazlı tedavi için uygun ve etkili bir adayın belirlenmesini gerektirmektedir. Mezenkimal stromal hücreler (MSC’ler), tendon onarımı için potansiyel bir doku mühendisliği stratejisi olarak araştırılmıştır. Multipotent olmalarına ve in vivo rejeneratif potansiyele sahip olmalarına rağmen, kendi kendini yenileme kapasiteleri sınırlıdır ve fenotipik heterojenlik sergilerler. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC’ler), yüksek kendini yenileme kapasiteleri ve benzersiz gelişimsel plastisiteleri nedeniyle bu sınırlamaları aşabilir. Tenosit gelişiminde, Skleraksi (Scx), tendon farklılaşmasının çok önemli bir doğrudan moleküler düzenleyicisidir. Ek olarak, mekanoregülasyonun embriyonik tendon gelişimini ve iyileşmesini yönlendiren merkezi bir unsur olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, tenosit üretmek için gerekli olabilecek biyolojik ve mekanik stimülasyonun sinerjik etkisini kapsüllemek için bir protokol geliştirdik. iPSC’ler mezenkimal stromal hücreler (iMSC’ler) haline geldi ve akış sitometrisi yoluyla klasik mezenkimal stromal hücre belirteçleri ile karakterize edildi. Daha sonra, bir lentiviral vektör kullanılarak, iMSC’ler SCX’i (iMSC^SCX+) stabil bir şekilde aşırı eksprese etmek için dönüştürüldü.Bu iMSC^SCX+ hücreleri, bir 2D biyoreaktör kullanılarak tek eksenli çekme yüklemesi yoluyla iTenositlere daha da olgunlaştırılabilir. Elde edilen hücreler, erken ve geç tendon belirteçlerinin yukarı regülasyonunun yanı sıra kollajen birikiminin gözlemlenmesiyle karakterize edildi. Bu iTenosit üretme yöntemi, araştırmacılara tendon hücre tedavisi uygulamaları için potansiyel olarak sınırsız bir kullanıma hazır allojenik hücre kaynağı geliştirmede yardımcı olmak için kullanılabilir.

Introduction

Tendon ve bağ onarımındaki çağdaş sorunların üstesinden gelmek için, hücre bazlı tedavilere uygun uygun bir hücre adayına ihtiyaç vardır. Tendon onarımı için doku mühendisliğinde bir araştırma yolu, potansiyel stratejiler olarak kemik iliği kaynaklı mezenkimal stromal hücrelerin (BM-MSC’ler) ve adipoz doku kaynaklı stromal hücrelerin (ASC’ler) araştırılmasını içerir. Bu hücreler multipotent yeteneğe, büyük bolluğa ve in vivo rejeneratif potansiyele sahiptir. Ek olarak, hayvan modellerinde gelişmiş iyileşme kapasitesi ve gelişmiş fonksiyonel sonuçlar göstermişlerdir¹. Bununla birlikte, bu hücreler sınırlı kendini yenileme yetenekleri, fenotipik çeşitlilik ve özellikle tendon oluşumu için sınırlı kapasite sergilerler. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisi, olağanüstü kendini yenileme kapasitesi ve eşsiz gelişimsel uyarlanabilirliği nedeniyle bu kısıtlamalara bir çözüm sunar. Araştırma ekibimiz ve diğerleri, iPSC’lerin mezenkimal stromal hücre benzeri varlıklara (iMSC’ler) başarılı bir şekilde farklılaşmasını ^{sağlamıştır2,3}. Bu nedenle, iMSC’ler tendon hücre tedavisi uygulamaları için allojenik bir kaynak olma potansiyeline sahiptir.

Skleraksi (SCX), tendon gelişimi için gerekli olan bir transkripsiyon faktörüdür ve farklılaşmış tenositler için en erken saptanabilir belirteç olarak kabul edilir. Ek olarak, SCX, diğerlerinin yanı sıra tip 1a1 zincir kollajen 1 (COL1a1), mohawk (MKX) ve tenomodulin (TNMD) dahil olmak üzere aşağı akış tendon farklılaşma belirteçlerini aktive eder ^4,5,6. Tendon olgunlaşması sırasında eksprese edilen diğer genler arasında tübülin polimerizasyonunu teşvik eden protein ailesi üyesi 3 (TPPP3) ve trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü alfa (PDGFRa)⁷ bulunur. Bu genler tendon gelişimi ve olgunlaşması için gerekli olmakla birlikte, ne yazık ki tendon dokusuna özgü değildir ve kemik veya kıkırdak gibi diğer kas-iskelet dokularında eksprese edilir ^5,7.

Tendon gelişimi sırasında belirteçlerin ekspresyonuna ek olarak, mekanostimülasyon embriyonik tendon gelişimi ve iyileşmesi için önemli bir unsurdur ^4,5,6. Tendonlar mekano-duyarlıdır ve büyüme modelleri çevrelerine tepki olarak değişir. Moleküler düzeyde, biyomekanik ipuçları tenositlerin gelişimini, olgunlaşmasını, bakımını ve iyileşme tepkilerini etkiler⁸. Fizyolojik yükleri ve biyomekanik ipuçlarını modellemek için çeşitli biyoreaktör sistemleri kullanılmıştır. Bu model sistemlerden bazıları ex vivo doku yüklemesi, çift eksenli veya tek eksenli gerilim uygulayan 2D hücre yükleme sistemleri ve iskele ve hidrojel kullanan 3D sistemleri^{içerir 9,10}. 2D sistemler, mekanik stimülasyonun tendona özgü genler veya hücre kaderi bağlamında hücrelerin morfolojisi üzerindeki etkilerini incelerken avantajlıdır, 3D sistemler ise hücre-ECM etkileşimlerini daha doğru bir şekilde kopyalayabilir ^9,10.

2D yükleme sistemlerinde, hücreler ve kültür substratı arasındaki gerilme homojendir, yani hücrelerin hücre iskeletine uygulanan yük tamamen kontrol edilebilir. Çift eksenli yükleme ile karşılaştırıldığında, tenositler ağırlıklı olarak in vivo⁹ kollajen demetlerinden tek eksenli yüklemeye maruz kaldığından, tek eksenli yükleme fizyolojik olarak daha önemlidir. Günlük aktiviteler sırasında tendonların %6’ya kadar tek eksenli gerilme yüküne maruz kaldığı bulunmuştur¹¹. Spesifik olarak, önceki çalışmalar, %4-5 fizyolojik aralıklarında yüklemenin, SCX ve TNMD gibi tendonla ilgili belirteç ekspresyonunu koruyarak ve ayrıca artan kollajen üretimini koruyarak tenojenik farklılaşmayı teşvik ettiği gösterilmiştir ^9,10. % 10’dan fazla suşlar travmatik olarak ilişkili olabilir, ancak fizyolojik olarak anlamlı olmayabilir^12,13.

Burada, tenosit üretimi için gerekli olabilecek mekanik ve biyolojik stimülasyonun sinerjik etkisini hesaba katan bir protokol sunulmaktadır. İlk olarak, embriyoid cisimlerin büyüme faktörlerine kısa süreli maruz kalması yoluyla iPSC’leri iMSC’lere indüklemek için tekrarlanabilir bir yöntem tanımladık ve akış sitometrisi kullanılarak MSC yüzey belirteçleri ile doğrulanmıştı. Daha sonra, iMSC’leri SCX’in (iMSC^SCX+) kararlı aşırı ekspresyonuna sahip olacak şekilde tasarlamak için bir lentiviral transdüksiyon yöntemini detaylandırıyoruz. Daha fazla hücre olgunlaşması için, iMSC^SCX+ , fibronektin kaplı silikon plakalara ekilir ve CellScale MCFX biyoreaktörü kullanılarak optimize edilmiş tek eksenli gerilim protokolüne tabi tutulur. Tenterojenik potansiyel, erken ve geç tendon belirteçlerinin yukarı regülasyonunun yanı sıra kollajen birikimi¹⁴ gözlemlenerek doğrulandı. Bu iTenosit üretme yöntemi, tendon hücre tedavisi uygulamaları için sınırsız kullanıma hazır, allojenik bir kaynak sunabilen bir kavram kanıtıdır.

Protocol

iTenosit üretmek için bu protokol üç ana adımda gerçekleştirilebilir: iPSC’lerden iMSC’lere (10 gün), iMSC’den iMSCSCX+ ‘a (2 hafta), iMSCSCX+ ‘dan iTenositlere (en az 4 gün). Protokoldeki her önemli adım, deneysel zaman çizelgesine bağlı olarak daha sonra duraklatılabilir ve yeniden başlatılabilir. Hücrelerin kültürlenmesi ile ilgili yöntemler için steril teknikler kullanılmalıdır. Bu protokoldeki tüm hücreler 37 °C, O2 ve nemde büyütülmelidir. 1. İndüklenmiş Mezenkimal Stromal Hücrelere (iMSC’ler) insan iPSC indüksiyonu Deney hazırlığıIscove’un Modifiye Dulbecco’nun Orta – Embriyoid Cisimcikleri (IMDM-EB) ortamını hazırlayın.50 mL IMDM bazal ortamını 8.5 mL nakavt serum replasmanı, 500 μL Minimal Esansiyel Ortam (MEM) esansiyel olmayan amino asitler, 0.385 μL (110 mM stok) beta-merkaptoetanol ve 500 μL antibiyotik-antimikotik çözelti (AAS) ile destekleyin (nihai konsantrasyonlar sırasıyla% 17,% 1, 110 μM,% 1) (bkz. Mezenkimal Stromal Hücre (MSC) ortamını hazırlayın.440 mL düşük glikozlu Dulbecco’nun Modifiye Eagle Medium’unu (DMEM) 50 mL fetal sığır serumu (FBS), 5 mL antibiyotik-antimikotik solüsyon (AAS) ve 5 mL L-glutamin (nihai konsantrasyonlar: sırasıyla , %1, 2 mM) ile destekleyin. Poli (2-hidroksietil metakrilat) (poli-HEMA) kaplı plakalar hazırlayın.Steril bir şişeye 10 g poli-HEMA ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin. Şişeye manyetik bir karıştırıcı ekleyin ve karıştırırken yavaşça 500 mL EtOH ekleyin. Tüm EtOH eklendikten sonra, karıştırma modunu en az 1200 saat ek düşük ısı ile 6 rpm’de açın. Poly-HEMA çözeltisi oda sıcaklığında bir yıla kadar saklanabilir. Steril koşullar altında, bir T75 şişesine 9 mL’de 2,5 μg/cm2 ekleyin. Hacmi kültür kabının boyutuna göre ayarlayın. Steriliteyi koruyarak, kullanmadan önce EtOH’nin tamamen buharlaşması için kapların kurumasına izin verin. Bu genellikle 24-72 saat sürer. Jelatin kaplı şişeler hazırlayın.Bir cam şişeyi NaOH ile yıkayın ve jelatin preparatına adayın. Deterjan kullanmayın. % 1 jelatin çözeltisi hazırlayın (5 g jelatin ve 500 mL endotoksin içermeyen su). Cam şişeyi jelatin çözeltisi ile 30 dakika otoklavlayın. Jelatin çözeltisinin soğumasını bekleyin ve oda sıcaklığında saklanabilir. Bir T75 şişesini şişe başına 5 mL jelatin çözeltisi ile kaplayın ve hücreleri tohumlamadan önce en az 1 saat inkübe edin. Jelatin kaplı şişeler 1 gün önceden hazırlanabilir. Floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) tamponunu hazırlayın.PBS’yi %2 sığır serum albümini ve %0.1 sodyum azid ile karıştırın. 4 °C’de saklayın. Embriyoid cisimciklerin (EB’ler) oluşumuNOT: iPSC’ler 6 oyuklu bir plakada kültürlenmeli ve kullanımdan önce -80 birleşmeye ulaşmalıdır.0. günde, doku kültürü başlığına 384 şeffaf tabanlı bir PCR plakası ve 15 dakika boyunca kapaksız UV getirin. Büyüme ortamını iPSC’lerden çıkarın (Malzeme Tablosuna bakın) ve kuyucukları PBS ile yıkayın. Her bir oyuğa 0.5 mL önceden ısıtılmış yumuşak hücre ayrışma reaktifi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve 37 ° C’de 5 dakika inkübe edin. iPSC’ler tek hücreler veya süspansiyon halinde kaldırılmış küçük agregalar haline gelene kadar hücreleri her 5 dakikada bir gözlemleyin. Tek hücreli bir süspansiyon sağlamak için hücre süspansiyonunu 1 mL’lik bir pipetle yeniden süspanse etti. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g’da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın, IMDM-EB ortamında yeniden süspanse edin (adım 1.1.1) ve bir hemositometre veya hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri sayın. Kuyucuk başına 25 μL hücre süspansiyonu ile 384 oyuklu plakanın kuyusu başına 5.000-25.000 hücre elde etmek için gereken uygun hücre süspansiyonu hacmini hesaplayın.NOT: Genel olarak, 6 oyuklu bir plakanın 2-3 birleşik (-80) kuyusu, 384 oyuklu bir plakada EB’ler yapabilir. EB başına hücre boyutu ampirik olarak belirlenecektir. 384 oyuklu bir plakanın tamamı için, oyuk başına 25 μL olmak üzere 9.6 mL hücre süspansiyonu kullanılmalıdır. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g’da tekrar santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri uygun hacimde IMDM-EB ortamı ve 10 μM Y-27632 dihidroklorür (stok: 10 mM, 1000x, Malzeme Tablosuna bakınız) içinde önceden soğutulmuş 15 mL konik bir tüpte yeniden süspanse edin. Konik malzemeye soğuk çözündürülmüş bazal membran matrisi (EB değerinde 384 oyuklu plaka başına 1 mg) ekleyin (bkz. Her bir kuyucuğa 25 μL hücre süspansiyonu dağıtın. Plakaya steril bir kapak yerleştirin ve 4 °C’de 450 x g’de 7 dakika döndürün. 37 °C’de 48 saat inkübe edin. 2. günde, hücreleri 3 mL önceden ısıtılmış IMDM-EB ortamı içeren 100 mm’lik bir plakaya aktarın. EB’leri 10 mL IMDM-EB içeren özel poli-HEMA kaplı T75 şişelerine aktarın. Hacmi kültür kabının boyutuna göre ayarlayın. EB’lerin 3 gün boyunca büyümesine izin verin. 5. günde, EB’leri 10 mL IMDM-EB ortamı ile hazırlanmış jelatin kaplı T75 şişelerine aktarın. Hacmi kültür kabının boyutuna göre ayarlayın. EB’leri askıya alarak 3 gün daha büyütün. 8. günde, iki tür EB’nin gözlemlendiğinden emin olun: şişeye bağlı EB’ler ve bağlı olmayan EB’ler. Bağlı olmayan EB’leri şişeden PBS ile yıkayın. Ekli EB’lere, TGFβ-1 (10 ng/mL) ile desteklenmiş IMDM-EB ortamı ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 2 gün boyunca büyümelerine izin verin. 10. günde, ortamı MSC ortamı olarak değiştirin. Hücreler haftada iki kez beslenmelidir. % 70 birleştiğinde, hücreleri yeniden plakalamak için “Standart kaldırma hücreleri protokolüne” geçin. Hücreleri jelatin kaplı plakalar üzerinde yeniden plakalayın. Standart kaldırma hücreleri protokolüYapışık hücreler% 70 birleşmeye ulaştığında, büyüme ortamını plakalardan aspire edin ve PBS ile yıkayın. Her 150 mm’lik plakaya 5 mL önceden ısıtılmış %0.25 tripsin ekleyerek hücreleri kaldırın ve 37 °C’de 5 dakika inkübe edin. Tripsin hacmini kültür kabının boyutuna göre ayarlayın. Mikroskop altında, hücrelerin çoğunun her plakadan kaldırıldığını kontrol edin. Hala bağlı hücreler varsa, hücreleri yerinden çıkarmak için plakaların kenarlarına hafifçe vurun. Önceden ısıtılmış büyüme ortamının hacmini iki katına ekleyerek hücreleri konik bir tüpte toplayın. Hücreleri oda sıcaklığında 300 x g’da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve sonraki adımlara geçin. MSC marker ekspresyonu için akış sitometrisi değerlendirmesiNOT: Kemik iliği MSC’leri gibi insan MSC’leri pozitif kontrol olarak kullanılmalıdır.”Standart kaldırma hücreleri protokolünü” uygulayın (adım 1.3). Süpernatanı 3 mL FACS tamponu ile yeniden süspanse edin ve tüm hacmi FACS tüplerine aktarın. Oda sıcaklığında 300 x g’da 5 dakika santrifüjleyin. FACS tamponu ile yıkama adımını iki kez daha tekrarlayın. Boyanmış tüplere 2 μL fare antihuman CD90-FITC, fare antihuman CD44-APC ve antihuman CD105-PE ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 4 ° C’de 45 dakika inkübe edin. İzotip kontrol tüplerine 20 μL fare IgG2a-FITC, fare IgG1-PB ve fare IgG1-PE ekleyin (bkz. Karanlıkta 4 °C’de 15 dakika inkübe edin. Tüm tüpleri 3 mL FACS tamponu ekleyerek ve 300 x g’da (oda sıcaklığında) 5 dakika santrifüjleyerek yıkayın. Hücreleri her tüp için 250 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Akış sitometrisi14 kullanarak MSC’lerin yüzey belirteçlerinin ekspresyonunu analiz edin. Uyarma ve emisyon dalga boyları şöyle olmalıdır: CD90-FITC, 495 nm’de uyarma zirvesi ve 519 nm’de emisyon zirvesi; CD44-APC, 640’ta uyarma zirvesi ve 660 nm’de emisyon zirvesi; CD105-PE, 561 nm’de uyarma zirvesi ve 574 nm’de emisyon zirvesi. 2. iMSC geçişi ve genişletme Reaktiflerin hazırlanmasıMSC dondurma ortamını hazırlayın.30 mL düşük glukoz DMEM, 5 mL DMSO ve 15 mL FBS’yi birleştirin (nihai konsantrasyonlar sırasıyla% 60,% 10,% 30). Çözeltiyi steril bir 0.45 μm filtre kullanarak filtreleyin. 4 °C’de saklayın. GeçişNOT: İndüksiyonu takiben, iMSC’ler, plastik doku kültürü plakaları üzerinde büyümeye bırakılmadan önce ek 2 geçiş için jelatin kaplı plakalar üzerinde büyütülmelidir. Ek olarak, hücreler birleştiğinde 1:3 bölme oranıyla geçilmelidir.”Standart kaldırma hücreleri protokolünü” uygulayın (adım 1.3). Hücreleri MSC ortamında yeniden süspanse edin ve hücreleri, şişe başına 20 mL ortam ile üç yeni 150 mm’lik T175 şişesi plakasına eşit olarak dağıtın. Hücreleri 37 °C’ye getirin. Büyüme ortamını önceden ısıtılmış MSC ortamı ile değiştirerek hücreleri haftada iki kez besleyin. Donma”Standart kaldırma hücreleri protokolünü” gerçekleştirin. Hücreleri 1 mL MSC dondurma ortamında yeniden süspanse edin. 1 mL hücre süspansiyonunu bir kriyoviyal içine ekleyin ve uzun süreli depolama için sıvı nitrojene aktarmadan önce -80 °C’de 24 saat dondurucu bir kapta saklayın. Çözdürme15 mL’lik konik bir tüpte 10 mL önceden ısıtılmış MSC ortamı hazırlayın. Kriyoviyal’i alın, 37 °C’lik bir su banyosuna daldırın ve bezelye büyüklüğünde bir buz topu kalana kadar (yaklaşık 1-2 dakika) döndürün. Hücre kültürü davlumbazında, kriyoviyal ortama 1 mL önceden ısıtılmış ortamı yavaşça ekleyin ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre süspansiyonunu kriyoviyalden önceden ısıtılmış ortamla hazırlanmış 15 mL’lik konik tüpe aktarın ve 300 x g’da (oda sıcaklığında) 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve taze ortamla yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu, toplam hacmi 20 mL olan 150 mm’lik bir plakaya ekleyin. Hacmi kültür şişesinin boyutuna göre ayarlayın. Hücreleri bölünmeye hazır olana kadar 37 °C’de inkübe edin. 3. Lentiviral transdüksiyon kullanarak SCX’i aşırı eksprese etmek için iMSC’lerin genetik mühendisliği NOT: Protokolün bu bölümünün tamamlanması iki hafta sürer. Ortam ve reaktiflerin hazırlanmasıHEK293T/17 hücre ortamını hazırlayın.50 mL FBS ve 5 mL AAS ile 445 mL Eagle’s Minimum Esansiyel Ortam (EMEM) takviyesi (nihai konsantrasyonlar sırasıyla% 10,% 1). MSC lenti paketleme ortamını hazırlayın.50 mL oda sıcaklığındaki FBS’yi 60 °C’lik bir su banyosunda 30 dakika ısıtarak ısıyla inaktive serumu hazırlayın. 445 mL düşük glikoz DMEM’i ısıyla inaktive edilmiş FBS ve 5 mL L-glutamin ile birleştirin (nihai konsantrasyonlar: sırasıyla% 10, 2 mM.) Transfeksiyon kompleksi hazırlayın.Transfeksiyon kompleksi bileşenlerinin (Malzeme Tablosuna bakınız) buz üzerinde çözülmesine izin verin: paketleme plazmitleri VSV-G ve Delta, SCX plazmidi ve BioT15,16. Plazmitleri yavaşça girdap haline getirin ve aşağı doğru döndürün. DNA konsantrasyonlarını ölçün. DNA konsantrasyonlarına ve transfeksiyon için amaçlanan şişelerin sayısına bağlı olarak, ihtiyaç duyulan her bir bileşenin hacmini hesaplayın: bir T75 şişesi için, transfeksiyon kompleksi 750 μL serumsuz ortamdan (serumsuz DMEM veya PBS gibi), 7.5 μg SCX plazmid, 0.75 μg VSV-G plazmid, 6.75 μg Delta plazmid ve 22.5 μL BioT’den oluşacaktır. Pipetleme hatası için fazladan düşünün. Hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Bir santrifüjde kısa bir süre döndürün. Oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin ve hemen kullanın. Transfeksiyon ve lentiviral üretimDİKKAT: 3. günden itibaren protokol, lentivirüs ile çalışmayı gerektirir ve bu nedenle çalışma, sınırlama seviyesi 2+ operasyonel prosedürler kullanılarak gerçekleştirilmelidir. İşçiler, iki kat eldiven, bilek kaplamaları, koruyucu gözlükler, maske ve uzun pantolon ve kapalı ayakkabılar dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman giymelidir. Pipet uçları, şişeler ve sıvı ortam dahil olmak üzere tüm atık ve malzemeler en az 20 dakika boyunca ağartıcı (son %1 sodyum hipoklorit) ile dekontamine edilmelidir. Elektrikli süpürgeyi kullanmayın.Tohum HEK293T/17 hücreleri.Transfeksiyondan yaklaşık 18-24 saat önce (0. gün), 293T hücrelerini kaldırın ve T75 şişelerine yerleştirin. Aşağıdaki ciltler, T75’i kültür kabı olarak kabul eder. Hacmi kullanılan hücre kültürü kabına göre ayarlayın. Kültür ortamını şişelerden çıkarın ve 5 mL PBS ile yıkayın.NOT: Hücreler şişenin yüzeyinden çok kolay bir şekilde kalkar. Şişenin yan tarafına PBS ekleyin ve çözeltinin hücrelere doğrudan eklenmesinden kaçının. Her şişeye 3 mL önceden ısıtılmış %0.25 tripsin ekleyin ve 37 °C’de 5 dakika inkübe edin. Hücreleri konik bir tüpe toplayın ve oda sıcaklığında 300 x g’da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın, 293T ortamında yeniden süspanse edin ve bir hemositometre veya hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri sayın. Hücreleri 5.3 x 104 hücre/cm2’de kaplayın ve gece boyunca 37 °C’de inkübe edin. Ertesi gün (1. gün), transfeksiyon kompleksini hazırlayın. Hücrelerden gelen büyüme ortamını 5 mL önceden ısıtılmış MSC lenti-paketleme ortamı ile değiştirin (adım 3.1.2). Transfeksiyon kompleksini hücrelere damla damla ekleyin. Transfeksiyon kompleksinin hücrelere eşit şekilde maruz kalmasını sağlamak için çanağı hafifçe eğin. Hücreleri 48 saat boyunca inkübatöre geri koyun.NOT: Toksisite 24 saat sonra (2. gün) gözlenmelidir. 48 saat sonra (3. gün), virüs içeren ortamı bir pipet kullanarak dikkatlice ayrı bir konik tüpe toplayın ve 300 x g’da (oda sıcaklığında) 5 dakika santrifüjleyin. 293T hücreli T75 şişesine 5 mL önceden ısıtılmış MSC lenti-paketleme ortamı ekleyin ve gece boyunca inkübatöre geri dönün. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı doğrudan filtreden pipetleyerek süpernatanı 0,45 μm steril bir filtre ile filtreleyin. Virüs içeren ortamı gece boyunca 4 °C’de saklayın. 24 saat sonra (4. gün), virüs içeren ortamı bir pipet kullanarak ayrı bir konik tüpe bir kez daha dikkatlice toplayın ve 300 x g’da (oda sıcaklığında) 5 dakika santrifüjleyin. Virüsü bir önceki toplama günü virüsü ile birleştirin ve homojen bir çözelti elde etmek için karıştırın. Bu noktada, deneysel zaman çizelgesine bağlı olarak protokol duraklatılabilir ve daha sonra yeniden başlatılabilir. Lentivirüs, -80 °C’de dondurulabilir ve dondurulabilir veya lentivirüs, “SCX ile iMSC’lerin Transdüksiyonu” (adım 3.3) ile devam ederken buz üzerinde saklanabilir.NOT: Lentivirüs alikotları dondurulduktan ve çözüldükten sonra tekrar dondurmayın. iMSC’lerin SCX ile transdüksiyonuTitre plakası transdüksiyonunu gerçekleştirin.0. günde, “Standart kaldırma hücreleri protokolünü” gerçekleştirin. MSC ortamındaki hücreleri yeniden süspanse edin ve bir hemositometre veya hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri sayın. 6 oyuklu bir plakaya 4 x 103 hücre /cm2 ekleyin. Kalan kısmı 20 mL MSC ortamı ile ekstra 150 mm’lik bir plakada yeniden plakalayın (bu kontrol plakası olacaktır). Hücreleri 37 °C’de 24 saat inkübe edin. Ertesi gün (1. gün), hücreler ~% 40 birleşik olmalıdır. Lenti paketleme büyüme ortamını önceden ısıtın ve polibren ve yaklaşık 3 mL lentivirüsü buz üzerinde çözün (veya virüs toplama ile aynı gün yapılırsa, kullanılana kadar buz üzerinde saklayın). İstenilen titrelere göre (yani, .5, , , , 0) kuyucuklara lenti-paketleme büyüme ortamı ve lentivirüs ekleyin. 5 μg/mL’lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 0,5 μL polibren ekleyin (stok konsantrasyonu: 10 mg/mL, bkz. Tüm hücrelere eşit şekilde maruz kalmayı sağlamak için plakayı döndürün. Plakayı 37 °C’de 48 saat inkübatöre geri koyun. Akış sitometrisi ile SCX lentivirüs titresi verimliliğini değerlendirin.48 saat sonra “Standart kaldırma hücreleri protokolünü” gerçekleştirin. PBS’deki hücreleri yeniden askıya alın ve bir hemositometre veya hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri sayın. Hücreleri oda sıcaklığında 300 x g’da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve yıkamak için 3 mL FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu akış sitometri tüplerine aktarın ve 300 x g’da 5 dakika santrifüjleyin. FACS tampon yıkamasını iki kez daha tekrarlayın ve son hücre peletlerini 300 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Bir akış sitometri makinesi kullanarak her titre için GFP ekspresyonunu değerlendirin. Titrelere ve hücre canlılık sayılarına dayanarak, transdüksiyona devam etmek için uygun lentivirüs titresini belirleyin. Bu noktada, deneysel zaman çizelgesine bağlı olarak protokol duraklatılabilir ve daha sonra yeniden başlatılabilir. Büyük ölçekli SCX iletimi gerçekleştirin.NOT: Listelenen hacimler 1x 150 mm plaka veya 1x T175 şişe başınadır. Bu, istenen damar boyutuna ve transdüksiyon ölçeğine bağlı olarak buna göre ayarlanabilir.0. günde, “Standart kaldırma hücreleri protokolünü” gerçekleştirin. MSC ortamındaki hücreleri yeniden süspanse edin ve bir hemositometre veya hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri sayın. Hücreleri 4 x 103 hücre/cm2’de tohumlayın. Hücreleri 37 °C’de 24 saat inkübe edin. Ertesi gün (1. gün), hücreler ~% 40 birleşik olmalıdır. Lenti paketleme büyüme ortamını önceden ısıtın ve polibren ve önceden hesaplanmış lentivirüs miktarını buz üzerinde çözün. Karar verilen titreye bağlı olarak, kuyucuklara istenen miktarda lenti-paketleme büyüme ortamı ve lentivirüs ekleyin. 5 μg/mL polibren ekleyin (stok konsantrasyonu: 10 mg/mL). 3. günde, hücreleri floresan mikroskop altında gözlemleyin. Yeni üretilen iMSCSCX+ , GFP’yi floresan olarak yaymalıdır. Virüs içeren ortamı önceden ısıtılmış MSC ortamıyla değiştirin. Bu noktada, deneysel zaman çizelgesine bağlı olarak protokol duraklatılabilir ve daha sonra yeniden başlatılabilir. 4. iMSCSCX+ geçiş ve genişletme Protokolün 2. adımında açıklandığı gibi, iMSC’lerde olduğu gibi iMSCSCX+ ‘ın geçişini, genişletilmesini, dondurulmasını ve çözülmesini gerçekleştirin. 5. Mekanik yükleme NOT: Bu bölüm en az 4 gün sürer ancak hücre kasılmasının gözlenip gözlenmediğine bağlı olarak daha uzun olabilir. Deney hazırlığıSilikon plakaları hazırlayın.Otoklav 2 silikon plaka (bkz. Daha sonra, steril koşullar altında, silikon plakaları otoklav torbasından çıkarın ve 150 mm’lik plakalara yerleştirin. 130 μL fibronektini (100x, Malzeme Tablosuna bakınız) 15 mL’lik konik bir tüpte 13 mL steril PBS ile birleştirin. Karıştırmak için tüpü birkaç kez ters çevirin. Silikon plakaların her bir oyuğuna 400 μL fibronektin çözeltisi ekleyin. Plakaları 37 °C’de en az 2 saat veya gece boyunca inkübe edin. Kullanmadan önce, fibronektin çözeltisini aspire edin ve fibronektin çözeltisinin tamamen buharlaşmasını sağlamak için plakaların hücre kültürü başlığında en az 30 dakika kurumasını bekleyin.NOT: Fibronektin çözeltisi önceden kuyucuklardan çıkarılabilir ve şimdi kaplanmış plakalar kullanıma kadar birkaç haftaya kadar 37 ° C’de oturabilir. MSC streç ortamını hazırlayın.15 mL’lik konik bir tüpte 14 mL önceden ısıtılmış MSC ortamına 140 μL askorbik asit (stok: 100x, nihai konsantrasyon: 50 μg/mL) ekleyerek MSC streç ortamını hazırlayın.NOT: Askorbik asit, her ortam değişikliğinden önce MSC ortamına taze olarak eklenmelidir. iMSCSCX+ ‘ın silikon plakalara tohumlanması”Standart kaldırma hücreleri protokolünü” uygulayın (adım 1.3). MSC ortamındaki hücreleri yeniden süspanse edin ve bir hemositometre veya hücre sayacı kullanarak canlı hücreleri sayın. 1.25 x 104 hücre/cm2 elde etmek için gereken hücre süspansiyonu hacmini hesaplayın. Bu hacimdeki MSC streç medyayı 15 mL konik borudan çıkarın. Hedef hücreleri ekleyin. Yeni hücre süspansiyonunu homojen hale getirin. Her iki silikon plakanın her kuyucuğuna 400 μL yeni hücre süspansiyonu ekleyin. Kapağı 150 mm’lik plakaların üzerine geri koyun ve 24 saat boyunca 37 °C’de inkübatöre geri koyun. Tek eksenli gerilimErtesi gün, germe aparatını (Malzeme Tablosuna bakınız)ddH2Ove ardından etanol ile durulayın. Cihazı silin, hücre kültürü başlığına yerleştirin ve 15 dakika UV’ye koyun. Tohumlanmış plakaları alın ve kuyucukların iyi hücre bağlantısı olup olmadığını kontrol edin. İnkübatörde bir plak bırakın (statik kontrol) ve ikinci tohumlanan silikon plağı, vidaları silikon plaktaki deliklerle hizalayarak germe aparatına yerleştirin. Steriliteyi sağlamak için aparatın kapağını değiştirin. Tohumlanmış silikon plakalı cihazı elektronik kaynağa takın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 37 °C’de inkübatöre yerleştirin. Programda, döngüsel germe protokolünü günde 2 saat% 4 sinüzoidal zorlanma, 0,5 Hz olarak ayarlayın. Başlat düğmesine bir kez basarak esnemeye başlayın. Germe hemen başlamalıdır. Hücreleri en az 3 gün gerin. Hücreleri günlük olarak izleyin ve hücre kasılması gözlemlenebiliyorsa germe protokolünü durdurun. Medyayı iki günde bir yeni MSC streç medyayla değiştirin.

Representative Results

İnsan iPSC’lerinin iMSC’lere göre farklılaşmasıDaha önce açıklandığı gibi, iPSC’leri iMSC’lere ayırmak için mevcut protokol, embriyoid cisimciklerininoluşumunu içerir 2. Bu işlem, iPSC’lerden iMSC’leri indüklemek için yaklaşık on gün sürer (Şekil 1A). Ancak, yeni oluşturulan iMSC’lerin en az iki kez geçilmesi şiddetle tavsiye edilir. Bu sadece jelatin kaplı plakalara olan ihtiyacı ortadan kaldırmaya yardımcı olmakla …

Discussion

Bu protokolde, iTenositler üç ana adımla üretilir: (1) iPSC’lerin iMSC’lere indüksiyonu, (2) bir lentiviral vektör kullanılarak SCX’in aşırı ekspresyonu ve (3) hücrelerin 2D tek eksenli gerilim yoluyla olgunlaşması.

iPSC’leri iMSC’lere ayırmak için sunulan protokol daha önce^{grubumuz 2} tarafından tanımlanmıştır. Bu yayından bu yana, iMSC’lerin klinik araştırmalarda ^21,22,23 kull…

Materials

2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Accutase	StemCell Technologies	7920	cell dissociation reagent
Antibiotic-antimycotic solution	Thermofisher	15240096
Anti-CD105	Ancell	326-050
APC mouse anti-human CD44	BD Biosciences	559942
APC mouse IgG2 K isotype control	BD Biosciences	555745
BenchMark fetal bovine serum	GeminiBio	100-106
Biglycan	Thermofisher	Hs00959143_m1
Bovine serum albumin	Millipore Sigma	A3733
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primer	Thermofisher	Hs00164004_m1
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primer	Thermofisher	Hs00943809_m1
Dimethyl sulfoxide	Millipore Sigma	D8418
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red	Thermofisher	11054020
Eagle's minimum essential medium (EMEM)	ATCC	30-2003
Fibronectin bovine plasma	Sigma Aldrich	F1141
FITC mouse anti-human CD90	BD Biosciences	555595
Gelatin from porcine skin	Sigma Aldrich	G1890
Goat anti Mouse IgG1-PE	Bio-Rad	STAR117
HEK 293T/17	ATCC	CRL-11268
IMDM, no phenol red	Thermofisher	21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1	Cedars-Sinai iPSC Core Facility	N/A	https://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITC	Miltenyi Biotec	130-113-271
KnockOut serum replacement	Thermofisher	10828010
L-ascorbic acid	Sigma Aldrich	A4544
L-Glutamine	Thermofisher	2503081
Matrigel	Corning	354230	basement membrane matrix
MechanoCulture FX	CellScale	N/A	stretching apparatus
MEM non-essential amino acids solution	Thermofisher	11140050
Mohawk human Taqman primer	Thermofisher	Hs00543190_m1
mTeSR Plus	StemCell Technologies	100-0276
PBS	Thermofisher	10010023
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primer	Thermofisher	Hs00998018_m1
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)	Sigma Aldrich	192066
Polybrene infection/transfection reagents	Millipore Sigma	TR-1003
Recombinant human  TGF-beta 1 protein human Taqman primer	RnD Systems	240-B
Scleraxis human Taqman primer	Thermofisher	Hs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF clone	OriGene	RC224305L4
Silicone plates	CellScale	N/A
Sodium azide	Millipore Sigma	S2002
Tenascin C human Taqman primer	Thermofisher	Hs00370384_m1
Tenomodulin human Taqman primer	Thermofisher	Hs00223332_m1
Thrombospondin 4 human Taqman primer	Thermofisher	Hs00170261_m1
Transfection reagent, BioT	Bioland Scientific LLC	B01-01
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermofisher	25200072
Tubulin polymerization promoting protein family member 3	Thermofisher	Hs03043892_m1
Y-27632 dihydrochloride	Biogems	1293823