Yöntem makalesi

Proteomik ve Fosfoproteomik Analizler için Biyoakışkanlardan Hücre Dışı Veziküllerin Kimyasal Afiniteye Dayalı İzolasyonu

DOI:

10.3791/65844

⸱

27 Ekim 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Purdue University, 2Tymora Analytical Operations, 3Department of Chemistry, Purdue University, 4Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut protokol, fonksiyonelleştirilmiş manyetik boncuklar kullanılarak idrar hücre dışı veziküllerin etkili izolasyonu için ayrıntılı açıklamalar sağlar. Ayrıca, western blotlama, proteomik ve fosfoproteomik dahil olmak üzere sonraki analizleri kapsar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyosıvılardan elde edilen hücre dışı veziküller (EV'ler) son zamanlarda likit biyopsi alanında önemli bir ilgi görmüştür. Hemen hemen her hücre tipi tarafından salınırlar, konakçı hücrelerin gerçek zamanlı bir görüntüsünü sağlarlar ve proteinler, özellikle fosforilasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonlara (PTM'ler) sahip olanlar da dahil olmak üzere çok sayıda moleküler bilgi içerirler. Bununla birlikte, mevcut EV izolasyon yöntemlerinden kaynaklanan düşük verim ve safsızlıklar nedeniyle EV'lerin biyoakışkanlardan izolasyonu zorlu olmaya devam etmekte ve bu da EV fosfoproteinleri gibi EV kargosunun aşağı akış analizini zorlaştırmaktadır. Burada, insan idrarı gibi biyosıvılardan EV izolasyonu için işlevselleştirilmiş manyetik boncuklara ve aşağı akış proteomiklerine ve EV izolasyonunu takiben fosfoproteomik analize dayalı hızlı ve etkili bir EV izolasyon yöntemini açıklıyoruz. Protokol, idrar EV'lerinin ve EV proteomu ve fosfoproteomunun hassas profillerinin yüksek geri kazanım verimini sağladı. Ayrıca, bu protokolün çok yönlülüğü ve ilgili teknik hususlar da burada ele alınmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı veziküller (EV'ler), tüm hücre tipleri tarafından salgılanan ve kan, idrar, tükürük vb. biyosıvılarda bulunan zar kapsüllü nanopartiküllerdir.1,2,3,4. EV'ler, konakçı hücrelerinin fizyolojik ve patolojik durumunu yansıtan çeşitli biyoaktif moleküllerden oluşan bir kargo taşır ve bu nedenle hastalığın ilerlemesinde çok önemli faktörler olarak işlev görür 4,5,6. Ayrıca, kapsamlı çalışmalar, EV tabanlı hastalık belirteçlerinin semptomların başlamasından veya tümörlerin fizyolojik tespitinden önce tanımlanabileceğini ortaya koymuştur 5,6,7.

Fosforilasyon, hücresel sinyalleşme ve düzenlemede önemli bir mekanizma görevi görür. Bu nedenle, anormal fosforilasyon olayları, düzensiz hücresel sinyal yolakları ve kansergibi metastatik hastalık gelişimi ile ilişkili olduğundan, fosfoproteinler biyobelirteç keşfi için değerli bir kaynak sağlar 8,9,10. Fosforilasyon dinamiklerinin profillenmesi, hastalığa özgü fosfoprotein imzalarının potansiyel biyobelirteçler olarak tanımlanmasına izin verse de, fosfoproteinlerin düşük bolluğu ve dinamik doğası, fosfoproteinlerin biyobelirteçler olarak geliştirilmesinde büyük zorluklar yaratmaktadır11,12. Özellikle, EV'ler içinde kapsüllenen düşük miktarda fosfoproteinler, hücre dışı ortamda harici enzimatik sindirimden korunur8. Sonuç olarak, EV'ler ve EV'den türetilen fosfoproteinler, kanser ve diğer hastalıkların erken evre tespitinde biyobelirteç keşfi için ideal bir kaynak sunar.

EV'lerde protein fosforilasyonunun analizi, kanser sinyalizasyonunu ve erken evre hastalık teşhisini anlamak için değerli bir kaynak sunsa da, etkili EV izolasyon yöntemlerinin eksikliği büyük bir engel teşkil etmektedir. EV izolasyonu genellikle diferansiyel ultrasantrifüjleme (DUC)13 ile sağlanır. Bununla birlikte, bu yöntem zaman alıcıdır ve düşük verim ve zayıf tekrarlanabilirlik nedeniyle klinik uygulamalar için uygun değildir13,14. Polimer kaynaklı çökeltme15 gibi alternatif EV izolasyon yaklaşımları, EV olmayan proteinlerin birlikte çökelmesi nedeniyle düşük özgüllük ile sınırlıdır. Antikor tabanlı afinite yakalama16 ve afinite filtrasyonu17 dahil olmak üzere afinite tabanlı yaklaşımlar, gelişmiş özgüllük sunar, ancak küçük hacim nedeniyle nispeten düşük bir geri kazanım oranıyla sınırlıdır.

EV'lerde fosfoprotein dinamiklerini keşfetmedeki sorunları ele almak için grubumuz, EV'leri işlevselleştirilmiş manyetik boncuklar18 üzerine yakalamak için kimyasal afiniteye dayalı hücre dışı veziküller toplam geri kazanım ve saflaştırma (EVtrap) tekniği geliştirmiştir. Önceki sonuçlar, bu manyetik boncuk tabanlı EV izolasyon yönteminin, çok çeşitli biyoakışkan numunelerinden EV'leri izole etmede oldukça etkili olduğunu ve DUC ve diğer mevcut izolasyon yöntemlerine kıyasla kontaminasyonu en aza indirirken çok daha yüksek EV verimi elde edebildiğini göstermiştir18,19. Çeşitli biyoakışkanlardan türetilen EV'lerin fosfoproteomunun profilini çıkarmak ve çeşitli hastalıklar için potansiyel fosfoprotein biyobelirteçlerini tespit etmek için EVtrap ve grubumuz20 tarafından geliştirilen titanyum bazlı bir fosfopeptit zenginleştirme yöntemini başarıyla kullandık 19,21,22.

Burada, dolaşımdaki EV'lerin izolasyonu için EVtrap'e dayalı bir protokol sunuyoruz. Protokol idrar EV'lerine odaklanır. Ayrıca, batı lekeleme kullanarak izole edilmiş EV'lerin karakterizasyonunu da gösteriyoruz. Daha sonra hem proteomik hem de fosfoproteomik analizler için numune hazırlama ve kütle spektrometresi (MS) alımını detaylandırıyoruz. Bu protokol, idrar EV proteomu ve fosfoproteomunun profilini çıkarmak için verimli ve tekrarlanabilir bir iş akışı sağlar, bu da EV'ler ve klinik uygulamaları hakkında daha fazla çalışmayı kolaylaştıracaktır23.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm idrar örnekleri sağlıklı bireylerden bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra toplandı. Deneyler, insan örneklerini içeren tüm etik standartlara uygundu ve Purdue Üniversitesi İnsan Araştırmaları Koruma Programı'nın yönergelerine uygundu.

1. Örnek toplama

  1. Hücre kalıntılarını ve büyük apoptotik cisimleri çıkarmak için 12 mL idrar örneğini 15 mL'lik bir konik santrifüj tüpünde 10 dakika boyunca 2.500 x g, 4 ° C'de santrifüjleyin.
  2. 10 mL süpernatanı 15 mL'lik yeni bir tüpe aktarın ve EV izolasyonuna devam edin.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir ve numuneler -80 °C'de saklanabilir ve kullanım sırasında 37 °C'de çözülebilir.

2. EVtrap yaklaşımını kullanarak EV izolasyonu

  1. Üreticinin talimatlarına göre numuneye 0,5 mL yükleme tamponu (1:10 v/v oranı) ve 100 μL EVtrap boncuk bulamacı (1:50 v/v oranı) ekleyin.
  2. Numuneyi oda sıcaklığında 30 dakika boyunca uçtan uca döndürerek inkübe edin.
  3. 15 mL'lik konik tüpü manyetik bir ayırıcı rafa yerleştirerek numuneyi peletleyin. Süpernatanı çıkarın.
  4. Boncukları 1 mL yıkama tamponunda tekrar süspanse edin ve süspansiyonu 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. EV'ye bağlı boncukları yeniden süspanse etmek için hafifçe pipetleyin.
  5. Tüpü 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpü manyetik ayırıcı rafına yerleştirin ve süpernatanı aspire edin. Süpernatanı tamamen aspire etmek için bir P200 pipeti kullanın ve boncukları aspire etmekten kaçının.
  6. Boncukları 1 mL yıkama tamponu ile yıkayın. Boncukların kurumasını önlemek için süpernatanı aspire ettikten hemen sonra tamponu ekleyin.
  7. Boncukları 2x oda sıcaklığında 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
  8. Boncukları 100 μL taze hazırlanmış 100 mM trietilamin ile oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin ve 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüp manyetik ayırıcı raf kullanarak EV'leri içeren ayrıştırılmış çözeltiyi toplayın.
    NOT: 1 mL 100 mM trietilamin hazırlamak için 14 μL trietilamin çözeltisini suda seyreltin.
  9. Adım 2.8'i tekrarlayın ve ayrıştırılan çözümleri birleştirin. Elüatı 4 °C'de bir vakumlu santrifüj yoğunlaştırıcı kullanarak kurutun.
    NOT: Deney burada duraklatılabilir. Kurutulmuş EV numuneleri, aşağıdaki adımlar veya sonuçlar üzerinde olumsuz bir etki olmaksızın birkaç ay boyunca -80 °C'de saklanabilir.

3. EV'lerin batı lekeleme ile karakterizasyonu

  1. Kurutulmuş EV örneğinin% 5'ini (idrar örneğinin 0.5 mL'sine eşdeğer) 20 μL 1x lityum dodesil sülfat (LDS) numune tamponunda 10 mM ditiyotreitol (DTT) ile yeniden süspanse edin.
    NOT: 0.5 mL idrardan EV'ler, western blotlamada CD9 (bir EV marker24) sinyalini tespit etmek için yeterlidir.
  2. Numuneyi 95 °C'de 5 dakika kaynatın. Numuneyi bir poliakrilamid jel üzerine yükleyin ve standart protokolleri25 izleyerek elektroforez ve immünoblotlama gerçekleştirin.
  3. Proteinleri düşük floresan poliviniliden florür (PVDF) membranına aktardıktan sonra, membranı oda sıcaklığında 1 saat boyunca tris-tamponlu salin ara-20 (TBST) içinde% 1 sığır serum albümini (BSA) ile bloke edin. 1 L TBST tamponu hazırlamak için 19 mM Tris bazı, 137 mM NaCl ve 1 mL Tween-20 ekleyin; HCl kullanarak pH'ı 7.4'e ayarlayın.
  4. Membranı tavşan anti-CD9 antikoru ile TBST'de% 1 BSA'da 1: 5.000 oranında 4 ° C'de gece boyunca veya oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin.
  5. Membranı 3x 5 dakika boyunca TBST ile yıkayın. Membranı, oda sıcaklığında 1 saat boyunca TBST'de% 1 BSA'da 1:5000 oranında anti-tavşan IgG, HRP'ye bağlı ikincil antikor ile inkübe edin.
  6. Membranı 3x 5 dakika boyunca TBST ile yıkayın. Ticari olarak elde edilen geliştirilmiş kemilüminesans (ECL) substratlarını (1:1 oranında) membran üzerine ekleyin ve bir kemilüminesans görüntüleme sistemindeki sinyalleri tespit edin.

4. Proteomik ve fosfoproteomik analiz için numune hazırlama

  1. 12 mM sodyum deoksikolat (SDC), 12 mM sodyum lauroil sarkozinat (SLS), 100 mM trietilamonyum bikarbonat tamponu (TEAB), 10 mM tris- (2-karboksietil) fosfin (TCEP), 40 mM kloroasetamid (CAA) ve 1x fosfataz inhibitör kokteylleri.
    NOT: Stok çözümleri, Malzeme Tablosunun açıklamasında listelenmiştir. Lizis tamponu, gerekli hacme bağlı olarak istenen konsantrasyonları elde etmek için stok çözeltileri eklenerek hazırlanır.
  2. Kurutulmuş EV örneğini 100 μL lizis tamponunda çözündürün ve örneği 1.100 rpm'de çalkalayarak 95 °C'de 10 dakika ısıtın.
  3. Numuneyi oda sıcaklığına soğuttuktan sonra, 400 μL 50 mM TEAB ekleyerek beş kat seyreltin.
  4. Üreticinin talimatlarına göre bir BCA tahlil kiti kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün. 50 mM TEAB ile beş kat seyreltilmiş lizis tamponunu boş olarak kullanın.
  5. 1:50 w/w enzim-protein oranında tripsin/Lys-C karışımı ekleyin ve numuneyi gece boyunca 37 °C'de 1.100 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.
  6. Numuneyi asitleştirmek için 50 μL %10 trifloroasetik asit (TFA) ekleyin.
  7. Numunelere 600 μL etil asetat ekleyin ve karışımı 2 dakika vorteksleyin.
  8. Numuneyi 20.000 x g'da 3 dakika santrifüjleyin ve üst tabakayı (organik tabaka) çıkarın. Aspirasyon sırasında arayüzü bozmaktan kaçının.
  9. 4.7-4.8 arasındaki adımları tekrarlayın. Bir vakumlu santrifüj yoğunlaştırıcı kullanarak sulu fazı kurutun.
  10. Peptitleri asitleştirmek için kurutulmuş numuneyi 200 μL %0.1 TFA'da yeniden süspanse edin ve üreticinin talimatlarına göre bir C18 tuz giderme ucu kullanarak numuneyi tuzdan arındırın. Ucu %80 asetonitrilde 200 μL %0,1 TFA ile koşullandırın, ardından 200 μL %0,1 TFA ile 2x uygulayın. Asitlendirilmiş peptit örneğini uca yükleyin ve ardından ucu 3x 200 μL %0.1 TFA ile yıkayın. Peptitleri% 80 asetonitril içinde 200 μL% 0.1 TFA ile elute.
  11. Bir vakumlu santrifüj yoğunlaştırıcı kullanarak elüatı kurutun. Proteomik analiz için peptit örneğinin %2'sini (idrar örneğinin 0.2 mL'sine eşdeğer) ayrı ayrı kurutun. Fosfoproteomik analiz için numunenin geri kalanını (%98) kullanın.
  12. Üreticinin talimatlarına göre bir fosfopeptit zenginleştirme kiti kullanarak numuneden fosfopeptitleri zenginleştirin. Zenginleştirme için aşağıda açıklanan adımları gerçekleştirin.
    1. Kurutulmuş numuneyi 200 μL yükleme tamponunda yeniden süspanse edin. Numuneye 50 μL boncuk ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuvvetlice çalkalayın. Numuneyi boncuklarla birlikte fritlenmiş uca yükleyin ve 100 x g'da 1 dakika santrifüjleyin.
    2. Ucu 200 μL yükleme tamponu ile yıkayın, ardından yıkama tamponu 1, ardından yıkama tamponu 2 ile yıkayın. Üç yıkama adımını da 20 x g'da 2 dakika ve 100 x g'da 1 dakika santrifüj ederek gerçekleştirin.
    3. Ayrıştırılmış fosfopeptitleri toplamak için ucu boncuklarla yeni bir tüpe koyun. Uca 50 μL elüsyon tamponu ekleyin ve 20 x g'da 2 dakika boyunca bir kez santrifüjleyin. Uca 50 μL daha elüsyon tamponu ekleyin ve 20 x g'da 2 dakika boyunca bir kez santrifüjleyin. 100 x g'da 1 dakika boyunca son bir kez santrifüjleyin.
  13. Ayrıştırılmış fosfopeptitleri bir vakumlu santrifüj yoğunlaştırıcı kullanarak kurutun.

5. LC-MS / MS analizi

NOT: Veriye bağlı edinim (DDA) gibi farklı LC-MS/MS sistemleri/ayarları ve veri toplama yöntemleri kullanılabilir.

  1. Kurutulmuş proteom/fosfoproteom numunelerini %0.1 formik asit (çözücü A) içinde yeniden süspanse edin ve numuneleri üreticinin talimatlarına göre yükleyin.
  2. Numuneleri, sıvı kromatografi (LC) sistemi aracılığıyla sıkışmış iyon hareketliliği uçuş süresi MS'ye enjekte edin ve önceden ayarlanmış standartlaştırılmış Whisper 40 numune/gün yöntemini kullanın. Peptitler, Malzeme Tablosunda belirtildiği gibi 15 cm'lik bir C18 kolonu (75 μm iç çap, 1.9 μm partikül boyutu) üzerinde ayrılır.
  3. Proteomik analiz için, rampa başına 300-1200 m/z ve 0,6-1,50 1/K0 arasında değişen bir kütle aralığı ile veriden bağımsız edinim (dia-PASEF) toplama yöntemiyle birleştirilmiş paralel bir birikim-seri parçalanma kullanarak veri elde edin ve döngü süresi 1,38 s.
  4. Fosfoproteomik analiz için, rampa başına 400-1550 m/z ve 0.6-1.50 1/K0 arasında değişen ve 1.38 s'lik bir döngü süresine sahip bir dia-PASEF toplama yöntemi kullanarak veri elde edin.
  5. Ham dosyaları proteomik yazılıma yükleyin ve kütüphaneden bağımsız veriden bağımsız bir alım iş akışı kullanarak sinyal çıkarma, tanımlama ve niceleme gerçekleştirin.
    1. Arama ayarları için Homo sapiens veritabanını, tripsin/P enzimleri içeren spesifik sindirim türlerini, 7 minimum peptit uzunluğunu, 52 maksimum peptit uzunluğunu, iki kaçırılan bölünmeyi, sabit modifikasyon olarak sisteinde karbamidometili, asetil proteini N-terimini, metiyoninde oksidasyonu ve serin, treonin ve tirozinde fosforilasyonu (fosfoproteomik analiz için) değişken modifikasyonlar olarak ve 5'i maksimum değişken modifikasyonlar olarak kullanın. PSM, peptit ve protein grubundaki FDR'yi 0.01'e ayarlayın.
      NOT: Bu protokolde Spectronaut yazılımı kullanılmıştır. DIA-NN ve PEAKS gibi diğer DIA veri arama yazılımları da yaygın olarak kullanılmaktadır. Veriler DDA modunda alınmışsa, MaxQuant ve Proteome Discoverer gibi yazılımlar uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, EV'lerin izolasyonundan aşağı akış proteomik ve fosfoproteomik analizlerine kadar kapsamlı bir iş akışı göstermektedir (Şekil 1). Üçlü idrar örnekleri EV izolasyonuna tabi tutuldu. İzole edilen EV'ler, batı lekeleme ile karakterize edildi ve daha sonra protein ekstraksiyonu, enzimatik sindirim ve peptit temizliği dahil olmak üzere kütle spektrometrisi tabanlı proteomik numune hazırlama için işlendi. Fosfoproteomik analiz için, fosfopeptitler, metal iyonu ile işlevselleştirilmiş ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etkili EV izolasyonu, EV'lerde düşük miktarda bulunan proteinleri ve fosfoproteinleri tespit etmek için temel bir ön koşuldur. Bu ihtiyacı karşılamak için çok sayıda yöntemin geliştirilmesine rağmen, çoğunluk hala büyük ölçekli çalışmalarda ve rutin klinik ortamlarda kullanımlarını engelleyen zayıf iyileşme veya düşük tekrarlanabilirlik gibi sınırlamalardan muzdariptir. DUC genellikle EV izolasyonu için en yaygın yöntem olarak kabul edilir ve hedef EV'lerin saflığını artırmaya yardımcı olmak için normal olarak ek yıkama ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rekabet eden bir finansal çıkar beyan ederler. Anton Iliuk ve W. Andy Tao, EVtrap boncukları geliştiren ve PolyMAC fosfopeptit zenginleştirme kitini ticarileştiren Tymora Analytical Operations'ın kurucu ortaklarıdır.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma kısmen NIH hibeleri 3RF1AG064250 ve R44CA239845 tarafından finanse edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,5 mL mikrosantrifüj tüpüYaşam Bilimleri ÜrünleriM-1700C-LB
1,5 mL tüp manyetik ayırıcı rafSergi Lab Malzemeleri1005
15 mL konik santrifüj tüpüCorning 
15 mL tüp manyetik ayırıcı rafSergi Lab Malzemeleri1002
Anti-tavşan IgG, HRP'ye bağlı AntikorHücre Sinyalizasyon Teknolojisi7074P2
Tezgah üstü inkübe çalkalayıcıBioerDIS-87999-3367802Bioer Termocell Karıştırma Bloğu MB-101
CD9 (D3H4P) Tavşan mAbHücre Sinyalizasyon Teknolojisi13403S
KloroasetamidSigma -AldrichC0267-100Gİndirgenmiş sülfür gruplarının alkilasyonu için kullanılır. Stok çözelti olarak 400 mM suda taze olarak hazırlayın.
Etil asetat Fisher Bilimsel E145-4Deterjanları çökeltir
Evosep One EvosepSıvı kromatografi sistemi
EvotipsEvosepEV2013Evosep One sistemi için numune yükleme 
EVtrapTymora AnalitikFonksiyonelleştirilmiş manyetik boncuklar, yükleme tamponu ve yıkama tamponu 
Immobilon-FL PVDF Membran Sigma-AldrichIPFL00010Kurutma membranı 
NuPAGE %4-12 Bis-Tris JelİnvitrojenNP0322BOXInvitrogen NuPAGE %4 ila %12, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Jel, 12 kuyulu
NuPAGE LDS Numune Tamponu (4X)InvitrogenNP0007
PBSThermoFisher10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9Bruker 1893473Ayırma sütunu 
Fosfataz İnhibitörü Kokteyli 2Sigma -AldrichP5726-5ML100X, Fosfotaz inhibitörü.
Fosfataz İnhibitörü Kokteyli 3Sigma -AldrichP0044-1ML100X,  Fosfotaz inhibitörü. 
Pierce BCA Protein Test KitiThermoFisher23225
Pierce ECL Western Blotting SubstratıThermoFisher32106HRP substratı 
PolyMAC fosfopeptit zenginleştirme kitiTymora AnalitikFosfopeptit zenginleştirme için polimer bazlı metal iyon afinite yakalama (PolyMAC)
Sodyum deoksikolat Sigma -AldrichD6750-10GDeterjan. Stok çözelti olarak 120 mM su hazırlayın.
Sodyum lauroil sarkosinat ve nbsp;Sigma -AldrichL9150-50GDeterjan. Stok çözelti olarak 120 mM su hazırlayın.
timsTOF HTBrukerSıkışmış iyon hareketliliği uçuş zamanı kütle spektrometresi
TopTip C-18 (10-200 & mu; L) ipuçları GlygenTT2C18.96Tuzdan arındırma yöntemi
TrietilaminSigma -Aldrich471283-100MLEV elüsyonu için.
Trietilamonyum bicabonat tamponuSigma -AldrichT7408-100ML1 M
Trifloroasetik asitSigma -Aldrich302031-100ML
Tris- (2-karboksietil) fosfin hidroklorürSigma -AldrichC4706Disülfid bağlarının azaltılması için kullanılır. Stok çözelti olarak 200 mM su hazırlayın. Stok çözeltisini küçük hacimli hale getirin ve -20 ° C'de saklayın; C (birden fazla donma-çözülme döngüsünden kaçının).
Tripsin/Lys-C KARIŞIMIThermoFisherPIA41007
352097Lizis tamponu için Lizis tamponu için

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Maacha, S., et al. Extracellular vesicles-mediated intercellular communication: roles in the tumor microenvironment and anti-cancer drug resistance. Mol Cancer. 18 (1), 55(2019).
  3. van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
  4. Becker, A., et al. extracellular vesicles in cancer: cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
  5. Bebelman, M. P., Smit, M. J., Pegtel, D. M., Baglio, S. R. Biogenesis and function of extracellular vesicles in cancer. Pharmacol Ther. 188, 1-11 (2018).
  6. Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. Am J Physiol Cell Physiol. 318 (1), C29-C39 (2020).
  7. Chang, W. H., Cerione, R. A., Antonyak, M. A. Extracellular Vesicles and Their Roles in Cancer Progression. Methods Mol Biol. 2174, 143-170 (2021).
  8. Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), 3175-3180 (2017).
  9. Harsha, H. C., Pandey, A. Phosphoproteomics in cancer. Mol Oncol. 4 (6), 482-495 (2010).
  10. Singh, V., et al. Phosphorylation: Implications in Cancer. Protein J. 36 (1), 1-6 (2017).
  11. Delom, F., Chevet, E. Phosphoprotein analysis: from proteins to proteomes. Proteome Sci. 4, 15(2006).
  12. Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Analytical strategies for phosphoproteomics. Proteomics. 9 (6), 1451-1468 (2009).
  13. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  14. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  15. Zeringer, E., et al. Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes. World J Methodol. 3 (1), 11-18 (2013).
  16. Mathivanan, S., et al. Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature. Mol Cell Proteomics. 9 (2), 197-208 (2010).
  17. Enderle, D., et al. Characterization of RNA from exosomes and other extracellular vesicles isolated by a novel spin column-based method. PLoS ONE. 10 (8), e0136133(2015).
  18. Wu, X., Li, L., Iliuk, A., Tao, W. A. Highly Efficient Phosphoproteome Capture and Analysis from Urinary Extracellular Vesicles. J Proteome Res. 17 (9), 3308-3316 (2018).
  19. Iliuk, A., et al. Plasma-derived extracellular vesicle phosphoproteomics through chemical affinity purification. J Proteome Res. 19 (7), 2563-2574 (2020).
  20. Iliuk, A. B., Martin, V. A., Alicie, B. M., Geahlen, R. L., Tao, W. A. In-depth analyses of kinase-dependent tyrosine phosphoproteomes based on metal ion-functionalized soluble nanopolymers. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2162-2172 (2010).
  21. Hadisurya, M., et al. Quantitative proteomics and phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles define diagnostic and prognostic biosignatures for Parkinson’s Disease. Commun Med. 3 (1), 64(2023).
  22. Hadisurya, M., et al. Data-independent acquisition phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles enables renal cell carcinoma grade differentiation. Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100536(2023).
  23. Wu, X., Liu, Y. K., Iliuk, A. B., Tao, W. A. Mass spectrometry-based phosphoproteomics in clinical applications. Trends Analyt Chem. 163, 117066(2023).
  24. Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nat Commun. 12 (1), 4389(2021).
  25. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  26. Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A web-based compendium of exosomal cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
  27. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (22), (2006).
  28. Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319(2015).
  29. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Res Int. 2018, (2018).
  30. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  31. Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. Sample preparation for relative quantitation of proteins using tandem mass tags (TMT) and mass spectrometry (MS). Methods Mol Biol. 1741, 135-149 (2018).
  32. Charles Jacob, H. K., et al. Identification of novel early pancreatic cancer biomarkers KIF5B and SFRP2 from “first contact” interactions in the tumor microenvironment. J Exp Clinl Cancer Res. 41 (1), 258(2022).
  33. Nunez Lopez, Y. O., et al. Extracellular vesicle proteomics and phosphoproteomics identify pathways for increased risk in patients hospitalized with COVID-19 and type 2 diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract. 197, 110565(2023).
  34. Hinzman, C. P., et al. A multi-omics approach identifies pancreatic cancer cell extracellular vesicles as mediators of the unfolded protein response in normal pancreatic epithelial cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12232(2022).
  35. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).
  36. Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Sci Rep. 6, 22519(2016).
  37. Searle, B. C., et al. Generating high quality libraries for DIA MS with empirically corrected peptide predictions. Nat Commun. 11 (1), 1548(2020).
  38. Skowronek, P., et al. Rapid and in-depth coverage of the (Phospho-)proteome with deep libraries and optimal window design for dia-PASEF. Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100279(2022).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Extracellular VesiclesEV IsolationBiofluid ProteomicsPhosphoproteomics AnalysisMagnetic Bead IsolationUrinary EVsLiquid BiopsyMass SpectrometryPhosphopeptide EnrichmentPost Translational Modifications

İlgili makaleler