Yöntem makalesi

Ex vivo Drosophila larva beynindeki monokarboksilatların ve diğer ilgili metabolitlerin genetik olarak kodlanmış sensörler kullanılarak görselleştirilmesi

1.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/65846

⸱

27 Ekim 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Neuroscience Institute, Universidad de Chile, 2Advanced Scientific Equipment Network (REDECA), Faculty of Medicine, Universidad de Chile, 3Department of Neuroscience, Faculty of Medicine, Universidad de Chile

Bu makalede

Özet

Burada, ex-vivo Drosophila larva beyin preparatında genetik olarak kodlanmış Förster rezonans enerji transferi tabanlı sensörler kullanarak glial hücrelerde ve nöronlarda monokarboksilatların, glikozun ve ATP'nin taşınmasını görselleştirmek için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Elektriksel aktiviteye bağlı olarak beyinlerin yüksek enerji gereksinimleri en ayırt edici özelliklerinden biridir. Bu gereksinimler, glikozdan ve monokarboksilatlar laktat ve piruvat gibi metabolitlerinden ATP üretimi ile karşılanır. Bu sürecin nasıl düzenlendiği veya özellikle Drosophila'daki kilit oyuncuların kim olduğu hala belirsiz.

Genetik olarak kodlanmış Förster rezonans enerji transferi tabanlı sensörleri kullanarak, ex-vivo Drosophila larva beyin preparatında glial hücrelerde ve nöronlarda monokarboksilatların ve glikozun taşınmasını ölçmek için basit bir yöntem sunuyoruz. Protokol, sensörlerden birini bir cam lamele ifade eden bir larva beyninin nasıl kesileceğini ve yapıştırılacağını açıklar.

Glial hücrelerde daha önce tanımlanmış monokarboksilat taşıyıcılarını yıkarak larva beyinlerinde laktat taşınımının ölçüldüğü bütün bir deneyin sonuçlarını sunuyoruz. Ayrıca, nöronal aktivitenin nasıl hızla artırılacağını ve aktif beyindeki metabolit değişikliklerinin nasıl izleneceğini gösteriyoruz. Gerekli tüm bilgileri sağlayan tarif edilen yöntem, diğer Drosophila canlı dokularını analiz etmek için kullanılabilir.

Giriş

Beyin, nöronal elektrik sinyali üretimi ve iletiminin yanı sıra sinaptik iletimin neden olduğu nöronlardaki iyon gradyanlarını geri yüklemenin yüksek maliyeti nedeniyle yüksek enerji gereksinimlerine sahiptir 1,2. Bu yüksek enerji talebinin uzun zamandır ATP3 üretmek için glikozun sürekli oksidasyonu ile karşılandığı düşünülüyordu. Kan-beyin bariyerindeki spesifik taşıyıcılar, kandaki glikozu beyne aktarır. Sabit glisemik seviyeler, beynin sabit bir glikoz kaynağı almasını sağlar4. İlginç bir şekilde, artan deneysel kanıtlar, laktat ve piruvat gibi glikoz metabolizmasından türetilen moleküllerin beyin hücrelerinin enerji üretiminde önemli bir rol oynadığını göstermektedir 5,6. Bununla birlikte, bu moleküllerin enerji üretimi için ne kadar önemli olduğu ve beyindeki hangi hücrelerin bunları ürettiği veya kullandığı konusunda hala bazı tartışmalar vardır 7,8. Bu görev için gerekli olan yüksek zamansal ve uzamsal çözünürlüğe sahip uygun moleküler araçların eksikliği, bu tartışmanın tamamen çözülmesini engelleyen önemli bir konudur.

Birkaç tasarlanmış floresan metabolik sensörün geliştirilmesi ve uygulanması, metabolitlerin nerede ve nasıl üretildiği ve kullanıldığı ile metabolik akışların bazal ve yüksek nöronal aktivite sırasında nasıl oluştuğuna dair anlayışımızda dikkate değer bir artışa neden olmuştur9. ATeam (ATP), FLII12Pglu700μδ6 (glikoz), Laconic (laktat) ve Pyronic (piruvat) gibi Förster rezonans enerji transferi (FRET) mikroskobuna dayalı genetik olarak kodlanmış metabolik sensörler, beyin enerji metabolizmasını anlamamıza katkıda bulunmuştur 10,11,12,13. Bununla birlikte, canlı hayvanlar veya dokular üzerinde deney yapmak için gereken yüksek maliyetler ve karmaşık ekipman nedeniyle, omurgalı modellerindeki sonuçlar hala öncelikle hücre kültürleriyle (glial hücreler ve nöronlar) sınırlıdır.

Bu sensörleri ifade etmek için Drosophila modelinin ortaya çıkan kullanımı, temel metabolik özelliklerin türler arasında korunduğunu ve işlevlerinin bu araçla kolayca ele alınabileceğini ortaya koymuştur. Daha da önemlisi, Drosophila modeli, glikoz ve laktat/piruvatın sinek beyninde nasıl taşındığına ve metabolize edildiğine, monokarboksilat tüketimi ile hafıza oluşumu arasındaki bağlantıya ve nöral aktivite ve metabolik akıştaki artışların nasıl örtüştüğünün dikkate değer gösterimine ışık tutmuştur 14,15,16,17 . Larva beyninde ifade edilen genetik olarak kodlanmış FRET sensörlerini kullanarak monokarboksilat, glikoz ve ATP seviyelerini ölçmek için burada sunulan yöntem, araştırmacıların Drosophila'nın beyninin diğer hayvanların beyinlerine uygulanabilecek enerjiyi nasıl kullandığı hakkında daha fazla bilgi edinmelerini sağlar.

Bu yöntemin glial hücrelerde ve nöronlarda laktat ve glikozu tespit etmede etkili olduğunu ve bir monokarboksilat taşıyıcısının (Chaski) glial hücrelere laktat ithalatında rol oynadığını gösterdik. Ayrıca, bir GABAA reseptör antagonistinin banyo uygulamasıyla kolayca indüklenebilen, artan nöronal aktivite sırasında metabolit değişikliklerini incelemek için basit bir yöntem gösteriyoruz. Son olarak, bu metodolojinin, yağ cisimleri gibi diğer metabolik olarak önemli dokularda monokarboksilat ve glikoz taşınmasını ölçmek için kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Sinek suşu bakımı ve larva senkronizasyonu

  1. Bu deneyleri gerçekleştirmek için, %10 maya, %8 glikoz, %5 buğday unu, %1,1 agar, %0,6 propiyonik asit ve %1,5 metilparabenden oluşan standart Drosophila gıdalarında 25 °C'de yetiştirilen sinek kültürlerini kullanın.
  2. Bu protokolü takip etmek için aşağıdaki satırları kullanın: w1118 (deneysel kontrol arka planı), OK6-GAL4 (motor nöronlar için sürücü), repo-GAL4 (tüm glial hücreler için sürücü), CG-GAL4 (yağ cisimleri için sürücü), UAS-Pyronic (piruvat sensörü), UAS-FLII12Pglu700μδ6 (glikoz sensörü), UAS-Laconic (laktat sensörü), UAS-GCaMP6f (kalsiyum sensörü), UAS-AT1.03NL (ATP sensörü) ve UAS-Chk RNAi GD1829. Sensörleri veya RNAi'yi ifade eden tüm çizgiler w1118 genetik arka planındadır.
  3. Senkronize üçüncü instar dolaşan larvaları elde etmek için, fosfat tamponlu salin çözeltisinde (PBS) %1 agaroz ile kaplı 60 mm'lik bir Petri kabı içeren yumurtlama odasına istenen genetik çaprazlamanın 300 sineğini (3-5 günlük, 100 erkek, 200 bakire dişi) yerleştirin. Sinekleri yumurtlamaya teşvik etmek için plağın ortasına bir damla sıvı/kremsi maya (1,5 cm çapında) koyun (Şekil 1).
  4. Sinekleri 3 gün boyunca 25 °C'de tutun, agaroz Petri kabını günde iki kez taze bir tane ve taze çözünmüş maya ile değiştirin.
  5. Petri kabını değiştirmeden önce sineklerin dördüncü günde 4 saat yumurtlamasına izin verin. Bu plakayı çıkarın. Daha sonra, 3 saat boyunca, sineklerin taze çözünmüş maya ile yeni bir agaroz plağına yumurta bırakmasına izin verin. Bu larvaları deneylerde kullanın.
  6. 3 saat sonra, yumurtaları içeren plağı çıkarın ve 24 saat boyunca 25 ° C'lik bir inkübatöre koyun.
  7. Bu plaktan 50 ila 100 yeni yumurtadan çıkmış larva toplayın (larva yumurtadan çıktıktan 0 saat sonra) ve bunları standart yiyecek içeren plastik bir şişeye koyun. Larvaların düzgün beslenmesini sağlamak için yiyeceğin öğütülmüş ve yumuşak olduğundan emin olun. Transferden 96 saat sonra larvaları kullanın.

2. Cam lameller poli-L-lizin ile yapın

  1. Bu adımı larva diseksiyonundan 1 saat önce gerçekleştirin. 6 oyuklu bir hücre kültürü plakasına 25 mm'lik cam lameller yerleştirin (kullanılacak kapakların çapı mikroskopta bulunan kayıt odasına bağlıdır).
  2. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca her lamellerin ortasına bir damla (300 μL) poli-L-lizin koyun.
  3. Her lamel 3x'i damıtılmış suyla, ardından 2x'i Ca2+ içermeyen bir tuzlu su çözeltisiyle yıkayın (larvaları incelemek için kullanılan aynı çözelti, bkz. adım 3.2). Kapakları kayıt odasına takın ve Ca2+ içermeyen salin solüsyonu ile doldurun.
    NOT: Larva beyni doğrudan cam lamellere yapışabilse de, yapışma zayıftır ve beyin, sürekli salin çözeltisi akışı nedeniyle deney sırasında zaman zaman hareket eder veya yer değiştirir. Poli-L-lizin adımının eklenmesi, yıkamaların bir sonucu olarak hareket riskini ve hatta beyin kaybını azaltır.

3. Ventral sinir kordonunu (VNC) ve yağ cisimciklerini (FB'ler) inceleyin

  1. Dolaşan üçüncü instar larvalarını istenen genetik çaprazlamadan (adım 1.7'den itibaren) toplayın ve 3 kez damıtılmış suyla iyice yıkayın.
  2. Larvaları, 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 4 mM MgCl2, 5 mM trehaloz, 5 mM HEPES ve 35 mM sükrozdan oluşan 750 μL nominal olarak sıfır Ca2+ buz gibi soğuk salin solüsyonu içeren bir cam diseksiyon kabına yerleştirin (pH = 6.7, bir pH metre ile ölçülür ve 1 M NaOH ve HCl% 37 v / v ile ayarlanır).
    NOT: pH'ın 6.7'ye ayarlanması çok önemlidir, çünkü daha önce gözlemlendiği gibi, monokarboksilat taşınması büyük ölçüde çözeltinin pH'ına bağlıdır. Ek olarak, 6.7, üçüncü bir instar larvasının hemolenfindeki pH'akarşılık gelir 17,18.
  3. Larvaları bir stereomikroskop altına yerleştirin ve bir çift forseps ile karnın arkasından enine bir kesim yapın.
  4. Larvaları ters çevirirken çeneyi forseps ile itin.
  5. Çenenin yanındaki ventral sinir kordonunu (VNC) gözlemleyin. Hayali diskleri ve kalan beyin kaudal dokularını dikkatlice çıkarın.
  6. Sinirleri keserek VNC'yi merkezi beyin ve optik loblarla dokunun geri kalanından ayırın. VNC'yi aktarın, kalan sinirlerden forseps ile alın ve Ca2+ içermeyen kayıt solüsyonunu içeren kayıt odasına yerleştirin (adım 3.2'deki aynı solüsyon). VNC'ler hemen lamellere yapışacaktır.
  7. Kalan sinirlerin karışmasını önlemek için, bunları forseps kullanarak lamel altına takın (kullanılan sürücü hattına bağlı olarak sinirler de floresan olacaktır) (Şekil 2).
  8. Başka bir deney setinde glikoz veya monokarboksilat taşınmasını ölçen yağ cisimciklerinde (FB'ler) deneyler yapmak için, 3.1-3.4 adımlarını izleyerek dokuları izole etmeye devam edin. Larvalar ters çevrildiğinde, FB'nin beyaz, iki taraflı, düz bir doku olduğunu gözlemleyin.
  9. FRET sensörlerini (uygun sürücüler kullanılarak genetik bir çaprazlamadan elde edilen) eksprese eden izole edilmiş FB'leri, Ca2+ olmadan kayıt solüsyonunu içeren kayıt odasına yerleştirin.
    NOT: FB oldukça hidrofobiktir (çözeltinin yüzeyinde yüzmeye meyillidir) ve forseps ile manipülasyona karşı son derece savunmasızdır, dikkatli kullanılmalıdır. Bu dokunun herhangi bir kaba kullanımı, daha sonra ölü hücrelere neden olacaktır (sensörlerin floresansının azalmasıyla).
  10. VNC'leri/FB'leri içeren kayıt odasını mikroskop tablasına yerleştirin.

4. Canlı hücre görüntüleme

  1. Doku eksprese eden sensörlerin görüntülerini elde etmek için, bir emisyon bölme sistemine ve bir CCD kameraya bağlı dik bir floresan mikroskobu kullanın. Herhangi bir deneye başlamadan 30 dakika önce mikroskobun aydınlatma sistemini açın.
    NOT: Burada hem VNC'leri hem de FB'leri gözlemlemek için 20x/0.5 suya daldırma objektifi ile donatılmış bir Dönen Disk floresan mikroskobu kullanıyoruz. Şekil 2 ayrıca 40x/0.8 suya daldırma objektifinin kullanımını göstermektedir.
  2. GCaMP6f floresansını görselleştirmek için, uyarma ve emisyon dalga boylarını sırasıyla 488 nm ve 540 nm'ye ayarlayın. Laconic/Pironik/ATP/glikoz sensörleri için uyarma dalga boyunu 440 nm'ye ve emisyon dalga boylarını 488 nm (mTFP, CFP) ve 540 nm'ye (Venüs, YFP) ayarlayın.
  3. GCaMP6f için her 2 saniyede bir ve Laconic/Pironik/ATP/glikoz sensörleri için her 10-30 saniyede bir 512 x 512 piksel boyutunda görüntüler elde edin. Elde edilen görüntünün kalitesini gözlemleyerek ışık kaynağına en uygun pozlamayı belirleyin. Bu protokolü takip etmek için, görüntülerin Laconic ve Pyronic sensörler için 300 ms ve glikoz ve ATP sensörleri için 100-150 ms pozlama olduğundan emin olun.
    NOT: Maruziyet, konfokal veya normal floresan mikroskobunun kullanımına bağlı olarak değişebilir.
  4. Kayıt odası mikroskop aşamasına yerleştirildikten sonra, suya daldırma objektifini dikkatlice yerleştirin ve objektifin deney boyunca su altında kaldığından emin olun. Oda sıcaklığını 25 °C'de tutun.
  5. Kayıt odasını bir perfüzyon sistemine bağlayın ve dokuları 128 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.5 mM CaCl2, 4 mM MgCl2, 5 mM trehaloz, 5 mM HEPES ve 35 mM sükroz, pH 6.7 (pH metre ile ölçülmüş ve NaOH ve HCl ile ayarlanmış) içeren kayıt solüsyonunda yıkayın.
  6. Hacmi sabit tutarken sıvıyı hazneden çıkarmak için düşük akı peristaltik pompaya bağlı olarak yerçekimi kullanarak doku boyunca 3 mL / dak kayıt çözeltisinin sabit akışını sağlayın. Gerekli akışı elde etmek için, çözelti içeren tüpleri (50 mL plastik tüpler) mikroskop tablasının 25 cm yukarısına yerleştirin.
    NOT: Bu yerçekimi güdümlü akış, peristaltik pompaların neden olduğu doku hareketini önlemek için kullanılır ve daha sonra daha doğru görüntü analizine olanak tanır.
  7. Herhangi bir stimülasyondan önce, sensörlerden sabit bir floresan taban çizgisi elde etmek için kayıt solüsyonunun 5-10 dakika akmasını sağlayın. Bu temeli elde etmek için süreyi gerektiği gibi değiştirin.
  8. VNC / FB'leri uyarmak için akan çözeltiyi 5 dakika boyunca stimülasyon çözeltisiyle değiştirin (salin çözeltisi içinde çözülen her deney için açıklanan konsantrasyonda glikoz, piruvat veya laktat ile; her şekle bakın).
    NOT: Stimülasyon süresi, deneyin ihtiyaçlarına göre değiştirilebilir (örneğin, daha önce bildirildiği gibi, nöronlarda bir platoya ulaşmak için glikoz darbeleri 10 dakikaya çıkarılabilir16).
  9. Stimülasyon çözeltisinde ozmolariteyi korumak için, eklenen monokarboksilat veya glikoz konsantrasyonuna göre sükroz konsantrasyonunu ( Drosophila beyni tarafından metabolize edilemeyen bir karbonhidrat) düzeltin.
  10. Basit bir vana sistemi kullanarak çözümleri değiştirin. Mikroskop tablasını hareket ettirmemeye dikkat edin.
  11. Nöronal aktiviteyi uyarmak için VNC'yi 80 μM pikrotoksine (PTX, sürekli akan) maruz bırakın. Bu prosedür,Ca2+ salınımlarının sıklığını arttırır ve metabolik olarak ilgili moleküllerdeki (örneğin, hücre içi ATP) değişiklikleri gözlemlemeyi mümkün kılar.
  12. Herhangi bir deneyin sonunda, tüpler ve kayıt odası da dahil olmak üzere tüm akış sistemini, kullanılan çözeltilerin izini ortadan kaldırmak için en az 10 dakika tuzlu su çözeltisi ve 10 dakika daha damıtılmış su ile iyice yıkayın.

5. Görüntü işleme ve veri analizi

  1. Elde edilen görüntüleri işlemek için Şekil 3'te gösterilen adımları izleyin.
  2. Görüntüyü (Laconic) ImageJ yazılımına aktarın. Görüntü, örneğin iki görünümüne sahiptir: soldaki mTFP sinyali ve sağdaki Venüs sinyalidir. Analiz edilecek hücreleri içeren bir bölge seçin ve bu görüntüleri (mTFP ve Venüs) yeni bir pencerede ayırın. Bu görüntülerin tam olarak aynı alanı içerdiğinden emin olun.
  3. Kayıt eklentisini açın ve normalde deneyde gözlemlenen dokunun küçük kaymasını sert gövde işleviyle düzeltin. Bunu her iki görüntüde de (mTFP ve Venüs) gerçekleştirin.
  4. mTFP sinyalindeki (488 nm) karşılık gelen 10 hücrenin sitozolünde en az 10 ilgi bölgesi (ROI) seçin ve seçimleri Venüs (540 nm) görüntüsüne aktarın.
  5. Analiz edilen hücrelere yakın, ancak fark edilebilir bir sinyal olmayan iki veya üç ROI seçin (her zaman VNC veya analiz edilen doku içinde, bkz. Şekil 3). Bunlar arka plan yatırım getirileridir.
  6. Her iki görüntüde de ROI'ler seçiliyken, fonksiyon ölçümünü kullanarak her sinyalin ortalama gri değerini elde edin. Verileri bir veri sayfasına aktarın ve her sinyal için ortalama arka plan değerini çıkarın.
  7. Venüs üzerindeki mTFP floresan oranını belirleyin (Laconic ve Pyronic için). Bu değer, burada açıklanan diğer FRET sensörlerinden farklı şekilde hesaplanır (burada oran genellikle YFP/CFP'dir), çünkü ilgili alt tabakalarına bağlandığında hem Laconic hem de Pyronic FRET verimliliklerini azaltır.
  8. Kaydedilen her değeri taban çizgisine bölerek verileri normalleştirin. Ayrı bir veri sayfasında, uyarandan önceki 2 dakika boyunca mTFP/Venüs oranının ortalama değerini alarak taban çizgisini hesaplayın.
  9. FRET tabanlı sensörler kullanan glikoz ve ATP ölçümleri için YFP/CFP oranını hesaplayın ve verileri adım 5.8'de açıklandığı gibi normalleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

1 saate kadar bu prosedür, monokarboksilat ve glikoz sensörlerinin floresansındaki hücre içi değişikliklerin kolayca ölçülmesini sağlar. Şekil 4'te gösterildiği gibi, hem glial hücrelerdeki hem de motor nöronlardaki Lakonik sensörler, nabzın başlangıcında benzer bir oranda 1 mM laktata yanıt verir, ancak motor nöronlar, daha önce gösterildiği gibi, 5 dakikalık nabız sırasında taban çizgisi üzerinde daha yüksek bir artışa ulaşır17. Bu laktat konsantrasyonu, üçüncü inst...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Beyin metabolizmasının incelenmesi için Drosophila modelinin kullanımı nispeten yenidir26 ve memeli metabolizması ile beklenenden daha fazla özelliği paylaştığı gösterilmiştir, bu da öncelikle birincil nöron kültürlerinde veya beyin dilimlerinde in vitro olarak incelenmiştir. Drosophila , araştırmacıların indüklenen aktivitenin neden olduğu metabolik değişiklikleri gerçek zamanlı olarak görselleştirmelerine veya hatta duyusal bir uyarana yanıt olarak genetik araçlar ve g...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir rakip veya finansal çıkar beyan etmezler.

Teşekkürler

Sierralta Lab'ın tüm üyelerine teşekkür ederiz. Bu çalışma FONDECYT-Iniciación 11200477 (AGG'ye) ve FONDECYT Regular 1210586 (JS'ye) tarafından desteklenmiştir. UAS-FLII12Pglu700μδ6 (glikoz sensörü), CNRS-Paris'ten Pierre-Yves Plaçais ve Thomas Preat tarafından bağışlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AgaroseSigmaA9539
CaCl2SigmaC3881
CCD Kamera ORCA-R2Hamamatsu-Cell-R
Yazılımı
Bloomington Drosophila Stok Merkezi7011Şişman vücut sürücüsü
Dumont # 5 ForsepsGüzel Bilimler Araçları11252-30
DV2 emisyon bölme sistemiFotometrik-Cam
lameller (25 mm çap)Marienfeld111650Almanya
GlucoseSigmaG8270
GraphPad PrismGraphPad YazılımSürümü 8,0,2
HEPESSigmaH3375
ImageJ yazılımıUlusal Sağlık EnstitüleriSürüm 1,53t
KClSigmaP9541
LUMPlanFl 40x/0.8 suya daldırma objektifiOlympus-Methylparaben
SigmaH5501
MgCl2SigmaM1028
NaClSigmaS7653
OK6-GAL4Bloomington Drosophila Stok MerkeziMotor nöron sürücüsü
PikrotoksinSigmaP1675SDİKKAT-Yutulduğunda ölümcül
Poli-L-lizinSigmaP4707
Propiyonik AsitSigmaP1386
Repo-GAL4Bloomington Drosophila Stok Merkezi7415Glial hücre sürücüsü (tümü)
Sodyum LaktatSigma71718
Sodyum piruvatSigmaP2256
İplik Diski floresan Mikroskobu BX61WIOlympus-Sükroz
SigmaS0389
TrehalozABD BiyolojikT8270
UAS-AT1.03NL Kyoto Drosophila Stok Merkezi117012ATP sensörü
UAS-Chk RNAi GD1829Viyana Drosophila Kaynak Merkeziv37139Chk RNAi hattı
UAS-FLII12Pglu700md6 Bloomington Drosophila Stok Merkezi93452Glikoz sensörü
UAS-GCaMP6f Bloomington Drosophila Stok Merkezi42747Kalsiyum sensörü
UAS-LaconicSierraltaLab-Laktat sensörü
UAS-PyronicPierre Yves Placais/Thomas Preat-CNRS-Paris
UMPlanFl 20x/0.5 suya daldırma objektifiOlympus-
Olympus-CG-GAL4

Kaynaklar

  1. Vergara, R. C., et al. The energy homeostasis principle: neuronal energy regulation drives local network dynamics generating behavior. Frontiers in Computational Neuroscience. 13 (49), 1-18 (2019).
  2. Pulido, C., Ryan, T. A. Synaptic vesicle pools are a major hidden resting metabolic burden of nerve terminals. Science Advances. 7 (49), 1-9 (2021).
  3. Benton, D., Parker, P. Y., Donohoe, R. T. The supply of glucose to the brain and cognitive functioning. Journal of Biosocial Science. 28 (4), 463-479 (1996).
  4. Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function. Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).
  5. Boumezbeur, F., et al. The contribution of blood lactate to brain energy metabolism in humans measured by dynamic 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy. The Journal of Neuroscience. 30 (42), 13983-13991 (2010).
  6. Baltan, S. Can lactate serve as an energy substrate for axons in good times and in bad, in sickness and in health. Metabolic Brain Disease. 30 (1), 25-30 (2015).
  7. Barros, L. F., Weber, B. CrossTalk proposal: an important astrocyte-to-neuron lactate shuttle couples neuronal activity to glucose utilization in the brain. The Journal of Physiology. 596 (3), 347-350 (2018).
  8. Yellen, G. Fueling thought: Management of glycolysis and oxidative phosphorylation in neuronal metabolism. The Journal of Cell Biology. 217 (7), 2235-2246 (2018).
  9. Koveal, D., Diaz-Garcia, C. M., Yellen, G. Fluorescent biosensors for neuronal metabolism and the challenges of quantitation. Current Opinion in Neurobiology. 63, 111-121 (2020).
  10. Imamura, H., et al. Visualization of ATP levels inside single living cells with fluorescence resonance energy transfer-based genetically encoded indicators. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15651-15656 (2009).
  11. Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochimica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).
  12. San Martin, A., et al. A genetically encoded FRET lactate sensor and its use to detect the Warburg effect in single cancer cells. PloS One. 8 (2), 1-13 (2013).
  13. San Martin, A., et al. Imaging mitochondrial flux in single cells with a FRET sensor for pyruvate. PloS One. 9 (1), 1-9 (2014).
  14. Placais, P. Y., et al. Upregulated energy metabolism in the Drosophila mushroom body is the trigger for long-term memory. Nature Communications. 8, 1-14 (2017).
  15. Mann, K., Deny, S., Ganguli, S., Clandinin, T. R. Coupling of activity, metabolism and behaviour across the Drosophila brain. Nature. 593 (7858), 244-248 (2021).
  16. Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain. Journal of Insect Physiology. 106 (1), 55-64 (2018).
  17. Gonzalez-Gutierrez, A., Ibacache, A., Esparza, A., Barros, L. F., Sierralta, J. Neuronal lactate levels depend on glia-derived lactate during high brain activity in Drosophila. Glia. 68 (6), 1213-1227 (2020).
  18. Geistlinger, K., Schmidt, J. D. R., Beitz, E. Human monocarboxylate transporters accept and relay protons via the bound substrate for selectivity and activity at physiological pH. PNAS Nexus. 2 (2), 1-8 (2023).
  19. Pasco, M. Y., Leopold, P. High sugar-induced insulin resistance in Drosophila relies on the lipocalin Neural Lazarillo. PloS One. 7 (5), 1-8 (2012).
  20. McMullen, E., Weiler, A., Becker, H. M., Schirmeier, S. Plasticity of carbohydrate transport at the blood-brain barrier. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 14, 1-15 (2020).
  21. Delgado, M. G., et al. Chaski, a novel Drosophila lactate/pyruvate transporter required in glia cells for survival under nutritional stress. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  22. Stilwell, G. E., Saraswati, S., Littleton, J. T., Chouinard, S. W. Development of a Drosophila seizure model for in vivo high-throughput drug screening. European Journal of Neuroscience. 24 (8), 2211-2222 (2006).
  23. Lerchundi, R., Huang, N., Rose, C. R. Quantitative imaging of changes in astrocytic and neuronal adenosine triphosphate using two different variants of Ateam. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14 (80), 1-13 (2020).
  24. Baeza-Lehnert, F., et al. Non-canonical control of neuronal Energy Status by the Na(+) Pump. Cell Metabolism. 29 (3), 668-680 (2019).
  25. Mattila, J., Hietakangas, V. Regulation of carbohydrate energy metabolism in Drosophilamelanogaster. Genetics. 207 (4), 1231-1253 (2017).
  26. De Backer, J., Grunwald, I. A role for glia in cellular and systemic metabolism: insights from the fly. Current Opinion in Insect Science. 53 (100947), 1-8 (2022).
  27. Loganathan, S., Ball, H., Manzo, E., Zarnescu, D. Measuring glucose uptake in Drosophila models of TDP-43 proteinopathy. Journal of Visualized Experiments. (174), e62936(2021).
  28. Dienel, G., Rothman, D. L. In vivo calibration of genetically encoded metabolite biosensors must account for metabolite metabolism during calibration and cellular volume. Journal of Neurochemistry. , (2023).
  29. Gandara, L., Durrieu, L., Behrensen, C., Wappner, P. A genetic toolkit for the analysis of metabolic changes in Drosophila provides new insights into metabolic responses to stress and malignant transformation. Scientific Reports. 9, 1-11 (2019).
  30. Gandara, L., Durrieu, L., Wappner, P. Metabolic FRET sensors in intact organs: Applying spectral unmixing to acquire reliable signals. BioRxiv. , (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Monokarboksilat Ta n mGlial H crelerN ronal AktiviteLaktat Ta n mGlikoz MetabolizmasFRET Sens rleriEx Vivo G r nt lemeMetabolit zleme

İlgili makaleler