Rd10 Farelerde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Fotoreseptör Progenitörlerinin Sub-Retinal Verilmesi

Kalıtsal retina hastalıkları ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu, fotoreseptör hücre kaybına ve sonunda körlüğe yol açar. Retina fotoreseptörü, fototransdüksiyondan (yani ışığın nöronal sinyallere dönüştürülmesinden) sorumlu özel hücrelerden oluşan retinanın dış segment tabakasıdır. Çubuk ve koni fotoreseptör hücreleri, retina pigmentli tabakaya (RPE) bitişiktir1. Hücre kaybını telafi etmek için fotoreseptör hücre replasman tedavisi ortaya çıkan ve gelişen bir terapötik yaklaşım olmuştur. Hasarlı fotoreseptör hücrelerini restore etmek için embriyonik kök hücreler (ESC'ler)^2,3,4, indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) kaynaklı RPE hücreleri ve retinal progenitör hücreler (RPC'ler)4,5,6,7,8 kullanıldı. Retina ve RPE arasında sınırlı bir boşluk olan sub-retinal boşluk, çevresi nedeniyle hasarlı fotoreseptör hücreleri, RPE ve Mueller hücrelerini değiştirmek için bu hücreleri biriktirmek için çekici bir yerdir ^9,10,11.

Gen ve hücre tedavileri, klinik öncesi çalışmalarda çeşitli retina hastalıkları için rejeneratif tıp için retina altı boşluğu kullanmaktadır. Bu, genin veya gen düzenleme araçlarının fonksiyonel kopyalarının anti-sens oligonükleotid tedavisi^12,13 veya CRISPR/Cas9 veya adeno-ilişkili virüs (AAV) tabanlı strateji 14,15,16 yoluyla baz düzenleme, materyallerin implantasyonu (örneğin, RPE tabakası, retina protezleri 17,18,19) ve farklılaşmış kök hücre kaynaklı retinal organoidler ^20,21,22 retina ve RPE ile ilişkili hastalıkları tedavi etmek için. RPE65 ile ilişkili Leber konjenital amauroz (LCA) ^23,24, CNGA3 ile ilişkili akromatopsi²⁵, MERTK ile ilişkili retinitis pigmentosa²⁶, koroideremi 27,28,29,30 tedavi etmek için retina altı boşlukta hESC-RPE ³¹ kullanan klinik çalışmalar etkili bir yaklaşım olduğu kanıtlanmıştır. Hücrelerin hasarlı alanın çevresine doğrudan enjeksiyonu, uygun bölgede hücre yerleşimi, sinaptik entegrasyon ve nihai görsel iyileşme şansını büyük ölçüde artırır.

İnsan ve iri gözlü modellerde (yani domuz 32,33,34,35, tavşan^{36,37,38,39,40} ve insan olmayan primat 41,42,43) retina altı enjeksiyon yapılmış olsa da, murin modelinde bu tür bir enjeksiyon, göz küresi boyutunun kısıtlanması ve muazzam olması nedeniyle hala zordur. fare gözünü işgal eden lens 44,45,46. Bununla birlikte, genetiği değiştirilmiş modeller büyük hayvanlarda (yani tavşanlarda ve insan olmayan primatlarda) değil, yalnızca küçük hayvanlarda kolayca bulunur, bu nedenle farelerde retina altı enjeksiyon, retinal genetik bozukluklarda yeni terapötik yaklaşımları araştırmak için dikkat çekmektedir. Hücreleri veya AAV'leri retina altı boşluğa iletmek için trans-kornea yolu, trans-skleral yol ve pars plana yolu olmak üzere üç ana yaklaşım kullanılmaktadır (Bkz. Şekil 2). Transkorneal ve transskleral yollar katarakt oluşumu, sineşi, koroid kanaması ve enjeksiyon bölgesinden reflü ile ilişkilidir 11,44,45,47,48,49. Enjeksiyon işleminin doğrudan görselleştirilmesi olarak pars plana yaklaşımını benimsedik ve enjeksiyon bölgesi mikroskop altında gerçek zamanlı olarak elde edilebiliyor.

Yakın zamanda, rekombinant insan retinasına özgü laminin izoformu LN523 kullanılarak ksenofree, kimyasal olarak tanımlanmış koşullar altında insan embriyonik kök hücrelerini (hESC'ler) fotoreseptör progenitörlerine farklılaştırabilen bir yöntem tanımladık. LN523'ün retinada mevcut olduğu tespit edildiğinden, insan retinasının hücre dışı matriks nişinin in vitro olarak özetlenebileceğini ve böylece hESC'lerden³⁶ fotoreseptör farklılaşmasını destekleyebileceğini varsaydık. Tek hücreli transkriptomik analiz, koni-çubuk homeobox ve recoverin'i birlikte eksprese eden fotoreseptör progenitörlerinin 32 gün sonra üretildiğini gösterdi. Otozomal insan retinitis pigmentosa'yı taklit eden bir retina dejenerasyonu 10 (rd10) mutant fare modeli, 32 hESC'den türetilen fotoreseptör progenitörlerinin etkinliğini in vivo olarak değerlendirmek için kullanıldı. hESC'den türetilen fotoreseptör progenitör hücreler, fotoseptör disfonksiyonu ve dejenerasyonunun devam ettiği P20'de rd10 farelerin retina altı boşluğuna enjekte edildi³⁶. Burada, kriyoprezervasyon sonrası hESC türevi fotoreseptör progenitörlerinin hazırlanması ve rd10 farelerin retina altı boşluğuna verilmesi için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu yöntem aynı zamanda farelerde AAV'leri, hücre süspansiyonlarını, peptitleri veya kimyasalları retina altı boşluğa uygulamak için de kullanılabilir.

İn vivo deneyler, SingHealth Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) ve Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) tarafından Oftalmik ve Görme Araştırmalarında hayvanların kullanımına ilişkin Bildiri tarafından onaylanan kılavuzlara ve protokole uygun olarak yapılmıştır. Yavrular, siklosporin (260 g / L) içeren içme suyuyla beslenerek P17'den (nakil öncesi) P30'a (nakil sonrası) kadar immünosuprese edildi.

1. Kriyoprezervasyon sonrası 32. gün hESC'den türetilen fotoreseptör progenitörlerinin hazırlanması

1. 37 °C'lik bir su banyosunda ön ısıtma fotoreseptör farklılaşma ortamı (PRDM).
2. Sıvı nitrojenden 32. gün hESC'den türetilmiş fotoreseptör progenitör hücreleri içeren bir kriyoviyal alın. Kuru buz üzerinde tutun.
3. Cryovial'i 37 °C'de bir su banyosunda 3-5 dakika çözdürün. Gün 32 hücreyi 1 mL PRDM'de tekrar süspanse edin ve 4 dakika boyunca 130 x g'da santrifüjleyin.
4. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 1 mL PRDM'de yeniden süspanse edin.
5. Hücre sayımı için karışımın 10 μL'sini çıkarın. Üreticinin talimatlarına göre% 0.2 tripan mavisi kullanarak hücreleri karıştırın. Hücre karışımını hücre sayma haznesine pipetleyin slayt. Otomatik hücre sayacı ile hücre sayısını ve canlılığını belirleyin.
6. Hücre canlılığı% 70'in üzerinde olduğunda bir sonraki adıma geçin. Kalan hücre süspansiyonunu 4 dakika boyunca 130 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve transplantasyon için 3 x 10⁵ hücre / μL konsantrasyonunda PRDM'deki hücre peletini yeniden süspanse edin.
7. Görünür hücre kümelerini gözlemleyin. Görünür hücre kümelenmesi gözlenene kadar mikrofüj tüpünde 10 μL'lik bir pipet ucu kullanarak hücre kümelerini tekrar tekrar süspanse edin. Hücre çözeltisinin iğneden ekstrüzyonunu gözlemlemek için 33G enjeksiyon şırıngasına yükleyin.

2. rd10 farelerde hESC'lerin retina altı verilmesi

1. Hayvanların hazırlanması
   1. İntraperitoneal yaklaşımla 27G iğneye bağlı 1 mL'lik bir tüberkülin şırıngasında ketamin (20 mg/kg vücut ağırlığı) ve ksilazin (2 mg/kg vücut ağırlığı) kombinasyonu kullanarak fareyi (P20, erkek/dişi, 3-6 g) uyuşturun. Önleyici bir analjezik olarak fareye deri altı buprenorfin (0.05 mg / kg) enjeksiyonu uygulayın.
   2. Anesteziyi uyguladıktan sonra, pupil dilatasyonu için% 1 tropikamid ve% 2.5 fenilefrin damlatın. Gözün kuruluğunu ve anesteziye bağlı kataraktı önlemek için korneaya oftalmik bir jel uygulayın.
   3. Tamamen uyuşturulana kadar fareyi boş bir kafese yerleştirin. Pençe yastığını sıkıştırarak uygun anestezi seviyesini değerlendirin ve hayvanın sert çimdiklemeye tepki verip vermediğini onaylayın.
   4. Fare tamamen uyuşturulduğunda, hayvanı 38 °C'ye ayarlanmış ılık bir ped üzerine yerleştirin.
2. Hücrelerin retina altı iletimi
   1. Burada yapıldığı gibi 1 portlu trans-vitreal pars plana yaklaşımını kullanmak için steril bir ortamda retina altı enjeksiyon yapın. Enjeksiyonu gerçekleştirmek için doğrudan ışık yoluna sahip dik bir ameliyat mikroskobu kullanın.
   2. İğne göbeğini çıkararak 10 μL'lik cam şırıngayı hazırlayın. 33G kör iğneyi cam şırıngaya monte edin. Metal göbek kapağını alın ve iğneyi şırıngaya dikkatlice sabitleyin.
   3. İğnede herhangi bir sızıntı belirtisi ve açıklığı olup olmadığını kontrol etmek için damıtılmış suyla yıkayın. Şırıngayı boşaltın ve dikkatlice yan tarafa koyun.
   4. Anestezi uygulanmış fareyi, tedavi gözü doğrudan mikroskobun hedefine bakacak şekilde bir yastığın üzerine yerleştirin. % 0.5 proparakain hidroklorür uygulayın ve 30 saniye bekleyin. Göze 150 μL oftalmik jel uygulayın ve üzerine yuvarlak bir örtü yerleştirin.
   5. Kornea, iris, göz bebeği, lens ve konjonktivayı gözlemleyerek gözün kaba bir muayenesini yapın. Göz bebeği aracılığıyla, odak düzlemini ayarlayarak fare gözünün fundusunu görselleştirin. Optik başlık göz bebeğinin ortasına yerleştirilene kadar başlığı ayarlayın ve yastığın üzerine uygun şekilde konumlandırarak başın hareketini en aza indirin.
   6. Düzgün bir hücre süspansiyonu elde etmek için tüpün tabanına hESC'lerle birden çok kez hafifçe vurun. 10 μL cam mikrolitrelik şırıngayı 33G künt iğne ile kullanarak 2 μL hücre/ortam çekin. Şırıngada hücre yerleşimini / kümelenmesini önlemek için enjeksiyondan hemen önce hücreleri geri çekin.
   7. 30G tek kullanımlık bir iğne kullanarak, limbusun 2 mm arkasında bir sklerektomi yarası yapın. Lense dokunmamak için iğnenin açısını ~45°'de tutun. İğnenin ucu gözde görüntülendikten sonra iğneyi yavaşça geri çekin. İğne batmasını önlemek için kullandıktan sonra iğneyi keskin çöp kutusuna atın.
   8. Cam şırıngayı alın ve künt iğneyi sklerektomi yarasına yerleştirin. Lense dokunmadan, künt iğneyi giriş yarasının karşı retinasına ulaşana kadar ilerletin. Kanamayı önlemek için enjeksiyon alanının ana retina kan damarlarından arınmış olduğundan emin olun.
   9. Sklera üzerinde bir basınç dalı görülene kadar retinaya hafifçe nüfuz edin. Hücrelerin vitreus boşluğuna sızmasını önlemek için iğnenin kör ucunu skleraya paralel tutun.
   10. Şırınga üzerinde hafif bir basınç korunurken retina altı boşluğa 2 μL hücre süspansiyonu veya PRDM ortamı (kontrol) yavaşça enjekte edin. Başarılı bir enjeksiyonla, enjeksiyon bölgesinde görünür bir bleb (yani, içinde hücre süspansiyonu/ortamı bulunan yükseltilmiş retina) oluşturulmalıdır.
       NOT: Retina yırtılmasını ve iğne ucundaki hücrelerin tıkanmasını önlemek için enjeksiyon sırasında sadece hafif basınç kullanılmalıdır.
   11. Blebi onayladıktan sonra, hücrelerin yerleşmesi için 10 saniye bekleyin. İğneyi gözden yavaşça geri çekin.
3. İntraoperatif optik koherens tomografi (OCT) bleb taraması (isteğe bağlı)
   1. Kafayı yavaşça hareket ettirerek kabarmayı mikroskop altında görselleştirmek için fare gözünü konumlandırın. Kafayı nazikçe tutarak pozisyonu sabitleyin. Ek bir göz bebeği genişlemesine gerek yoktur. Kapak fişini ve gözdeki jeli çıkarmayın. Blebi görselleştirmek için net bir optik ortam sağlar.
   2. Ameliyat mikroskobunun yerleşik iOCT işlevini kullanarak intraoperatif OCT'yi gerçekleştirin.
   3. OCT ekranında Küp seçeneğine basın ve Ok düğmelerine basarak tarama alanını bleb üzerine konumlandırın. En iyi OCT kalitesi için Merkezleme ve Odaklanma'yı kaydırarak OCT'yi ayarlayın. Bleb bölgesinin OCT taramasını almak için Yakala/Tara'ya basın. Taramaların kalitesini kontrol etmek için görüntüleri inceleyin.
4. Kurtarma
   1. Kapak fişini çıkarın ve jeli gazlı bezle gözden temizleyin. Enfeksiyonu önlemek için enjeksiyondan sonra bir kez antibiyotik merhem sürün.
   2. Sternal yaslanmanın sürdürülmesi ve ev kafesine geri dönmesi için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanın ılık bir ışık altında anesteziden kurtulmasına izin verin. Hayvanı enjeksiyondan sonra en az 3 gün boyunca iltihaplanma, enfeksiyon ve sıkıntı belirtileri açısından izleyin.
      NOT: 150 W sıcak ışık, hayvan kafesinden en az 30 cm uzakta olmalı ve yanık yaralanmasını önlemek için dikkatli olunmalıdır.
   3. Deri altı buprenorfin enjeksiyonu (0.05 mg / kg) 1 gün boyunca 8 saatte bir veya veteriner hekimin tavsiyesine göre uygulayın. Gözde iltihaplanma veya enfeksiyon görülürse, uygun tedavi için bir veteriner hekime danışın.
5. Aletlerin temizlenmesi ve sterilizasyonu
   1. 10 μL cam mikrolitre şırıngayı ve 33G kör iğneyi %100 etanol 10x ile yıkayın. Şırıngayı damıtılmış suyla yakarak etanolü yıkayın.
   2. Cam şırıngayı ve iğneyi sökün. Şırıngayı saklamak için kurutun.

10 μL'lik cam şırınga, üreticinin talimatlarına göre monte edilmiştir (Şekil 1) ve hücre süspansiyonunu/ortamını iletmek için kullanılan kör iğne Şekil 1B'de gösterilmektedir. Subretinal enjeksiyon için farklı yaklaşımlar Şekil 2'de gösterilmektedir. Bu protokolde pars plana yaklaşımını açıklıyoruz (Şekil 2C). Bir cam şırıngaya monte edilen künt iğne, bir sklerotomi yarasından sokuldu ve dünya çapında retina altı boşluğa erişti. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, enjeksiyon yapılırken iğnenin yörüngesi, retinadan penetrasyon ve hücrelerin iletimi doğrudan mikroskop altında izlendi. Hücrelerin/ortamın başarılı bir şekilde verilmesi, enjeksiyon bölgesinde bir kabarcık gözlemlenerek doğrulandı (Şekil 3B). Başarılı bir bleb, su balonuna benzeyen açık beyazımsı bir renk olarak tanımlanabilir. Hücrelerin/ortamın enjeksiyon bölgesindeki vitreus boşluğuna sızması ve bir kabarcık oluşturmaması nedeniyle başarısız bir doğum gözlenir. OCT taraması enjekte edilen alanda gerçekleştirildi ve tarama, hücre ile tedavi edilen gözde yüzen bireyselleştirilmiş hESC'ler gösterirken (Şekil 4A), medya ile tedavi edilen göz, retina altı boşlukta hücresiz berrak sıvı gösterdi (Şekil 4B). Bireyselleştirilmiş hESC'ler, retina altı boşlukta dağılmış hiperreflektif materyaller olarak tanımlanır (Şekil 4A). Enjeksiyonun başarı oranı, blebin başarılı bir şekilde oluştuğu göz sayısı not edilerek hesaplandı. Laboratuvarımızda bu yaklaşımı benimseyen uygulamalara ve enjeksiyonların başarı oranlarına yer verdik (Tablo 1).

Şekil 1: Enjeksiyon sırasında kullanılan aletler. (A) 10 μL cam şırınga, 33G künt iğne ile monte edilmiştir. (B) 33G künt iğnenin yakınlaştırılmış resmi. (C) Hayvanın başının dinlenmesi için yastık. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Retina altı enjeksiyonun farklı yolları. (A) Transkornea yolu: Enjeksiyon iğnesi kornea ve göz bebeğinden geçerek retina altı boşluğa girer. (B) Transskleral yol: Retina altı boşluğa doğrudan sklera yoluyla erişilir. (C) Pars plana yolu: Enjeksiyon iğnesi, limbusta bir kesi yoluyla vitreus boşluğuna sokulur. İğne retinayı delerek retina altı boşluğa ulaşır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Subretinal enjeksiyon sırasında gözün fundus görüntüleri. (A) Subretinal enjeksiyon yapılmadan önce, iğnenin ucu, ana retina kan damarlarından kaçınarak retinaya temas eden vitreus boşluğunda görülebilir. (B) Subretinal enjeksiyondan sonra, enjeksiyon bölgesinde görünür bir kabarcık oluştu (sarı noktalı çizgi). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Enjekte edilen gözlerin intraoperatif OCT taramaları. Taramalar enjeksiyondan hemen sonra yapıldı. (A) hESC ile tedavi edilen göz: üst panel, OCT taramasının (camgöbeği ve pembe kesit çizgileri) gözdeki yerini gösterdi; Tedavi edilen gözde retina altı boşlukta (sarı noktalı çizgi, orta ve alt paneller) hESC'ler gözlendi. (B) Medyayla tedavi edilen göz: üst panel, OCT taramasının gözdeki yerini (camgöbeği ve pembe kesit çizgileri) gösterdi; Ortam enjekte edilen gözde retina altı boşlukta (sarı noktalı çizgi, orta ve alt paneller) hücresiz berrak sıvı gözlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Farklı uygulamalarda retina altı enjeksiyonun başarı oranı.

Hwee Goon Tay, Alder Therapeutics AB'nin kurucu ortağıdır. Diğer yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.