Kriyoprezervasyon sonrası hESC kaynaklı fotoreseptör progenitör hücrelerin hazırlanması ve bu hücrelerin rd10 farelerde retina altı verilmesi için ayrıntılı bir protokol tanımladık.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Rd10 Farelerde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Fotoreseptör Progenitörlerinin Sub-Retinal Verilmesi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
İnsan pluripotent kök hücreleri kullanılarak fotoreseptör hücrelerin rejenerasyonu, hem kalıtsal hem de yaşlanan retina hastalıklarının ileri evrelerde tedavisi için umut verici bir tedavidir. İnsan rekombinant retinaya özgü laminin izoform matrisinin, insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC'ler) fotoreseptör progenitörlerine farklılaşmasını destekleyebildiğini gösterdik. Ek olarak, bu hücrelerin subretinal enjeksiyonu, rd10 kemirgen ve tavşan modellerinde kısmi restorasyon göstermiştir. Subretinal enjeksiyonun, hedef boşluğa yakınlığı nedeniyle gözün fotoreseptör hücrelerine ve retina pigmentli epitel (RPE) tabakasına farmasötik bileşikler vermek için kullanılan yerleşik bir yöntem olduğu bilinmektedir. Ayrıca, retina hastalıklarını tedavi etmek için adeno ile ilişkili viral vektörleri retina altı boşluğa iletmek için de kullanılmıştır. Fare modelindeki farmasötik bileşiklerin ve hücrelerin retina altı iletimi, murin göz küresinin boyutundaki kısıtlama nedeniyle zordur. Bu protokol, genetik retinitis pigmentosa mutant, rd10 farelerinde hESC'den türetilen fotoreseptör progenitör hücrelerin enjeksiyon için hazırlanması ve bu hücrelerin retina altı dağıtım tekniği için ayrıntılı prosedürü açıklar. Bu yaklaşım, hedeflenen bölgeye, özellikle de fotoreseptör dejenerasyonuna yol açan hastalıkların meydana geldiği retinanın dış nükleer tabakasına hücre tedavisine izin verir.
Giriş
Kalıtsal retina hastalıkları ve yaşa bağlı makula dejenerasyonu, fotoreseptör hücre kaybına ve sonunda körlüğe yol açar. Retina fotoreseptörü, fototransdüksiyondan (yani ışığın nöronal sinyallere dönüştürülmesinden) sorumlu özel hücrelerden oluşan retinanın dış segment tabakasıdır. Çubuk ve koni fotoreseptör hücreleri, retina pigmentli tabakaya (RPE) bitişiktir1. Hücre kaybını telafi etmek için fotoreseptör hücre replasman tedavisi ortaya çıkan ve gelişen bir terapötik yaklaşım olmuştur. Hasarlı fotoreseptör hücrelerini restore etmek için embriyonik kök hücreler (ESC'ler)2,3,4
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
İn vivo deneyler, SingHealth Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) ve Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) tarafından Oftalmik ve Görme Araştırmalarında hayvanların kullanımına ilişkin Bildiri tarafından onaylanan kılavuzlara ve protokole uygun olarak yapılmıştır. Yavrular, siklosporin (260 g / L) içeren içme suyuyla beslenerek P17'den (nakil öncesi) P30'a (nakil sonrası) kadar immünosuprese edildi.
1. Kriyoprezervasyon sonrası 32. gün hESC'den türetilen fotoreseptör progenitörlerinin hazırlanması
- 37 °C'lik bir su banyosunda ön ısıtma fotoreseptör farklılaşma ortamı (PRDM).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
10 μL'lik cam şırınga, üreticinin talimatlarına göre monte edilmiştir (Şekil 1) ve hücre süspansiyonunu/ortamını iletmek için kullanılan kör iğne Şekil 1B'de gösterilmektedir. Subretinal enjeksiyon için farklı yaklaşımlar Şekil 2'de gösterilmektedir. Bu protokolde pars plana yaklaşımını açıklıyoruz (Şekil 2C). Bir cam şırıngaya monte edilen künt iğne, bir sklerotomi yarasından sokuldu ve dünya çapında r.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Subretinal enjeksiyon, RPE ve retina hastalıklarını tedavi etmek için hücre süspansiyon transplantasyonu için kullanılmıştır 23,25,26,27,28,31,40. Bu yaklaşım, kemirgen çalışmalarında sadece hücre nakli ve gen tedavisi yaklaşımları için değil, aynı zamanda retina hastalıkları için yeni terap.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Hwee Goon Tay, Alder Therapeutics AB'nin kurucu ortağıdır. Diğer yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Teşekkürler
Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee ve Yingying Chung'a, kriyoprezervasyondan sonra 32 hESC'den türetilmiş fotoreseptör progenitörlerinin hazırlanması için teknik yardım sağladıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi Genç Araştırmacı Araştırma Hibe Ödülü (NMRC/OFYIRG/0042/2017) ve Ulusal Araştırma Vakfı24'üncü Rekabetçi Araştırma Programı Hibesi (CRP24-2020-0083) tarafından HGT'ye verilen hibelerle desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| % 0.3 Tobramisin | Novartis | NDC & nbsp; 0078-0813-01 | Tobrex (3.5 g) |
| % 0.3 Tobramisin ve% 0.1 Deksametazon | Novartis | NDC 0078-0876-01 | Tobradex (3.5 g) |
| % 0.5 Proparakain hidroklorür | Alcon | NDC 0998-0016-15 | % 0.5 Alcaine (15 mL) |
| 1 mL Tüberkülin şırıngası | Turemo | SS01T2713 | |
| % 1 Tropicamide | Alcon | NDC 0998-0355-15 | % 1 Midriasil (15 mL) |
| % 2.5 Fenilefrin hidroklorür | Alcon | NDC 0998-0342-05 | % 2.5 Mydfrin (5 mL) |
| 24 oyuklu doku kültürü plakası | Costar | 3526 | |
| 30 G Tek kullanımlık iğne | Becton Dickinson (BD) | 305128 | |
| 33 G, 20 mm uzunlukta künt iğneler | Hamilton | 7803-05 | |
| Otomatik Hücre Sayacı | NanoEnTek | Model: Havva | |
| A Vitamini Içermeyen B27 | Yaşam Teknolojileri | 12587001 | %236 |
| Buprenorfin | Ceva | Veterjezik veteriner (0.3 mg/mL) | |
| CKI-7 | Sigma | C0742 | 5 & mikro; İçme suyunda M36 |
| Siklosporin | Novartis | 260 g/L | |
| Gün 32 hESC'den türetilmiş fotoreseptör progenitör hücreler | DUKE-NUS Tıp Fakültesi | İnsan embriyonik kök hücreleri 32 gün boyunca farklılaşır. Ref 36'daki protokole bakınız. | |
| Gazlı | Bez Kazanan Sanayi Co., Ltd. | 1SNW475-4 | |
| Glasgow Minimum Temel Orta | Gibco | 11710– 035 | |
| hESC hücre hattı H1 | WiCell Araştırma Enstitüsü | WA01 | |
| İnsan beyninden türetilmiş nörotrofik faktör (BDNF) | Peprotech | 450-02-50 | 10 ng/mL36 |
| >İnsan siliyer nörotrofik faktör (CNTF) | Prospec-Tany Technogene | CYT-272 | 10 ng/mL36 |
| Ketamin hidroklorür (100 mg/mL) | Ceva Santé Animale | KETALAB03 | |
| LN-521 | Biolamina | LN521-02 | 1 & mikro; g36 |
| >mFreSR | KÖK HÜCRE Teknolojileri | 5854 | |
| Mikrolitre cam şırınga (10 mL) | Hamilton | 7653-01 | |
| N-[N-(3,5-diflorofenasetil-L-alanil)]-S-fenilglisin t-butil ester (DAPT) | Selleckchem | S2215 | 10 & M36 |
| N-2 takviyesi | Yaşam Teknolojileri | A13707-01 | %136 |
| Esansiyel olmayan amino asitler (NEAA) | Gibco | 11140– 050 | 1x36 |
| NutriStem XF Media | Satorius | 05-100-1A | |
| Çalışma mikroskobu | Zeiss | OPMI LUMERA 700 | Dahili iOCT fonksiyonlu |
| PRDM (Fotoreseptör farklılaşma ortamı, 50ml) | DUKE-NUS Tıp Fakültesi | Bkz. medya kompozisyonu36. Bazal Orta, 10 & M DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 ve mikro; M Retinoik asit, %2 B27 ve %1 N2. Bazal Ortam: 1x GMEM, 1 mM sodyum piruvat, 0.1 mM B-merkaptoetanol, 1x Esansiyel olmayan amino asitler (NEAA). | |
| Piruvat | Gibco | 11360– 070 | 1 mM36 |
| Rd10 fareler | Jackson Laboratuvarı | B6. CXB1-Pde6brd10/J fareler | Cinsiyet: erkek/dişi, Yaş: P20 (enjeksiyon), Ağırlık: 3-6 g |
| Retinoik asit | Tocris Bioscience | 0695/50 | 0.5 & M36 |
| Yuvarlak Kapak Slipi (12 mm) | Fisher Scientific | 12-545-80 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | 0.5 & mikro; M36 |
| >Vidisic Jel (10 g) | Dr. Gerhard Mann | ||
| Ksilazin hidroklorür (20 mg/mL) | Troy Laboratories | LI0605 | |
| β-merkaptoetanol | Yaşam Teknolojileri | 21985– 023 | 0,1 mM36 |
Kaynaklar
- Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
- Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
