Yöntem makalesi

Tendonlarda Gen Ekspresyon Seviyelerinin Mekansal Yüksek Çözünürlüklü Analizi

734 görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/65852

⸱

8 Mart 2024

 , 
1Center for Regenerative Medicine, Department of Orthopedic Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Harvard Stem Cell Institute, 3Center Of Regeneration and Longevity (CORAL), Tel-Aviv Sourasky Medical Center

Bu makalede

Özet

Bu makale, tendonlar için optimize edilmiş bir in situ protokolün nasıl gerçekleştirileceğini açıklamaktadır. Bu yöntemde doku hazırlama, kesit geçirgenliği, prob tasarımı ve sinyal amplifikasyon yöntemleri ele alınmaktadır.

Özet

Son yıllarda, birçok farklı tıbbi ve biyoloji alanında yüksek çözünürlüklü transkriptomik için birçok protokol geliştirilmiştir. Bununla birlikte, matristen zengin dokular ve özellikle tendonlar, düşük hücre sayıları, hücre başına düşük RNA miktarı ve yüksek matris içeriği nedeniyle geride kaldı ve bu da onları analiz etmeyi karmaşık hale getirdi. En yeni ve en önemli tek hücreli araçlardan biri, tendonlardaki gen ekspresyon seviyelerinin mekansal analizidir. Bu RNA uzamsal araçları, yeni ve bilinmeyen popülasyonların spesifik hücrelerini bulmak, tek hücreli RNA-seq sonuçlarını doğrulamak ve tek hücreli RNA-seq verilerine histolojik bağlam eklemek için tendonlarda özellikle yüksek öneme sahiptir. Bu yeni yöntemler, hücrelerde RNA'nın olağanüstü hassasiyetle analiz edilmesini ve tek hücre düzeyinde tek moleküllü RNA hedeflerinin tespit edilmesini sağlayacak, bu da tendonları moleküler olarak karakterize etmeye ve tendon araştırmalarını teşvik etmeye yardımcı olacaktır.

Bu yöntem makalesinde, tek hücre seviyelerinde sağlam hücreler içinde hedef RNA'yı tespit etmek için yeni in situ hibridizasyon testleri kullanarak histolojik kesitlerde uzamsal gen ekspresyon seviyelerini analiz etmek için mevcut yöntemlere odaklanacağız. İlk olarak, tendon dokusunun mevcut farklı tahliller için nasıl hazırlanacağına ve hedefe özgü sinyallerin arka plan gürültüsü olmadan, ancak yüksek hassasiyet ve yüksek özgüllük ile nasıl yükseltileceğine odaklanacağız. Daha sonra, makale belirli geçirgenleştirme yöntemlerini, farklı prob tasarımlarını ve şu anda mevcut olan sinyal amplifikasyon stratejilerini açıklayacaktır. Tek hücre çözünürlüğünde farklı genlerin transkripsiyon seviyelerini analiz etmek için bu benzersiz yöntemler, çeşitli hayvan modellerinin ve insan tendon dokularının genç ve yaşlı popülasyonlarında tendon dokusu hücrelerinin tanımlanmasını ve karakterizasyonunu sağlayacaktır. Bu yöntem aynı zamanda kemikler, kıkırdak ve bağlar gibi diğer matris açısından zengin dokulardaki gen ekspresyon seviyelerinin analiz edilmesine de yardımcı olacaktır.

Giriş

Tendonlar, kas ve kemik arasındaki kuvvetin iletimini sağlayan bağ dokularıdır1. Gelişimsel olarak, eksenel tenositler, somitlerin2 sklerotomu içindeki mezenkimal hücrelerden türetilir; uzuv tendonları lateral plaka mezoderminden türetilir; ve kraniyal tendonlar, kraniyal nöral krest soyundankaynaklanır 3,4. Tendon, skleraksi transkripsiyon faktörü5'in ekspresyonu ile karakterize edilebilir, ancak tenomodulin, mohawk ve erken büyüme yanıtı 1/2 6,7,8,9 dahil olmak üzere çeşitli belirteçler de tendon gelişiminde önemli bir rol oynar.

Genel olarak, tendonun bilinen birkaç belirtecine rağmen, daha derinlemesine bir karakterizasyon zor olmaya devam etmektedir, çünkü tendon, bir biyomekanik özellik gradyanı boyunca yayılan hücreler içerir. Miyotendinöz bileşke, tendon orta gövdesi ve daha kalsifiye entezden, tendon hücreleri, gerilme özellikleri arasında değişen hücre dışı matrislerde bulunur. Tendonun, yumuşak ve sert doku arasındaki mekanik mukavemet farkının neden olduğu gerilme gerilimine dayanması gerektiğinden, tendondaki hücrelerin mekansal organizasyonu, işlevi için özellikle önemlidir. Bununla birlikte, bu tendon alt popülasyonları hakkında çok az şey bilinmektedir.

Tek hücreli RNA Seq veya in situ hibridizasyon dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere hücre alt popülasyonlarını açıklamaya başlamak için birçok yüksek çözünürlüklü uzamsal transkriptomik araç kullanılabilir. Bununla birlikte, bu uzamsal profil oluşturma testleri, mikrodiseksiyon veya kesit alma işleminden sonra doku boyunca RNA ekspresyonunu ortaya çıkarmaya yardımcı olurken, bu yöntemler tendon dokusu üzerinde gerçekleştirildiğinde zor olabilir. Tendonlar, kuru kütle10 ile kollajenin yaklaşık% 86'sından oluşan matris açısından zengin dokulardır ve bu da hücrelerin dizileme için çıkarılmasını zorlaştırır. Hem matristen hücrelerin izole edilmesindeki komplikasyonlar, hem tendon11'in hiposellüler doğası hem de nispeten düşük RNA sayısı nedeniyle, tendon analiz edilmesi zor bir dokudur.

Bu yazıda, doku hazırlama, permeabilizasyon ve prob tasarım yöntemleri sağlayarak yeni in situ hibridizasyon testlerini tendonlar için kullanmak üzere optimize etmek için bir yöntem sunuyoruz. Mevcut dizileme teknolojileriyle birleştiğinde, bu, araştırmacıların gelişmekte olan, yetişkin veya yaralı tendonlar boyunca tendon alt popülasyonlarını artan test duyarlılığı ve özgüllüğü ile mekansal olarak karakterize etmelerine yardımcı olabilir.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve AAALAC yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Deneyler, Massachusetts General Hospital'da onaylanmış protokol #2013N000062 altında gerçekleştirildi. Bu çalışmada C57BL/J6 fareleri (5 haftalık ve P0) kullanılmıştır. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.

1. Numune hazırlama ve sabitleme

  1. Fareleri bir CO2 odasında ötenazi yapın, ardından ikincil bir ötenazi yöntemi olarak servikal çıkık yapın. Ardından, farenin arka ayaklarını kalça eklemi12 boyunca kesmek için makas kullanın. Bir sintilasyon şişesinde, farenin arka ayağını, numuneyi tamamen kaplayacak kadar %4'lük paraformaldehit (PFA) çözeltisine daldırın ve dokuyu 24 saat sabitleyin.
    NOT: Fiksasyon için %4 PFA yerine %10 formalin de kullanılabilir. Fiksasyondan sonra, numune daha sonraki işlemlere kadar fosfat tamponlu salin (PBS) içinde saklanabilir. Tüm arka ayağı sabitleyerek, tendon üzerindeki gerginliği koruyabilir ve entezi, tendon orta gövdesini veya miyotendinöz bileşkeyi inceleme fırsatına sahip oluruz.
  2. PFA'yı sintilasyon şişesinden çıkardıktan sonra, numuneyi kaplayacak kadar PBS ekleyerek numuneyi 1x PBS ile 3 x 10 dakika yıkayın. Daha sonra, arka ayakları 1-2 hafta çalkalayarak 4 ° C'de 0,5 M EDTA'ya daldırın ve her 2-3 günde bir taze EDTA ile değiştirin.
  3. EDTA'yı çıkardıktan sonra, numuneyi 1x PBS ile 3 x 10 dakika yıkayın, numuneleri% 70 EtOH içinde kurutun ve istenen yönde parafine gömün. Dokuyu 3 μm kalınlığında kesitlere ayırmak için geleneksel FFPE kesit alma tekniklerini kullanın ve kesitleri işlenmiş, yüklü bir mikroskop lamına aktarın (bkz. Malzeme Tablosu)13.
    NOT: Bölümler, sonraki adımlara geçmeden önce 4 °C'de saklanabilir.
  4. Deparafinizasyon
    1. Slaytları sıcak bir plaka üzerinde 60 °C'de 1 saat pişirin ve ardından slaytların oda sıcaklığına (RT) gelmesine izin verin. Parafin mumunu slaytlardan çıkarmak için, slaytları bir sürgülü rafa yerleştirin ve ksilen ile doldurulmuş bir boyama kabına indirin. Taze ksilen içinde 3 x 5 dakika tekrarlayın.
      DİKKAT: Ksilen tehlikelidir; Dikkatli tutun.
    2. Bölümleri yeniden sulandırmak için, slaytları yıkama başına 5 dakika boyunca, tümü RT'de olmak üzere aşağıdakilere daldırın: 2x'i %100 EtOH'de, 1x'i dH2O'da seyreltilmiş %75 EtOH'de, 1x'i PBS'de seyreltilmiş %50 EtOH'de, 1x'i PBS'de seyreltilmiş %25 EtOH'de ve 2x'i PBS'de yıkayın.
      NOT: Tüm rehidrasyon adımları, bir sürgülü raf üzerindeki slaytlarla ve boyama tabaklarındaki çeşitli EtOH çözeltileri ile yapılır.

2. RNAscope (ticarileştirilmiş ISH) protokolü14 adaptasyonu

  1. Çözeltilerin ve probların hazırlanması
    1. pH 8'de 25 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA ve 50 mM glikozu birleştirerek kesitli numunelerin ön işlemi için TEG çözeltisi hazırlayın. Tüm numunelerin işlenmesi için yeterli bir hacim oluşturun veya fazlasını hazırlayın; filtre-sterilize edin ve RT'de saklayın; Kullanmadan önce çözeltiyi uygun şekilde karıştırın.
    2. Tüm yıkamalar için yeterli miktarda 1x Yıkama Tamponu (Malzeme Tablosuna bakın) hazırlayın ve RT'de saklayın.
    3. 40 ° C'lik bir su banyosunda veya inkübatörde, ilgilenilen probları 10 dakika ısıtın. Ardından, probları ISH protokolü14'e göre hazırlayın.
  2. Numunelerin ön muamelesi
    1. Önerilen ön işlem solüsyonunu kullanmak yerine, slaytları 60 ° C'de 4 saat boyunca TEG tamponu içeren bir boyama kabına daldırın.
      NOT: TEG tampon inkübasyonu, doku özellikle yoğunsa veya ilgilenilen RNA bağlanma motifinin antijen alımı zorsa 6 saate kadar uzatılabilir. Bu durumda buraya bir durma noktası eklenebilir, slaytlar kurutulabilir ve gece boyunca 4 °C'lik bir buzdolabında saklanabilir.
    2. Numuneleri tampondan çıkarın ve kurumasını bekleyin. Daha sonra, numunelerin etrafını hidrofobik bir bariyer kalemle çizin, proteaz IV içeren başka bir boyama kabına daldırın ve 40 °C'de 45 dakika fırında inkübe edin.
      NOT: Yetişkin fareler için proteaz IV'ü öneririz. P0 gibi daha genç fareler kullanıyorsanız, 30 dakika boyunca proteaz III gibi daha hafif bir enzim kullanmanızı öneririz. Farklı yaşlar için sorun giderirken, tendonun bütünlüğünü gözlemleyin ve bozulma olup olmadığını kontrol edin. Doku ayrışıyor veya bozuluyorsa, inkübasyon süresini azaltın veya kullanılan proteazı değiştirin.
    3. Numuneleri tekrar TEG tamponunda 30 dakika yıkayın ve ardından probları ISH protokolüne14 göre hibritleyin.
    4. Numunenin üzerine 50-100 μL montaj reaktifi ekleyin. Mikroskopi için numunelerin üzerine bir lamel yerleştirin. Görüntüleme yaparken, sinyali görüntülemek için yüksek bir büyütme (40x objektif veya daha yüksek) kullanın.

3. HCR ISH protokolü15 adaptasyonu

  1. Sonradan Tespit
    1. PBS'de %4 PFA (PBS'de), PBT çözeltisi (PBS'de %0.1 Tween-20) ve PBS'de Proteinaz K (stok konsantrasyonu 10 mg/mL, nihai konsantrasyon 5 μg/mL) hazırlayın.
    2. İlk sonek adımına başlamak için, slaytları 5 dakika boyunca %4 PFA içeren bir boyama kabına daldırın; daha sonra %4 PFA solüsyonunu çıkarın ve sonraki adımlarda kullanmak üzere saklayın. Slaytları PBT solüsyonunda 2 x 5 dakika durulayın ve PBT solüsyonunu çıkarın. Slaytları 5 dakika boyunca Proteinaz K çözeltisi (5 μg/mL) içeren bir boyama kabına koyun ve 2 x 5 dakika PBT çözeltisinde durulayın.
    3. İkinci sonek adımına başlayın ve slaytları 5 dakika boyunca %4 PFA'ya daldırın.
      NOT: Bu, adım 3.1.2'den kaydedilen %4'lük PFA'nın aynısıdır.
    4. Slaytları PBT solüsyonunda 3 x 5 dakika durulayın.
      NOT: Tüm sabitleme sonrası adımlar, bir sürgülü raf üzerindeki slaytlarla ve ilgili solüsyonları içeren boyama kaplarında yapılır.
  2. Asetilasyon
    1. 625 μL asetik anhidrit, 3.3 mL 1 M trietanolamin (TEA) tamponu ve 246 mL ddH2O içeren asetilasyon solüsyonunu hazırlayın. İyice karıştırdığınızdan ve hazırlandıktan hemen sonra kullandığınızdan emin olun.
    2. Slaytları 10 dakika asetilasyon solüsyonuna yerleştirin ve ardından PBT solüsyonunda 3 x 5 dakika durulayın. Slaytları ddH2O'da durulayın ve 30 dakika kurumaya bırakın. Ardından, hidrofobik bir bariyer kalemle numunelerin etrafını çizin.
      NOT: Tüm asetilasyon adımları, bir sürgülü raf üzerindeki slaytlarla ve ilgili solüsyonları içeren boyama kaplarında yapılır.
  3. Hibridizasyon
    1. Hibridizasyon tamponunu 37 °C'ye önceden ısıtın ve nemlendirilmiş bir odayı 37 °C'ye ısıtın.
      DİKKAT: Tampon, tehlikeli bir madde olan formamid içerir. Slaytlar yeterince kuru değilse, fazla dH2O'yu çıkarmak için kenarları bir laboratuvar bezi ile kurulayın.
    2. 100 μL hibridizasyon tamponuna her prob karışımından 0,4 pmol ekleyerek prob çözeltileri hazırlayın.
      NOT: dHCR görüntüleme kullanılıyorsa, prob hibridizasyon verimliliğini artırmak için daha yüksek bir prob konsantrasyonu kullanın.
    3. 3 M NaCl (4 L'lik son hacimde 701.1 g NaCl) ve 0.3 M Na3CH6H5O7•2H2O (352.8 g) birleştirerek 4 L Sodyum Klorür Sodyum Sitrat Tamponu (20x SSC) hazırlayın ve ardından HCl veya 10 N NaOH ekleyerek nihai pH'ı 7'ye ayarlayın. 4 L'ye ulaşmak için yeterli H2O ekleyin. 20x SSC'yi 5x'e seyrelterek ve toplam hacmin% 0.1'i olacak şekilde% 10 Tween 20 ekleyerek 5x SSCT hazırlayın.
    4. Numuneye 200 μL hibridizasyon tamponu ekleyin, slaytları nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin ve slaytların 10 dakika inkübe etmesine izin verin. Hibridizasyon solüsyonunu çıkarın ve kenarları bir laboratuvar mendili ile lekeleyerek sürgü üzerindeki fazla tamponu boşaltın.
    5. Hazırlanan prob çözeltisinden 100 μL'yi numunenin üzerine ekleyin ve numunenin üzerine bir lamel yerleştirin. Gece boyunca bir fırında veya yaklaşık 12-16 saat, 5x SSC ve% 50 formamid içeren bir çözelti ile nemlendirilmiş bir odada inkübe edin. Sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayın.
      NOT: Kuluçka gece boyunca olduğundan, lamel ilavesi buharlaşmayı en aza indirmek içindir.
    6. 37 ° C'lik bir su banyosunda 5x SSCT çözeltisinden oluşan bir alikot ve RT'de ikinci bir alikot bırakın. Bir sonraki adımda numune numarasına ve yıkama sayısına bağlı olarak ihtiyaç duyulan bu alikotların hacimlerini tahmin edin.
  4. Yıkama
    1. Önceden ısıtılmış 5x SSCT çözeltisini kullanarak, %75 yıkama tamponu/%25 5x SSCT, %50 yıkama tamponu/%50 5x SSCT ve %25 yıkama tamponu/%75 5x SSCT solüsyonu hazırlayın.
    2. Fazla probları çıkarmak için, slaytları yıkama başına 15 dakika boyunca 37 °C'de %75 yıkama tamponu/%25x SSCT, %50 yıkama tamponu/%50x SSCT ve %50 yıkama tamponu/%25 5x SSCT'ye daldırın. Lamellerin numunelerden kaymasına izin verin.
    3. Slaytları %100 5x SSCT ile 2 x 15 dakika inkübe edin ve ardından RT'de 5 dakika boyunca 5x SSCT'ye daldırın.
      NOT: Yıkama adımları, bir sürgülü raf üzerindeki slaytlarla ve ilgili solüsyonları içeren boyama kaplarında veya damlacıklar halinde eklenen solüsyonlarla yapılabilir.
  5. Amplifikasyon
    1. 6 μL saç tokası h1 ve 6 pmol saç tokası h2'yi 2 μL'lik 3 μM'lik bir stoğu çırparak hazırlayın (95 °C'de 90 saniye ısıtın ve RT'ye soğutun). Bu işlem sırasında saç tokalarını ışıktan koruyun.
      NOT: HCR saç tokaları h1 ve h2, bir saç tokası saklama tamponunda sağlanır ve ani soğutma için hazırdır. Cool h1 ve h2 saç tokalarını ayrı tüplere oturtun.
    2. Slaytları kenarlarını bir laboratuvar mendiliyle lekeleyerek kurulayın. Ardından, numunenin üzerine 200 μL amplifikasyon tamponu ekleyin ve RT'de 30 dakika boyunca nemlendirilmiş bir odaya yerleştirin. RT'de 100 μL amplifikasyon tamponuna snapcool h1 saç tokaları ve snapcool h2 saç tokaları ekleyerek saç tokası karışımını hazırlayın.
    3. Amplifikasyon tamponunu çıkarın ve kenarları bir laboratuvar mendiliyle lekeleyerek sürgü üzerindeki fazla sıvıyı boşaltın. Önceden hazırlanmış firkete karışımından 100 μL ekleyin ve numunenin üzerine parafilm yerleştirin. Slaytları RT'de karanlık, nemlendirilmiş bir odada en az 4 saat veya gece boyunca inkübe edin.
    4. Fazla saç tokalarını çıkarmak için, slaytları bir boyama kabına 5x SSCT'ye daldırın ve RT'de 30 dakika inkübe edin. Yıkamayı taze 5x SSCT'de 30 dakika ve üçüncü kez 5 dakika tekrarlayın.
    5. Kenarları bir laboratuvar mendili ile kurulayarak slaytları kurulayın ve numunenin üzerine 50-100 μL montaj reaktifi ekleyin. Mikroskopi için numunelerin üzerine bir lamel yerleştirin. Görüntüleme yaparken, sinyali görüntülemek için yüksek bir büyütme (40x objektif veya daha yüksek) kullanın.

Sonuçlar

figure-results-1
Şekil 1: RNAScope kullanılarak yetişkin fare Aşil tendonunda Poli A RNA ekspresyonu. Ticarileştirilmiş ISH testi kullanılarak fare Aşil tendonunda (sol panel) başarılı Poly A etiketlemesinin temsili görüntüsü. DAPI ile kolokalizasyon, probun özgüllüğünü (orta ve sağ paneller) doğrulayarak arka plan gürültüsünün kontrolüne izin verir. Görüntüler Leica SPE Konfokal Mikroskop ile 63x'te çekildi. Ölçek çubukları = 20 μm. Kısaltmalar: ISH = yerinde hibridizasyon; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: RNAScope kullanılarak P0 fare Aşil tendonunda Poli A RNA ekspresyonu. Ticarileştirilmiş ISH testi kullanılarak P0 fare kalkaneusunda (sol panel) başarılı Poly A etiketlemesinin temsili görüntüsü. DAPI ile kolokalizasyon ve minimum arka plan gürültüsü, probun özgüllüğünü doğrular (orta ve sağ paneller). Tendon kesikli bir çizgi ile işaretlenmiştir. Görüntüler ZEISS Axio Imager mikroskobu ile çekildi. Ölçek çubukları = 20 μm. Kısaltmalar: ISH = yerinde hibridizasyon; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu protokol, araştırmacıların ticari olarak temin edilebilen in situ hibridizasyon araçlarını kullanmalarına ve bunları yetişkin tendon dokusunda kullanım için uyarlamalarına yardımcı olacaktır. Bu sonuçta, farklı genlerin transkripsiyon seviyelerini uzamsal olarak bilgilendirilmiş tek hücre çözünürlüğünde analiz etmemizi sağlar. Bir ISH testinin başarılı bir şekilde çalıştırılması, ilgilenilen hedefler için yüksek özgüllüğe ve minimum arka plan gürültüsüne sahip olacaktır. Protokol hem yetişkin hem de neonatal Aşil tendonlarında kullanılabilir (Şekil 1, Şekil 2, Şekil 3 ve Şekil 4). Poli A, numunede beklenen RNA seviyelerinin olduğunu kalitatif olarak doğrulayarak başarılı bir çalıştırmayı doğrulamaya yardımcı olmak için bir kontrol olarak kullanılabilir.

Bununla birlikte, ISH protokollerinin sorun gidermeye ihtiyaç duymasının birkaç yolu vardır. Örneğin, Şekil 5 , hücrelerin gerçekten mevcut olduğunu gösteren DAPI karşı boyasına rağmen, tendonun birkaç bölgesinde Poli A sinyalinin bulunmadığı şekilde, tendondaki Poli A'nın yetersiz prob hibridizasyonunu göstermektedir. Ayrıca, uzatılmış proteinaz K inkübasyon süresi boyunca HCR'deki son düzeltme adımlarında (Şekil 6) veya uzatılmış proteaz IV inkübasyonu yoluyla RNAScop'taki ön tedavi adımlarında doku aşırı sindirilirse, doku morfolojisi bozulabilir. Son olarak, Şekil 7 , RNA hibridizasyon probu eklenmezse, ancak yine de bir nükleer karşı leke kullanılırsa, negatif bir kontrolün nasıl görüneceğine dair bir örnektir.

figure-results-3
Şekil 3: HCR kullanılarak yetişkin fare Aşil tendonunda skleraksi RNA ekspresyonu. HCR kullanılarak yetişkin fare Aşil tendonunda (sol panel) başarılı skleraksi RNA etiketlemesinin temsili görüntüsü. DAPI nükleer bir karşı leke (orta panel) olarak kullanılır. DAPI ile kolokalizasyon, probun özgüllüğünü doğrular (sağ panel). Görüntüler Leica SPE Konfokal Mikroskop ile 63x'te çekildi. Ölçek çubukları = 20 μm. Kısaltmalar: HCR = hibridizasyon zincir reaksiyonu; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: HCR kullanılarak P0 fare Aşil tendonunda Poli A RNA ekspresyonu. HCR kullanılarak P0 fare Aşil tendonunda Poly A RNA etiketlemesinin temsili görüntüsü. DAPI ve Poly A, kalkaneusun hem kemiğini hem de Aşil tendonunu etiketler (sırasıyla sol ve sağ paneller). Hem DAPI hem de Poly A problarının her iki dokuda kolokalizasyonu ve minimum arka plan gürültüsü, başarılı bir HCR çalışmasını doğrular (sağ panel). Görüntüler ZEISS Axio Imager mikroskobu ile çekildi. Ölçek çubukları = 20 μm. Kısaltmalar: HCR = hibridizasyon zincir reaksiyonu; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: P0 fare Aşil tendonunda Poly A RNA probları ile başarısız HCR çalışması. HCR kullanılarak P0 fare Aşil tendonunda başarısız Poli A RNA etiketlemesinin temsili görüntüsü. DAPI, kalkaneusun kemik ve tendonundaki çekirdekleri etiketledi (sol panel), ancak Poly A HCR probu tüm tendon boyunca nüfuz etmedi (orta ve sağ panel, beyaz ok uçlarına bakın). Bununla birlikte, Poly A kemiğin çoğunu başarıyla etiketledi. Görüntüler ZEISS Axio Imager mikroskobu ile çekildi. Ölçek çubukları = 20 μm. Kısaltmalar: HCR = hibridizasyon zincir reaksiyonu; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Aşırı sindirilmiş yetişkin fare Aşil tendonunda HCR Poly-A etiketleme örneği. HCR kullanılarak aşırı sindirilmiş bir yetişkin fare Aşil tendonunda Poly A RNA etiketlemesinin temsili görüntüsü. Poli A ve DAPI bu örnekte (sağ panel) doğru bir şekilde birlikte lokalize olur, ancak tendonun tipik tek eksenli morfolojisi bozulur (beyaz ok uçları). Görüntüler ZEISS Axio Imager mikroskobu ile çekildi. Ölçek çubukları = 20 μm. Kısaltmalar: HCR = hibridizasyon zincir reaksiyonu; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Yetişkin fare Aşil tendonunda Poly A RNAscope için negatif kontrol. Poly A probunun eklenmediği, ancak amplifikasyon problarının eklendiği Poly A RNA etiketlemesi için negatif kontrolün temsili görüntüsü. Beklendiği gibi, DAPI çekirdeği başarıyla etiketledi (sol panel), ancak Poly A (orta panel) için sinyal yoktu. Görüntüler ZEISS Axio Imager mikroskobu ile çekildi. Ölçek çubukları = 20 μm. Kısaltma: DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu yazıda, tendon dokusunda yüksek derecede özgüllük ve duyarlılıkla kullanılabilecek şekilde mevcut ISH araçlarından yararlanmak için yapılan modifikasyonları açıklıyoruz. Tendon oldukça matris yoğun bir doku olduğundan, benzer derecelerde prob penetrasyonu ve özgüllüğü elde etmek için protokol ayarlamaları sıklıkla yapılmalıdır. Bu spesifik permeabilizasyon yöntemleri ve tendon dokusunun sinyal amplifikasyon stratejileri, tartışılan ISH protokollerinin etkinliğini arttırmanın ayrılmaz bir parçasıdır. Bu adımlar olmadan, probların tendondaki RNA ile güçlü ve spesifik bir etkileşime sahip olması zordur.

RNAscope14'te, protokolün tendon dokusunda daha etkili çalışması için kullanılan ön tedavi tamponunda ayarlamalar yapılmalıdır. Daha spesifik olarak, TEG Tamponunun bir ön işlem olarak kullanılması, probların hedef RNA'ya erişimini iyileştirir. TEG Tamponuna ek olarak, proteaz IV tedavisi, 45 dakika ila 1 saat uzunluğunda olacak şekilde standart sürenin ötesine uzatılır. HCR15'te, yıkamaların uzunluğu arttırılmış ve RNA-FISH testinin başlamasından önce son düzeltme adımları eklenmiştir. Son ek adımları, %4 PFA, PBT, Proteinaz K ve asetilasyon çözeltisinde inkübasyon adımlarının eklenmesini içeriyordu. Toplu olarak, bu modifikasyonlar probun tendon RNA'sına erişimini iyileştirmeye ve arka plan gürültüsünü azaltmayayardımcı olur 16,17. Bununla birlikte, bu protokol modifikasyonları, kullanılan ön işlem solüsyonlarını modifiye ederek ve probun RNA'ya bağlanması için erişilebilirliği artırmak için son fiksasyon adımları ekleyerek ISH'de kullanılan probların özgüllüğünü ve hassasiyetini artırmaya yardımcı olsa da, prob tasarımı tarafından oluşturulan sınırlamalar vardır.

Problar için RNA erişilebilirliğinin ortaya çıkardığı zorlukları iyileştirmek için, ISH testlerini optimize etmek için ek değişiklikler yapılabilir. mRNA15'in dijital mutlak kantitasyonu için bir yöntem olan dHCR görüntüleme kullanılacaksa, prob hibridizasyon verimliliğini artırmak için probun konsantrasyonunun arttırılması önerilir. Ayrıca, amplifikasyon adımlarında daha kısa bir süre kullanılması, tek moleküllü noktaların kırınım açısından sınırlı olmasını sağlar. Daha uzun kuluçka süreleri, görüntüleme sırasında kastan daha yüksek otofloresan ile sonuçlanabilir. Seçilen tendon yetişkin murin Aşil tendonundan daha yoğun ve / veya daha büyükse,% 4 PFA fiksasyon adımının süresinin uzatılmasını öneririz.

Yukarıda belirtilen ticari ISH protokollerinde yapılan bu değişiklikler, daha uzun ön tedavi veya fiksasyon adımları gerektiren yetişkin fare dokusu veya daha yoğun dokular için en yararlıdır. Mevcut protokollerde yapılan bu modifikasyonlar, probların RNA'ya erişilebilirliğini iyileştirmeye yardımcı olsa da, bazı problar, hedef RNA motiflerinin erişilebilirliğine bağlı olarak, yaşlı farelerde genç farelerde veya yenidoğanlarda olduğundan daha yüksek bir konsantrasyon veya daha uzun bir inkübasyon süresi gerektirebilir. RNAscope'un ön tedavi adımlarında proteaz kullanımı ile ilgili olarak, yetişkin fare tendonları için 45 dakika proteaz IV, yenidoğan tendonları için 30 dakika proteaz III kullanılmasını öneririz. Testin etkinliğini değerlendirmek, protokoldeki herhangi bir ayarlamayı değerlendirmek veya numuneler arasındaki ekspresyonunu genel olarak karşılaştırmak için çeşitli kontroller kullanılabilir. Örneğin, bir Poly A probu, çalışmanın özgüllüğünü değerlendirmek, numunedeki RNA dağılımını/bozunmasını değerlendirmek ve RNA'nın problar tarafından erişilebilir olduğunu doğrulamak için kullanılan bir nükleer karşı boyama ile karşılaştırılabilir. Benzer şekilde, temizlik genleri için problar da RNA erişilebilirliğine erişmek için kontrol görevi görebilir. Bilinen ifade desenlerine sahip hedeflere sahip pozitif denetimler, özgüllüğün doğrulanmasına yardımcı olur ve negatif denetimler, olası spesifik olmayan bağlamaların değerlendirilmesine yardımcı olur.

Genel olarak, dokuların mekansal gen ekspresyon profilini daha iyi anlamak için çeşitli teknikler geliştirildiğinden, sonuçları doğrulamak için daha fazla yönteme ihtiyaç vardır. Özellikle, tek hücreli RNA Seq gibi tahliller, gen ekspresyonunu değerlendirmek için popüler araçlar olarak ortaya çıkmaktadır, ancak sonuçlarının daha yüksek bir çözünürlükte mekansal olarak incelenmesi gerekmektedir. Buna yardımcı olmak için, ISH tahlilleri, daha kantitatif tahliller tarafından üretilen transkriptomik verilerin uzamsal bağlamını daha iyi anlamak ve doğrulamak için kullanılabilir. Tendonda, bu tür tahlillerin eşleştirilmesi, benzersiz hücre popülasyonlarına özgü belirteçleri uzamsal olarak doğrulayarak entez, tendon orta gövdesi ve miyotendinöz kavşakta bulunan hücreleri daha fazla karakterize etmeye yardımcı olacaktır.

Açıklamalar

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, bu protokollerin geliştirilmesi ve sorun giderme konusundaki destekleri ve teşvikleri için Jenna Galloway'e ve Galloway Lab üyelerine teşekkür eder.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 M trietanolamin tamponu
%10 Formalin çözeltisi
%10 Ara-20
20x Tuzlu Sodyum Sitrat tamponu
%4 PFA
ACD RNAscope Floresan Multipleks Floresan Reaktif Kiti V2ACD323100
Asetik Anhidrit
Axio Görüntüleyici MikroskobuZEISS
C57BL/J6 fareler JAX ID: 000664
LamelFisher 12-541-042
ddH2O
ETDAThermofisherAM9262
EtOH
Glikoz VWRKimyasalları BDHBDH9230-500G
HCR RNA-FISH BundleMoleküler Aletler A.Ş.
HybEZ II Hibridizasyon SistemiACD
İmmedge Bariyer KalemVektör LaboratuvarlarıH4000
Leica SPE Konfokal MikroskopLeica
ParafilmFisher
Fosfat tamponlu salin (PBS, 1x)İnvitrojenAM96251x çözelti elde etmek için 10x PBS'yi mili-Q suda seyreltin
Proteaz IV
Proteinaz KRoche3115836001
RNAscope H2O2 ve Proteaz ReaktifleriACDPN 322381ACD RNAscope Floresan Multipleks Floresan Reaktif Kiti V3'te Bulunur
RNAscope Multipleks Floresan Tespit KitiACDPN 323110ACD RNAscope Floresan Multipleks Floresan Reaktif Kiti V2
RNAscope Hedef Alma reaktiflerineACD322000ACD RNAscope Floresan Multipleks Floresan Reaktif Kiti V4'e
RNAscope Yıkama TamponuACDPN 310091ACD RNAscope Floresan Multipleks Floresan Reaktif Kiti V5
RNAscope  Prob SeyrelticiACD300041
Slayt tutucuStatLab4465A
Kapaklı BoyamaKabı StatLabLWS20WH
Superfrost Plus Mikroskop slaytlarıFisher1255015işlenmiş, şarjlı slaytlar
Tris-HCl
KsilenSigma-Aldrich534056-4L
dahildir dahildir

Kaynaklar

  1. Sharma, P., Maffulli, N. Tendon injury and tendinopathy: healing and repair. Journal of Bone and Joint Surgery. 87 (1), 187-202 (2005).
  2. Brent, A. E., Schweitzer, R., Tabin, C. J. A somitic compartment of tendon progenitors. Cell. 113 (2), 235-248 (2003).
  3. Noden, D. M. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).
  4. Chen, J. W., Galloway, J. L. The development of zebrafish tendon and ligament progenitors. Development. 141 (10), 2035-2045 (2014).
  5. Schweitzer, R., et al. Analysis of the tendon cell fate using Scleraxis, a specific marker for tendons and ligaments. Development. 128 (19), 3855-3866 (2001).
  6. Tsai, S., Nödl, M., Galloway, J. Bringing tendon biology to heel: Leveraging mechanisms of tendon development, healing, and regeneration to advance therapeutic strategies. Developmental Dynamics. 250 (3), 393-413 (2021).
  7. Kannus, P., et al. Location and distribution of non-collagenous matrix proteins in musculoskeletal tissues of rat. The Histochemical Journal. 30 (11), 799-810 (1998).
  8. Kannus, P. Structure of the tendon connective tissue. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 10 (6), 312-320 (2000).
  9. Thorpe, C. T., Birch, H. L., Clegg, P. D., Screen, H. R. C. The role of the non-collagenous matrix in tendon function. International Journal of Experimental Pathology. 94 (4), 248-259 (2013).
  10. Lin, T. W., Cardenas, L., Soslowsky, L. J. Biomechanics of tendon injury and repair. Journal of Biomechanics. 37 (6), 865-877 (2004).
  11. Grinstein, M., et al. A distinct transition from cell growth to physiological homeostasis in the tendon. eLife. 8, e48689(2019).
  12. Villaseñor, S., Grinstein, M. Two-photon microscopy for the study of tendons. Journal of Visualized Experiments. , e65853(2023).
  13. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288(2018).
  14. Wang, F., et al. RNAscope®: A Novel In Situ RNA Analysis Platform for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  15. Choi, H. M. T., et al. Third-generation situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145 (12), 165753(2018).
  16. Jackson, D. J., Herlitze, I., Hohagen, J. A whole mount in situ hybridization method for the gastropod mollusc Lymnaea stagnalis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53968(2016).
  17. Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806(2020).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Uzamsal Gen fadesiTendon Dokusun Situ HibridizasyonTek H cre RNATranskriptomik Y ntemlerSinyal AmplifikasyonuProb Tasar mMatriks Zengin DokularHistolojik KesitlerGen fadesi Analizi
Video yakında

İlgili makaleler