Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Tendonların incelenmesi için iki foton mikroskobu

794 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/65853

⸱

29 Mart 2024

 , 
1Center for Regenerative Medicine, Department of Orthopedic Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Harvard Stem Cell Institute, 3Center Of Regeneration and Longevity (CORAL), Tel-Aviv Sourasky Medical Center

Bu makalede

Özet

Bu makale, multifoton mikroskobu kullanılarak tendonların hazırlanması, kurulması ve görüntülenmesi sürecini özetlemektedir. Ek olarak, kollajen fibril hizalamasını analiz etmek için SHG uygulamasını ve tendonların 3 boyutlu bir temsilinin oluşturulmasını kapsar. Bu metodoloji, yaralanma ve gelişim sırasında tendon hücrelerini ve ECM'lerini karakterize etmede oldukça değerli olduğunu kanıtlamaktadır.

Özet

İki foton mikroskobu, derin doku hücrelerini değerlendirmek ve çeşitli biyolojik sistemlerde hücre dışı matrisin (ECM) hizalanmasını karakterize etmek için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu teknik, iki farklı sinyali tespit etmek için doğrusal olmayan ışık-madde etkileşimlerine dayanır: kollajen liflerinin görselleştirilmesini ve oryantasyonlarını kolaylaştıran ikinci harmonik üretilen (SHG) difüzyon sinyali ve ultraviyole uyarılmış otofloresan görüntüleme için yakın kızılötesi uyarma sinyali.

SHG görüntüleme, fibriller kollajen I'in sentrosimetrik olmayan kristal yapısı nedeniyle kollajen liflerinin görüntülenmesinde özellikle etkili olduğunu kanıtlamaktadır. Tendonların sınırlı sayıda hücreye sahip matris açısından zengin dokular olduğu göz önüne alındığında, yüksek kollajen içeriği onları iki foton mikroskobu kullanılarak analiz için ideal adaylar yapar. Sonuç olarak, iki foton mikroskobu, tendonlardaki kollajen anormalliklerini analiz etmek ve karakterize etmek için değerli bir araç sunar. Uygulaması, tendon gelişimini, yaralanmalarını, iyileşmesini ve yaşlanmasını incelemeye kadar uzanır ve iki foton mikroskobu araçları kullanılarak tendon hücrelerinin kapsamlı karakterizasyonunu ve çeşitli koşullar altında ECM ile etkileşimlerini sağlar. Bu protokol, tendon biyolojisinde iki foton mikroskobunun kullanımını ana hatlarıyla belirtir ve gelişim sırasında ve yaralanma sonrasında tendon hücrelerinin etkili bir şekilde görüntülenmesi ve karakterizasyonunun elde edilmesi için uyarlanmış bir metodoloji sunar. Yöntem, tendonlar ve bu matris ile etkileşime giren hücreler içindeki ECM'nin kapsamlı bir görüntüsünü oluşturmak için ince mikroskobik kesitlerin kullanılmasına izin verir. En önemlisi, makale, hayvan modellerinde iki foton mikroskobu kullanarak 3D görüntüler oluşturmak için bir teknik sergiliyor.

Giriş

Düzgün bir şekilde çalışması ve kuvveti kastankemiğe 1 iletmesi için tendonlar, kollajen lifleri arasındaki moleküller arası ve molekül içi bağlara güvenir. Kollajen liflerinin karmaşık kendi kendine montajı, çapraz bağlanması ve hizalanması, tendon dokusunun 2,3,4 biyomekanik mukavemetine ve esnekliğine katkıda bulunan oldukça organize bir matrisin kurulmasıyla sonuçlanır. Diğer ECM proteinleri de tendonlardaki5 fibriller ağın stabilitesine katkıda bulunsa da, tendon kuru kütlesi yaklaşık% 86 kollajen6'dır ve kollajen I, toplam kollajen içeriğinin% 96'sını oluşturur 7,8. Bu sonuçta kollajen yapısını normal tendon sağlığı ve fonksiyonunun önemli bir çıktısı haline getirir.

Tendonlar için kullanılan bazı klinik görüntüleme yöntemleri MRG ve/veya ultrasondur. Ultrason teknolojisi, tendonun fasiküler yapısının görüntülerini sağlarken ve dokudakifibriler yapının bir kısmını ortaya çıkarırken9, çözünürlük miktar tayini için ideal değildir. MRG, ultrason görüntülemeden daha iyi uzamsal çözünürlüğe sahiptir, ancak yine de sınırlıdır. Bununla birlikte, bu yöntemler aynı zamanda bir doku yoluyla potansiyel görüntüleme derinliklerinde de sınırlıdır. Daha mikro ölçekte, kollajen fibrillerinin yapısını ve olası anormallikleri değerlendirmek için küçük ve geniş açılı ışık saçılımı ve konfokal mikroskopi kullanılabilir.

Buna karşılık, ikinci harmonik nesil (SHG) mikroskobu, kollajen fibrillerinin dış kabuğunu yakalayabildiği için diğer görüntüleme yöntemlerinden farklıdır. Tendonlardaki kollajen I fibrilleri, tendon ECM boyunca tek eksenli paralel bir şekilde düzenlenir ve doğası gereği sentrosimetrik değildir 4,10. Bu özellikler, konfokal görüntülemeden 2-3 kat daha derin net görüntüler üretebilen bir çoklu foton mikroskobu kullanılarak görüntüleme için kullanılabilir11. Bu aynı zamanda tendonun daha kaliteli optik kesitlerini oluşturmamızı sağlar. İlgilenilen örneğe ışık yansıtıldığında, bir SHG sinyali üretilir ve bu ışık saçılımı yakalanabilir. Tendonlarda bu, kollajen yapısının ve hizalamasının bir görüntüsünü üretir, böylece tendinopatilerin, yaralanmaların vb. potansiyel morfolojik ve patolojik sonuçlarını değerlendirmemize olanak tanır.

Kollajen, tendon kuru kütlesinin çoğunu oluşturduğundan ve tendon fonksiyonuna katkıda bulunduğundan 6,12, kollajen yapısının bozulması tendonların biyomekanik özelliklerini etkileyebilir. Bu nedenle, yapısını analiz etmek, yaralanmaların etkisini ve ciddiyetini daha iyi anlamamıza ve iyileşme etkinliği için bir ölçü oluşturmamıza yardımcı olabilir. Bu makale, gelişim ve yaralanmaların kollajen I fibrillerinin yapısını ve hizalamasını nasıl etkilediğini analiz etmek ve hayvan modellerinde tendon ECM'nin 3D görüntülerini oluşturmak için multifoton ve SHG mikroskobu kullanan bir yöntemi gözden geçirmektedir. Bu nedenle, tendonları görüntüleme yöntemimiz, araştırmacıların gelişim sırasında veya yaralanma sonrasında tendon hücrelerini ve ECM'yi karakterize etmelerine yardımcı olabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Massachusetts General Hospital'da Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) (Protokol #2013N0000062) ve AAALAC yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi. Bu çalışma için Scx-GFP arka planında, 30 günlükken BHLHE40 boş nakavt veya heterozigot dişi fare kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz.

1. Doku hazırlama ve fiksasyon

  1. Dokuyu hazırlamak için, fareleri bir CO2 odasında (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) ötenazi yapın ve ardından servikal çıkık yapın.
  2. Doku örneğine yapışabilecek kürk miktarını azaltmaya yardımcı olmak için, kürk doygunluğa ulaşana kadar fareye %70 EtOH püskürtün. Arka ayakların derisini sürün ve ardından makas kullanarak kalça eklemini keserek iki arka ayağı çıkarın.
  3. İki arka ayağı 20 mL'lik bir parıldama şişesine yerleştirin ve şişenin dolması için% 4 PFA'ya daldırın. Şişeleri gece boyunca çalkalayarak 4 °C'ye yerleştirin.
  4. Arka ayakları 1x PBS'de oda sıcaklığında (RT) 10 dakika çalkalayarak yıkayın ve toplam 3 kez tekrarlayın. Arka ayakları 4 ° C'de 0,5 M EDTA'ya (pH 8.0) daldırın ve 2 haftaya kadar çalkalayın ve her 2-3 günde bir taze EDTA ile değiştirin.
  5. Arka ayakları RT'de 1x PBS'de 10 dakika çalkalayarak yıkayın, yıkamaları toplam 3 kez tekrarlayın.
  6. Uzuvları taze 1x PBS'ye daldırın ve görüntüleme için kullanılana kadar 4 °C'de saklayın.

2. Tendonun diseksiyonu ve görüntüleme için doku hazırlanması

  1. Ayağı forseps ile tutarken, yaylı makasın bıçağının bir ucunu ( Malzeme Tablosuna bakınız) Aşil tendonunun altına kaydırın ve miyotendinöz kavşağa mümkün olduğunca yakın kestiğinizden emin olun.
  2. Tendonun kopmuş miyotendinöz ucunu forseps ile tutun ve tendonu kemiğe mümkün olduğunca yakın kesmek için yaylı makası kullanın.
    NOT: Gerekirse, ilk kesim sırasında Aşil tendonunu arka bacağın geri kalanından uzak tutmaya yardımcı olmak için forseps kullanın. Görüntüleme sırasında kollajen hizalamasını etkileyeceği için dokuyu ezmemeye veya zarar vermemeye dikkat edin.
  3. Geçirgenlik sağlamak ve nükleer bir karşı lekeye sahip olmak için, disseke edilmiş tendonu PBT'ye (PBS'de %1 Triton-X) %0.1 Draq5 (stok konsantrasyonu, 5 mM, Malzeme Tablosuna bakınız) daldırın. Tendonu 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve 1 mL PBT'ye 1 uL Draq5 ekleyin. Bir rocker üzerinde RT'de gece boyunca kuluçkaya yatırın. Draq5 ışığa duyarlı olduğundan, mikrosantrifüj tüplerini alüminyum folyo ile kapatın ve numuneleri ışıktan koruyun.
  4. Görüntülemeden önce Draq5 solüsyonunu çıkarın ve dPBS ile değiştirin. Numuneyi ışıktan korumaya devam ettiğinizden emin olun.
    DİKKAT: Draq5, kategori üç toksisiteye sahiptir ve OSHA Tehlike İletişim Standardı tarafından tehlikeli olarak kabul edilir. Temastan kaçının ve etiketli bir atık kabına atın.
  5. İç çapı 6 mm olan bir biyopsi delme aleti kullanarak, bir parça jel köpüğü kesin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 60 x 15 mm'lik küçük bir Petri kabına yerleştirin. Jel köpüğün genişlemesini sağlamak için tabağa ddH2O ekleyin.
  6. Disseke edilmiş Aşil tendonunu jel köpüğü üzerine yerleştirin. Bir rondelaya yapıştırılmış bir lamel kullanarak, lamel doku ile temas edene kadar rondelayı dikkatlice tendonun üzerine yerleştirin. Görüntüleme sırasında sorun yaşamamak için, numune ile lamel arasında hava kabarcığı olmadığından emin olun. Gerekirse, numuneyi ve yıkayıcıyı lamel ile kaplamak için tabağa daha fazla ddH2O ekleyin.

3. Çoklu foton mikroskobu ile görüntüleme

  1. Bir FVMPE-RS çoklu foton lazer mikroskobu, suya daldırılabilen 25x objektif, HPDS-O IR darbeli lazer ve IR darbeli lazer (Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak, EPI ışık yolu kullanılarak görüntülenecek numuneyi ve ilgilenilen bölgeyi bulun. Örnek bulunduktan sonra, kamerayı Aşil tendonunun miyotendinöz veya entezyal ucuna ayarlayın.
  2. Işık yolunu LSH'ye getirin, Lazer 2'nin IR Lazer ayarını 840 nm'ye ayarlayın ve aktif olarak hizalayın. HV gücünü, dokuyu ve SHG sinyalini %20'yi aşmadan görebilecek şekilde ayarlayın. Kazancı ayarlamayın ve ofseti 0'a eşit tutun.
  3. Ardından, örnek görüntüleri almak için z-stack parametrelerini yapılandırın. 1024 x 1024 tarama boyutu kullanın ve adım boyutunu 0,4 mikron olarak ayarlayın. Z-yığınları ortalama olarak yaklaşık 150 dilimdir ve dış kılıftan başlar ve SHG sinyali artık net olmayana kadar tendonun merkezine doğru hareket eder ve sagital optik bölümlerüretir 13.
  4. Sinyal algılama standardizasyonuna izin vermek için lazer gücünü Parlak Z moduna ayarlayın. Z yığını başlatma/durdurma parametreleri oluşturulduktan sonra, lazer yoğunluğunu görüntülemenin başlangıcında 4 ve görüntülemenin sonunda 6 olarak ayarlayın. Bu, dürbün dokunun daha derinlerine inerken SHG sinyalinde tutarlılığın korunmasına yardımcı olur.
  5. Z-yığınları oluşturulduktan sonra, enine yönde optik bölümlerden oluşan bir film oluşturmak için bunları ImageJ/FIJI'de daha fazla işleyin. Bunu yapmak için ImageJ/FIJI yazılımını14 açın ve Image > Stacks > Reslice'a tıklayın. Bu, Aşil tendonunun enine bir görünümüne sahip olmamızı sağlayacak ve tenositlerin yıldız morfolojisini ve kollajen matrisindeki yönelimlerini ortaya çıkaracaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokol, tendon hücrelerini ve hücre dışı matrislerini (ECM) yaralanma sonrası, gelişim sırasında veya mutant bir durumda karakterize etmek için kullanışlıdır. Numunenin dikkatli bir şekilde diseksiyonu ve hazırlanması ile, doku boyunca sagital oryantasyonda z-stack videoları oluşturulabilir (Video 1 ve Video 2). Görüntüleri işlemek ve yeniden dilimlemek için ImageJ/FIJI kullanılarak, Aşil tendonunun enine bir görünümü oluşturulur (Video 3 ve Video 4...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu makale, tendon ECM'nin sentrosimetrik olmayan kristal özelliklerini kullanarak fare Aşil tendonunu hazırlamak, incelemek ve görüntülemek için bir yöntem sunar. Doku hazırlamadaki temel adımlar, karşı lekeler için geçirgenliği ve görüntüleme sırasında bir petri kabına uygun doku yerleşimini sağlamayı içerir. Draq5 yerine, Hoechst 33258 1:100.000 seyreltmede13 kullanılabilir, ancak yüksek geçirgenliği, fotostabilitesi ve minimum fotoağartma nedeniyle Draq5 tercih...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar, bu protokollerin geliştirilmesi ve sorun giderme konusundaki destekleri ve teşvikleri için Jenna Galloway'e ve Galloway Lab üyelerine teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.5 M EDTA pH 8.0InvitrogenAM9262
2 mL mikrosantrifüj tüpleriUSA Scientific1620-2700
20 mL sintilasyon şişesiSigma-AldrichZ190527-1PAK
%4 ParaformaldehitElektron Mikroskobu Bilimleri50-980-487%4 PFA çözeltisi oluşturmak için PFA ampuol kullanın
6 mm Biyopsi Punch ToolTed Pella, Inc. 15111-60
60 x 15 mm petri kabı
BHLHE40 Scx-GFP arka planında boş nakavt veya heterozigot fareler Jackson LaboratuvarıJAX ID #029732MGI ID #3717419
LamellerFisher12-544-FM20 yıkayıcı dPBS alanını kapsayan herhangi bir lamel kullanabilir
Gibco14190144
Draq5ABCAMab108410
İnce makas 21 mm kesme kenarıGüzel Bilim Araçları14060-10
FVMPE-RS çoklu foton lazer tarama mikroskobuOlympus
Gelfoam Steril Sünger Boyut 50 Pfizer00009-0323-01
INSIGHT X3-OL IR darbeli lazerOlympus
MaiTai HPDS-O IR darbeli lazerOlympus
Fosfat Tamponlu Salin (1x)InvitrogenAM96251x çözelti elde etmek için 10x PBS'yi mili-Q suda seyreltin
Paslanmaz çelik M20 düz yıkayıcı McMaster-Carr
Triton X-100MP Biyomedikal807426%1 çözelti elde etmek için Triton X-100'ü dPBS'de seyreltin
Vannas yaylı makas 4 mm kesme kenarıGüzel Bilim Araçları15018-10
XLPlan N 25X WMP Lens

Kaynaklar

  1. Sharma, P., Maffulli, N. Tendon injury and tendinopathy: healing and repair. The Journal of Bone and Joint Surgery. 87 (1), 187-202 (2005).
  2. Kadler, K. E., Holmes, D. F., Trotter, J. A., Chapman, J. A. Collagen fibril formation. The Biochemical Journal. 316 (Pt 1), 1-11 (1996).
  3. Butler, D. L., Grood, E. S., Noyes, F. R., Zernicke, R. F. Biomechanics of ligaments and tendons. Exercise And Sport Sciences Reviews. 6, 125-181 (1978).
  4. Tsai, S. L., Nödl, M. T., Galloway, J. L. Bringing tendon biology to heel: Leveraging mechanisms of tendon development, healing, and regeneration to advance therapeutic strategies. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 250 (3), 393-413 (2020).
  5. Subramanian, A., Schilling, T. F. Tendon development and musculoskeletal assembly: emerging roles for the extracellular matrix. Development (Cambridge, England). 142 (24), 4191-4204 (2015).
  6. Lin, T. W., Cardenas, L., Soslowsky, L. J. Biomechanics of tendon injury and repair. Journal of Biomechanics. 37 (6), 865-877 (2004).
  7. Riley, G. P., Harrall, R. L., Constant, C. R., Chard, M. D., Cawston, T. E., Hazleman, B. L. Tendon degeneration and chronic shoulder pain: changes in the collagen composition of the human rotator cuff tendons in rotator cuff tendinitis. Annals of the Rheumatic Diseases. 53 (6), 359-366 (1994).
  8. Bobzin, L., Roberts, R. R., Chen, H. J., Crump, J. G., Merrill, A. E. Development and maintenance of tendons and ligaments. Development (Cambridge, England). 148 (8), dev186916(2021).
  9. Hodgson, R. J., O'Connor, P. J., Grainger, A. J. Tendon and ligament imaging. The British Journal of Radiology. 85 (1016), 1157-1172 (2012).
  10. Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. Interpreting second-harmonic generation images of collagen I fibrils. Biophysical Journal. 88 (2), 1377-1386 (2005).
  11. Centonze, V. E., White, J. G. Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging. Biophysical Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).
  12. Franchi, M., Trirè, A., Quaranta, M., Orsini, E., Ottani, V. Collagen structure of tendon relates to function. The Scientific World Journal. 7, 404-420 (2007).
  13. Grinstein, M., Dingwall, H. L., O'Connor, L. D., Zou, K., Capellini, T. D., Galloway, J. L. A distinct transition from cell growth to physiological homeostasis in the tendon. eLife. 8, e48689(2019).
  14. Rueden, C. T., Schindelin, J., Hiner, M. C., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18, 529(2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Tendon GörüntülemeKolajen LiflerEkstraselüler MatriksSHG GörüntülemeTendon GelişimiTendon Yaralanması3B Doku GörüntülemeMatriks KarakterizasyonuDerin Doku Görüntüleme

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.