Bu protokol, primer fibroblastları premenopozal veya postmenopozal insan vajinal dokusundan izole etmek için güvenilir ve etkili bir teknik göstermektedir. Vajinal fibroblast izolasyonu için mevcut protokoller, yaşlanan dokudan hücre izolasyonunun zorluklarını dikkate almamaktadır. Pelvik organ prolapsusu ameliyatı sonrası kadınlardan vajinal doku elde edildi.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
İnsan Vajinasından Primer Fibroblastların Doku İşlenmesi ve İzolasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Pelvik organ sarkması, kadınların yaşam kalitesini ciddi şekilde etkileyen bir rahatsızlıktır. Kaslar ve bağlar zayıfladığında ve pelvik organların pelviste daha aşağıya düşmesine neden olarak vajinada bir çıkıntı oluşturduğunda ortaya çıkar. Pelvik organ prolapsusunu düzeltmek için cerrahi, temel bir tedavi olmuştur. Son zamanlarda, hücresel düzeyde prolapsusu olan hastaların doku kompozisyonunun incelenmesine artan bir ilgi vardır.
Şu anda donör veya hasta yaşının hücre bazlı tedaviler üzerindeki etkisi konusunda çok az fikir birliği vardır. Vajinal fibroblast izolasyonu için yayınlanmış mevcut protokoller ya premenopozal dokuya odaklanmakta ya da donör dokunun yaşı hakkında yorum yapmayı ihmal etmektedir. Mevcut protokollerin çoğu hayvan modellerini kullanır. İnsan vajinal dokusunun kıvamı, çoğu protokolde kullanılan dokulardan daha yoğundur. Bu çalışmada, insan vajinal dokusu öncelikle yaşlı donörlerden elde edildi ve bu da muhtemelen mevcut protokollerin başarısızlığına katkıda bulundu.
Bu çalışmanın amacı, donör yaşı ve menopoz durumundan bağımsız olarak insan vajinal fibroblastlarının güvenilir bir şekilde elde edilmesi için standart bir protokol tanımlamaktır. Sonuçlar, pelvik organ prolapsusu ameliyatı geçiren dokuz ayrı donörden alınan doku kullanılarak çoğaltıldı. Altı hasta postmenopozal idi ve en yaşlı donör 78 yaşındaydı. Doku bağışçılarının ortanca yaşı 59 idi.
Burada, enzimatik ve mekanik ayrışma ve tek bir donörden çoklu vajinal biyopsilerin hücre süspansiyonu havuzunun bir kombinasyonunu kullanarak fibroblastla zenginleştirilmiş tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için güvenilir bir yöntem açıklıyoruz. İnsan vajinal primer fibroblastlarının güvenilir izolasyonu, pelvik organ prolapsusunun yanı sıra mikrobiyom-konak etkileşimlerinin incelenmesinde yararlı olabilir.
Giriş
Bilim ve araştırmada cinsiyet eşitsizliği devam eden bir konudur. Öncelikle kadın cinsiyetindeki insanları etkileyen bozukluklara yönelik araştırmalar yetersiz finanse edilmektedir1. Pelvik organ prolapsusu, kadın cinsiyeti ile güçlü bir şekilde ilişkili bir hastalıktır. Kaslar ve bağlar zayıfladığında ve pelvik organların pelvis içinde daha aşağıya düşmesine neden olarak vajinada bir çıkıntı oluşturduğundaortaya çıkar 2. Bu patofizyoloji bağlamında hücresel etkileşimler veya doku düzeyindeki faktörlerin cerrahi müdahalelerin başarısını nasıl etkilediği hakkında çok az şey bilinmektedir3.
Hücre dizilerinden ziyade birincil hücreler, daha fazla fizyolojik alaka düzeyi sağlamada translasyonel klinik araştırmalar için gerekli olarak yaygın olarak kabul edilmektedir4. Birincil hücreler doğrudan ilgilenilen vücut dokusundan alınır ve in vivo fizyolojiyi daha kesin bir şekilde taklit edebilir. Primer fibroblastların insan vajinasından izolasyonu, yaş ve menopoz durumu gibi temel donör özelliklerini göz önünde bulundurarak, pelvik organ prolapsusunun biyolojik mekanizmalarını ve hastalık modellemesini incelemek için yararlı olabilir.
Pelvik organ prolapsusu genellikle yaşlı veya menopoz sonrası bireyleri etkiler. Bu durumun incelenmesinde primer fibroblast hücrelerinin izolasyonu ve proliferasyonu, azalmış hücre popülasyonları ve yaşlı donörlerden gelen klonojenik yetenek nedeniyle zordur5. Deneyimlerimize göre, vajinal dokunun ayrışması için daha önce tarif edilen protokollerin kullanımı, standart 1cm2 doku biyopsisinden herhangi bir fibroblast çıkarmayı başaramadı.
Bir literatür taraması yoluyla, benzer çalışmaların iki gruba ayrıldığını bulduk: murin6 gibi hayvan modelleri ve insan modelleri 7,8. Fare protokolünü takip ederken, insan vajinal dokusunun doku işlemesi için makas kullanımı yetersiz mekanik sindirime neden oldu. Murin dokusu ve diğer doku bölgeleri9 kullanılarak protokollerin ekstrapolasyonu başarısız oldu.
İnsan vajinal örneklerini kullanan çoğu makale, pelvik organ prolapsusuolan premenopozal bireylerden alınan dokuyu kullanmıştır 7,10. Birkaç makale hem menopoz öncesi hem de menopoz sonrası bireylerden alınan örneklerin kullanıldığını bildirmiş olsa da11, fibroblastları yaşlı veya menopoz sonrası donörlerden başarılı bir şekilde izole etmek için kullanılan protokolü yeterince ayrıntılı olarak tanımlamadılar. Menopoz sonrası dokudan fibroblastlar kullanılarak yapılan izolasyon ve hastalık modellemesi, pelvik organ prolapsusunun hücresel patofizyolojisini anlamak için gerekli olabilir, çünkü bu durum menopozu takip eden on yılda bireylerde en yüksek prevalansa sahiptir12.
Mekanik ve enzimatik ayrışmanın bir kombinasyonunu kullanarak insan vajinal dokusundan fibroblast ile zenginleştirilmiş tek hücreli bir süspansiyonun izolasyonu ve kültürü için bir yöntem tanımladık. Bu makale, menopoz sonrası veya yaşlanan insan vajinal fibroblastlarının nasıl elde edileceğine dair güvenilir bir protokolü açıklamaktadır. İzole edilen hücrelerin, vimentin, F-aktin ve α-düz kas aktini (α-SMA) ekspresyonunu değerlendirmek için faz kontrast mikroskobu ve immünofloresan (IF) kullanılarak morfolojik inceleme yoluyla fibroblast olduğu doğrulandı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Vajinal doku, pelvik organ prolapsusu ameliyatı geçiren kadınlardan elde edildi. Ameliyattan sonra toplanan vajinal doku atık madde olarak kabul edildi ve aksi takdirde atılacaktı. Çalışma, Kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi ve Massachusetts General Brigham Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı.
1. Hastadan vajinal doku alımı
- Pelvik organ prolapsusunu anamnez alarak ve pelvik muayene bulgularını kullanarak teşhis edin: Klinikte pelvik organ prolapsusu kanıtı gösteren Pelvik Organ Prolapsusu Kantifikasyonu (POP-Q) ölçümleri elde edildi.
- Aşağıdaki dahil etme kriterlerini kullanın: 18 yaşından büyük; semptomatik pelvik organ prolapsusu öyküsü; Pelvik organ prolapsusunun cerrahi olarak düzeltilmesi için seçim.
- Aşağıdakileri hariç tutun: Hamile kadınlar ve doku bağışlamayı reddeden hastalar.
- Pelvik organ prolapsusu ameliyatının gerekli bir adımı olarak fazla vajinal dokuyu kesin. Bu vajinal epitel, anterior kolporafi, posterior kolpokortari ve kolpokleizis ameliyatlarından sonra toplam kalınlıkta eksize edilir.
- Dokuyu normal salin veya serumsuz DMEM / F12 (Gibco) ortamı ile steril bir örnek toplama kabında laboratuvara taşıyın. Buz üzerinde tutun.
2. Doku işleme ve sindirim
- Doku hazırlama
- Dokuyu vajinal epitelin tam kalınlığını kapsayacak şekilde ölçün ve kesin, yaklaşık 1cm2'lik segmentler oluşturun.
- Biyopsi boyutunun 1 cm2 hassas ölçüldüğünden emin olun.
NOT: Doku biyopsi boyutunun fazla tahmin edilmesi doku sindirimini bozabilir. - Tek bir donörden her biri 1 cm2 ölçülerinde 2-3 ek vajinal biyopsi hazırlayın ve biyopsileri bir kenara koyun.
- Mekanik sindirim
- Vajinal biyopsiyi 10 cm'lik bir hücre kültürü Petri kabına yerleştirin. Dokunun kurumasını önlemek için vajinal dokuya 100 U/mL penisilin/streptomisin, 2,5 μg/mL amfoterisin Bonto ile desteklenmiş 500-1.000 μL serumsuz ortam pipetleyin.
- Her iki elinizde iki steril neşter (No. 11 veya No. 15) kullanarak vajinal dokuyu küçük parçalara ayırın.
- Bıçakların uçlarının doku yüzeyine dik olduğundan emin olun. İki neşter kullanarak doku yüzeyine eşit ve sabit bir basınç uygulayın. Dokuyu çok küçük parçalara ayırmak için alternatif bir çekme hareketi gerçekleştirin.
- Bu kıyma tekniğini, numune 1-2 mm'lik parçalarla homojen bir kıvamda olana kadar iki neşter tekniğini kullanarak tekrarlayın.
NOT: 1cm2'lik bir biyopsinin bu iki neşter tekniği kullanılarak mekanik sindirimin tamamlanması yaklaşık 15-20 dakika sürmelidir. - Kıyılmış dokuyu süspanse ederek plakaya 100 U / mL penisilin / streptomisin, 2.5 μg / mL amfoterisin B ile desteklenmiş 2-3 mL serumsuz DMEM / F12 ortamı ekleyin. Herhangi bir topaklanmayı parçalamak için doku parçaları içeren çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyin.
- Enzimatik sindirim
- Doku parçaları içeren çözeltiyi 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Kalan doku parçalarını toplamak için vajinal dokunun kıyıldığı doku kültürü kabına serumsuz DMEM/F12 ortamı ekleyin. Doku parçaları içeren çözeltiyi konik tüpe aktarın. Toplam hacim 10 mL olana kadar ilave serumsuz DMEM/F12 ortamı ekleyin.
- 5 mg Liferazı 1 mL steril suda (5 mg / mL) çözün. 230 μL'lik alikotlarda −20 °C'de bir aya kadar veya −80 °C'de 6 ay boyunca saklayın.
- Tüpe 230 μL Liferaz (stok 13 U / mL) ekleyin, son konsantrasyon 0.3 U / mL.
NOT: Liberaz aktivitesi partiler arasında farklılık gösterebilir. Her bir alikotu kullanmadan hemen önce bir su banyosu kullanarak çözdürün. Tekrarlanan dondurma ve çözdürme işlemlerinden kaçının. - Aynı donörden 2-3 ek vajinal biyopsi için 2.1-2.3 adımlarını tekrarlayın.
NOT: Tek bir biyopside alınan doku parçalarını içeren her solüsyonu ayrı konik tüplerde saklayın. Örneğin 4 tüpte 4 vajinal biyopsi yapılması. Bu, santrifüjlemeden sonra optimum hücre peletlemesi için önemlidir. - Tüpleri 37 °C'de 3 saat boyunca bir numune karıştırıcı kullanarak sürekli, kuvvetli çalkalama ile inkübe edin.
- Bir CO2 inkübatörüne bir numune karıştırıcısı yerleştirin. Sürekli ajitasyon sürdürün. (Örnek karıştırıcı ayarları: 5 sn boyunca 25 rpm dönme hareketi, 5 sn boyunca 30° karşılıklı (eğilme dönüşü) ve 3 sn boyunca 2° titreşim (girdap) hareketi).
- Kuluçka sırasında, tüpleri 30 dakikalık aralıklarla girdaplayın.
- Numuneleri 5 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve atın.
- Liberaz enzimini seyreltmek için peleti% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 100 U / mL penisilin / streptomisin, 2.5 μg / mL amfoterisin B ile 1-2 mLof DMEM / F12 ortamında yeniden süspanse edin. Pelet tamamen yeniden süspanse olana kadar kuvvetlice pipetleyin.
3. Hücre kültürü
- Sindirilmemiş doku parçalarının çıkarılması
- 50 mL'lik steril bir konik kabın üzerine 100 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin.
- Aynı donörün çoklu doku biyopsilerinden elde edilen hücre süspansiyonunu bir araya getirin.
- 5 mL'lik bir şırınga pistonu ile bastırarak doku / enzim süspansiyonunu süzün. Kalan doku parçaları tamamen bastırılmış gibi görünene kadar bu adımı tekrarlayın.
NOT: Süzgeçten tam olarak geçirilmeyen vajina dokusu parçalarından bir miktar mukus olabilir. Mukusu hücre süzgeci ile atın.
- Hücre kültürü havuzu
- Bir Petri kabında (60 mm x 15 mm) birden fazla vajinal biyopsiden (aynı donörden) plaka havuzlanmış hücre süspansiyonu.
- Petri kabını gece boyunca 37 ° C'de bir CO2 inkübatöründe inkübe edin.
- Faz kontrast mikroskobu ile yapışık olmayan hücrelerin varlığını gözlemleyin ve onaylayın.
- Mikroskobun odağının plakanın altında olduğundan emin olun.
NOT: Ön planda çok sayıda bağışıklık hücresi olabilir. Plakanın dibine daha az sayıda fibroblast eklenecektir. - Yeterli hücre yapışmasını sağlamak için hücre kültürü ortamını değiştirmeden önce 18-24 saat bekleyin.
- % 80 birleşme meydana gelene kadar kültür ortamını her üç günde bir değiştirin. Hücreler% 80-90 birleşmeye ulaştığında, daha büyük bir şişeye genişletin veya ileride kullanmak üzere hücre parçalarını dondurun.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Pelvik organ prolapsusu ameliyatı geçiren 10 bağımsız donörden vajinal doku toplandı. Tarif edilen protokol kullanılarak, hücreler insan vajinal dokusundan izole edildi. Hücre popülasyonları karakteristik uzun, düz ve iğ şeklinde bir görünüme sahipti. Diğer çalışmalarda olduğu gibi, donörün yaşı arttıkça fibroblastların klonojenik yeteneklerinin önemli ölçüde daha yavaş olduğunu ve hücre ikiye katlama kapasitelerinin azaldığını gözlemledik. Bu farklılıklar, yaşlı bireylerden (75-78 yaş) izole edilen fibroblastlar ile gen...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Daha önce yapılan birçok çalışma, primer fibroblastların insan vajinasından nasıl izole edileceğini bildirmiştir 3,7. Birkaç çalışma, pelvik organ prolapsusu olan premenopozal bireylerden alınan insan vajinal dokusunu kullandı. Birkaç makale premenopozal ve postmenopozal bireylerden doku kullanımını bildirmiş olsa da 7,11, fibroblastları yaşlı veya postmenopozal donörlerd...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
İfşa edilecek herhangi bir çıkar çatışmamız yok.
Teşekkürler
Massachusetts General Hospital'daki Vincent Üreme Biyolojisi Merkezi'nin tüm üyelerine ve VIncent Memorial Hastanesi Vakfı'na cömert destekleri için şükranlarımızı sunarız. Dr. Bo Rueda'ya ve laboratuvarına değerli önerileri ve bize laboratuvar ekipmanı ödünç verdikleri için özel teşekkürler.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Amfoterisin B | Bio Techne | B23192 | |
| Hücre süzgeci (100 μ m) | ThermoFisher Scientific | 22363549 | |
| Konik Santrifüj Tüpleri (15 mL) | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | |
| Tüy Tek Kullanımlık Neşter No. 15 | Socorex | FB.15 | |
| Fetal Sığır Serumu | Sigma Aldrich | NC1983075 | |
| Yüksek Berraklıklı Konik Santrifüj Tüpleri (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| HulaMixer Numune Karıştırıcı | ThermoFisher Scientific | 15920D | |
| İnsan Fibronektin DuoSet ELISA | R& D Sistemleri | DY1918-05 | |
| İnsan Pro-Kollajen I alfa 1 DuoSet ELISA R | & D Systems | DY6220-05 | |
| Liberaz Araştırma Sınıfı | Sigma Aldrich | 05 401 119 001 | |
| Penisilin / Streptomisin (5000U / ml) | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Petri kapları, polistiren (100 mm x 20 mm) | Millipore Sigma | P5606 | |
| Serolojik pipetler (10 mL) | ThermoFischer Scientific | 170356N | |
| Steril şırıngalar (5 mL) | Fischer Scientific | 14-955-458 |
Kaynaklar
- Mirin, A. A. Gender disparity in the funding of diseases by the U.S. J Womens Health. 30 (7), 956-963 (2021).
- MacLennan, A. H., Taylor, A. W., Wilson, D. H., Wilson, D. The prevalence of pelvic floor disorders and their relationship to gender, age, parity, and mode of delivery. BJOG. 107 (12), 1460-1470 (2000).
- Ruiz-Zapata, A. M., Kerkhof, M. H., Zandieh-Doulabi, B., Brölmann, H. A. M., Smit, T. H., Helder, M. N. Fibroblasts from women with pelvic organ prolapse show differential mechanoresponses depending on surface substrates. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 24 (9), 1567-1575 (2013).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Rorteau, J., et al. Maintenance of chronological aging features in culture of normal human dermal fibroblasts from old donors. Cells. 11 (5), 858(2022).
- Blum, M., Koehler, J., Yangdon, T., Chatterjea, D. Generating primary murine vaginal fibroblast cell lines. MethodsX. 7, 101100(2020).
- Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. comparative characterization of vaginal cells derived from premenopausal women with and without severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (7), 931-943 (2016).
- Ruiz-Zapata, A. M., et al. Vaginal fibroblastic cells from women with pelvic organ prolapse produce matrices with increased stiffness and collagen content. Sci Rep. 6 (1), 22971(2016).
- Khan, M., Gasser, S. Generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues. J Vis Exp. (107), e53565(2016).
- Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. Static mechanical loading influences the expression of extracellular matrix and cell adhesion proteins in vaginal cells derived from premenopausal women with severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (8), 978-992 (2016).
- Medel, S., Alarab, M., Kufaishi, H., Drutz, H., Shynlova, O. Attachment of primary vaginal fibroblasts to absorbable and nonabsorbable implant materials coated with platelet-rich plasma. Female Pelvic Med Reconstr Surg. 21 (4), 190-197 (2015).
- Awwad, J., Sayegh, R., Yeretzian, J., Deeb, M. E. Prevalence, risk factors, and predictors of pelvic organ prolapse. Menopause. 19 (11), 1235-1241 (2012).
- Waise, S., et al. An optimized method to isolate human fibroblasts from tissue for ex vivo analysis. Bio Protoc. 9 (23), e3440(2019).
- Nadalutti, C. A., Wilson, S. H. Using human primary foreskin fibroblasts to study cellular damage and mitochondrial dysfunction. Curr Protoc Toxicol. 86 (1), (2020).
- Da Silva Lara, L. A., et al. Menopause Leading to Increased Vaginal Wall Thickness in Women with Genital Prolapse: Impact on Sexual Response. J Sex Med. 6 (11), 3097-3110 (2009).
- Stasio, D. D., Lauritano, D., Iquebal, H., Romano, A., Gentile, E., Lucchese, A. Measurement of oral epithelial thickness by optical coherence tomography. Diagnostics. 9 (3), 90(2019).
- Zorina, A., Zorin, V., Kudlay, D., Kopnin, P. Age-related changes in the fibroblastic differon of the dermis: role in skin aging. Int J Mol Sci. 23 (11), 6135(2022).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
