İnsan Vajinasından Primer Fibroblastların Doku İşlenmesi ve İzolasyonu

Summary

Bu protokol, primer fibroblastları premenopozal veya postmenopozal insan vajinal dokusundan izole etmek için güvenilir ve etkili bir teknik göstermektedir. Vajinal fibroblast izolasyonu için mevcut protokoller, yaşlanan dokudan hücre izolasyonunun zorluklarını dikkate almamaktadır. Pelvik organ prolapsusu ameliyatı sonrası kadınlardan vajinal doku elde edildi.

Abstract

Pelvik organ sarkması, kadınların yaşam kalitesini ciddi şekilde etkileyen bir rahatsızlıktır. Kaslar ve bağlar zayıfladığında ve pelvik organların pelviste daha aşağıya düşmesine neden olarak vajinada bir çıkıntı oluşturduğunda ortaya çıkar. Pelvik organ prolapsusunu düzeltmek için cerrahi, temel bir tedavi olmuştur. Son zamanlarda, hücresel düzeyde prolapsusu olan hastaların doku kompozisyonunun incelenmesine artan bir ilgi vardır.

Şu anda donör veya hasta yaşının hücre bazlı tedaviler üzerindeki etkisi konusunda çok az fikir birliği vardır. Vajinal fibroblast izolasyonu için yayınlanmış mevcut protokoller ya premenopozal dokuya odaklanmakta ya da donör dokunun yaşı hakkında yorum yapmayı ihmal etmektedir. Mevcut protokollerin çoğu hayvan modellerini kullanır. İnsan vajinal dokusunun kıvamı, çoğu protokolde kullanılan dokulardan daha yoğundur. Bu çalışmada, insan vajinal dokusu öncelikle yaşlı donörlerden elde edildi ve bu da muhtemelen mevcut protokollerin başarısızlığına katkıda bulundu.

Bu çalışmanın amacı, donör yaşı ve menopoz durumundan bağımsız olarak insan vajinal fibroblastlarının güvenilir bir şekilde elde edilmesi için standart bir protokol tanımlamaktır. Sonuçlar, pelvik organ prolapsusu ameliyatı geçiren dokuz ayrı donörden alınan doku kullanılarak çoğaltıldı. Altı hasta postmenopozal idi ve en yaşlı donör 78 yaşındaydı. Doku bağışçılarının ortanca yaşı 59 idi.

Burada, enzimatik ve mekanik ayrışma ve tek bir donörden çoklu vajinal biyopsilerin hücre süspansiyonu havuzunun bir kombinasyonunu kullanarak fibroblastla zenginleştirilmiş tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için güvenilir bir yöntem açıklıyoruz. İnsan vajinal primer fibroblastlarının güvenilir izolasyonu, pelvik organ prolapsusunun yanı sıra mikrobiyom-konak etkileşimlerinin incelenmesinde yararlı olabilir.

Introduction

Bilim ve araştırmada cinsiyet eşitsizliği devam eden bir konudur. Öncelikle kadın cinsiyetindeki insanları etkileyen bozukluklara yönelik araştırmalar yetersiz finanse edilmektedir¹. Pelvik organ prolapsusu, kadın cinsiyeti ile güçlü bir şekilde ilişkili bir hastalıktır. Kaslar ve bağlar zayıfladığında ve pelvik organların pelvis içinde daha aşağıya düşmesine neden olarak vajinada bir çıkıntı oluşturduğunda^{ortaya çıkar 2}. Bu patofizyoloji bağlamında hücresel etkileşimler veya doku düzeyindeki faktörlerin cerrahi müdahalelerin başarısını nasıl etkilediği hakkında çok az şey bilinmektedir³.

Hücre dizilerinden ziyade birincil hücreler, daha fazla fizyolojik alaka düzeyi sağlamada translasyonel klinik araştırmalar için gerekli olarak yaygın olarak kabul edilmektedir⁴. Birincil hücreler doğrudan ilgilenilen vücut dokusundan alınır ve in vivo fizyolojiyi daha kesin bir şekilde taklit edebilir. Primer fibroblastların insan vajinasından izolasyonu, yaş ve menopoz durumu gibi temel donör özelliklerini göz önünde bulundurarak, pelvik organ prolapsusunun biyolojik mekanizmalarını ve hastalık modellemesini incelemek için yararlı olabilir.

Pelvik organ prolapsusu genellikle yaşlı veya menopoz sonrası bireyleri etkiler. Bu durumun incelenmesinde primer fibroblast hücrelerinin izolasyonu ve proliferasyonu, azalmış hücre popülasyonları ve yaşlı donörlerden gelen klonojenik yetenek nedeniyle zordur⁵. Deneyimlerimize göre, vajinal dokunun ayrışması için daha önce tarif edilen protokollerin kullanımı, standart 1^cm2 doku biyopsisinden herhangi bir fibroblast çıkarmayı başaramadı.

Bir literatür taraması yoluyla, benzer çalışmaların iki gruba ayrıldığını bulduk: murin⁶ gibi hayvan modelleri ve insan modelleri ^7,8. Fare protokolünü takip ederken, insan vajinal dokusunun doku işlemesi için makas kullanımı yetersiz mekanik sindirime neden oldu. Murin dokusu ve diğer doku bölgeleri⁹ kullanılarak protokollerin ekstrapolasyonu başarısız oldu.

İnsan vajinal örneklerini kullanan çoğu makale, pelvik organ prolapsusu^olan premenopozal bireylerden alınan dokuyu kullanmıştır ^7,10. Birkaç makale hem menopoz öncesi hem de menopoz sonrası bireylerden alınan örneklerin kullanıldığını bildirmiş olsa da¹¹, fibroblastları yaşlı veya menopoz sonrası donörlerden başarılı bir şekilde izole etmek için kullanılan protokolü yeterince ayrıntılı olarak tanımlamadılar. Menopoz sonrası dokudan fibroblastlar kullanılarak yapılan izolasyon ve hastalık modellemesi, pelvik organ prolapsusunun hücresel patofizyolojisini anlamak için gerekli olabilir, çünkü bu durum menopozu takip eden on yılda bireylerde en yüksek prevalansa sahiptir¹².

Mekanik ve enzimatik ayrışmanın bir kombinasyonunu kullanarak insan vajinal dokusundan fibroblast ile zenginleştirilmiş tek hücreli bir süspansiyonun izolasyonu ve kültürü için bir yöntem tanımladık. Bu makale, menopoz sonrası veya yaşlanan insan vajinal fibroblastlarının nasıl elde edileceğine dair güvenilir bir protokolü açıklamaktadır. İzole edilen hücrelerin, vimentin, F-aktin ve α-düz kas aktini (α-SMA) ekspresyonunu değerlendirmek için faz kontrast mikroskobu ve immünofloresan (IF) kullanılarak morfolojik inceleme yoluyla fibroblast olduğu doğrulandı.

Protocol

Vajinal doku, pelvik organ prolapsusu ameliyatı geçiren kadınlardan elde edildi. Ameliyattan sonra toplanan vajinal doku atık madde olarak kabul edildi ve aksi takdirde atılacaktı. Çalışma, Kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi ve Massachusetts General Brigham Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylandı.

1. Hastadan vajinal doku alımı

1. Pelvik organ prolapsusunu anamnez alarak ve pelvik muayene bulgularını kullanarak teşhis edin: Klinikte pelvik organ prolapsusu kanıtı gösteren Pelvik Organ Prolapsusu Kantifikasyonu (POP-Q) ölçümleri elde edildi.
2. Aşağıdaki dahil etme kriterlerini kullanın: 18 yaşından büyük; semptomatik pelvik organ prolapsusu öyküsü; Pelvik organ prolapsusunun cerrahi olarak düzeltilmesi için seçim.
3. Aşağıdakileri hariç tutun: Hamile kadınlar ve doku bağışlamayı reddeden hastalar.
4. Pelvik organ prolapsusu ameliyatının gerekli bir adımı olarak fazla vajinal dokuyu kesin. Bu vajinal epitel, anterior kolporafi, posterior kolpokortari ve kolpokleizis ameliyatlarından sonra toplam kalınlıkta eksize edilir.
5. Dokuyu normal salin veya serumsuz DMEM / F12 (Gibco) ortamı ile steril bir örnek toplama kabında laboratuvara taşıyın. Buz üzerinde tutun.

2. Doku işleme ve sindirim

1. Doku hazırlama
   1. Dokuyu vajinal epitelin tam kalınlığını kapsayacak şekilde ölçün ve kesin, yaklaşık 1^cm2'lik segmentler oluşturun.
   2. Biyopsi boyutunun 1 cm² hassas ölçüldüğünden emin olun.
      NOT: Doku biyopsi boyutunun fazla tahmin edilmesi doku sindirimini bozabilir.
   3. Tek bir donörden her biri 1 cm² ölçülerinde 2-3 ek vajinal biyopsi hazırlayın ve biyopsileri bir kenara koyun.
2. Mekanik sindirim
   1. Vajinal biyopsiyi 10 cm'lik bir hücre kültürü Petri kabına yerleştirin. Dokunun kurumasını önlemek için vajinal dokuya 100 U/mL penisilin/streptomisin, 2,5 μg/mL amfoterisin Bonto ile desteklenmiş 500-1.000 μL serumsuz ortam pipetleyin.
   2. Her iki elinizde iki steril neşter (No. 11 veya No. 15) kullanarak vajinal dokuyu küçük parçalara ayırın.
   3. Bıçakların uçlarının doku yüzeyine dik olduğundan emin olun. İki neşter kullanarak doku yüzeyine eşit ve sabit bir basınç uygulayın. Dokuyu çok küçük parçalara ayırmak için alternatif bir çekme hareketi gerçekleştirin.
   4. Bu kıyma tekniğini, numune 1-2 mm'lik parçalarla homojen bir kıvamda olana kadar iki neşter tekniğini kullanarak tekrarlayın.
      NOT: 1^cm2'lik bir biyopsinin bu iki neşter tekniği kullanılarak mekanik sindirimin tamamlanması yaklaşık 15-20 dakika sürmelidir.
   5. Kıyılmış dokuyu süspanse ederek plakaya 100 U / mL penisilin / streptomisin, 2.5 μg / mL amfoterisin B ile desteklenmiş 2-3 mL serumsuz DMEM / F12 ortamı ekleyin. Herhangi bir topaklanmayı parçalamak için doku parçaları içeren çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyin.
3. Enzimatik sindirim
   1. Doku parçaları içeren çözeltiyi 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Kalan doku parçalarını toplamak için vajinal dokunun kıyıldığı doku kültürü kabına serumsuz DMEM/F12 ortamı ekleyin. Doku parçaları içeren çözeltiyi konik tüpe aktarın. Toplam hacim 10 mL olana kadar ilave serumsuz DMEM/F12 ortamı ekleyin.
   2. 5 mg Liferazı 1 mL steril suda (5 mg / mL) çözün. 230 μL'lik alikotlarda −20 °C'de bir aya kadar veya −80 °C'de 6 ay boyunca saklayın.
   3. Tüpe 230 μL Liferaz (stok 13 U / mL) ekleyin, son konsantrasyon 0.3 U / mL.
      NOT: Liberaz aktivitesi partiler arasında farklılık gösterebilir. Her bir alikotu kullanmadan hemen önce bir su banyosu kullanarak çözdürün. Tekrarlanan dondurma ve çözdürme işlemlerinden kaçının.
   4. Aynı donörden 2-3 ek vajinal biyopsi için 2.1-2.3 adımlarını tekrarlayın.
      NOT: Tek bir biyopside alınan doku parçalarını içeren her solüsyonu ayrı konik tüplerde saklayın. Örneğin 4 tüpte 4 vajinal biyopsi yapılması. Bu, santrifüjlemeden sonra optimum hücre peletlemesi için önemlidir.
   5. Tüpleri 37 °C'de 3 saat boyunca bir numune karıştırıcı kullanarak sürekli, kuvvetli çalkalama ile inkübe edin.
   6. Bir CO₂ inkübatörüne bir numune karıştırıcısı yerleştirin. Sürekli ajitasyon sürdürün. (Örnek karıştırıcı ayarları: 5 sn boyunca 25 rpm dönme hareketi, 5 sn boyunca 30° karşılıklı (eğilme dönüşü) ve 3 sn boyunca 2° titreşim (girdap) hareketi).
   7. Kuluçka sırasında, tüpleri 30 dakikalık aralıklarla girdaplayın.
   8. Numuneleri 5 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve atın.
   9. Liberaz enzimini seyreltmek için peleti% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 100 U / mL penisilin / streptomisin, 2.5 μg / mL amfoterisin B ile 1-2 mLof DMEM / F12 ortamında yeniden süspanse edin. Pelet tamamen yeniden süspanse olana kadar kuvvetlice pipetleyin.

3. Hücre kültürü

1. Sindirilmemiş doku parçalarının çıkarılması
   1. 50 mL'lik steril bir konik kabın üzerine 100 μm'lik bir hücre süzgeci yerleştirin.
   2. Aynı donörün çoklu doku biyopsilerinden elde edilen hücre süspansiyonunu bir araya getirin.
   3. 5 mL'lik bir şırınga pistonu ile bastırarak doku / enzim süspansiyonunu süzün. Kalan doku parçaları tamamen bastırılmış gibi görünene kadar bu adımı tekrarlayın.
      NOT: Süzgeçten tam olarak geçirilmeyen vajina dokusu parçalarından bir miktar mukus olabilir. Mukusu hücre süzgeci ile atın.
2. Hücre kültürü havuzu
   1. Bir Petri kabında (60 mm x 15 mm) birden fazla vajinal biyopsiden (aynı donörden) plaka havuzlanmış hücre süspansiyonu.
   2. Petri kabını gece boyunca 37 ° C'de bir CO₂ inkübatöründe inkübe edin.
   3. Faz kontrast mikroskobu ile yapışık olmayan hücrelerin varlığını gözlemleyin ve onaylayın.
   4. Mikroskobun odağının plakanın altında olduğundan emin olun.
      NOT: Ön planda çok sayıda bağışıklık hücresi olabilir. Plakanın dibine daha az sayıda fibroblast eklenecektir.
   5. Yeterli hücre yapışmasını sağlamak için hücre kültürü ortamını değiştirmeden önce 18-24 saat bekleyin.
   6. % 80 birleşme meydana gelene kadar kültür ortamını her üç günde bir değiştirin. Hücreler% 80-90 birleşmeye ulaştığında, daha büyük bir şişeye genişletin veya ileride kullanmak üzere hücre parçalarını dondurun.

Results

Pelvik organ prolapsusu ameliyatı geçiren 10 bağımsız donörden vajinal doku toplandı. Tarif edilen protokol kullanılarak, hücreler insan vajinal dokusundan izole edildi. Hücre popülasyonları karakteristik uzun, düz ve iğ şeklinde bir görünüme sahipti. Diğer çalışmalarda olduğu gibi, donörün yaşı arttıkça fibroblastların klonojenik yeteneklerinin önemli ölçüde daha yavaş olduğunu ve hücre ikiye katlama kapasitelerinin azaldığını gözlemledik. Bu farklılıklar, yaşlı bireylerden (75-78 yaş) izole edilen fibroblastlar ile genç bireylerden (35-47 yaş) izole edilenler karşılaştırıldığında belirgindi. Orta yaşlı donörlerden alınan hücreler bir ara profil (56-61 yaş) sergiledi. Hücre proliferasyon oranları başlangıçta aynı bilinen tohumlama yoğunluğuna sahip bir faz kontrast mikroskobu kullanılarak doğrudan görselleştirme ile tahmin edildi.

Şekil 1: Protokolün şematik gösterimi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 1, ayrışma ve izolasyon protokolünün şematik bir temsilini göstermektedir. Bu adımları takiben, bu protokol, alt kültür hücrelerine izin vermek için yeterli hücre sayısında on donörden dokuzunda primer fibroblast izolasyonunda% 90'lık bir başarı oranı sağlamıştır. Bağışçıların ortanca yaşı 59 idi.

Protokol (Yazar, yıl)	Orijinal protokolün donör dokusu	Bağışçı Sayısı	Yıllar içinde donör yaşı	Elde edilen fibroblastlar	Morfoloji
Ruiz-Zapata ve ark., 2013	İnsan vajinası	3	56-78	Hayır	YOK
Khan ve ark., 2016	Fare kulağı ve kuyruğu	2	48-65	Hayır	YOK
Waise ve ark., 2019	İnsan dokusu	3	56-75	Hayır	YOK
Nadalutti ve diğerleri, 2020	İnsan sünnet derisi	1	65	Hayır	YOK
Geçerli	İnsan vajinası	10	35-79	Evet	Mil şeklinde

Tablo 1: İnsan Vajinal Fibroblastlarının Başarılı İzolasyonu için Protokollerin Karşılaştırılması. Mevcut farklı protokollerin bizimkiyle karşılaştırılması ve morfolojik sonuçlarla kanıtlanması.

Tablo 1 , bu çalışmada vajinal fibroblast izolasyonunu denemek için diğer protokollerin kullanılmasının sonuçlarını göstermektedir. Vajinal mukozadan ve daha yaşlı donörlerden primer fibroblastların izolasyonu için standart bir protokol geliştirdik⁵.

Tablo 1'de listelenenler de dahil olmak üzere birçok yerleşik protokolü test ettik ve çalışmamızda bu protokolleri kullanarak hücre izolasyonunda başarı gözlemlemedik. Sınırlamaları için aşağıdaki nedenleri öneriyoruz.

Ruiz ve ^ark.3 tarafından yayınlanan protokol, fasyanın kazınmasını ve dokunun küçük parçalara ayrılmasını içerir. Deneyimlerimize göre, fasyayı ayırt etmek zordur ve kazıma girişimleri hücre veriminde önemli bir azalmaya neden olabilir. Bu yöntem basit olsa da, genelleştirilebilirliğini sınırlayan kritik ayrıntılardan yoksundur. Ek olarak, bu protokoldeki mekanik sindirim, daha yoğun olma eğiliminde olan menopoz sonrası doku için yetersiz görünmektedir.

Khan ve ^ark.9 ve Waise ve ^ark.13 tarafından yayınlanan protokoller, neşter tekniğine kıyasla önemli çok yönlü kesme kuvvetleri oluşturmayan doku kıyma için makas kullanır. Deneyimlerimize göre, makas yöntemi de etkili bir şekilde işe yaramadı.

Son olarak, eksplant yöntemini kullanan Nadalutti ve ^ark.14 protokolü, elimizde başarılı bir şekilde fibroblast vermedi. Bu yöntem, fibroblastları başarılı bir şekilde ayırmak için daha agresif mekanik ve enzimatik işlem gerektirebilen menopoz sonrası dokunun doğası nedeniyle daha az etkili olabilir.

Şekil 2: 0. günde askıya alınmış hücrelerin faz kontrast görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2, protokolümüzü kullanarak 0. günde askıya alınan hücreleri göstermektedir.

Şekil 3: Üç adet 1^cm2 doku biyopsisinden oluşan havuzlanmış hücre süspansiyonundan 100x büyütmede kültürün 14. gününde vajinal primer fibroblastların faz kontrast görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3 , 1 cm² boyutlarında 3 doku biyopsisinin havuzlanmış hücre süspansiyonundan 100x büyütmede primer fibroblastları göstermektedir.

Fibroblast kimliği, daha önce tarif edildiği gibi immünofloresan tekniklerle ve küçük modifikasyonlarla araştırıldı. Primer vajinal hücrelerin hücresel kökenini doğrulamak için, immünofloresan boyama yoluyla fibroblastik kökenli spesifik biyobelirteçler kullandık. Hücreler, premenopozal ve postmenopozal doku örneklerinden vimentin (Şekil 4), F-aktin ve α-SMA'nın pozitif boyanmasına dayalı olarak fibroblastlar olarak tanımlandı (Şekil 5). Fibroblastlar, deneylerde kullanılmak üzere yüksek canlılıkla (%>90) genişlemeye kadar kültürlendi.

Şekil 4: Vajinal fibroblastların vimentininin pozitif boyanması. İzole edilen premenopozal ve postmenopozal doku primer fibroblastları IF analizine tabi tutuldu ve görüntüler 200x büyütmede çekildi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Vajinal fibroblastların F-aktin ve α-SMA'sının pozitif boyanması. IgG kontrolü ile karşılaştırıldığında protein ekspresyonunun sonuçları. Görüntüler 200x büyütme ile toplanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Daha önce yapılan birçok çalışma, primer fibroblastların insan vajinasından nasıl izole edileceğini bildirmiştir ^3,7. Birkaç çalışma, pelvik organ prolapsusu olan premenopozal bireylerden alınan insan vajinal dokusunu kullandı. Birkaç makale premenopozal ve postmenopozal bireylerden doku kullanımını bildirmiş olsa da ^7,11, fibroblastları yaşlı veya postmenopozal donörlerden başarılı bir şekilde izole etmek için kullanılan protokolü yeterince ayrıntılı olarak tanımlamadılar. Vajinal duvar, genital prolapsusu olan postmenopozal kadınlarda premenopozal kadınlara göre daha kalındır, bu da bu popülasyonda izolasyon ile ilgili artan zorluğu açıklayabilir¹³. Pelvik taban bozuklukları en çok menopoz sonrası veya ileri yaş gruplarında yaygın olduğundan, menopoz sonrası donörlerden başarılı bir şekilde izole edilmesi, hastalık modellemesi ve araştırması için gereklidir.

35-78 yaş arası donörlerden insan vajinal fibroblastlarını başarılı ve tutarlı bir şekilde hasat etmek ve kültürlemek için bir protokol oluşturduk. Primer vajinal hücrelerin hücresel kökeni, immünofloresan boyama yoluyla fibroblastik kökenli biyobelirteçler ile doğrulandı.

Burada sunulan insan vajinal fibroblast izolasyon prosedürü, primer fibroblast hücrelerinin izolasyonunu ve kültürünü mümkün kılar. Deneyimlerimize göre, primer hücrelerin ayrışması için hayvan⁹ve insan ^3,14,16 dokusu için daha önce yayınlanmış protokollerin kullanılması, bu çalışmada insan vajina örneklerinden herhangi bir fibroblast çıkaramadı¹⁴.

İnsan vajinal dokusundan hücre ayrışmasının zorluklarının iki olası nedenini varsaydık: (1) mukozanın dermal kalınlığı yaşlı donörlerde daha fazladır ve yaşlı donörlerden alınan mukozal olmayan dokununkiyle karşılaştırıldığında^13,17 hücre ayrışmasını daha zor hale getirir ve (2) fibroblastların yoğunluğu yaşlı bireylerde belirgin şekilde azalabilir¹⁷.

Bu zorluklar göz önüne alındığında, bu protokolde değiştirilmemesi gereken birkaç kritik adım vardır. İlk kritik adım, çok titiz bir mekanik sindirimin uygulanmasıdır. Burada iki neşter tekniğini kullanıyoruz. Deneyimlerimize göre, dokuyu kıymak için makasla ikame etmek, fibroblastları insan vajinal dokusundan ayırmak için yeterince küçük parçalar vermez.

Diğer kritik adım, hücre süspansiyonunun bir araya getirilmesi ve tek bir donörden 3-4 tam kat biyopsi (1^cm2) alınmasıdır. Bu, devam eden ekim için yeterli hücre elde etmek için gereklidir. Tüm olgularda, pelvik organ prolapsusu cerrahisinin gerekli bir parçası olarak fazla vajinal epitel kesildiği için 1^cm2'den önemli ölçüde daha fazla doku topladık. Bu çalışmada, çeşitli donörler arasındaki hücresel özellikleri ve proliferasyonu araştırmak ve ayırt etmek için yalnızca aynı donörden kaynaklanan hücre süspansiyonlarını bir araya getirdik.

Protokolümüzün belirgin bir avantajı vardır: mekanik ve enzimatik sindirim, menopoz sonrası doku için daha iyi verime yol açar, ancak menopoz öncesi örnekler üzerinde olumsuz bir etkisi yoktur.

Protokolümüzde çeşitli sınırlamalar olduğunu kabul ediyoruz. Vajinal sarkma ameliyatının yapılmadığı durumlarda insan vajinal dokusuna erişim zor olabilir. Çoklu doku biyopsi örneklerinin hücre süspansiyonlarının bir araya getirilmesi ihtiyacı da bir sınırlama olabilir.

Sonuç olarak, insan vajinal fibroblastlarının elde edilmesi için bu protokol, özellikle postmenopozal bireylerde pelvik taban bozukluklarında gelecekteki araştırmalar için yararlı bir araç olacak ve kadın sağlığı araştırmalarına önemli bir katkı sağlayacaktır.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amfoterisin B	Bio Techne	B23192
Hücre süzgeci (100 μ m)	ThermoFisher Scientific	22363549
Konik Santrifüj Tüpleri (15 mL)	Fisher Scientific	14-959-53A
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320033
Tüy Tek Kullanımlık Neşter No. 15	Socorex	FB.15
Fetal Sığır Serumu	Sigma Aldrich	NC1983075
Yüksek Berraklıklı Konik Santrifüj Tüpleri (50 mL)	Fisher Scientific	14-432-22
HulaMixer Numune Karıştırıcı	ThermoFisher Scientific	15920D
İnsan Fibronektin DuoSet ELISA	R& D Sistemleri	DY1918-05
İnsan Pro-Kollajen I alfa 1 DuoSet ELISA R	& D Systems	DY6220-05
Liberaz Araştırma Sınıfı	Sigma Aldrich	05 401 119 001
Penisilin / Streptomisin (5000U / ml)	ThermoFisher Scientific	15070063
Petri kapları, polistiren (100 mm x 20 mm)	Millipore Sigma	P5606
Serolojik pipetler (10 mL)	ThermoFischer Scientific	170356N
Steril şırıngalar (5 mL)	Fischer Scientific	14-955-458