Method Article

Motorlu bir cihaz kullanarak tek hücre analizi için dokuların mekanik ayrışması

DOI:

10.3791/65866

⸱

November 10th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland, 2UMD Terrapin Works, University of Maryland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Akış sitometrisi gibi aşağı akış analizleri için tek hücreli süspansiyonlar oluşturmak üzere dokuların kombine enzimatik ve yarı otomatik mekanik ayrışması için genel bir protokol sağlanır. Bu protokol için geliştirilen düşük maliyetli mekanik cihazın imalatı, montajı ve çalıştırılması için talimatlar dahildir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doku örneklerinin analizi için tek hücreleri izole edebilmek ve hazırlayabilmek, yeni biyomedikal keşifler ve araştırmalar için hızla önemli hale geldi. Tek hücreli izolasyonlar için manuel protokoller oldukça zaman alıcıdır ve kullanıcı değişkenliğine eğilimlidir. Otomatik mekanik protokoller, işlem süresini ve numune değişkenliğini azaltabilir, ancak daha düşük kaynaklı araştırma ortamlarında kolayca erişilebilir veya uygun maliyetli değildir. Burada açıklanan cihaz, akademik laboratuvarlar için düşük maliyetli bir alternatif olarak ticari olarak temin edilebilen malzemeler kullanılarak yarı otomatik doku ayrışması için tasarlanmıştır. Cihaz tasarımının imalatı, montajı ve çalıştırılması için talimatlar sağlanmıştır. Ayrışma protokolü, birden fazla fare dokusunda manuel preparatlarla karşılaştırılabilir hücre verimleri ve numune canlılığı ile güvenilir bir şekilde tek hücreli süspansiyonlar üretir. Protokol, cihaz başına aynı anda 12 adede kadar doku örneğini işleme yeteneği sağlayarak büyük örnek boyutları gerektiren çalışmaları daha yönetilebilir hale getirir. Eşlik eden yazılım ayrıca, değişen dokulara ve deneysel kısıtlamalara uyum sağlamak için cihaz protokolünün özelleştirilmesine de izin verir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek hücreli analiz, akış sitometrisi, farklı hücre tiplerinin tanımlanması, tek hücre dizilimi veya hücreler arasındaki genomik veya transkriptomik varyasyonların tanımlanması gibi uygulamalar için yeni biyomedikal keşifler için hızla önemli hale gelmiştir1. İlgilenilen dokulardan bu tür hücre izolasyonlarının gerçekleştirilmesi, disseke edilmiş dokuların kıyılmasını ve istenen hücrelerden bağ dokusunu filtrelemek için ince bir hücre süzgecinden itilmesini gerektirir (Şekil 1A). Dendritik hücreler veya makrofajlar veya özellikle fibröz dokulardan hücreler gibi yapışık hücre tiplerinin izole edilmesi, ek mekanik veya enzimatik ayırma adımları gerektirir 2,3,4. Bu işlem genellikle manuel olarak yapılır, bu da hücre verimlerini ve numune canlılığını değerlendirirken oldukça zaman alıcı ve kullanıcı değişkenliğine eğilimli hale getirir. Bu nedenle, otomatik doku ayrışması için özelleştirilebilir seçenekler sunmak çok önemlidir. Bu tür sistemleri tasarlamak için bazı girişimlerde bulunulmuş olsa da, büyük ölçüde bu cihazların maliyet engelleyici doğası nedeniyle, özellikle akademik laboratuvarlarda ve daha düşük kaynak ortamlarında mevcut seçeneklere her zaman kolayca erişilememektedir5. Ayrıca, bu cihazlar her zaman bir araştırma grubunun bireysel ihtiyaçlarına göre özelleştirilemez6.

Burada, sindirim enzimleri ve mekanik bozulma yardımıyla tüm dokuların veya doku parçalarının tek hücreli süspansiyonlara sindirimini otomatikleştirmek için bir doku ayrıştırıcı cihaz tasarlandı. Bu cihaz laboratuvarda kolayca monte edilebilir, sıcaklık regülasyonu için ısıtma veya soğutma odalarına yerleştirilebilir, gerekli sayıda dokunun ayrışması için özelleştirilebilir ve istenen ayrışma protokolleri ile programlanabilir. Bu cihazın geniş kullanımı, hücre ekstraksiyon protokollerinin tekrarlanabilirliğini önemli ölçüde artırabilir ve manuel ayrışmaya zaman kazandıran bir alternatif sağlayabilir.

Tasarım, otomatik bir işlemle 12 dokuya kadar aynı anda sindirime izin verir. Cihaz, paralel olarak bağlanmış ve motorların dönüşünü/hızını kontrol etmek için ayarlanabilir voltaj kadranlı bir AC/DC adaptör aracılığıyla standart bir duvar prizi ile çalışan 12 ayrı motordan oluşur. Motorlar, C-boruların üst kısmına sıkıca oturan altıgen bir cıvatayı döndürür. C-tüpleri, motorların sabitlendiği üst plakaya her iki taraftan kilitlenen akrilik bir plaka üzerinde aşağı doğru gerilimle yerinde tutulur (Şekil 1B). Motorlar paralel olarak bağlandığından, herhangi bir voltajdaki hızları çok fazla değişmemelidir, ancak voltaj sabit tutulduğunda bile yük (cihaza monte edilen C-tüplerinin sayısı) hızı etkileyecektir. Dakikadaki dönüşleri (rpm) ölçmek için, bir hall etkisi sensörü ve motor millerinden birine sabit bir mıknatıs kullanılarak bir takometre dahil edilmiştir (Ek Şekil 1). Motor dizileri oluşturmak için CAD dosyaları Ek Kodlama Dosyası 1'de sağlanır. Ayrıca, motorlara iletilen pozitif/negatif yükleri tersine çevirerek dönüş yönünü tersine çevirmek için programlanabilir bir anahtar da dahildir. Tüm bu özellikler, bir Arduino Nano (Ek Kodlama Dosyası 2) üzerinde kodlanmış yazılım (Arduino IDE yazılımı, Malzeme Tablosuna bakın) kullanılarak entegre edilmiştir. Bağlı düğmeleri ve bir LCD paneli (Ek Şekil 2) kullanarak, kaydedilmiş ve özel protokoller oluşturmak ve çalıştırmak, bir protokolün belirli zamanlarında dönüş yönünü otomatik olarak tersine çevirmek, voltajı kullanarak hızı ayarlamak (Ek Şekil 3) ve programlanmış bir protokolü tamamlamak için mevcut motor hızını ve kalan süreyi görüntülemek mümkündür (Ek Şekil 4).

Bu çalışma için, hem bu cihazla mekanik-enzimatik doku ayrışması hem de manuel-enzimatik doku ayrışması kullanılarak, aşağı akış uygulamaları için geri kazanılan hücrelerdeki farklılıkları belirlemek için tek hücreli süspansiyonlar hazırlandı. Hücre preparatları, doku başına toplam hücre verimine ve hücre canlılığı yüzdesine göre değerlendirildi. Yüzey marker ekspresyonundaki potansiyel farklılıkları karşılaştırmak için akış sitometrisi kullanıldı. Veriler grafik ve istatistiksel analiz programları kullanılarak analiz edilmiştir. Örneklem veya grup çiftlerini karşılaştırmak için eşlenmemiş Welch t-testleri kullanıldı ve örneklem büyüklükleri n > 4 fareyi temsil eden 2 tekrarlanan deney kullanıldı. Bu cihazın imalatı ve montajı için ayrıntılı talimatlar Ek Dosya 1'de bulunabilir. Bu protokol için gerekli malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol UMD Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Bu çalışmalar için 7 ila 9 haftalık dişi C57BL / 6J farelerinden alınan dokular kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz.

1. Manuel ayrışma

NOT: Bu adım Maisel K. ve ark.7'den uyarlanmıştır.

  1. Diseke edilmiş dokuyu çıkarın ve% 5 fetal sığır serumu (FBS) ile soğuk hücre kültürü ortamına yerleştirin.
  2. Parçalar herhangi bir boyutta 1 mm'den küçük olana kadar keskin diseksiyon makası kullanarak dokuyu kesin.
  3. Kıyılmış dokuyu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve 5 mL ortam ekleyin.
  4. İzole edilen doku ve hücre tiplerine göre sindirim enzimleri ekleyin. Sunulan deneyler için Kollajenaz 4 (1 mg/mL), Kollajenaz D (1 mg/mL) ve DNaz (40 μg/mL) kullanın.
  5. İnkübasyon boyunca hafif çalkalama ile 37 ° C'de 1 saat boyunca bir çalkalayıcı veya külbütör üzerinde inkübe edin. Numuneyi 100 kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
  6. 5 mM konsantrasyonlu bir numune hacmi elde etmek için EDTA ekleyin. Numuneyi 100 kez yukarı ve aşağı pipetleyin ve ardından numuneyi 100 kez kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyin.
  7. Numuneyi 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin ve 50 mL veya 15 mL'lik bir tüpte toplayın.
  8. Toplanan hücreleri 300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak süpernatanı çıkarın ve hücreleri 1 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin.
  9. 9 mL soğuk 1X Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ekleyerek lizis tamponunu nötralize edin.
  10. Toplanan hücreleri tekrar 300 x g'de 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak süpernatanı çıkarın ve hücreleri istenen tampon veya ortamda yeniden süspanse edin.

2. Yarı otomatik mekanik ayrışma

  1. Diseke edilmiş dokuyu %5 fetal sığır serumu (FBS) içeren soğuk hücre kültürü ortamına yerleştirin.
    NOT: Bu protokol, katı dokulardan hücre izolasyonu için tasarlanmıştır.
  2. Doku parçaları herhangi bir boyutta yaklaşık 5 mm olana kadar keskin diseksiyon makası kullanarak dokuyu kesin. Kıyılmış dokuyu bir C-tüpüne aktarın ve 1 mL ortam ekleyin.
  3. C-tüpünü cihaza yükleyin. Tüp tutucu plakayı (Ek Şekil 1A) D şeklindeki tüp tabanlarının üzerine takın.
  4. Gergi kollarını akrilik plakaya kilitleyerek boruları motor plakasına sabitleyin (Ek Şekil 3).
  5. Özel bir program ayarlayın: İleri, 30 sn; Ters, 10 sn; Döngü, 4 kez.
    1. Mavi düğmeye basarak Ana Menü'den Özel Mod'u seçin.
    2. İlk özel mod menüsünde, ekrandaki değer 30 s okuyana kadar kırmızı düğmeye basarak ileri dönüş süresini 30 s olarak belirtin. Bu değeri seçmek ve bir sonraki menü ekranına ilerlemek için mavi düğmeye basın.
    3. İkinci özel mod menüsünde, ekrandaki değer 10 sn okuyana kadar kırmızı düğmeye basarak ters dönüş süresini 10 sn olarak belirtin. Bu değeri seçmek ve bir sonraki menü ekranına ilerlemek için mavi düğmeye basın.
    4. Üçüncü özel mod menüsünde, ekrandaki değer 4X okuyana kadar kırmızı düğmeye basarak 2.5.2-2.5.3 adımlarında ayarlanan seçimlerin kaç kez tekrarlanacağını belirtin. Bu değeri seçmek ve programı başlatmak için mavi düğmeye basın.
      NOT: Özel programlar cihaz hafızasında saklanmaz, ancak daha hızlı çalışma için önceden ayarlanmış programlardan biri olarak programlanabilir (cihaz programlama talimatları Ek Dosya 1'de verilmiştir).
  6. LCD Ekranın sağ alt köşesindeki hesaplanan rpm değeri 200 (Ek Şekil 3) okuyana kadar voltaj kontrol kadranını (Ek Şekil 3) ayarlayarak özel programı 4 rpm'de çalıştırın.
  7. İzole edilen doku ve hücre tiplerine göre 4 mL'lik ortama sindirim enzimleri ekleyin.
    NOT: Sunulan deneyler için Kollajenaz 4 (1 mg/mL), Kollajenaz D (1 mg/mL) ve DNaz (40 μg/mL) kullanın.
  8. C-tüpünü cihaza yükleyin ve aşağıdaki programı 2.3 rpm'de çalıştırmak için 2.6-200 adımlarını tekrarlayın: İleri, 30 sn; Ters, 10 sn; Döngü, 4 kez.
  9. Cihazı, tüpler hala yüklüyken 45 dakika boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre aktarın.
  10. C-tüpünü cihaza yükleyin ve aşağıdaki programı 50 rpm'de çalıştırmak için 2.3-2.6 arasındaki adımları tekrarlayın: İleri, 270 sn; Ters, 30 sn; Döngü, 9 kez.
  11. Numunede 5 mM'lik bir konsantrasyon elde etmek için EDTA ekleyin.
  12. C-tüpünü cihaza yükleyin ve aşağıdaki programı 2.3 rpm'de çalıştırmak için 2.6-100 arasındaki adımları tekrarlayın: İleri, 30 sn; Ters, 10 sn; Döngü, 2 kez.
  13. Numuneyi 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirin ve 50 mL veya 15 mL'lik bir tüpte toplayın.
  14. Toplanan hücreleri 300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir pipet kullanarak atın ve hücreleri 1 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında 1 dakika inkübe edin.
  15. Lizis tamponunu 9 mL soğuk Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile nötralize edin.
  16. Toplanan hücreleri tekrar 300 x g'de 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir pipet kullanarak atın ve hücreleri istenen tampon veya ortamda yeniden süspanse edin.

3. Veri analizi

  1. Bir grafik ve istatistiksel analiz yazılımı kullanarak verileri analiz edin (bkz.
  2. 2 tekrarlanan deneyi temsil eden n > 4 fare örneklem büyüklükleri ile örneklem veya grup çiftlerini karşılaştırmak için eşleştirilmemiş Welch t-testlerini kullanın.
    NOT: Farklılıklar istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi (p < 0.05). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yarı otomatik mekanik protokol, hücrelerin manuel olarak işlendiği deneylerden elde edilen sonuçları çoğaltabilir. Bu cihaz kullanılarak ve manuel ayrışma ile hazırlanan hücre süspansiyonları, fare akciğeri, böbreği ve kalp dokuları arasında karşılaştırılabilir hücre verimleri ve numune canlılığı gösterir (Şekil 2A, B). T hücreleri ve dendritik hücreler gibi bağışıklık hücrelerinin popülasyonları, izolasyon protokolündeki bir farklılıktan önemli ölçüde etkilenmemiştir (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu cihaz, sonraki tek hücreli analiz için tüm dokulardan tek hücreli süspansiyonlar sağlamak üzere araştırma ortamında kolay montaj için tasarlanmıştır. Özellikler, temel olmakla birlikte, akademik ortamlarda ve ötesinde araştırmacıların ihtiyaçlarını karşılamak için yeterlidir. Bu cihazı kullanmanın önemli bir yararı, değişkenliği azaltarak tek hücreli süspansiyonların hazırlanmasını iyileştirme potansiyelidir. Ek olarak, 12+ numuneyi aynı anda işleme yeteneği, numuneden numuneye tutarlılığı artırabilir ve bu da manuel ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fischell Biyomühendislik Bölümü (KM), T32 GM080201 (MA), Vogel Endowed Summer Fellowship (MA), LAM Vakfı (KM) ve Amerikan Akciğer Derneği'nden (KM) fon alındı. Yazarlar, düzenleme konusundaki yardımları için Michele Kaluzienski'ye teşekkür etmek istiyor.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
¼ inç akrilik levha  12 "x 24"Akrilik Mega MağazaN/A
½ inç akrilik levha 12" x 12"SimbaLuxSL-AS13-12x12
12 G paslanmaz çelik tel (gergi kolları için)Everbilt 1000847413
16 G elektrik kablosu (telli)En İyi BağlantılarN/A
2 x 3 mm mıknatıs   SU-CRO0587N/A
2 kanallı röle kartı (motorlara giden akımın ters polaritesini için)AEDIKOAE06233
37 mm Çaplı DC Motorlar (12 V, 200 rpm) x 12GreartisanN/AAnma Torku: 2,2 Kg.cm
Redüksiyon Oranı: 1:22
Anma Akımı: 0,1 A
D Şekilli Çıkış Mili Boyutu: 6 x 14mm (0,24 "x 0,55") (D x U)
Şanzıman Boyutu: 37 x 25 mm (1,46 "x 0,98") (D x U) < br / > Motor Boyutu: 36,2 x 33,3 mm (1,43 "x 1,31") (D x U) < br / > Montaj Deliği Boyutu: M3 (dahil değildir)
Değişken voltaj kontrol cihazlı AC / C Güç Adaptörü    (5 Amper, 3-12 volt)Mo-guJ19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A Hassas kova dönüştürücü düşürücü transformatörWalfront1A(Arduino Nano'ya güç sağlamak için güç adaptörü)
Arduino Nano & nbsp;   (Lafvin)LAFVIN8541582500
Düğmeleri AwpeyeButon
C57BL6/J fareler Jackson Laboratuvarı
Kollajenaz 4WorthingtonCLS4 LS004188
Kollajenaz DRoche11088866001
DMEM (Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı)Corning10-013-CV
DNAseRoche11284932001
Çift taraflı köpük bantSANKAN/A
Çift Taraflı prototipleme devre kartıdeyueN/A
EDTASigma- AldrichE7889
Elektrikli lehim ve havyaLDK1002P
Elektrik Bandı3M03429NA
FBS (Fetal Sığır Serumu)Gibco16140089
gentleMACS C TüplerMiltenyi130-093-237
Graphpad Prism GraphPad, La Jolla, CAGrafik ve istatistiksel analiz yazılımı
Hall etkisi sensörü Boyutlar: 0.79 x 0.79x 0.39 inçSunFounder43237-2
Altıgen Bağlayıcı 6 mm Delikli Motor Pirinç x 2 x 12UxcellN/A Altıgen
başlı cıvatalar (M4-.70 X 12 Altıgen Başlı Vida) x 12FASN/A
Jumper telleri (Arduino Nano için)ELEGOOEL-CP-004
LCD ekranJANSANEN/A
M3 Altıgen Soket Başlı Kapak Vidaları x 12Shenzhen
Baishichuangyou
Technology co. Ltd		310luosditaozhuang
M3 Paslanmaz ÇelikMakine vidaları Düz Başlı Altıgen Soket Kapaklı Vidalar (30 mm) x 36Hala Uyanıka52400001
Hızlı bağlantı kesme terminal konektörleriIEUYO22010064
Kırmızı Kan Hücresi Lizis Tamponu (10x)Hücre Sinyalizasyonu46232
Terminal adaptör kalkanı Arduino Nano için genişletme kartı  12 "x 24"Shenzhen
Weiyapuhua
Teknolojisi		60-026-3

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wiegleb, G., Reinhardt, S., Dahl, A., Posnien, N. Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material. Frontiers in Zoology. 19 (1), 27(2022).
  2. Weiskirchen, S., Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Tacke, F., Weiskirchen, R. Isolation and culture of primary murine hepatic stellate cells. Fibrosis: Methods and Protocols. Rittié, L. , New York, NY: Springer. 7113-7118 (2017).
  3. Wang, J., et al. The isolation and characterization of endothelial cells from juvenile nasopharyngeal angiofibroma. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (9), 856-858 (2016).
  4. Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 102022(2022).
  5. McBeth, C., Gutermuth, A., Ochs, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. Automated tissue dissociation for rapid extraction of viable cells. Procedia CIRP. 65, 88-92 (2017).
  6. Welch, E. C., Yu, H., Barabino, G., Tapinos, N., Tripathi, A. Electric-field facilitated rapid and efficient dissociation of tissues into viable single cells. Scientific Reports. 12 (1), 10728(2022).
  7. Maisel, K., et al. Pro-lymphangiogenic VEGFR-3 signaling modulates memory T cell responses in allergic airway inflammation. Mucosal Immunology. 14 (1), 144-151 (2021).
  8. Karmakar, T., et al. A pilot study to determine the utility of automated tissue dissociator for flowcytometry based evaluation of hematolymphoid tumor tissue biopsies. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 38 (2), 403-410 (2022).
  9. Montanari, M., et al. Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies. Biomolecules. 12 (5), 701(2022).
  10. Genova, A., Dix, O., Saefan, A., Thakur, M., Hassan, A. Carpal tunnel syndrome: a review of literature. Cureus. 12 (3), e7333(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tissue DissociationSingle Cell AnalysisMechanical DissociationMotorized DeviceCell SuspensionFlow CytometryCell ViabilityImmune Cell IsolationSurface Marker ExpressionRed Blood Cell Lysis

Related Articles