Tek Bir Tankta Davranış Testleri Bataryası Kullanılarak Yetişkin Danio rerio'da Nörotoksisite Değerlendirmesi

Zebra balığı (Danio rerio), ekotoksikoloji, ilaç keşfi ve güvenlik farmakolojisi çalışmaları için popüler bir model omurgalı türüdür. Düşük maliyeti, köklü moleküler genetik araçları ve sinir sisteminin morfogenezi ve bakımında yer alan temel fizyolojik süreçlerin korunması, zebra balığını nörodavranışsal toksikoloji de dahil olmak üzere sinirbilim araştırmaları için ideal bir hayvan modeli haline getirir ^1,2. Bir kimyasalın nörotoksisitesini değerlendirmek için ana son nokta, yakın zamana kadar nöropatolojik etkilerin varlığıydı. Bununla birlikte, son zamanlarda, davranışsal uç noktalar nörotoksikolojik tarama protokollerine dahil edilmiştir ve bu fonksiyonel sonuçlar artık kimyasalların potansiyel nörotoksisitesini tanımlamak ve belirlemek için yaygın olarak kullanılmaktadır ^3,4. Ayrıca, balıklarda çok hafif bir davranış değişikliği bile hayvanın doğal koşullarda hayatta kalmasını tehlikeye atabileceğinden, davranışsal uç noktalar ekolojik açıdan oldukça önemlidir⁵.

Yetişkin zebra balığı araştırmalarında en çok kullanılan davranış testlerinden biri, anksiyete benzeri davranışları ölçen yeni tank testidir⁽NTT)^6,7. Bu tahlilde, balıklar yeniliğe maruz bırakılır (balıklar bilinmeyen bir tanka yerleştirilir), hafif bir caydırıcı uyaran ve davranışsal tepkileri gözlenir. NTT, esas olarak balıkların bazal lokomotor aktivitesini, jeotaksisini, donmasını ve düzensiz hareketlerini değerlendirmek için kullanılır. Düzensiz⁸, ani yön değişiklikleri (zikzak) ve tekrarlanan hızlanma bölümleri (darting) ile karakterizedir. Bu bir alarm reaksiyonudur ve genellikle donma olaylarından önce veya sonra gözlenir. Donma davranışı, hipolokomasyona, akineziye ve batmaya neden olan sedasyonun neden olduğu hareketsizlikten farklı olarak, tankın dibindeyken balığın hareketlerinin (operküler ve oküler hareketler hariç) tamamen durmasına karşılık gelir⁸. Donma genellikle yüksek stres ve kaygı durumuyla ilgilidir ve aynı zamanda itaatkar davranışın bir parçasıdır. Karmaşık davranışlar, hayvanların kaygı durumunun mükemmel göstergeleridir. NTT'nin farmakolojik ve genetik manipülasyona duyarlı olduğu gösterilmiştir⁹, bu da onu anksiyete ve ilgili bozuklukların sinirsel temelini incelemek için değerli bir araç haline getirir.

Zebra balığı oldukça sosyal bir türdür, bu nedenle çok çeşitli sosyal davranışları ölçebiliriz. Sığlık testi (ST) ve sosyal tercih testi (SPT), sosyal davranışı değerlendirmek için en çok kullanılan testlerdir¹⁰. ST, balıkların uzamsal davranışlarını ve hareket kalıplarını ölçerek¹¹ bir araya gelme eğilimini ölçer. ST, grup dinamiklerini, liderliği, sosyal öğrenmeyi incelemek ve birçok balık türünün sosyal davranışını anlamak için yararlıdır¹². Yetişkin zebra balıklarındaki SPT, Crawley'nin fareler¹³ için sosyal yenilik testi tercihinden uyarlandı ve bu model türlerde¹⁴ sosyal etkileşim çalışması için hızla popüler bir davranışsal test haline geldi. Bu iki test aynı zamanda ilaç tarama testlerinde kullanılmak üzere uyarlanmıştır ve sosyal davranışı modüle eden yeni bileşiklerin tanımlanması için umut vaat etmiştir ^15,16.

Genel olarak, yetişkin zebra balıklarındaki davranışsal tahliller, aktif bileşiklerin ve kötüye kullanılan ilaçların davranış mekanizmaları veya nörofenotipleri hakkında değerli bilgiler sağlayabilen güçlü araçlardır¹⁷. Bu protokol, bu davranışsal araçların⁷ temel malzeme kaynaklarıyla nasıl uygulanacağını ve çok çeşitli nöroaktif bileşiklerin etkilerini karakterize etmek için bunların toksisite deneylerinde nasıl uygulanacağını detaylandırır. Ek olarak, aynı testlerin nöroaktif bir bileşiğe (metamfetamin) akut maruziyetin nörodavranışsal etkilerini değerlendirmek için ve aynı zamanda bir pestisitin (glifosat) çevresel konsantrasyonlarına kronik maruziyetten sonra bu etkileri karakterize etmek için de uygulanabileceğini göreceğiz.

Etik standartlara sıkı sıkıya uyulması, deney için kullanılan zebra balıklarının refahını ve uygun şekilde muamele görmesini garanti eder. Tüm deneysel prosedürler, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri (CID-CSIC) tarafından belirlenen yönergeler altında gerçekleştirilmiştir. Aşağıda sunulan protokoller ve sonuçlar, yerel yönetim tarafından verilen lisans (11336 numaralı anlaşma) altında gerçekleştirilmiştir.

1. Davranış testleri için hayvan barınağı

1. Tüm testleri ( Şekil 1'de sunulmuştur) 27:28-10 ile 17:00 arasında izole bir davranış odasında gerçekleştirin.
2. Deney tankının olası kontaminasyonunu önlemek için deneylere başlamadan önce hem kontrol hem de maruz kalan balıkları temiz balık suyunda [90 mg / L akvaryum sistemleri tuzu, 0.58 mM CaSO₄·2H₂O ve 0.59 mM NaHCO₃ içeren ters ozmoz arıtılmış su] birkaç kez yıkayın.
3. Deneye başlamadan 1 saat önce hayvanları davranış odasına alıştırın.
4. Hayvanların (≈50:50 erkek: dişi oranı) deneysel olarak saf olduğundan emin olun ve tüm davranış testlerini deney grubundan habersiz gözlemcilerle kör bir şekilde yapın.
5. Davranışsal deneylerde anlamlı sonuçlar elde etmek için, ideal olarak iki veya daha fazla bağımsız deney arasında elde edilen koşul başına toplam 18 denek sayısına (n = 18) sahip olun. Örneğin, bireysel testlerde, çoğaltma başına koşul başına 9 hayvanın davranışını analiz edin. Grup testlerinde, çoğaltma başına koşul başına 6 ila 9 hayvandan oluşan bir sürünün davranışını analiz edin.
6. Tüm testleri bir pil testi yaklaşımını izleyerek gerçekleştirin ( Şekil 2'deki planlama önerilerine bakın). Etik olarak daha uygun olan bu yöntem, 3R indirgeme ilkesine^{uygun olarak} çalışma için ihtiyaç duyulan hayvan sayısını azaltmaya izin verir 7.
7. Çoğu zaman, davranışsal tahliller biyolojik tahlillere bağlıdır, bu nedenle numuneleri (OMIC'ler veya kimyasallar) toplamadan ve analiz etmeden önce ötenazi yönergelerine¹⁸ göre hayvanları feda edin. Uç noktanın örnekleme olduğu kanıtlanmazsa, deneyin sonunda kontrol grubunu yeniden kararlılaştırın. Kontrol hayvanlarını birkaç gün sonra üreme veya deneysel amaçlar için tekrar kullanın.

Şekil 1: Deney düzenekleri. Yetişkin zebra balıklarında çok çeşitli davranışları incelemek için kare tankın üç konfigürasyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Deneysel zaman çizelgesi. Davranışsal tahlillerin kaydedilmesi için iki planlama önerisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Tankın deneysel konfigürasyonları

1. Anksiyete benzeri davranış: Yeni Tank Testi (NTT)
   1. Aynı anda maksimum balık sayısını kaydetmek için deney kurulumunu (tank, kamera ve bilgisayar sayısı) ayarlayın. Bireysel davranış tahlilleri zaman alıcıdır, bu nedenle zamanı, malzemeyi ve alanı optimize edin.
   2. Deney tanklarını NTT için hazırlayın: Denekler arasında yansıma ve paraziti önlemek için yan duvarlarda ve altta akrilik panellerle kaplanmış kare tank (20 cm uzunluk, 20 cm genişlik, 25 cm yükseklik).
   3. Deney tanklarını 28 °C'de 7 L (su sütunu yüksekliği: 20 cm yükseklik) iyi oksijenlenmiş balık suyu ile doldurun.
   4. Görüntünün bozulmasını önlemek için tankın kameranın önündeki konumunu ayarlayın.
   5. Aydınlatma kurulumunu kontrol edin. LED arka ışık (10000 lux), iyi koşullarda video kaydı için tankın tüm bölümlerinde homojen bir aydınlatma sağlar.
   6. Kameraları açın ve 3. bölüme göre ayarlayın.
   7. Mümkün olduğunca çabuk kaydetmeye başlamadan önce denekleri tek tek deney tanklarının dibine yerleştirin.
      NOT: Tankın altındaki hayvanla kayda başlamak önemlidir.
   8. Kayıt sırasında hayvanları rahatsız etmemeye özen gösterin. Sadece tanklar arasında değil, aynı zamanda destek ile dış arasındaki görsel etkileşimi sınırlamak için bir perde veya panel kullanılması.
   9. Kaydın sonunda (standart kayıt süresi 6 dakikadır), testten geçmiş olan hayvanları, saf hayvanlarla karıştırmamak için başka bir tanka aktarın.
   10. Prosedürü mevcut tüm konularla tekrarlayın. Bireysel denemelerde (iki veya daha fazla bağımsız tekrardan) anlamlı sonuçlar elde etmek için koşul başına toplam 18 denek olması tavsiye edilir.
   11. Olası tank etkilerinden kaçınmak için denemeler arasında her tanka atanan deney grubunu rastgele seçin (aynı anda birkaç koşul kaydediyorsanız).
2. Sosyal gruplandırılmış davranış: Sığlık Testi (ST)
   1. ST'nin deneysel konfigürasyonu NTT'ninkiyle aynıdır (aynı tanklar doğrudan yeniden kullanılabilir).
   2. 2.1.1-2.1.6 adımlarını izleyin. ST'yi kurmak için.
   3. Mümkün olduğunca çabuk kaydetmeye başlamadan önce deney tanklarının altındaki sürüyü (aynı anda 6 ila 9 denek) tanıtın.
      NOT: Tankın altındaki hayvanla kayda başlamak önemlidir.
   4. 2.1.8-2.1.11 adımlarını izleyin. ST'yi gerçekleştirmek için.
   5. Prosedürü mevcut tüm konularla tekrarlayın. Bu tahlilde anlamlı sonuçlar elde etmek için, her kopyada aynı banka boyutuna sahip en az iki bağımsız kopya yapın.
   6. Sürüsün boyutunu tüm deney grupları için tutarlı tutun ve aynı deney içinde çoğaltın.
3. Sosyal Bireysel Davranış: Sosyal Tercih Testi (SPT)
   1. Deneysel alanı ve kayıt süresini optimize etmek için deney kurulumunu ayarlayın.
   2. Deney tanklarını SPT için hazırlayın: Yanal görünürlük sağlamak için kare tank (20 cm uzunluk, 20 cm genişlik, 25 cm yükseklik) şeffaf (cam veya plastik). Tek odaklı balık, belirli bir sanal bölge - tek taraflı harici muhafaza tankına yerleştirilmiş bir balık sürüsü veya spesifik olmayan sanal bölge - tek taraflı harici boş bir muhafaza tankı ile etkileşime girmekte serbesttir.
   3. Deney tanklarını 28 °C'de 5 L (su sütunu yüksekliği: 15 cm, dış muhafaza tanklarındaki su sütunu ile aynı yükseklikte) temiz balık suyu ile doldurun.
   4. Görüntünün bozulmasını önlemek için tankın kameranın önündeki konumunu ayarlayın.
   5. Sistemin homojen bir aydınlatma alıp almadığını kontrol edin.
   6. Hayvan ortada olacak şekilde hemen kayda başlamadan önce denekleri teker teker deney tanklarının dibine yerleştirin.
   7. Kayıt sırasında gözlemciler ve hayvanlar arasındaki görsel etkileşimlerden kaçının.
   8. 6 dakikalık kaydın sonunda, mevcut hayvanları saf hayvanlarla karıştırmamak için başka bir tanka aktarın.
   9. Prosedürü mevcut tüm konularla tekrarlayın. Bireysel denemelerde anlamlı sonuçlar elde etmek için koşul başına toplam 18 denek sayısına sahip olun (iki veya daha fazla bağımsız tekrardan).

3. Davranış testleri için video kaydı

1. Her bilgisayarda GigE kameranın kullanılabilirliğini kontrol etmek için kamera yöneticisini açın.
2. GigE kamera kontrol yazılımını başlatın (burada açıklanan uEye Cockpit gibi). Kamera seçeneğini açın, Monokrom modunu seçin ve görüntü boyutunu (1:2) ayarlayın.
3. Kamera Özellikleri'ni açın
   1. Kamera altında, Piksel Saati'ni Maksimum'a ayarlayın, Kare Hızı'nı saniyede 30 kareye (fps) ayarlayın ve Pozlama'yı ayarlayın (Görüntü çok karanlıksa Otomatik veya Manuel ayar).
   2. Görüntü altında, Kazanç'ı 0 (Otomatik) ve Siyah Düzeyleri'ni (İyi bir kontrast elde etmek için Otomatik veya Manuel ayarlama) olarak ayarlayın.
   3. Boyut altında, pencerenin boyutunu kazınması gereken bölgeye ayarlayın (Genişlik: Sol Genişlik, Yükseklik: Yükseklik-Üst). Bu adım, görüntünün boyutunu ve dolayısıyla videonun son boyutunu küçültmeye izin verir.
   4. Kamera Özellikleri'ni kapatın.
4. Kamera ayarlarını ve videoları kaydetmek üzere deneme oturumu için genel bir klasör oluşturun.
5. Fotoğraf makinesi ayarlarını kaydetmek için Dosya > Parametreleri Kaydet > Dosya'ya ayarlayın ve en son oluşturulan deneme klasörünü seçin.
   NOT: Böylece fotoğraf makinesi ayarları dosyası, herhangi bir zamanda aynı görüntü parametreleriyle çalışmaya devam etmek için (örn. fotoğraf makinesi aniden kapatıldığında veya aynı ayarları yeniden kullanmak için, kurulum süresini kısaltarak ve deney koşullarını homojenleştirerek) uygulamaya yeniden yüklenebilir. Bir anda kamera videolar arasında donarsa, kaydı durdurun, çıkın ve kamerayı kapatın. Tekrar açın, Dosya > Parametreleri Yükle > Dosyaya giderek kamera parametrelerini yeniden yükleyin ve kaydı yeniden başlatın. Balıkları atmak veya tekrarlamak için mevcut videonun tamamen alınıp alınmadığını kontrol edin (tekrarlamadan önce hayvanlara yeniden alışmaları için biraz zaman verin).
6. Bu kamera kurulum prosedürünü (adım 3.1-3.5) tüm kameralarda tekrarlayın.
7. Tüm kameralar doğru şekilde yapılandırıldığında, Video Dizisi Kaydet'i açın.
8. Yeni bir video dosyası olarak kaydetmek için Oluştur'u seçin, yakın zamanda oluşturulan deneme klasörünü seçin ve video dosyasının adında konu, deneme türü ve tarih bilgilerini raporlayın.
9. Maks. Kareler'i seçin. Çerçeve kutusuna 10800 yazın. Standart video, AVI formatında 30 fps'de 6 dakika (Video 1) kaydediyor; Bu nedenle, toplamda 6 dakika x 60 s x 30 fps = 10800 kare.
10. Kare Hızı öğesini seçin veya kare hızını manuel olarak belirtin (kayıt hızı: 30 fps).
11. Tüm bilgisayarlarda video dosyası oluşturma prosedürünü tekrarlayın.
12. Her deney tankının altındaki konuları tek tek tanıtın. Tüm tahliller bir kerede çalıştırılacaktır.
13. Kaydet'e tıklayarak kayıtları hızlı bir şekilde başlatın ve istenen maksimum kare sayısını almak için bekleyin (adım 3.10).
14. Videolar kaydedildikten sonra, Maksimum kare sayısına ulaşıldı! mesajını içeren bir sohbet kutusu belirir. Kabul Et'i seçin.
15. Kaydı bitirmek ve video dosyasını kapatmak için Kapat'ı seçin.
16. Az önce gözlemlenen balıkları çıkarın. Onları saf balıklardan ayırmaya dikkat edin.
17. Doğrudan Oluştur'u seçin ve video kaydetmeye devam etmek için işlemi tekrarlayın.
18. Tüm kayıtlar tamamlandıktan sonra Çıkış'ı seçin.
19. Kameraları kapatmak için Kamerayı Kapat ve Programdan çık öğesini seçin.

4. Kaydedilen videoların analizi

1. Analiz yazılımını başlatın (Malzeme Tablosuna bakın).
2. Yeni bir şablonu detaylandırmak için Şablondan Yeni'ye tıklayın > Video Dosyasından Önceden Tanımlanmış Bir Şablon > Uygulandı ve şablonu oluşturmaya başlamak için bir video seçin. İyi hareketlilik ve iyi kayıt koşulları sergileyen bir denekle deneyin temsili bir videosunu seçmeye çalışın.
3. Parametreler'de, parametreleri aşağıdaki pencerelerde yapılandırın (1 - 4/7). Balık > Yetişkin Zebra Balığı modelini, arena Açık Alan Meydanı > Bir Arena'yı, Arena başına Konu sayısını (ST için çoklu izleme paketi [çeşitli konuları bir arenada takip edin] gereklidir), Merkez Noktasına Göre Algılama türünü seçin ve son olarak kare hızını 30 fps'ye ayarlayın. Aşağıdaki pencerelerde (5 ila 7/7), parametreleri değiştirmeyin; varsayılan yapılandırma Tamam'dır.
4. Denemeyi şablon olarak adlandırın ve depolanan videonun geri kalanıyla aynı klasöre yerleştirin. Şablon, tüm kurulum bilgilerini içeren birkaç alt bölüme sahip bir deneme klasörü olarak oluşturulur.
5. Deneme Ayarları altında, tanımlanan kurulumu kontrol edin (video dosyasından, arenadan, denek sayısından, saniyedeki kareden). Burada sistem birimleri değiştirilebilir.
6. Arena Ayarları altında, ekranın ortasına sağ tıklayın ve Yakala'yı seçin. İtibaren Dosya'da ekranda. Kaliteli bir video görüntüsü seçin ve Kabul et arka plan ayarları için bu görüntüyü yakalamak için. İlk olarak, kalibre edilmiş bir kural oluşturarak görüntüyü kalibre edin. Tankın genişliğini ölçek olarak kullanın (19 cm). Ardından arenayı çizin. Kareyi, hayvanın yüzeye yaklaştığında yansımalarını veya balık yazılımının tankın siyah alanlarıyla herhangi bir şekilde karışmasını önlemek için yeterince yapmaya dikkat edin. Son olarak, şekil bölgelerini Çerçeve işleviyle çizin.
   1. NTT ve ST için, tankın ön tarafını üst ve alt olmak üzere iki eşit sanal bölgeye bölün (bkz. Şekil 1). İki eşit yatay kutu çizin. Kutular her biri için yarım arenayı kaplar. Sırasıyla üst ve alt bölgeler için Üst ve Alt olarak adlandırın. Kutuların aynı genişliğe (9-10 cm) ve uzunluğa (8-9 cm) sahip olmasına, arena sınırlarını (turuncu kare) aşmamasına ve üst üste binmemesine dikkat edin, her ok bölgesinin tam olarak bölgelerini gösterdiğini kontrol edin.
   2. SPT için, deneysel alanı kavramsal olarak üç eşit büyüklükte bölgeye bölün: boş, merkez ve türdeş (bkz. Şekil 1). Üç eşit dikey kutu çizin. Sığ tanka yönelik kutuyu Conspecific, boş tanka yönlendirilmiş kutuyu Boş ve ortadaki kutuyu Merkez olarak adlandırın. Kutuların aynı genişlikte (6 cm) ve uzunlukta (18-19 cm) olmasına, arena sınırlarını aşmamasına ve üst üste gelmemesine dikkat edin.
7. Algılama Ayarları altında, Video Dosyasında hangi videonun ele alınacağını doğrulayın. Ardından, algılama kalitesini kontrol edin (sarı balık, kırmızı merkez nokta). Algılamayı ayarlamak, hayvanı yeniden odaklamak için Otomatik Algıla'ya tıklayın (beyaz arka plan üzerinde hayvanın profilde yüzdüğü bir görüntü seçin, resmi tüm vücudunu alarak çizin ve algılamayı Evet ile doğrulayın). Dinamik Çıkarma, Daha Koyu Konu, Arka Plan Ayarları, Arka Plan Öğrenme, Konu Boyutu, Gürültü Azaltma vb. seçerek algılamayı iyileştirmek için Gelişmiş'i açın.
8. Deneme Sürümü Ayarları altında, bir deneme sürümü koyun ve diğerlerini silin (sağ tıklayın ve silin)
9. Veri Ayarları'nın altında, Sonuçlar iletişim pencereleri oluşturun. Sonuçları zaman ve bölge başına parametreleştirin. Örneğin, dakikaya göre veri çıkışı için bir Sonuçlar penceresi ve toplam süreye göre (6 dakika) veri çıkışı için başka bir pencere oluşturun. Her bölge için veri çıkışını isteyin (her bölgedeki mesafe gerekliyse isteyin). Farklı Sonuçlar pencerelerini oklarla Başlangıç penceresine bağlayın.
10. Analiz Ayarları'nın altında, analiz edilecek parametreleri ve her parametre için İstatistik türünü seçin. Bu parametreler, izlemeden elde edilen verilere göre otomatik olarak hesaplanacaktır.
    1. NTT ve SPT için aşağıda tanımlanan seçenekleri belirleyin:
       1. Arenada kat edilen mesafeyi (cm) ve ilgili bölgelerde kat edilen mesafeyi (cm) elde etmek için Taşınan Mesafeyi ( Toplam'ı seçin) seçin.
       2. Bölgelerde (bölgelerde) geçirilen süreye ve bölgelere ilk girişe kadar gecikme süresine sahip olmak için Bölgeler İçinde'yi ( Bölgeler, Sıklık, Kümülatif ve İlk Gecikme Süresi'ni seçin) seçin.
       3. Bölge Geçişi'ni seçin (Eşik: 0 cm, Bölge 1 > Bölge 2 Ekle'yi seçin; Bölge 2 > Bölge 1, herhangi bir bölgede, Sıklık) bölgelerdeki giriş sayısını elde etmek için.
       4. Hipermobilite süresine, donma süresine (s) sahip olmak için Mobility Sate'yi seçin (Yüksek mobil p'in üzerinde, Hareketsiz %3'ün altında, minimum 150 kare doldurun ve frekans, kümülatif ve gecikme süresini ilk olarak seçin).
          NOT: Otomatik analiz kullanılarak donma davranışının yaklaşık değeri ve donma bölümlerinin sayısı ve süresi hakkında daha fazla ayrıntı için Tartışma bölümüne bakın.
       5. Darting ve düzensiz (hızlı hızlanma hareketleri) gibi karmaşık davranışların oluşumunu değerlendirmek için Hızlanma ve Dönüş Açısı'nı (frekansı ve kümülatifi seçin) seçin.
    2. ST için, yukarıdaki keşif parametrelerine ek olarak, balıklar arasındaki ortalama mesafeyi (cm), en yakın komşu arasındaki ortalama mesafeyi (cm) ve en uzak komşu arasındaki ortalama mesafeyi elde etmek için Konular Arasındaki Mesafe (tüm konuları seçin, ortalama, maksimum, minimum) seçeneğini seçin.
11. Şablon kullanıma hazırdır. Son değişiklikleri kaydedin ve videodan herhangi bir veri almadan şablonu kapatın (şablon dosyasını koruyun; hafiftir ve yönetimi ve kopyalanması kolaydır). Birden fazla yazılım lisansı varsa, videoları her bilgisayara kopyalanan aynı şablondan analiz edin.
12. Şablonu kopyalamak ve kullanmak için iki seçenek vardır:
    1. Şablon dosyasını davranış analizi yazılımıyla açın, yeni bir özdeş dosya oluşturmak için Dosya > Farklı kaydet'e gidin.
    2. Karşılama arayüzünde, Şablondan Yeni'yi seçin > Video Dosyasından Özel Şablon > Uygulandı (şablonu seçin. EthXV dosyası). Yeni denemeyi adlandırın ve konumunu seçin. Yazılımın şablon dosyasındaki bilgileri kopyalaması birkaç dakika sürebilir.
13. Video farklı bir kamerayla kaydedildiyse şablonu yeniden ayarlamak için Arena Ayarları'na gidin (4.6 ve 4.7 adımlarını izleyin).
14. Hangi videonun seçildiğini kontrol etmek için Algılama Ayarları'na veya Edinme'ye gidin ve gerekirse video dosyasını değiştirin.
15. Alım'ın altında DDS'yi > Başlamaya Hazır'ı seçin. Yazılımın videoyu işlemesi birkaç dakika sürebilir.
16. Edinme tamamlandığında İzleme Düzenleyicisi'ne gidin. İşlenen videoyu daha hızlı okumak ve izlemenin doğru olup olmadığını kontrol etmek için hızlanma x16'yı seçin.
    NOT: Bazen, izlemede "kayıplar" olabilir (yazılımın kendisinin yansımaları veya karışıklığı nedeniyle). Az sayıda ise bu bölümden manuel olarak düzenlenebilirler; Aksi takdirde, tüm deneyi yeniden işlemek, tuvalin tanımını ve algılamayı iyileştirmek tercih edilir.
17. İstatistikler altında, Verileri Hesapla > Dışa Aktar'a tıklayın. Veri dışa aktarma işlemi doğrudan deneme klasöründe bulunur.
18. Görselleştirmeyi İzle veya Isı Haritaları altında, hayvanın izleme görüntülerini oluşturun ve dışa aktarın (sağ tıklayın, görüntüyü dışa aktarın, bu verileri elektronik tablo raporuyla kaydetmek için deneyin Dosyaları Dışa Aktar klasörünü seçin).
19. Etkin denemeyi kapatmak için Dosya'ya gidin ve bir sonraki video için bu prosedürü tekrarlayın.

5. İstatistiksel analiz

1. Her gruptaki verilerin normalliğini (Shapiro-Wilk testi) analiz edin.
2. Homoskedastisiteyi Levene'nin testi ile değerlendirin.
3. Normallik ve homoskedastisite kriterlerinin reddedilemediği durumlarda gruplar arasındaki farklılıkları test etmek için tek yönlü ANOVA'yı ve ardından Dunnett ve Tukey'in çoklu karşılaştırma testlerini kullanın.
4. Normallik ve homoskedastisite kriterleri reddedildiğinde gruplar arasındaki farklılıkları test etmek için Kruskal-Wallis testini ve ardından Bonferroni düzeltmesini kullanarak ikili bir karşılaştırma yapın.
5. Verileri grafik yazılımla çizin.

Bu bölümde, bu davranışsal araçların balık nörotoksikolojisindeki bazı olası uygulamalarına bakacağız. Aşağıdaki sonuçlar, eğlence amaçlı bir uyuşturucu olan metamfetaminin (METH) akut veya aşırı etkilerinin ve sucul ekosistemlerde bulunan ana herbisitlerden biri olan glifosatın sub-kronik etkilerinin karakterizasyonuna karşılık gelmektedir.

Yetişkin zebra balıklarında metamfetamin aşırı nörotoksisite modelinin karakterizasyonu
40 mg/L METH'in NTT üzerindeki etkisini değerlendirirken (Şekil 3), Kruskal-Wallis testi, maruz kalan hayvanların, deney tankının üst bölgesinde (H(2) = 35.964, P = 1.55 x 10-8) ve bu bölümde kat edilen mesafede (H(2) = 32.272) keşif süresinde bir azalma ile karakterize edilen pozitif bir jeotaksi sunduğunu doğruladı. P = 9.82 x 10-8) ve ziyaret sayısında (H(2) = 36.527, P = 1.17 x 10-8). Ayrıca üst bölgeye ilk ziyaretten önceki gecikme süresinde de önemli bir artış gözlemledik (H(2) = 17.264, P = 0.00018). METH maruziyetinden sonra NTT'de ölçülen parametrelerde gözlenen farklılıkların, Bonferroni düzeltmesi (P > 0.8) ile onaylandığı gibi, zaman içinde tutarlı olduğunu belirtmek önemlidir. Maruz kalma süresinin donma davranışı için anlamlı bir etkisi bulunmuştur (H(2) = 13.120, P = 0.0014).

Şekil 3: 3 saat ve 48 saat boyunca 40 mg/L metamfetamine (METH) maruz kalan yetişkin zebra balıklarının standart 6 dakikalık yeni tank testinde (NTT) değerlendirilen anksiyete benzeri davranış. Her deneyden elde edilen veriler, karşılık gelen kontrol değerlerine normalleştirildi. Birleştirilmiş veriler, medyan (n = 14-15), **p < 0.01, ***p < 0.001; NTT uç noktaları için Bonferroni düzeltmeli Kruskal Wallis testi. 2 bağımsız deneyden elde edilen veriler. Bu rakam Bedrossiantz ve ark.15'in izniyle çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Donma hareketleri, donmanın sıklığı, gecikmesi, süresi veya konumu değerlendirilerek ölçülebilir. Bunları puanlamanın en iyi yolu şüphesiz oldukça zahmetli ve karmaşık olan deneyimli bir gözlemcinin gözüdür, bu nedenle donma davranışını tespit etmek için EthoVision yazılımını kullanarak otomatik bir alternatif denedik19. Yazılım tarafından hesaplanan donma saldırılarının sayısının, gecikmesinin ve süresinin (Tablo 1A), gözlemci tarafından manuel olarak puanlanan bölümlerle (Tablo 1B) iyi bir doğrulukla ilişkili olduğunu bulduk. İki yöntem sonuçlar açısından eşdeğer olsa da (P = 0.958, Öğrenci testi), burada donmayı değerlendirmek için otomatik yaklaşımı kullandık. METH'e 3 saat maruz kaldıktan sonra donma süresi önemli ölçüde artarken (P = 0.0012), 48 saat maruziyetten sonra kontrol ile fark bulunmadı (P = 0.16). METH her iki zamanda da düzensiz hareketler üzerinde hiçbir etki yaratmadı.

METH'e akut maruziyetten sonra sosyal davranış üzerindeki etkileri değerlendirmek için iki deneysel paradigma kullandık. ST (Şekil 4), bireyler arasındaki ortalama mesafenin ve en uzak mesafenin METH'li balıklar için anlamlı derecede daha büyük olduğunu ortaya koymuştur (H(2) = 53.261, P = 2.72 x 10-12; H(2)=52.504, P = 3.97 x 10-12 ortalama ve en uzak balıklar arası mesafeler için sırasıyla), davranışsal bir sosyal izolasyon fenotipine işaret eder. Yine, Bonferroni post hoc testi kullanılarak zaman etkisinin bulunmadığını belirtiyoruz (P > 0.5).

Şekil 4: 3 saat ve 48 saat boyunca 40 mg/L metamfetamine (METH) maruz kalan yetişkin zebra balıklarının sosyal davranışları. Ortalama ve en uzak balıklar arası mesafeler dahil olmak üzere sürü testi (ST) sonuçları. Birleştirilmiş veriler, medyan (n = 18), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; Bonferroni düzeltmesi ile Kruskal Wallis testi. 2 bağımsız deneyden elde edilen veriler. Bu rakam Bedrossiantz ve ark.15'in izniyle çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

SPT'de (Şekil 5), tedavi edilen balıklar, belirli bölgede harcanan zaman ve kat edilen mesafede önemli bir azalma göstermektedir (F(2,74) = 14.497, P = 4.87 x 10-6; F(2,73) = 13.461, P = 0.00001 sırasıyla belirli bölgede harcanan zaman ve kat edilen mesafe için). Bu sonuçlar, TS sonuçlarının önerdiği sosyal izolasyon fenotipini yeniden doğrulamaktadır. Tukey'in Dürüst Anlamlı Fark (HSD) post hoc testi, iki analiz zamanı arasında olası bir fark olmadığını dışladı (P > 0.5).

Şekil 5: 3 saat ve 48 saat boyunca 40 mg/L metamfetamine (METH) maruz kalan yetişkin zebra balıklarının sosyal davranışları. Deney tankının üç sanal bölgesinin her birinde balığın zamanı ve mesafesi dahil olmak üzere sosyal tercih testi (SPT) sonuçları: boş, merkez ve türdeş. Her deneyden elde edilen veriler, karşılık gelen kontrol değerlerine normalleştirildi. Birleştirilmiş veriler, medyan (n = 17-20), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA. 2 bağımsız deneyden elde edilen veriler. Bu rakam Bedrossiantz ve ark.15'in izniyle çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Çevresel glifosat seviyelerine subkronik maruziyetin davranışsal etkisi
3 μg/L glifosata subkronik maruziyetin NTT üzerindeki etkilerinin davranışsal analizi (Şekil 6), tepeyi keşfetmek için harcanan zamanda (F2,77 = 8.744, P = 0.0004), bu kısımda kat edilen mesafede (F2,77 = 9.118, P = 0.0003) ve ziyaret sayısında (F2,77 = 3.441, P = 0.037). Bu etkiler, tankın tepesine ilk ziyaretten önceki gecikme süresinde gözlemlenen artan etki gibi pozitif jeotaksi davranışının karakteristiğidir (H(2) = 9.628, P = 0.008). Maruz kalan hayvanların düzensiz ve donma davranışlarının ifadesi de NTT'de analiz edildi. Süre (H(2) = 17.261, P = 0.025) ve düzensiz epizod sayısı (F2,76 = 10.073, P = 0.0001) glifosat ile önemli ölçüde artmıştır. Buna karşılık, kontrol ile donma farkı bulunmadı (Pearson Ki-Kare(2) = 2.964, P = 0.253). Ekolojik bir bağlama uygulandığında, NTT'de yapılan gözlemler, glifosatın balıkların keşif davranışını önemli ölçüde azaltabileceğini ve vahşi doğada hayatta kalma yeteneklerini tehlikeye atabileceğini göstermektedir.

Şekil 6: 2 hafta boyunca 0,3 μg/L ve 3 μg/L glifosata maruz kalan yetişkin zebra balıklarının standart 6 dakikalık yeni tank testinde (NTT) değerlendirilen anksiyete benzeri davranış. Analiz edilen davranışsal parametrelerin yanı sıra, üst ve alt olmak üzere iki eşit sanal bölgeye bölünmüş deney tankının bir karikatürü. Medyan (n = 23-29), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 ile dağılım grafiği olarak rapor edilen veriler; Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA (Toplam mesafe, Üstteki mesafe, Üstteki süre, Tepeye geçişler, Düzensiz nöbetler, Yüksek hareketlilik frekansı) veya Bonferroni düzeltmeli Kruskal Wallis testi (Tepeye kadar gecikme, Düzensiz süre). Donma süresi ve donma nöbetlerinde fark bulunmadı (P > 0.05). 2-4 bağımsız deneyden elde edilen veriler. Bu rakam Faria ve ark.20'nin izniyle çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Kendilerini yırtıcılardan korumak için sosyal baskıyla bir arada tutulan kutuplaşmamış türdeşlerden oluşan okullaşma, Danio rerio'nun doğal bir eğilimidir. Okul, hayvanların kaygı veya korku düzeyine bağlı olarak "sıkılaşabilir" veya "genişleyebilir", deneysel olarak tanımlanması çok kolay olan belirli bir görsel efekt (Şekil 7). Glifosat deneyinde, sürüleme testi, 3 μg/L'ye maruz kalan balıklarda, sürünün gruplandırılmasıyla yansıtılan kaygıda bir artış olduğunu ve böylece bireyler arasındaki ortalama mesafede ve en uzak mesafede önemli bir azalma olduğunu ortaya koymuştur (F2,56 = 5,664, P = 0,006 ve F2,56 = 7,413, P = 0,001, ortalama ve en uzak balıklar arası mesafeler için, sırasıyla) kontrolle karşılaştırıldığında.

Şekil 7: 2 hafta boyunca 0.3 μg/L ve 3 μg/L glifosata maruz bırakılan yetişkin zebra balıklarının sosyal davranışları. Medyan (n = 19-20), *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 ile dağılım grafiği olarak rapor edilen veriler; Dunnett'in çoklu karşılaştırma testi ile tek yönlü ANOVA (Ortalama balıklar arası mesafe ve En uzak mesafe) 2 ila 4 bağımsız deneyden elde edilen veriler. Bu rakam Faria ve ark.20'nin izniyle çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Otomatik bir analiz kullanarak donma davranışının yaklaşık bir değeri. Bu tabloda bildirilen veriler, iki farklı yöntemle analiz edilen aynı kayıttan (Video 1) gelmektedir. (A) EthoVision V13 yazılımı ile otomatik hesaplama ile donma davranışının tahmini. Değişken hareketlilik, konu alanının iki numune arasındaki değişiminden hesaplanır, bu nedenle bu alanın edinme sıklığına bağlıdır. Çok düşük bir hareketsizlik eşiği (%3'ten az hareketlilik) ve örnekleme hızını minimum sürekli 5 sn (150 kareden fazla) olarak belirledik. (B) Davranışsal Gözlem Araştırma Etkileşimli Yazılımı (BORIS, ücretsiz ve açık kaynaklı yazılım) ile donma davranışının analizi. BORIS, video kodlama ve canlı gözlemler için bir olay günlüğü yazılımıdır. BORIS ile gözlemci, başlangıç ve bitiş noktalarını tanımlayarak donma bölümünü bir durum olayı olarak kodlayabilir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: Yeni tank testinde balıkları kontrol edin. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yürütüldüğünü beyan ederler.