Bu protokol, retroviral vektör üretimini ve murin T hücresi transdüksiyonunu kolaylaştırarak fare CAR-T hücrelerinin verimli bir şekilde üretilmesini kolaylaştırır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Murin kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerinin verimli üretimi
Bu makalede
Özet
Özet
Kimerik antijen reseptörü (CAR)-T hücrelerini kullanan tasarlanmış hücre tedavileri, hematolojik maligniteleri olan bireylerde dikkate değer bir etkinlik elde etmiştir ve şu anda çeşitli katı tümörlerin tedavisi için geliştirilmektedir. Şimdiye kadar, yeni CAR-T hücre ürünlerinin ön değerlendirmesi, ağırlıklı olarak immün yetmezliği olan fareler kullanılarak ksenogreft tümör modellerinde gerçekleştirilmiştir. Bu yaklaşım, deney ortamında insan CAR-T hücrelerinin başarılı bir şekilde aşılanmasını kolaylaştırmak için seçilmiştir. Bununla birlikte, tümörlerin ve CAR-T hücrelerinin aynı fare suşundan türetildiği sinjeneik fare modelleri, fonksiyonel bir bağışıklık sistemi ve kapsamlı tümör mikroçevresi (TME) bağlamında yeni CAR teknolojilerinin değerlendirilmesine izin verir. Burada açıklanan protokol, retroviral transdüksiyon ve ex vivo T hücre kültürü için standartlaştırılmış yöntemler sunarak fare CAR-T hücre üretimi sürecini kolaylaştırmayı amaçlamaktadır. Bu protokolde açıklanan yöntemler, bağışıklığı yeterli sistemlerde yeni CAR teknolojilerinin rutin olarak değerlendirilmesini sağlamak için bu çalışmada kullanılanların ötesinde diğer CAR yapılarına da uygulanabilir.
Giriş
Kimerik antijen reseptörlerini (CAR'lar) eksprese eden evlat edinen T hücresi tedavileri, antijen pozitif kanser hücrelerini spesifik olarak hedeflemek ve ortadan kaldırmak için adaptif bağışıklık sisteminin gücünden yararlanarak kanser immünoterapisi alanında devrim yaratmıştır1. B hücreli maligniteleri hedef alan CAR-T hücre tedavilerinin başarısı klinik olarak doğrulanmış olsa da, hayvan modellerinde gerçekleştirilen klinik öncesi çalışmalar, katı tümörleri hedefleyen yeni CAR'ların geliştirilmesi için hayati önem taşımaktadır. Bununla birlikte, şimdiye kadar katı tümör endikasyonlarında sınırlı klinik etkinlik gösteril....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan prosedürleri, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (Columbia Üniversitesi, AC-AABQ5551 ve AC-AAAZ4470 protokolleri) onayı ile 20-25 g ağırlığındaki 6-8 haftalık dişi BALB/c veya CF57BL/6 fareler kullanılarak gerçekleştirildi. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz. Bu protokol, murin T hücrelerinin 'aktivasyonundan sonraki günler' etrafında yapılandırılmıştır ve viral üretim -2. günde başlar. Retrovirüs, ilk üretimden sonra -80 ° C'de saklanabilir ve bu protokolün gelecekteki kullanımı için, 0. günde 2. adım, T hücresi izolasyonu ve aktivasyonu ile başlanabilir.
1. Retroviral vektör ü....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada açıklanan protokol, fare CAR-T hücrelerinin üretilmesi için murin T hücresi transdüksiyon sürecini standartlaştırmayı amaçlamaktadır. Şekil 1 , ilgili adımların ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Süreç, viral bileşenlerin Phoenix Eco hücrelerine birlikte transfeksiyonu yoluyla retroviral vektörlerin üretilmesiyle başlar. Şekil 2 , transfeksiyon gününde Phoenix Eco hücrelerinin optimal yoğunluğunun bir görüntüsünü sağlar. İzole edilmiş T hücreleri.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, in vivo çalışmalar için CAR-T hücreleri üretmek üzere murin T hücrelerinin retroviral transdüksiyonu için gerekli adımları ve reaktifleri açıklar. Retroviral transdüksiyon koşullarının optimize edilmesi, ultrasantrifüjleme veya ek reaktifler yoluyla viral konsantrasyona ihtiyaç duymadan sağlam CAR ekspresyonu sağlar. Ancak, bu metodolojiye uygulanabilecek birden fazla değişiklik vardır.
Bu protokol, GFP'ye özgü bir CAR'ın örnek oluşumunu açıklarken, bu yöntemler, ilgileni.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan edilmedi.
Teşekkürler
Makalenin eleştirel incelemesi için L. Brockmann'a teşekkür ederiz. Bu çalışma NIH 1R01EB030352 ve UL1 TR001873 tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 0.45 μ m filtreler | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
| 1 mL şırınga | Fisher Bilimsel | 14-955-450 | |
| 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri | Fisher Bilimsel | 05-408-135 | |
| 10 mL şırınga | BD | 14-823-16E | |
| 100 ve mu; m süzgeç | Corning | 07-201-432 | |
| 15 cm TC işlem görmüş hücre kültürü kapları | ThermoFisher Scientific | ||
| 15 mL konik tüpler | Şahin | 14-959-70C | |
| 40 μ m süzgeç | Corning | 07-201-430 | |
| 50 mL konik borular ve nbsp; | Şahin | 14-959-49A | |
| 70 μ m süzgeç | Corning | 07-201-431 | |
| Attune NxT Akış Sitometresi | ThermoFisher Bilimsel | ||
| BALB/C, 6-8 haftalık | Jackson Laboratuvarı | 651 | |
| B-Merkaptoetanol ve nbsp; | Gibco | 21985023 | |
| Sığır Serumu Albümini | GOLDBIO | A-420-500 | |
| DMEM Orta | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (PBS), Kalsiyum ve Magnezyum İçermez | Gibco | 14-190-250 | |
| DynaMag-2 Mıknatıs ve nbsp; | Invitrogen | 12-321-D | |
| EasySep Mıknatıs | Kök Hücre Teknolojileri | 18000 | |
| EasySep Fare T hücresi İzolasyon Kiti | Kök Hücre Teknolojileri | 19851 | |
| FACS tamponu | BD | BDB554657 | |
| Fetal sığır serumu (FBS) | Corning | MT35011CV | |
| GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
| G-Rex6 | Wilson Kurt | 80240M | |
| HEPES Tampon Çözeltisi | Gibco | 15-630-080 | |
| İnsan rekombinant IL-15 | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
| İnsan rekombinant IL-2 | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
| İnsan rekombinant IL-7 | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
| Lipofektamin 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler Çözeltisi | Gibco | 11140-050 | |
| Fare Anti-CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
| Fare Anti-CD3 / CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
| Fare Anti-CD4 BV605 | BD | 563151 | |
| Fare Anti-CD44 APC | Biolegend | 103011 | |
| Fare Anti-CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
| Fare Anti-CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
| Nikon Ti2 Prime 95B kameralı ve nbsp; | Nikon | ||
| İşlenmemiş 24 kuyulu plakalar | CytoOne | CC7672-7524 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
| pCL-Eco | Addgene | # 12371 | |
| Penisilin / Streptomisin Çözeltisi | Gibco | 15-070-063 | |
| Phoenix Eco hücreleri | ATCC | CRL-3214 | |
| pMDG.2 | Addgene | # 12259 | |
| pMSCV_PGK_GFP28z | Yok | Yapımcı: R.LV. | |
| Saflaştırılmış sfGFP | N/A | R.LV tarafından üretilmiştir. | |
| RetroNectin ('transdüksiyon reaktifi') | Takara Bio | T100B | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Serolojik pipet 10 mL | Fisher Scientific | 13-678-11E | |
| Serolojik pipet 25 mL | Fisher Scientific | 13-678-11 | |
| Serolojik pipet 5 mL | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| Sodyum Piruvat | Gibco | 11-360-070 | |
| TC ile işlenmiş 24 kuyulu plakalar ve nbsp; | Corning | 08-772-1 | |
| Tripan mavisi | Gibco | 15-250-061 |
Kaynaklar
- June, C. H., Sadelain, M. Chimeric antigen receptor therapy. N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
- Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).
- Hou, A. J., Chen,....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
