İn Vitro Tahliller ve Transkriptomik Çalışmalar için Yetişkin Fare Omuriliğinden Saf Astrositlerin ve Mikroglia'nın İzolasyonu

Astrositler ve mikroglia, merkezi sinir sisteminde (MSS) hayati roller oynayan, nöronal fonksiyonu düzenlemek, CNS gelişimine katkıda bulunmak, kan-beyin bariyerini korumak ve diğer kritik süreçlere katılmak gibi sorumlulukları kapsayan çok yönlü glial hücrelerdir 1,2,3,4 . Homeostazın korunmasındaki rollerinin yanı sıra, bu glial hücreler ayrıca yaralanma ve onarım mekanizmalarında da önemli bir rol oynar. Mikroglia, hakaret veya yaralanmaları takiben fagositik, inflamatuar ve göç etme yetenekleriyle bilinir ^5,6,7. Hastalıktaki astrosit yanıtları eşit derecede çeşitlidir, iltihaplanmaya, glial skarların oluşumuna ve kan-beyin bariyerinin tehlikeye atılmasına^katkıları kapsar ^8,9. CNS'deki mikroglia ve astrositlerin zararlı ve onarıcı rolleri hakkındaki anlayışımız artmış olsa da, hem yapılarında hem de işlevlerinde doğal heterojenlik, onları çeşitli bağlamlarda incelemek için sağlam araçlar gerektirmektedir.

Mikroglia ve astrositlerin sağlık ve hastalıktaki rolleri hakkında daha fazla bilgi edinmek, in vivo ve in vitro araştırmaların birleşik bir yaklaşımını gerektirir. İn vivo teknikler, CNS içindeki glial hücreler ve nöronlar arasındaki karmaşık karışmadan yararlanırken, in vitro metodolojiler, tek hücreli fonksiyonları veya spesifik uyaranlar altındaki yanıtları değerlendirirken değerli olduğunu kanıtlamaktadır. Her yöntem benzersiz avantajlar sunar; İn vitro çalışmalar, komşu hücrelerden doğrudan veya dolaylı girdi olmadan bu hücre tiplerinin spesifik rollerini anlamak için gereklidir. Ek olarak, ölümsüz hücre hatlarını kullanan in vitro tahliller, süresiz olarak çoğalma yeteneği, maliyet verimliliği ve bakım kolaylığı dahil olmak üzere belirli faydalar sunar. Bununla birlikte, birincil hücrelerin, hücre hatlarına kıyasla normal fizyolojik tepkileri daha yakından taklit ettiğine dikkat etmek önemlidir. Bu fizyolojik alaka, fonksiyonel testlerde ve transkriptomik analizlerde çok önemlidir.

Özellikle yetişkin fare omuriliğinden birincil hücrelerin elde edilmesindeki zorluklardan biri, örneklerin miktarı ve canlılığında yatmaktadır. Beyinden daha küçük olan ve önemli miktarda miyelin içeren yetişkin omuriliği, benzersiz zorluklar doğurur. Yenidoğan hayvanlardan veya yetişkin fare beyninden saf, canlı glial hücrelerin izolasyonunu detaylandıran birkaç yayınlanmış protokol olsa da 10,11,12,13, bu metodolojiler omuriliğe özgü hastalıkları ve yaralanmaları incelemek için uygun olmayabilir. Bu protokolde, yetişkin fare omuriliğinden saf, canlı mikroglia ve astrositleri verimli bir şekilde izole etmek için kapsamlı bir prosedür sunuyoruz, hücre kültürü ve transkriptomik analizlerde aşağı akış uygulamalarını kolaylaştırıyoruz. Bu protokol, bu hücreleri 10 haftadan 5 aya kadar olan yetişkin farelerden izole etmek için başarıyla kullanılmış ve koşullu nakavt fareleri, ilaç tepkileri, gelişimsel araştırmalar ve yaşa bağlı modelleri içeren çalışmalar dahil olmak üzere çeşitli bağlamlarda faydasını göstermiştir.

Tüm hayvan bakımı ve deneysel prosedürler, George Washington Üniversitesi Tıp ve Sağlık Bilimleri Fakültesi'nde (Washington, D.C., ABD; IACUC#2021-004). Çalışmada, ticari bir tedarikçiden temin edilen ve George Washington Üniversitesi'nde bulunan 10 haftadan 5 aya kadar erkek ve dişi C57BL / 6J vahşi tip (WT) fareler kullanıldı. Protokol iş akışına genel bir bakış Şekil 1'de sunulmuştur.

1. Omuriliğin hazırlanması

1. Hayvanları Avertin (steril suda 12.5 mg/mL 2,2,2-Tribromoetanol ve %2,5 2-metil-2-bütanol) kullanarak uyuşturun (bkz. Farelerde ayak parmağı ve kuyruk tutamlarına yanıt verilmediğini onaylayın.
2. Periferik kan mononükleer hücrelerini çıkarmak için soğuk 1x Dulbecco'nun fosfat tamponlu salini (DPBS) ile kardiyak perfüzyon gerçekleştirin.
   1. Hayvanı sığ bir tepsiye yerleştirin ve plevral boşluğu ortaya çıkarmak için yanal bir kesi yapın. Peristaltik bir pompaya bağlı 23 G'lik bir perfüzyon iğnesini (Malzeme Tablosuna bakınız) sol ventriküle yerleştirin ve pompayı etkinleştirin. Soğuk DPBS kalpten aktıktan sonra, sağ atriyumda küçük bir kesi oluşturun.
      NOT: Hücre canlılığını artırmak için bu adımda daha hızlı bir perfüzyon hızı tercih edilir. Kan 1 dakikadan kısa sürede boşaltılmalıdır. Karaciğerin temizlenmesi başarılı perfüzyonu gösterir.
3. Büyük makas kullanarak hayvanın başını kesin ve omurgayı^{çıkarın 14}. Doku durulaması için buz üzerinde bir Petri kabında Ca²⁺/Mg²⁺/%0.2 glikoz ile soğuk 1x DPBS'ye daldırın.
4. Şu andan itibaren, tüm adımların steril bir ortamda gerçekleştirildiğinden emin olun. Tüm omuriliği izole etmek için hidrolik ekstrüzyon¹⁴ kullanın. 18 G'lik bir iğne ve^{Ca2 +}/Mg^{2 +}/% 0.2 glikozlu soğuk 1x DPBS ile doldurulmuş 10 mL'lik bir şırınga kullanın. Omuriliği, tüm dokuyu batırmak için Ca^{2 +} / Mg^{2 +}/% 0.2 glikoz ile yeterli soğuk 1x DPBS içeren buz paketleri üzerine yerleştirilmiş bir Petri kabına aktarın.
5. Meninksleri laminer akış başlığı içinde mikroskop altında dikkatlice çıkarın. Omuriliği buz paketleri üzerinde boş bir Petri kabına aktarın ve 10 numaralı bıçaklı cerrahi neşter kullanarak tüm omuriliği 2-3 mm'lik bölümlere ayırın.

2. Enzimatik hücre ayrışması

1. Üreticinin protokolünü izleyerek piyasada bulunan Yetişkin Beyin Ayrışma Kitinden Enzim karışımı 1 ve Enzim karışımı 2'yi ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Omuriliğin düzgün bir şekilde kaplanmasını sağlamak için enzimleri çanakta birkaç kez döndürün, ardından 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Her 5 dakikada bir, doku topaklanmasını önlemek ve reaktiflerin eşit dağılımını kolaylaştırmak için kabı hafifçe döndürün.
2. Çanağı inkübatörden çıkarın ve Minimal Esansiyel Ortama (MEM) 350 μL 0.46 mg/mL DNAse I ekleyin (bkz. Hafifçe döndürerek karıştırın.
3. 1 mL soğuk DMEM/%0.5 Fetal Sığır Serumu (FBS) ekleyin ve hafifçe döndürerek karıştırın. Tüm içeriği hemen 5 mL'lik bir tüpe aktarın.

3. Mekanik hücre ayrışması

1. Bir P1000 pipeti kullanarak, dokuyu üç kez nazikçe ezin ve dokuyu daha da ayrıştırmak için her seferinde doku parçalarının çekildiğinden emin olun. Ardından, tıkalı bir 9" cam Pasteur pipeti kullanarak, işlem sırasında kabarcık oluşmadığından emin olmak için beş kez daha hafifçe ezin.
2. 5 mL'lik tüpü dik olarak yerleştirin ve dokunun 30 saniye boyunca dibe çökmesine izin verin. Doku yerleştikten sonra, bir P1000 pipeti kullanarak süpernatanı çekin ve 30 μm'lik bir filtreden 15 mL'lik bir konik tüpe geçirin.
3. Kalan doku ile aynı 5 mL'lik tüpe 1 mL soğuk DMEM /% 0.5 FBS ekleyin. Bir Pasteur pipeti kullanarak üç kez hafifçe ezin.
4. Dokunun 30 saniye boyunca dibe çökmesine izin verin, ardından süpernatanı 30 μm'lik bir filtreden geçirin ve daha önce olduğu gibi aynı 15 mL'lik tüpe toplayın. Adım 3.3 ve adım 3.4'ü bir kez daha tekrarlayın.
5. Filtrelenmiş hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Elde edilen süpernatanı bir vakum aspiratörü kullanarak dikkatlice çıkarın ve atın.

4. Miyelin giderimi

1. Kalıntı temizleme solüsyonunu kullanarak miyelini çıkarın (DRS) üreticinin protokolünü izleyerek Yetişkin Beyin Ayrışma Kitinde sağlanır. Enkaz çıkarıldıktan sonra, hücre peletine 5 mL soğuk DMEM /% 0.5 FBS ekleyin ve tüpü üç kez hafifçe ters çevirin. Hücre süspansiyonunu oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
   NOT: Hücreler in vitro çalışmalar için kullanılacaksa ve kültürde kalacaksa, bunun yerine önceden ısıtılmış DMEM/%0.5 FBS kullanılmalıdır.
2. Süpernatanı atın ve hücre peletini 1 mL DPBS /% 0.5 FBS (RNA çalışmaları için soğuk ve in vitro deneyler için sıcak) içinde yeniden süspanse edin. Hücreleri sayın ve Trypan Blue kullanarak canlılığı değerlendirin.
   NOT: Hücre konsantrasyonunu artırmak için birden fazla hayvandan alınan hücre süspansiyonları birleştirilebilir.
3. Toplam 5 mL hacme kadar DPBS /% 0.5 FBS ekleyerek hücreleri yıkayın. Süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı bir pipet kullanarak atın.

5. Mikroglia ve astrosit izolasyonu

1. Hücreleri, üreticinin protokolünü izleyerek anti-CD11b veya anti-ACSA-2 mikro boncuklarla etiketleyin (bkz.
2. Üreticinin talimatlarına göre MS sütunlarını kullanarak hücreleri pozitif seçime göre sıralayın (bkz. Malzeme Tablosu). Sıralamadan sonra, sıralanan hücreleri 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

6. İn vitro tahliller için kaplama hücreleri

NOT: Hücreler kaplanmayacaksa ve hemen RNA analizi için kullanılacaksa, 8. adıma geçin.

1. Hücreleri 1 mL sıcak DMEM /% 0.5 FBS'de yeniden süspanse edin. Hücreleri sayın ve bir hemasitometre kullanarak canlılıklarını değerlendirin (bkz.
2. Hücre konsantrasyonunu 50 μL başına 75.000 hücreye ayarlayın. 24 oyuklu bir plakada her bir Poli-L-lizin kaplı lamel^11'e 50 μL hücre süspansiyonu ekleyin.
3. Hücrelerin lamel üzerine yapışmasını sağlamak için 37 °C'de 2 saat inkübe edin.
4. Her bir oyuğa dikkatlice 450 μL ılık DMEM /% 5 FBS / Penisilin-Streptomisin (Pen-Strep, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
5. 3 gün sonra, ortamın yarısını 250 μL sıcak DMEM/%5 FBS/Pen-Strep ile değiştirin. Bakım için, ortamı her 4-5 günde bir 500 μL sıcak DMEM/%5 FBS/Pen-Strep ile tamamen değiştirin.

7. İmmünohistokimya

NOT: İmmünohistokimya analizlerinin, ortam en az bir kez değiştirildikten en az 3 gün sonra yapılması en iyisidir. Bu, döküntülerin çıkarılmasını ve hücrelerin lamel üzerine tamamen yapışmasını sağlar.

1. Ortamı çıkarın ve hücreleri oda sıcaklığında (RT) veya 37 °C'de 15 dakika boyunca ılık DMEM/%5 FBS/%10 normal keçi serumu (NGS) içinde fare önleyici mAb O4 (1:100) ( Malzeme Tablosuna bakın) ile etiketleyin.
   NOT: Bu adımı atlayın ve hücreler O4 ile etiketlenmeyecekse 7.3 adımına geçin.
2. Lamelleri üç kez ılık DMEM/%5 FBS'ye batırarak nazikçe durulayın. Keçi anti-fare 594 IgM (1: 300) ( Malzeme Tablosuna bakın) ılık DMEM/%5 FBS/%10 NGS'ye ekleyin ve karanlıkta 15 dakika RT'de inkübe edin. Ilık DMEM/%5 FBS'de üç kez nazikçe durulayın.
3. Hücreleri soğuk %5 asetik asit/metanol ile 4 °C'de 15 dakika sabitleyin. 1x PBS ile üç kez yıkayın, ardından uygun antikorla etiketleyin: anti-tavşan GFAP (1: 500), anti-fare GFAP (1: 500) veya anti-tavşan Iba1 (1: 500) içinde %1 Triton-X100/1x DPBS'de %10 NGS (bkz. RT'de 1 saat inkübe edin.
   NOT: Lameller zaten O4 ile lekelenmişse karanlıkta saklayın.
4. PBS ile üç kez nazikçe durulayın. Uygun ikincil antikorla etiketleyin: anti-fare 594 IgG (1: 500), anti-tavşan 488 IgG (1: 500) (bkz. Karanlıkta RT'de 30 dakika inkübe edin.
5. PBS ile üç kez nazikçe durulayın. RT'de 1 dakika boyunca DAPI (1: 1000) ile karşı boyayın. PBS ile üç kez durulayın, montaj ortamı ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve lamellerin slaytlara monte edilmesi.

8. RNA ekstraksiyonu

NOT: İdeal olarak, analiz için yeterli RNA'yı çıkarmak için en az 100.000 hücre olmalıdır. Gerekirse, 2-3 omurilikten hücreler birleştirilebilir.

1. Üreticinin protokolünü izleyerek piyasada bulunan bir RNA izolasyon kiti kullanarak RNA'yı çıkarın (bkz. Kitte verilen RW1 yıkama tamponu ile her yıkama adımı için, hücreleri 2 dakika daha yıkama tamponunda bırakın.
2. Kalan genomik DNA'yı, üreticinin talimatlarına göre DNaz I kullanarak çıkarın (bkz. RT'de DNaz ile 15 dakika inkübe edin, ardından RW1 tamponu ile yıkayın.
3. RNA verimini artırmak için, elüsyondan önce, numuneleri RT'de RNAse içermeyen suda 10 dakika inkübe edin. Bir biyoanalizör¹⁵ kullanarak RNA bütünlüğünü ve miktarını değerlendirin (bkz.

Bu protokolde özetlenen yöntemler, yetişkin fare omuriliğinden saf ve canlı mikroglia ve astrositlerin izolasyonunu sağlayarak, in vitro fonksiyonel veya histolojik testler ve RNA analizi dahil olmak üzere çeşitli aşağı akış uygulamalarını kolaylaştırır.

İn vitro çalışmalar için başarılı bir izolasyon, birkaç gün boyunca sürekli hücre proliferasyonuna neden olacaktır. Yetişkin hücreler, yenidoğan hayvanlardan izole edilen hücrelere kıyasla daha yavaş bir proliferasyon hızı sergiler ve ilk birkaç gün içinde bazı kalıntılar mevcut olabilir. 4 güne kadar in vitro (DIV), hücreler büyük ölçüde döküntülerden arındırılmış olmalı ve çoğu hücre şişenin dibine yapışmalıdır. Astrositler daha uzun süreçler oluşturmaya başlarken, mikroglia daha kısa iğlerle oval bir şekil alacaktır (Şekil 2). 7 DIV ile, astrositler bağlı bir birleşik tabaka oluşturmalı ve mikroglia daha az ve daha kısa süreçler göstermelidir (Şekil 3).

Saflık, astrosit kültürlerinde oligodendrosit kontaminasyonunu değerlendirmek için GFAP ve O4 ile ACSA2 ile sıralanmış hücrelerin ve mikroglia kültürlerinde astrosit kontaminasyonunu değerlendirmek için CD11b ile sıralanmış hücrelerin Iba1 ve GFAP ile çift etiketlenmesiyle doğrulanabilir (Tablo 1).

Başarılı bir protokol aynı zamanda minimum bozunma ve yeterli miktarda yüksek kaliteli RNA verecektir (Şekil 4A). İzole hücrelerden ekstrakte edilen RNA'nın elektroferogramları, belirgin 18S ve 28S pikleri sergilemelidir. Hücrelerin aşırı ayrışması veya perfüzyon ile hücre sıralaması arasındaki uzun süre, RNA bozulmasına yol açabilir (Şekil 4B). Yetersiz enzimatik ve/veya mekanik ayrışma veya yetersiz miyelin uzaklaştırımı, hücre veriminin ve RNA'nın azalmasına neden olabilir (Şekil 4C). İzole astrositler, inflamatuar belirteçleri tanımlamak için sıralanabilir. Sağlıklı astrositlerin inflamasyonla aktive olan astrositlerle karşılaştırılması (örneğin, deneysel bir otoimmün ensefalomiyelit hayvanından), sağlıklı ve enflamatuar astrositlerde inflamatuar yolların göreceli inhibisyonlarını ortaya çıkaracaktır (Şekil 4D).

Şekil 1: Omurilik hazırlığı, doku ayrışması ve hücre sıralamasına genel bakış. Şekil, doku ayrışması ve hücre sıralaması dahil olmak üzere omurilik hazırlama sürecine genel bir bakış sağlar. Omurilik diseksiyonundan sonra dokular enzimatik ve mekanik ayrışmaya uğrar. Miyelin çıkarılır ve hücreler, astrositleri ve mikrogliaları hedeflemek için anti-ACSA2 veya anti-CD11b antikorları ile etiketlenir. Sıralanan hücreler daha sonra hücre kültürü ve RNA analizi için kullanılabilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: 4 gün in vitro (4DIV) astrositlerin ve mikrogliaların faz kontrast görüntüleri. (A) Genişletilmiş işlemlere sahip ACSA2+ sıralanmış hücrelerin temsili bir örneğini gösterir. (B) CD11b+ hücreleri, oval şekilli hücre gövdeleri ve kısa süreçler gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şekil Ahn, J. J. ve ark.16'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: 8 gün in vitro (8DIV) astrositlerin ve mikrogliaların floresan görüntüleri. (A) GFAP (yeşil) ve O4 (kırmızı) ile etiketlenmiş ACSA2+ hücreleri, minimal O4 boyaması sergiler ve bağlı bir birleşik astrosit tabakası oluşturur. (B) Iba1 (yeşil) ve GFAP (kırmızı) ile etiketlenmiş CD11b + hücreleri, GFAP'ın minimum varlığını gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm. Bu şekil Ahn, J. J. ve ark.16'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: RNA örneklerinin temsili elektroferogramları. (A) Başarılı bir hücre izolasyonundan sonra yüksek verimli, yüksek kaliteli RNA beklenir. (B) Hücre ölümü, yetersiz ayrışma veya yetersiz enkaz çıkarma durumlarında düşük verim, düşük kaliteli RNA veya (C) düşük verim, yüksek kaliteli RNA beklenebilir. (D) İnflamatuar astrositlere karşı sağlıklı astrositlerde seçilmiş inflamatuar yolların RNA dizileme analizi, enflamatuar astrositlere kıyasla sıralanmış sağlıklı astrositlerde inflamasyonun göreceli inhibisyonunu ortaya koymaktadır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: ACSA-2 ve CD11b hücreleri için ayırma sonrası hücre verimi, saflığı ve canlılığı. Bu tablo Ahn, J. J. ve ark.16'dan uyarlanmıştır.

Hiç kimse