Bağırsak-beyin Nöral İletişiminin Gerçek Zamanlı Analizi: Bağırsak Glukoz Stimülasyonuna Yanıt Olarak Korteks Çapında Kalsiyum Dinamiği

Öncelikle, glikozun bağırsakta algılanması, bağırsak lümeni ^1,2,3,4,5,6 içindeki enteroendokrin hücrelerde bulunan tatlı tat reseptörleri (Tas1r2, Tas1r3) ve sodyum-glikoz kotransporter 1 (SGLT-1) yoluyla gerçekleşir. Beyindeki glikoz hissi, bağırsaktan emiliminden sonra tipik olarak dakikalar ila saatler arasında değişen bir süreçtir, esas olarak plazma kan şekeri seviyelerinin artmasına ve 7,8,9,10,11 hormonlarının salınmasına dayanan bir olaydır (ör., glukagon benzeri peptit-1 [GLP-1], Peptit YY (PYY) ve glikoza bağımlı insülinotropik polipeptit [GIP]). Hipotalamusun (ARC) kavisli çekirdeğine ulaşırlar ve burada pro-opiomelanocortin (POMC) nöronlarını ve aguti ile ilişkili protein (AgRP) nöronlarını kan akışı ve vagus siniri (parasempatik sinir) ile ^{bağlarlar12,13,14}. Bu nöronların aktivitesindeki değişiklik, metabolizmanın ve beslenme davranışının kontrolüne yol açar ^15,16.

Son literatür, glikoz emilimini takiben bağırsak-beyin nöral sinyalizasyonunun önemini giderek daha fazla vurgulamaktadır. Bu karmaşık yol genel olarak iki ana mekanizmaya ayrılabilir. Birincisi, spinal afferentlerin aktivasyonunu içerir ve sonuçta ARC'deki AgRP nöronal aktivitesini etkiler. İkinci mekanizma, vagus sinirinin epitel hücreleri ile bağlantılar yoluyla uyarılmasını gerektirir. Bağırsak epitel hücrelerinin vagus sinirini¹³ aktive edebileceği çok yönlü yollar göz önüne alındığında, rolü çok yönlü olarak kabul edilir.

Bağırsak, vagus ve spinal afferent sinir aktivitelerinin önemli bir kısmı beslenme davranışları ile ilişkilidir 17,18,19. Bununla birlikte, ortaya çıkan kanıtlar, "nöropod hücrelerine" çıkıntı yapan belirli vagus sinir liflerinin glikoz tercihinde rol oynadığını göstermektedir. Enteroendokrin hücrelerin bir alt kümesi olan nöropod hücreleri, luminal taraflarında SGLT-1'i eksprese eder ve duyusal uyaranları glutamaterjik sinapslar ^2,20,21,22 yoluyla bir vagus sinirine iletir. Vagus sinirinin aktivasyonu, ventral tegmental alandaki (VTA) dopaminerjik nöronları saniyeler içinde tetikler¹⁹. Özellikle, bir glutamat antagonisti kullanarak, özellikle duodenumda vagal aktivasyonun inhibe edilmesi, farelerde^sükroz tercihini azaltır 1. Bu, glikoz alımı sonrası gıda seçimi davranışını modüle etmede nöropod hücre aktivasyonunun kritik rolünün altını çizmektedir².

Bu gelişmelere rağmen, hızlı bağırsak glikoz algılama mekanizmalarının ve bunların kortikal aktiviteler üzerindeki etkilerinin tam olarak anlaşılması karmaşık bir muamma olmaya devam etmektedir. AgRP nöronları tarafından kontrol edilen beyin aktivasyonu serebral korteks^23'ü içermese de, VTA'daki dopaminerjik nöronların serebral kortekse projekte olduğu bilinmektedir. Bununla birlikte, glikoz algılamasından sonra hızlı VTA dopaminerjik nöronal aktivasyonunun serebral korteksi gerçekten aktive edip etmediği bilinmemektedir. Bu mekanizmayı aydınlatmak için, genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum göstergesini eksprese eden transgenik farelerde intragastrik glikoz uygulamasının kortikal Ca^{2 +} dinamiklerini hızla etkileme potansiyelini araştırdık.

Bu makale, farelerde korteks çapında Ca²⁺ görüntüleme kullanılarak intragastrik glikoz uygulamasını takiben kortikal aktivitedeki değişiklikleri kapsamlı bir şekilde anlamak için düşük maliyetli ve daha az invaziv bir yöntem sunmaktadır Son zamanlarda, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini ifade eden transgenik fareler kullanılarak, sağlam bir kafatası yoluyla transkraniyal korteks geniş Ca²⁺ görüntüleme tekniği popülerlik kazanmıştır²⁴. Özellikle, bu çalışmada kullanılan BAC GLT-1-G-CaMP7 #817 transgenik fare hattı (G7NG817 fare olarak da bilinir), nöronlarda ve astrositlerde^{25 Ca2+} sensörünü, G-CaMP7'yi eksprese eder. Serebral korteksteki yüksek ekspresyon yoğunluğu nedeniyle, bu transgenik fare serisi, standart bir epifloresan mikroskobu kullanılarak transkraniyal korteks genişliğinde Ca²⁺ görüntüleme için özellikle uygundur.

Tüm deneysel protokoller, Japonya Ochanomizu Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (hayvan çalışma protokolleri 22017). Tüm hayvan deneyleri, Ochanomizu Üniversitesi'nin Akademik Araştırma Kurumlarında (Eğitim, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı, Japonya) Hayvan Deneylerinin Uygun Şekilde Yürütülmesine İlişkin Temel Yönergelere uygun olan hayvan deneyleri yönergelerine göre gerçekleştirilmiştir. Kullanılan hayvan sayısını en aza indirmek için çaba sarf edildi. Bu çalışma ARRIVE kılavuzuna uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Transgenik farelerin hazırlanması

1. Bu deneyi takip etmek için, yetişkin erkek ve dişi BAC GLT-1-G-CaMP7 #817 transgenik fare serisini, yani G7NG817 fareleri^24,25 (8 haftadan büyük) kullanın. G7NG817 farelerin²⁵ arka plan suşu C57BL/6J'dir.
2. Fareleri 12 saat / 12 saat aydınlık / karanlık döngüsü altında barındırın ve onları en fazla beş fareden oluşan gruplar halinde büyütün.

2. Kateter oluşturma

1. Silikon tüpü (iç çap 0.5 mm, dış çap 1.0 mm) 7 cm'lik kesin bir uzunluğa ayarlamak için makas kullanın (Şekil 1A-a).
   NOT: İşlemlerden önce makas ve silikon tüp sterilize edildi.
2. Küçültülmüş plastik boncukları (iç çap 3 mm, dış çap 5 mm) özel boruya yapıştırın ve ucundan 3 mm uzakta olduklarından emin olun (Şekil 1A-b). Boncukları siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak güvenli bir şekilde yapıştırın (tıbbi veya standart varyantlar kabul edilebilir).
3. 23 G'lik bir iğnenin tepesini kesin olarak çıkarın ve ardından iğne ucundan 1,5 cm kesin (Şekil 1A-c).
4. Adım 2.3'ten kesitli 23 G iğneyi, boncukların yapıştırıldığı yerin karşısındaki silikon tüpün ekstremitesine sokun (Şekil 1A-d).

3. Enjektör oluşturma

1. İğne ucundan 1 cm çıkarmak için steril pense kullanın (Şekil 1B-a).
   NOT: Kopan uçtaki deliğin bütünlüğünü koruduğundan ve deforme olmadığından emin olun, çünkü herhangi bir bozulma enjeksiyon çözeltisinin akışını engelleyebilir.
2. Uyarlanmış 23 G enjeksiyon iğnesini adım 3.1.1'den 2.5 mL'lik bir şırıngaya bağlayın (Şekil 1B-b).
3. Bir silikon tüpü gerekli uzunluğa kadar segmentlere ayırın (bu deneyde 15 cm'lik bir silikon tüp) ve 23 G enjeksiyon iğnesinin üzerine kılıflayın (Şekil 1B-c).
   NOT: Dağıtılan çözeltinin hacmi, borunun uzunluğuna bağlı olarak dalgalanacaktır. Örneğin, 15 cm'lik bir tüp ile yaklaşık 50 μL çözelti deney sonrası oyalanacaktır.
4. 23 G enjeksiyon iğnesini iğne ucundan 1,5 cm uzakta kesin.
5. Adım 3.4'teki kesitli kısmı adım 3.3'te şekillendirilen silikon kateter ile birleştirin (Şekil 1B-d).
   NOT: Adım 3.1 ve 3.4'te oluşturulan deliklerin insizyon sonrası bozulmadan kaldığından emin olun. Düzeltme gerekiyorsa, dairesel konfigürasyonunu eski haline getirmek için pense kullanın.

4. Mide lokalizasyonu

1. Belirli bir odada% 3.0 izofluran inhalasyonu yoluyla fareye anestezi uygulayın. Göz kuruluğunu önlemek için oftalmik merhem sürün.
2. Farenin anestezi durumunu doğruladıktan sonra, anestezi uygulanmış fareyi inhalasyon odasından ameliyat masasına hassas bir şekilde aktarın. Prosedür boyunca termal destek sağlayın.
3. Fareyi sırtüstü yatırın, ağzını inhalasyon aparatına yakın hizalayın ve izofluran konsantrasyonunu% 3.0 ila% 2.0 arasında modüle edin.
   NOT: İzofluran maskesinin alt segmentini üst muadilinden ayırın ve ayrılan maskeyi (üst segment) yapışkan bant kullanarak ameliyat masasına sabitleyin.
4. Farenin ağız boşluğunu, ön ayaklarını ve arka ayaklarını yapışkan bant kullanarak ameliyat masasına destekleyin.
   NOT: Fareyi masaya sabitleyerek, fare uyuşturulsa bile harekete bağlı cerrahi hatalar önlenebilir.
5. Tüy dökücü krem kullanarak farenin tüylerini sol üst karın bölgesinden (ameliyat bölgesinin etrafındaki alanın 0'si) çıkarın. Ameliyat bölgesine topikal olarak lokal bir analjezik uygulayın ve devam etmeden önce 5 dakika bekleyin.
6. Karın derisine lokal anestezik jel uygulayın ve 5 ila 10 dakika bekleyin. Ardından, cerrahi alanı alternatif iyonofor ve% 70 etanol turları ile 3 kez dezenfekte edin. Anestezi derinliğini bir ayak parmağı kıstırma ile onaylayın ve hayvanı steril cerrahi örtülerle örtün. Kabaca 1.5 cm uzunluğunda (Şekil 1C-b), abdominal medyanın 1 cm sağında ve ksifoid sürecin 5 mm altında (Şekil 1C-c) bir cilt insizyonu yapın. Ardından, karın duvarında ilk cilt kesisi ile aynı yerde 1,5 cm'lik bir kesi oluşturun.
   NOT: Altta yatan karaciğere zarar vermemek için dikkatli olun.
7. Sol hepatik lobu künt uçlu forseps kullanarak lateral olarak hassas bir şekilde yeniden konumlandırın ve altındaki mideyi ortaya çıkarın.

5. Kateter yerleştirilmesi

1. Mideyi yükseltin ve kesiden dikkatli bir şekilde çıkarın.
   NOT: Başta karaciğer olmak üzere bitişik organların bütünlüğünü korumak için azami özen gösterin ve mideye aşırı kuvvet uygulamaktan kaçının.
2. Pilor antrumunda küçültücü bir perforasyon (yaklaşık 1,5 mm çapında) oluşturmak için makas kullanın.
3. Kateterin ucunu perforasyona sokun ve boncuğun pilorik antrum ile doğrudan temas halinde olduğundan emin olun.
   NOT: Kateter, yerleştirilmeden önce %0,1 ila %0,5 klorheksidin glukonat solüsyonu ile dezenfekte edilir.
4. Tıbbi sınıf siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak kateterin boncuğunu mideye yapıştırın.
   NOT: Midenin çevredeki organlara bağlı olmadığından emin olun.
5. Kateterin mideye sıkıca yapıştığını doğrulayın, ardından mideyi sol hepatik lobun altındaki doğuştan gelen yerine hassas bir şekilde yeniden konumlandırın.
6. Bir polidioksanon (PDS) sütür kullanarak kateterin dışa doğru uzamasına izin verecek şekilde karın duvarını dikin. Bundan sonra, cilt kesisini karın kapanışına benzer bir şekilde kapatın.
7. Fareyi sterilize edilmiş bir kafeste nazikçe yeniden konumlandırın.
   NOT: Ameliyat sonrası fareler tekil olarak barındırılmalıdır. Yara kapanışına topikal olarak lokal bir analjezik uygulayın ve yerel kurumsal kılavuzlarda önerildiği gibi analjezik planlarını izleyin.
8. Standart bir ortamda en az 48 saatlik bir kurtarma süresine izin verin.
   NOT: Farenin midesine yerleştirilen kateterin bir ucu, yabancı maddelerin girişini önlemek ve ısırmayı önlemek için ucu kapalı 23G iğne ile kapatılır. Karından çıkıntı yapan kateter kısa olduğu için farenin onu yataktan sürüklemesini engeller, bu da açılmasına veya dolaşmasına neden olabilir.

6. İn vivo transkraniyal Ca²⁺ görüntüleme için hazırlık

1. İzofluran kullanarak fareye anestezi uygulayın (% 2'de indüksiyon;% 0.8 ile% 1.0 arasında idame).
2. Nabız ve solunumun etkilerini azaltmak için yardımcı kulak çubukları kullanarak fareyi stereotaksik bir platforma sabitleyin. Ardından, fareyi bir floresan stereo mikroskop altına yerleştirin.
3. Bir cıva ışık kaynağı ile birlikte geniş bantlı bir mavi floresan filtre seti (460-490 nm'de uyarma ve 520 nm'de emisyon ile) kullanın.
4. Görüntüleri bir kamera kullanarak yakalayın ve belirlenen görüntüleme yazılımını kullanarak işleyin.
5. Elektrikli tıraş makinesi veya tüy dökücü krem kullanarak saç derisindeki tüyleri dikkatlice çıkarın.
   NOT: Tıraş bıçağı kullanıyorsanız, iyice dezenfekte edildiğinden emin olun ve cildi kesmemeye dikkat edin.
6. Kafa derisinin yüzeyini pamuklu bir bez veya benzeri bir alet kullanarak% 0.1-0.5'e seyreltilmiş bir klorheksidin glukonat çözeltisi ile dezenfekte edin. Ardından, alkolle dezenfekte edin ve bu alternatif turları 3 kez tekrarlayın.
7. Lokal anestezik jel uygulayın ve 5-10 dakika bekleyin.
8. Dental akrilik çimento uygulamaya hazırlanın.
   1. Saç derisini kesmek için steril bir neşter bıçağı kullanın. Ya kafa derisini tamamen çıkarın ya da başın arkasından alnına doğru düz bir kesim yapın.
   2. Fazla deriyi uzatarak kafatasını ortaya çıkarmak için klipsler kullanın.
   3. Periosteumun bağ dokusunu çıkarmak için pamuklu çubuk kullanın.
   4. Periosteumu çıkardıktan hemen sonra akrilik çimentoyu uygulayın. Açıkta kalan kemikten buharlaşma nedeniyle kafatası yüzeyinin opak hale gelmesini önlemek için hızlı hareket edin.
   5. Çimentonun kuruması için yaklaşık 5 dakika bekleyin.

7. İntraduodenal glukoz uygulaması ile transkraniyal Ca²⁺ görüntüleme

1. Hem deneysel çözeltiyi hem de tuzlu suyu ortam sıcaklığına dengeleyin. Fareleri belirli bir süre boyunca (örneğin, 2 saat) bir diyet kısıtlamasına tabi tutun.
2. Enjeksiyonu başlatmadan önce ~ 0.03 mL salin kullanarak fare tarafı kateter içindeki kalıntı içeriği temizleyin.
3. Deneysel çözeltiyi (örneğin, 300 μL su içinde hazırlanan, ilave 300 μL su ile tamamlanan% 10'luk bir glikoz çözeltisi) şırıngaya aspire edin, ardından kateter ile arayüzleyin. Spesifik deneysel hedefe göre uyarlanmış çözeltinin optimal dozajını belirleyin.
   NOT: Bu aşamada, farenin iç anatomisini tehlikeye atabilecek kateter üzerinde aşırı zorlanmayı önlemek için dikkatli olun. Fare tarafındaki boruyu son derece nazik bir şekilde manipüle etmeye çalışın. Ek olarak, sıkışan hava ve kabarcıklar gastrointestinal distansiyona neden olabileceğinden, şırınganın çözelti sonrası hava aspirasyonundan yoksun kaldığından emin olun.
4. Farenin fizyolojik durumunu değerlendirin ve yazılım uygulamasının kayıt işlemi düğmesine tıklayarak görüntüleme yazılımının kayıt işlevini etkinleştirin.
5. 512 x 512 piksel çözünürlükte, 16 bit derinlikte ve 10 Hz kare hızında görüntü yakalayın.
   NOT: Kayıt parametreleri, belirli deneysel gereksinimlerle uyumlu olacak şekilde ayarlanabilir.
6. Spontan veriler elde edin (örneğin, 50 s'yi kapsayan), ardından deney çözeltisinin deneye göre uyarlanmış bir oranda kademeli olarak infüzyonu (burada, 0.035 mL / s).
   NOT: Deneyin sonunda, fareye izofluran anestezisi altında servikal çıkık ile derhal ötenazi uygulanacaktır.

8. Görüntü verilerinin işlenmesi ve analizi

1. Görüntü verilerini 64 x 64 piksel olarak yerleştirin.
2. ImageJ kullanarak elle çizilmiş ilgi alanlarını (ROI'ler) belirleyin. ROI'leri frontal alan (M2), Namlu (Somato), oksipital alan (Görsel) ve retrosplenial bölge (RSC) dahil olmak üzere somatosensoriyel alan olarak belirlemek için fare beyin atlasına bakın.
3. ROI'lere karşılık gelen koordinatları çıkarmak için ReadImageJROI MATLAB işlevini kullanın. Sağlanan bağlantı aracılığıyla MATLAB işlevine erişin: https://jp.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/32479-readimagejroi
4. MATLAB kullanarak ROI içindeki ortalama floresan yoğunluğu değişim oranını hesaplayın.
   1. Floresan yoğunluğu değişim oranını (ΔF/F) denklem (1) ile tanımlayın:
      (1)
      Burada FT, belirli bir zamandaki floresan yoğunluk değerini temsil eder ve kaydın başlangıcından enjeksiyonun 50 saniyesine kadar olan ortalama yoğunluk değeri F₀ olarak gösterilir.
5. Enjeksiyon çözeltisinin organa ulaşmasındaki gecikmeyi hesaba katın. Temel olarak enjeksiyondan sonraki üç saniyeyi kapsayan ortalama yoğunluk değerini kullanın. Enjeksiyondan 3 saniye veya daha sonra meydana gelirlerse analiz için temel yoğunluk değeri + 1 SD'yi aşan hedef dalga formları.

İzofluran anestezi uygulanmış bir G7NG817 faresi ile transkraniyal korteks geniş Ca2+ görüntüleme
Şekil 1'de gösterilen prosedürü takip ederek kateteri oluşturduk. Midenin pozisyonunu dikkatli bir şekilde belirledikten sonra kateteri o lokasyona taktık (Şekil 1). Kateter yerleştirildikten sonra (yaklaşık 48 saat) yeterli iyileşme süresine izin verdikten sonra, sonraki bağırsak stimülasyon gözlemleri için temel floresan yoğunluğu değişikliklerini belirlemek için hafif izofluran anestezisi (% 0.8-1.0) altında spontan nöral aktiviteyi ölçtük. Sonuç olarak, tüm korteksi kapsayan rastgele Ca2+ salınım modellerini doğruladık (Şekil 2A). Şekil 2, kateterlerin önceden yerleştirildiği spontan beyin aktivitesinin temsili örneklerini sunmaktadır. Enjeksiyonu takiben M2 bölgesinde ilk gözlenebilir Ca2+ geçici pik zamanını 0.0 s olarak tanımladık. Sahte renk temsili, bu Ca2+ geçici durumunun zirvesini maksimum değer olarak, ortalama değer artı minimum değer olarak bir standart sapma (1 SD) ile gösterdi. Sol ve sağ hemisferlerin tüm bölgelerde senkronize aktivite gösterdiği açıktı.

Daha sonra, her bir işlevsel alandaki dalgaları karakterize etmek için yatırım getirileri oluşturduk. Şekil 2B'de gösterildiği gibi, her bir ROI için floresan yoğunluk oranındaki zamansal değişiklikleri sunduk (Şekil 2B). Gözlemlenen bu yüzey Ca2 + salınımları, düşük aktivite dönemleri ve yüksek genlikli floresan değişiklikleri arasında değişen bir patlama bastırma modelini takip etti. Bu aktivite modeli, kortikal yüzey EEG'sini ve Ca2+ dinamiğini26 aynı anda ölçen önceki bulgularla uyumludur.

Baskılanma ve patlama durumları arasındaki küresel veya bölgesel yüzey Ca2+ dalgalanmalarına rağmen, kalsiyum dalgalanmasını başlatan spesifik kortikal bölge farklı olabilir. Daha önce bildirildiği gibi, bir sinyal yerel bir kortikal bölgeyi uyardığında, alanın aktive olması ve ardından kortikal durumda küresel bir kaymaya neden olması beklenir27,28.

İntragastrik glukoz enjeksiyonu sonrası korteks Ca2+ dinamiğindeki değişiklikler
Daha sonra, glikoz veya su uygulamasının kortikal aktiviteyi nasıl etkilediğini açıklamak için, enjeksiyon sırasında ve sonrasında korteks çapında Ca2 + dinamiklerini izledik. Sonuç olarak, intragastrik glukoz enjeksiyonunu takiben kortikal Ca2+ dinamiklerinde değişiklikler bulduk. Kortikal aktivasyonun çeşitli bölgelerinde gösterilen spontan aktivitenin aksine, kateter yoluyla doğrudan bağırsak glikoz enjeksiyonu üzerine prefrontal alanda veya ikincil motor kortekste (M2) ani aktivasyon gözlemledik, bu intragastrik su enjeksiyonu ile indüklenmeyen bir etki (Şekil 3A-C). Ayrıca, bu geçici, belirgin Ca2+ olaylarının intragastrik glukoz enjeksiyonunu takiben yaklaşık 10 saniye boyunca sürekli olarak meydana gelme eğiliminde olduğunu gözlemledik. Bu tür kalıcı fenomenler, su uygulandığında belirgin değildi (Şekil 3D-F).

Her bir ROI'deki Ca2+ olayları, glikoz uygulamasının tamamlanmasından sonra 4-8 s içinde meydana gelen ilk zirvede, işitsel korteks (Referans) referans olarak kullanılarak floresan yoğunluk değişim oranının oranının hesaplanmasıyla karakterize edildi. Sonuç olarak, enjeksiyon öncesi ve sonrası işitsel korteks referans olarak kullanılarak M2 bölgesindeki yanıt karşılaştırıldıktan sonra glikoz enjekte edildiğinde önemli bir değişiklik gözlendi.

Buna karşılık, su enjekte edildiğinde böyle bir değişiklik gözlenmedi (Şekil 3G, su N = 7: enjeksiyondan önce, 2.38 ± 2.53'e karşı 2.05 ± 1.84, p > 0.05; glukoz N = 7: enjeksiyondan önce 2.48 ± 0.97'ye karşı 3.76 ± 2.76, p < 0.01, Wilcoxon işaretli sıra testi). Daha sonra, her bir kortikal bölgedeki aktivasyon seviyelerini, enjeksiyondan sonra ve enjeksiyon öncesi değerin oranıyla tanımlayarak, sadece M2 bölgesinde anlamlı bir fark gözlendi (Şekil 3H, M2: 0.92 ± 0.89'a karşı 1.30 ± 0.32, p = 0.006; Somato: 0.95 ± 0.076'ya karşı 1.04 ± 0.13, p = 0.27; Görsel: 0.92 ± 0.3 vs. 1.00 ± 0.06, p = 0.89; RSC: 0.97 ± 0.27'ye karşı 1.10 ± 0.27, p = 0.60, t-testi).

Şekil 1: Yönteme genel bakış. (A) Kateter oluşturma: (a) Silikon tüpü kesin. (b) Tıbbi siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak silikon tüpe plastik bir boncuk yapıştırın. (c) 23 G iğneyi uçtan 1,5 cm kesin. (d) İğnenin kesik ucunu silikon tüpe takın. (B) Enjektör tertibatı: (a) 23 G'lik bir enjeksiyon iğnesini 1 cm kesin. (b) Kesilmiş enjeksiyon iğnesini 2,5 mL'lik bir şırıngaya bağlayın. (c) Enjeksiyon iğnesinin kesilen kısmını bir silikon tüp ile kılıflayın. (d) 23 G iğneyi uçtan 1,5 cm kesin. (e) İğnenin kesik ucunu silikon tüpe takın. (C) Cerrahi prosedür: (a) Cerrahi bölgeyi epilasyon yapın. (b) Cildi ve karın duvarını yaklaşık 1,5 cm uzunluğunda kesin. (c) Makas kullanarak pilor antrumunda küçük bir delik (yaklaşık 1,5 mm çapında) oluşturun ve kateteri (silikon tüp) yerleştirin. Tıbbi siyanoakrilat yapıştırıcı kullanarak kateteri pilor antrumuna sabitleyin. (d) 5/0 ipek dikiş materyali ve iğne kullanarak karın duvarını ve cildini dikin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Kateter takılı G7NG817 farelerde spontan korteks geniş Ca2+ salınımları. (A) 0,2 s aralıklarla görüntülenen korteks genişliğinde Ca2+ salınımlarının temsili bir örneği. Floresan yoğunluğundaki değişiklikler, sahte bir renk kaplaması ile temsil edilir. B'deki kesikli çizgiyle çevrelenen zaman penceresi, tepe noktası 0 olarak ayarlanmış ilk görünen Ca2+ geçici durumunu gösterir. Sahte renk gösterimi, maksimum değer olarak bu Ca2+ geçici noktasının tepe noktasını ve minimum değer olarak ortalama +1 SD'yi kullanır. (B) Örnekteki her bir ROI için floresan yoğunluğundaki zaman serisi değişiklikleri. Çizgi renkleri farklı kortikal alanlara karşılık gelir: kırmızı, M2'yi temsil eder; macenta, somatosensoriyel alanı (Somato) temsil eder; mavi görsel alanı temsil eder (Görsel); yeşil ise retro splenial bölgesini temsil eder. Somon renkli şerit enjeksiyon süresini gösterir. (C) Kesikli anahat içindeki tek bir tepe izole edilir ve büyütülmüş bir görünümde görüntülenir. Kısaltmalar: SD = standart sapma; ROI = ilgi alanı; RSC = retro splenial bölge. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Glikoz veya su enjeksiyonu sırasında/sonrasında korteks geniş Ca2+ yanıtı. (A) 0.2 s aralıklarla görüntülenen temsili bir glikoz uygulaması örneği. Floresan yoğunluğundaki değişiklikler, sahte bir renk kaplaması ile temsil edilir. B'deki kesikli çizgiyle çevrelenen zaman penceresi, enjeksiyondan sonra ilk ortaya çıkan Ca2+ geçici durumunu gösterir ve tepe noktası 0 olarak ayarlanır. Sahte renk temsili, maksimum değer olarak enjeksiyondan sonraki ilk Ca2+ geçici noktasının zirvesine ve minimum değer olarak ortalama +1 SD'ye dayanmaktadır. (B) Örnekteki her bir ROI için floresan yoğunluğunun zaman serisi değişiklikleri. Çizgi renkleri farklı kortikal alanlara karşılık gelir: kırmızı M2'yi, macenta somatosensoriyel alanı (Somato), mavi görsel alanı (Görsel) ve yeşil retro splenial bölgeyi temsil eder. (C) Kesikli anahat içindeki tek bir tepe izole edilir ve büyütülmüş bir görünümde görüntülenir. Analiz hedef kalsiyum dalgası, enjeksiyondan 4-8 saniye sonra ortaya çıkan en erken dalgadır. (D) Glikoz kontrol verileri olarak su enjeksiyonunun temsili bir örneği. (E) Örnekteki her bir ROI için floresan yoğunluğundaki zaman serisi değişiklikleri. Çizgi renkleri B'deki gibidir. (F) Kesikli anahat içindeki tek bir tepe izole edilir ve büyütülmüş bir görünümde görüntülenir. Analiz hedef kalsiyum dalgası, enjeksiyondan 4-8 saniye sonra ortaya çıkan en erken dalgadır. (G) M2 spontan aktivitesinin (enjeksiyondan önce) ve enjeksiyondan sonra (enjekte edilen) yanıtın karşılaştırılması. Ortalama floresan yoğunluğu enjeksiyondan önce 50 saniyenin üzerinde değişir ve işitsel korteks referans olarak kullanılarak enjeksiyondan 4 saniye ile 8 saniye arasındaki M2 bölgesindeki tepe yanıtı hesaplanmıştır. (H) Su veya glikoz uygulandığında her kortikal bölgedeki aktivasyon seviyelerinin karşılaştırılması. Her bölge için G cinsinden belirlenen enjeksiyon sonrası değerin enjeksiyon öncesine oranı hesaplandı. N.S. anlamlı olmayanı temsil eder (p > 0.05). ** <0.01. Hata çubukları, ortalamanın standart hatası olarak tanımlanır. Kısaltmalar: SD = standart sapma; ROI = ilgi alanı; RSC = retro splenial bölge. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.