Oral Kandidiyazisin Murin Modelinde Kurkuminoid Aracılı Antimikrobiyal Fotodinamik Tedavi

Oral kandidiyazis (OC), ağız boşluğunun ana mantar enfeksiyonudur; Candida spp.'nin aşırı büyümesinden kaynaklanır. OK için predispozan faktörler arasında endokrin disfonksiyon, geniş spektrumlu antibiyotik kullanımı, radyoterapi ve kemoterapi, beslenme yetersizlikleri, kserostomi (düşük tükürük akımı), protez kullanımı, kötü hijyen ve özellikle immünosupresyon^{yer alır 1}. Candida türleri arasında Candida albicans en yaygın ve öldürücü olanıdır; İnsan vücudunda ortak bir tür ve fırsatçı bir patojen olarak bulunur. C. albicans , morfolojisini kommensal mayalardan (blastopores) patojenik filamentlere (hif ve psödohif) değiştirme yeteneğine ^sahiptir2. Filamentli formlar, özellikle hifler, endositoz veya aktif penetrasyon yoluyla konakçı epitelini istila ederek enfeksiyona neden olabilir³. C. albicans'ın diğer virülans faktörleri arasında yapışma, biyofilm oluşumu ve lipazlar, fosfolipazlar, proteinazlar ve kandidalizin⁴ gibi lipolitik ve hidrolitik enzimlerin ve toksinlerin salgılanması yer alır.

OC tedavileri, antifungal ajanların, özellikle topikal polienlerin ve azollerin (nistatin ve mikonazol) kullanımını ^içerir5. Bununla birlikte, sadece kısa süreli etkinlik gösterirler ve nüks sıktır. Ek olarak, antifungallerin aşırı kullanımı, antifungal direnç gelişimi ve yayılması sorununa yol açmıştır⁶. Bu nedenle, oksijen varlığında bir ışığa duyarlılaştırıcı (PS) ve ışığı uygun bir dalga boyunda (PS absorpsiyonununkiyle aynı) birleştiren antimikrobiyal Fotodinamik Terapi (aPDT) gibi alternatif tedavilere ihtiyaç vardır. PS'ler hücrelere bağlanır veya hücreler tarafından alınır ve ışıkla aktive edildiğinde, duyarlı hücreler için toksik olan reaktif oksijen türleri (ROS) üretir⁷.

aPDT'de kullanılan ışığa duyarlılaştırıcılardan (PS'ler) biri, zerdeçal bitkisinin (Curcuma longa L.) rizomlarından ekstrakte edilen doğal olarak oluşan bir bileşik olan kurkumindir (CUR). Kurkumin, anti-inflamatuar, antioksidan, antikanser ve antimikrobiyal yetenekler dahil olmak üzere çok sayıda terapötik özelliğe sahiptir ^8,9. Daha önce yapılan bir araştırma, CUR kullanan aPDT'nin, konakçının dokularına herhangi bir zarar vermeden bir murin oral kandidiyazis modelinde C. albicans'ı etkili bir şekilde azalttığını buldu¹⁰. CUR, zerdeçaldan ekstrakte edilen ana kurkuminoiddir, ancak bu bitkide demetoksikurkumin ve bis-demetoksikurkumin gibi diğer polifenoller de bulunur. Kurkuminoid aracılı aPDT, kateterlerde büyütülen Staphylococcus aureus biyofilmlerine karşı antibakteriyel aktivite gösterdi¹¹. Bununla birlikte, bildiğimiz kadarıyla, C. albicans'a karşı antifungal aktivitesi belirsizliğini korumaktadır. Bu nedenle, bu çalışmada, bir murin OK modelinde C. albicans'a karşı bir kurkuminoid tuzun aracılık ettiği aPDT'yi değerlendirdik.

Farelerin kullanımına ilişkin araştırma protokolü, UNESP, Araraquara Diş Hekimliği Fakültesi'ndeki Hayvan Kullanımı Etik Kurulu (vaka numaraları 05/2008 ve 09/2020) tarafından onaylanmıştır. Referans suş olarak C. albicans (ATCC 90028) kullanıldı. Bu çalışma için vücut kütlesi 20-30 g olan altı haftalık dişi İsviçre fareleri (n = 45) kullanıldı. Hayvanlar São Paulo Eyalet Üniversitesi, UNESP, Botucatu tarafından sağlandı.

1. PS'nin hazırlanması ve aPDT için ışık kaynağının seçimi

1. PS'yi test edilecek maddenin özelliklerine göre hazırlayın.
   NOT: Bu çalışmada, PS olarak suda çözünür bir kurkuminoid karışımı (CUR bazlı suda çözünür tuz karışımı¹²) kullanılmıştır (bkz. Malzeme Tablosu ve Şekil 1). 20 μM, 40 μM ve 80 μM'de (sırasıyla 15.6, 29.2 ve 58.4 mg/L) seyreltmeler, kullanımdan hemen önce ultra saf suda hazırlandı ve 5 °C'de tutuldu.
2. Dokuyu ısıtmadan ışığa duyarlı hedefin tamamını eşit ve aynı anda aydınlatabilen uygun bir dalga boyuna (PS absorpsiyonununkiyle aynı) sahip bir ışık ekipmanı seçin.
   NOT: Bu çalışmada, Instituto de Física de São Carlos'ta (São Paulo Üniversitesi, São Carlos, SP, Brezilya) tasarlanan ışık yayan diyot (LED, bkz. Malzeme Tablosu) içeren bir el aleti kullanılmıştır. Işığın sağladığı çıkış gücü, yaklaşık 455 nm'lik mavi dalga boyunda 89,2 mW/^cm2 idi.

2. C. albicans inoculum'un hazırlanması

1. Referans suşu C. albicans (ATCC 90028) kullanana kadar -80 °C'de %50 gliserol ile maya-pepton-glikoz (YEPD, Malzeme Tablosuna bakınız) içinde saklayın.
2. Donmuş suşu oda sıcaklığında çözdürün, kloramfenikol içeren Sabouraud dekstroz agar (SDA) içeren bir Petri kabına 100 μL'lik bir alikot yayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 37 ° C'de 48 saat inkübe edin.
3. Beş koloniyi %2 glikoz (YNBg) ortamı ile 10 mL maya nitrojen suyuna aktarın ve 16 saat boyunca 37 ° C'de aerobik olarak büyütün.
4. Maya kültürünü taze YNBg (1:10) içinde seyreltin ve optik yoğunluk büyümenin orta log fazına ulaşana kadar aerobik olarak 37 °C'de inkübe edin.
   NOT: Daha önce her laboratuvar için mikrobiyal büyüme eğrisini standartlaştırın. Mevcut araştırmada, kültürlerin, 540 nm'de (OD₅₄₀) optik yoğunluk ile gösterildiği gibi, ortalama değeri 0.536 ± 0.062 rastgele birim (ortalama ± standart sapma [SD]) ile gösterildiği gibi büyümenin orta log fazına ulaşana kadar yaklaşık 8 saat inkübe etmelerine izin verildi.
5. Kültürü oda sıcaklığında 5.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı atın ve peleti aynı hacimde steril fosfat tamponlu salin (PBS; 0.136 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM KH₂PO₄, 10 mM Na₂HPO₄, pH 7.4) ile iki kez yıkayın.
6. PBS'de dört seri 10 kat seyreltme gerçekleştirmek için 100 μL alikot kullanın, seyreltmeleri SDA plakalarına yayın ve koloni sayımı için 37 ° C'de 48 saat inkübe edin. Standart olarak, mantar süspansiyonları mililitre başına yaklaşık 4.5 × 10⁷ koloni oluşturan birim (CFU/mL)] konsantrasyonlarda kullanılır.

3. Farelerde OC indüksiyonu

NOT: Aşağıdaki metodoloji daha önce Takakura ve ^ark.13 tarafından tanımlanmış ve grubumuz^10,14 tarafından bazı değişikliklerle yeniden üretilmiştir.

1. Fareleri, aynı sayıda tedaviye karşılık gelen dokuz gruba (n = 5) rastgele dağıtın (Ek Dosya 1).
   NOT: Farelerin ağız boşluğu Candida büyümesi için negatif olmalıdır. Bunun, ağız boşluğunu sürünerek ve numuneyi SDA üzerine kaplayarak kontrol edilmesi gerekir.
2. Hayvanları, zemin kaplaması için odun talaşı ile^{birlikte propilen kutularda 10} (kutu başına en fazla 5 fare), 23 ± 2 ° C'de 12/12 saat aydınlık/karanlık döngüsü altında sıcaklık kontrollü bir vivaryumda tutun. Belirli bir zenginleştirmenin sağlanmasına gerek yoktur.
3. Fareleri ekstrüde fare diyeti ve filtrelenmiş su ad libitum üzerinde tutun.
4. İmmünsüpresif ilaç olan prednizolonu (100 mg/kg vücut ağırlığı, bkz . Malzeme Tablosu), ilk gün ilk kez C + L + 20, C + L + 40, C + L + 80, C + L - 20 μM, C + L- 40, C + L- 80, C-L + ve C-L- gruplarının tüm üyelerine deri altına enjekte edin (Ek Dosya 1).
   NOT: Aynı gruptaki fareleri aynı kutuda tutun ve herhangi bir stres ve kilo kaybı belirtisi için günlük olarak izleyin. Stres veya kilo kaybı not edilirse analjezik veya değiştirilmiş yiyecek / su için veteriner tavsiyesi alın.
5. Birinci günden başlayarak ve deneyin sonuna kadar, içme suyunda 0.83 mg / mL'de tetrasiklin hidroklorür sağlayın¹³.
6. C + L + 20, C + L + 40, C + L + 80, C + L- 20, C + L- 40, C + L- 80, C-L + ve C-L- (Ek Dosya 1) grupları dahil olmak üzere fare dillerini ikinci günde C. albicans inoculum ile aşılayın. Bu fareleri negatif kontrol grubundan (NCtrl) aşılamayın.
   1. Aşılamadan önce her uyluk kasına 10 mg / kg klorpromazin klorür (bkz . Malzeme Tablosu) intramüsküler enjeksiyonu ile hayvanları sakinleştirin.
   2. Steril bir swabı (hayvan başına bir tane) taze hazırlanmış (yani aşılamadan hemen önce hazırlanmış) standartlaştırılmış bir C. albicans süspansiyonuna batırarak farelerin ağız içi aşılamasını gerçekleştirin.
   3. Sakinleştirilmiş fareleri sırtüstü pozisyona getirin. Steril bir forseps kullanarak dillerini nazikçe ağızlarından çekin. Her farenin dilini ıslatılmış bir bezle 30 saniye ovalayın. Sedasyondan kurtulana kadar fareleri izleyin.
7. Beşinci günde, immünosupresyonunu sürdürmek için tamamlayıcı bir deri altı prednizolon (100 mg / kg vücut ağırlığı) enjeksiyonu uygulayın.
   NOT: Bu protokol, ağız içi aşılamadan sonra enfeksiyonu 7 gün boyunca tutmak için yeterlidir. Protokol zaman çizelgesi Şekil 2'de gösterilmektedir.

4. Antimikrobiyal Fotodinamik Tedavi ve C. albicans'ın oral lezyonlardan kurtarılması

1. Yedinci günde, tedaviden önce, ksilazin (10 mg / kg vücut ağırlığı) ile birlikte intraperitoneal ketamin hidroklorür (100 mg / kg vücut ağırlığı) enjeksiyonu kullanarak hayvanları uyuşturun (bkz.
2. Her hayvanı, ağzı açık tutmak için kesici dişlerin etrafına sarılabilen paslanmaz çelik tellerle donatılmış bir ped cihazı^14,15 üzerine sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
   NOT: Fareleri sakinleştirilirken ısıtmak, oda sıcaklığında hipotermiyi önlemek ve anesteziye bağlı ölümleri önlemek için izotermal pedler önerilir¹⁵. Anestezi uygulanan her hayvan, anestezi derinliğini doğrulamak için ayak parmakları sıkıştığında geri çekilme refleksinin olmaması ile izlenmelidir. Gerekirse orijinal dozun 1/3'ünde (ksilazin olmadan) bir idame dozu ketamin uygulanabilir.
3. Mandibula ve yanaklar geri çekildiğinde, dili nazikçe ağzın dışına yerleştirin.
4. C+L+ gruplarından fareler için, dilin sırtına 70 μL PS pipetleyin (test edilen konsantrasyonlardan birinde). Fareleri ışınlama öncesi süre olarak 20 dakika boyunca karanlık bir ortamda tutun. Bu süre zarfında, ışığa duyarlılaştırıcının (PS) yutulmasını önlemek için her hayvanın dilinin ağız boşluğunun içinde kaldığından emin olun.
5. Işığa duyarlılık döneminden sonra, aydınlatma için dili ağızdan dışarı çekin. LED cihazını dilin sırtına yerleştirin ve 37.5 J/^cm2'de (mevcut cihazla 7 dakika) aydınlatın (Şekil 3).
6. C+L- gruplarından hayvanlar için, dilin sırtında test edilen konsantrasyonlardan birinde 70 μL PS pipetleyin ve bu fareleri 27 dakika karanlıkta tutun.
7. C-L+ grubundaki hayvanlar için (önceden herhangi bir ışığa duyarlılık olmadan ışıkla tedavi edilir), dilin sırtına 70 μL steril salin solüsyonu pipetleyin. Fareleri 20 dakika karanlıkta tutun ve ardından dillerini 37,5 J/^cm2'de (mevcut cihazla 7 dakika) aydınlatın.
8. C-L grubundan fareler için (ne PS ne de ışıkla muamele edilmemiş), dilin sırtına 70 μL steril salin solüsyonu pipetleyin ve 27 dakika karanlıkta tutun.
9. Tedaviden hemen sonra C. albicans'ı tüm farelerin dillerinden kurtarın. Dilin sırtını steril bir pamuklu çubukla 1 dakika boyunca temizleyin.
10. Her numune swabını 1 mL steril salin içeren bir tüpe yerleştirin ve mikrobiyal hücreleri yeniden süspanse etmek için 1 dakika boyunca girdap yapın.
11. Hemen PBS'de 10 kat seri seyreltme gerçekleştirin ve SDA plakaları üzerinde 25 μL'lik alikotları çoğaltın. Plakaları aerobik olarak 37 °C'de 48 saat inkübe edin.
12. 48 saat sonra, maya koloni sayımlarını belirlemek için dijital bir koloni sayacı ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanın. Her hayvan için C. albicans yükünü (CFU/mL) hesaplayın.
13. CFU/mL değerlerini log_10'a dönüştürün ve deneyin tasarımına ve veri varsayımlarına göre uygun şekilde analiz edin.
    NOT: Bu çalışmada Welch'in tek yönlü ANOVA ve Games-Howell post-hoc testi (α = 0.05)¹⁶ kullanılmıştır.

5. Histopatolojik analizler

1. Sekizinci günde, fareleri intraperitonial enjeksiyon yoluyla 10 mg / kg'da ksilazin ile birlikte 100 mg / kg'da ketamin ile uyuşturun ve aşırı dozda ketamin (intraperiotoniyal yoluyla uygulanan 200 mg / kg) ile ötenazi yapın. Solunum hareketinin (apne) ve kalp atışının (asistol) yokluğunu kontrol ederek ölümü onaylayın.
2. Dili dikkatlice sıkıştırın ve hayvanın ağzından dışarı çekin. Manuel bir neşter kullanarak, ön ve orta bölgelerde herhangi bir yaralanmaya neden olmadan tüm dili cerrahi olarak çıkarmak için sirkumvalat papilladan önce bir kesi yapın.
3. Dili 24 saat boyunca% 10 tamponlu formalin (pH 7.2-7.4) içinde sabitleyin ve 2 saat boyunca akan suda yıkayın.
4. Parafin işlemine dahil edilmeye devam edin: dehidrasyon, berraklaştırma ve emprenye^10,14.
5. Bir mikrotom kullanarak seri bölümleri (5 μm kalınlığında) kesin, ardından bölümleri cam slaytlara yapıştırın. Histopatolojik inceleme ve ışık mikroskobu altında gözlem yoluyla mantarları tanımlamak için periyodik asit-Schiff ve hematoksilen (PAS-H) kullanarak bu bölümleri boyamaya devam edin.
6. C. albicans enfeksiyonuna bağlı doku reaksiyonunu incelemek için tercihen çalışılan gruplara kör olan bir patoloğa danışın.
7. Dokunun histolojik özelliklerini (epitel ve bağ dokusu), özellikle değişen yoğunluklarda lokal inflamatuar yanıtları tanımlayın.

OC'nin murin modeli, tüm enfekte farelerin dilinde tipik beyaz lekeler ve psödomembranlar gösterdi (Şekil 4A). C-L-hayvanlarından elde edilen C. albicans , bu mikroorganizma tarafından doku kolonizasyonunu doğruladı (değerler 1.62 x 104 ila 4.80 x 105 CFU/mL arasında değişiyordu). Beklendiği gibi, NCtr grubundaki hayvanlar, örneklemeden sonra herhangi bir doku değişikliği veya koloni büyümesi göstermedi (Şekil 4B).

aPDT, ışığa duyarlılık için 80 μM'de kurkuminoidler kullanıldığında C. albicans'ın canlılığını azaltmıştır (Şekil 5). 80 μM PS aracılı aPDT ile elde edilen ortalama log10 azalma, C-L- grubundakine kıyasla 2.47 idi (p = 0.008).

Fare dillerinden elde edilen C. albicans kolonilerinin sayısı, aydınlatmasız kurkuminoidlerle tedavi edilen fareler (C + L- grupları), ışıkla tedavi edilen ancak daha önce ışığa duyarlı hale getirilmemiş fareler (C-L + grupları) ve tedavi edilmemiş fareler (C-L- grubu) arasında önemli ölçüde farklı değildi (p ≥ 0.210).

Enfekte olmamış hayvanların dillerinin histolojik özellikleri (NCtr), sağlam lamina propria, bazal membran ve filiform papilla dahil olmak üzere normal/sağlıklı dokular gösterdi (Şekil 6A). Buna karşılık, C-L- grubundan farelerin dillerinin histopatolojik görüntüleri incelendiğinde, mantar infiltrasyonu olmamasına rağmen, epitelin keratinize tabakasında maya ve filamentlerin mevcut olduğu açıktı. Altta yatan bağ dokusunda, esas olarak mononükleer hücrelerin aracılık ettiği hafif bir inflamatuar yanıt gözlendi ve filiform papillalar özellikle yoktu (Şekil 6B). Hem C+L- hem de C-L+ gruplarındaki farelerin dillerinin histolojik analizi benzer özellikler gösterdi. Buna karşılık, 80 μM kurkuminoid aracılı aPDT ile tedavi edilen farelerin dil bölümleri, esas olarak epitelin keratinize tabakası ile sınırlı olan azaltılmış sayıda mantar hücresi ortaya çıkardı (Şekil 6C).

Şekil 1: Işığa duyarlılaştırıcının kimyasal yapısı. Işığa duyarlılaştırıcı olarak kullanılan suda çözünür tuz karışımının kimyasal yapısı, S.4 doğal kurkumin ve F.6 diğer kurkuminoidlerden (demetoksikurkumin ve bis-demetoksikurkumin) oluşur. Nihai ortalama moleküler ağırlık 730.32 g/mol'dür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Oral kandidiyazis ve aPDT'nin murin modeli için protokol zaman çizelgesi. Oral kandidiyazis ve antimikrobiyal fotodinamik tedavinin (aPDT) murin modeli için protokolü özetleyen bir zaman çizelgesi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Işığa duyarlılıktan sonra fare dillerinin aydınlatılması. Işığa duyarlılıktan sonra (enfekte dokunun ışığa duyarlılaştırıcı ile inkübasyonu), diller mavi (~455 nm) bir LED ışık kullanılarak 37.5 J /cm2'de aydınlatıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Murin oral kandidiyazis modelinde beyaz lezyonlar. (A) Oral kandidiyazisin murin modelinde gözlenen beyaz lezyonları gösteren temsili görüntüler. (B) Negatif (enfekte olmayan) kontrol. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Candida albicans farelerin dillerinden elde edildi. Veriler, tedavi gruplarından log10'un (CFU / mL) standart sapması ± ortalama değerleri temsil eder. Welch'in tek yönlü varyans analizi, tedavilerin etkilerinin gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılık gösterdiğini gösterdi (p < 0.001). Ortalamaların yanındaki farklı küçük harfler (a, b, c) Games-Howell testine göre istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar göstermektedir (p≤ 0.030). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Fare dillerinin histolojik bölümlerinin temsili görüntüleri. Fare dillerinin histolojik kesitleri PAS-H ile boyandı ve görüntüler 200x'te yakalandı. (A) İndüklenmiş oral kandidiyazis, ışığa duyarlılık ve aydınlatma olmayan negatif kontrol fareleri (NCtr grubu). (B) İndüklenmiş oral kandidiyazisli fareler, ne ışığa duyarlı ne de LED aydınlatmaya maruz kalır (CL grubu). (C) 80 μM kurkuminoidlere ve 37.5 J /cm2 LED aydınlatmaya maruz kalmış indüklenmiş oral kandidiyazisli hayvanlar (C + L + 80 grubu). Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Deney grupları. Bu çalışmada kullanılan deney gruplarının bir listesi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

C. albicans has been associated with oral and esophageal infections in individuals with an immunocompromised state, diabetes mellitus, prolonged use of antibiotics, and poor oral hygiene^1,3. The study of human infectious diseases requires both in vitro and in vivo investigations before clinical trials can be safely and accurately designed. The present study describes a method for establishing a murine model of OC, which can be used to evaluate the pathogenesis of oral infections by C. albicans and the efficacy of antifungal approaches^{15,16,17,18,19}.

The murine model of OC employed here was successfully established, as evidenced by the substantial fungal load recovery from lesions as well as by the characteristic infection features observed in the macroscopic and histopathological analyses of the tongues of infected mice. Many studies have used similar murine models of OC. In such models, female mice are immunosuppressed and inoculated with C. albicans, resulting in lesions on the tongue^{10,13,14,15,20,21}. Immunosuppression with prednisolone, a glucocorticoid, inhibits the activity of neutrophils against C. albicans²². In this study, female mice were immunosuppressed with two subcutaneous injections of prednisolone, one day prior to and three days after infection with C. albicans¹³. In addition, the administration of tetracycline in drinking water during the course of the experiment caused oral dysbiosis by disturbing oral bacteria and helping C. albicans to thrive^23,24. Furthermore, the sedation caused by the intramuscular injection of chlorpromazine chloride prevented the animals from drinking water and eating immediately after inoculation. Thus, fungal cells stayed in contact with the dorsum of the tongue for a longer time, enabling the development of germ tubes and the transition from yeasts to filaments (hyphae and pseudohyphae), which are the pathogenic morphologies of C. albicans that can invade the human epithelium. Teichert et al.²⁵ used an immunodeficiency protocol to induce OC in mice and recovered only 2 x 10² CFU/mL of C. albicans.

While Totti et al.²⁶ utilized sialoadenectomized mice and conducted four separate inoculations with a C. albicans suspension, it's noteworthy that, in their case, the infection was not sustained in most animals over the course of the experiment. In contrast, in the present study, the inoculation with fungal cells was carried out only once, and it resulted in the recovery of 10⁴ CFU/mL of C. albicans from the oral cavity. This study employed the murine model of candidiasis described by Takakura et al.¹³, who performed oral inoculation with a clinical strain isolated from a patient with cutaneous candidiasis (10⁶ CFU/mL). Three to seven days post-inoculation, 10⁵-10⁶ CFU/mL of C. albicans were recovered from the oral cavity of mice¹³. The differences between the method of Takakura et al.¹³ and this study include the use of different fungal concentrations in the inoculum (this study used 10⁷ CFU/mL of C. albicans) and different C. albicans strains for oral inoculation (the reference strain ATCC 90028 was used here). Carmello et al.²⁰ employed a similar protocol, which involved using immunosuppressed animals. However, they administered two additional subcutaneous injections of prednisolone to the animals on days 1, 5, 9, and 13 of the experiment. Their study revealed a positive correlation between the scores assigned to the oral lesions of the infected animals and the number of CFU/mL over a period ranging from 5 to 16 days post-infection. It has been well-established in previous research that it is crucial to closely monitor animals under anesthesia to prevent hypothermia. Additional maintenance doses of ketamine should be administered with discretion, only when necessary²⁷.

Regarding the efficacy of aPDT application, the results showed that the irradiation of tongues previously treated with an 80 µM curcuminoid salt mixture caused a significant reduction (2.47 log₁₀) in the viability of C. albicans. Histological analyses revealed that sections from tongues treated with 80 µM curcuminoid-mediated aPDT showed a reduced number of fungal cells, which were limited to the keratinized layer, and a low inflammatory response. It is worth emphasizing that an inflammatory response was detected in all mice that were infected with C. albicans. This observation implies that the inflammation observed in all the aPDT groups might be linked to Candida infection rather than being attributed to aPDT, a consistent finding in line with our prior investigations^10,13,14,15.

Previous investigations used CUR, methylene blue, and photodithazine (PDZ) as PSs and obtained promising results^{10,20,24,25,27}. In a similar study¹⁰, a combined exposure to CUR and LED light caused a significant reduction in the viability of C. albicans; however, the use of 80 µM CUR and light reduced fungal viability by 4.0 log₁₀. Dovigo et al.¹⁰ used only CUR as PS, whereas we used a salt containing the three main curcuminoids from C. longa. When CUR (260 µM) and LED light were used for five consecutive days in the treatment of oral candidiasis in mice, the authors observed a reduction of 1.11 log₁₀ in fungal viability²¹. When methylene blue was used as PS at 450 µg/mL and 500 µg/mL, aPDT totally eradicated C. albicans from the oral cavity of mice²⁵. Moreover, when aPDT was mediated by PDZ (100 mg/L), a 3.0 log₁₀ reduction and complete remission of oral lesions were observed²⁰. In addition, aPDT increased TNF-α expression in comparison with that in the untreated group²⁰. In a study where a fluconazole-resistant strain was used, aPDT mediated by PDZ (200 mg/L) promoted a reduction equivalent to 1.3 log₁₀²⁷. Moreover, the combination of aPDT with nystatin resulted in a substantial reduction in fungal viability, amounting to a decrease of 2.6 log₁₀, along with notable improvements in oral lesions and a reduction in the inflammatory response²⁷. Collectively, these studies provide compelling evidence for the effectiveness of aPDT in reducing fungal burden within the murine model of oral candidiasis, underscoring its potential as a clinical treatment option due to its antimicrobial efficacy without causing harm to host tissues.

In conclusion, the murine model of OC used in this study is appropriate for mimicking infection and evaluating aPDT efficacy. As a limitation, the OC model used here employed only one reference strain of C. albicans (other strains, clinical isolates, and non-albicans Candida species were not evaluated). In addition, the corticosteroid-induced immunosuppression used in mice to develop oral infection may not mimic other immunodeficiency states, such as that due to HIV infection. There may also be differences in the host conditions for developing OC, such as the oral microbiota of mice and humans. This protocol should be expanded further to evaluate mixed biofilms formed by more than one species or by different strains from the same species. Furthermore, keeping mice adequately sedated and preventing hypothermia while avoiding anesthesia-related mortality are the most difficult steps of the protocol.