Yöntem makalesi

Ligatur Kaynaklı Periodontitis Fare Modelinin Preklinik Araştırmalar İçin Optimizasyonu

DOI:

10.3791/65908

⸱

30 Nisan 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Comprehensive Care, Department of Periodontology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Division of Pediatric and Public Health, Adams School of Dentistry, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Epidemiology, Gillings School of Global Public Health, University of North Carolina at Chapel Hill, 4Department of Applied Physical Sciences, University of North Carolina at Chapel Hill, 5Department of Biostatistics and Health Data Science, School of Medicine, Indiana University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ligatur kaynaklı periodontitis fare modeli, periodontal hastalığı incelemek için etkili ve giderek daha popüler bir araçtır. Laboratuvar çalışması tasarımı, 3D baskılı alveolar alet üretimi ve μCT analiziyle kemik nicelendirmesi dahil olmak üzere, interproksimal alveolar kemik imha odaklı basitleştirilmiş bir modelin uygulanması için ayrıntılı rehberler sunulmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Farelerde ligatürle indüklenen periodontitin deneysel modeli, periodontal hastalık patogenezini anlamada temel rol oynamıştır; ancak translasyonel ve terapötik uygulamalarda tam olarak kullanılmamıştır. İnsan hastalığına benzer şekilde, farelerde ligatur kaynaklı periodontit, bir dizi farklı mikrobiyal, iltihaplayıcı ve osteo-immünolojik olaylarla gelişir. Ligatürle indüklenen alveolar kemik yıkımı, nispeten kısa sürede ilerler ve kolayca ölçülebilir; bu da preklinik çalışmalar için maliyet etkin bir hastalık modeli haline gelir.

Klasik ligatür modelinin teknik zorluğunu aşmak için, basitleştirilmiş ligatür kaynaklı periodontitis fare modeli oluşturuldu. Basitleştirilmiş hastalık modeli, iki bitişik dişin tüm çevresinde hastalık yaratmak yerine, yalnızca iki arka dişin interproksimal bölgesinde inflamatuar kemik yıkımına odaklanır; bu bölge aynı zamanda insanlarda yaygın periodontal hastalığın başladığı bölgedir. Ligatür yerleştirme için üç boyutlu (3D) baskılı araçlar kullandığı için, yaklaşım hızlı ve etkilidir ve fare başına 5-10 dakika prosedür süresi sağlar. Osteoklastonik sinyal 3 gün sonra ligatür yerleştirildikten sonra tespit edilirken, ligasyondan 9 gün sonra kemik yıkımı sürekli olarak gelişir.

Burada, basitleştirilmiş ligatür model protokolü, çalışma tasarımına özgü önemli unsurları (örneğin, güç hesaplaması, prosedür standartlaştırılması, kalibrasyon), 3D baskılı araçların geliştirilmesi (örneğin, "fare diş yatağı" ve "ligatür tutucu") ve μCT analiziyle alveolar kemik niceliklendirme ile detaylandırılır. Rank, Rankl ve osteoklastogenezin ana düzenleyici üçlüsün diş eti gen ekspresyonu, terapötik etkinliğin dolaylı kanıtı olarak kullanılır. Bu makalede sunulan yöntemler, araştırmacıların basitleştirilmiş ligatür kaynaklı periodontit modelini uygulamasını yönlendirerek yenilikçi periodontit tedavilerini preklinik ortamda test edecektir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Periodontal hastalık, diş eti destekleyici yapıların (diş eti destekleyici yapıların, çimento ve alveolar kemik) dahil olmak üzere tahribiye ile sonuçlanan karmaşık bir iltihap sürecidir. Periodontal kemik kaybının gelişmesi için, diş eti bariyerinin kırılması ve bakteriyel invaziyanın gerçekleşmesi, ayrıca inflamatuar hücrelerin toplanması ve doğuştan alınan bağışıklık yanıtından edinilmiş baskın bağışıklık yanıtına geçişolmalıdır 1. Osteoblastlar ile osteoklastlar arasındaki son dengesizlik, onun yok oluşu yoluyla alveolar kemik kaybına yolaçar 2. Periodontal hastalık tanisini geri dönebilir diş eti iltihabından (gingivit) ayıran fenotipik bulgu, alveolar kemik kaybıdır. Bu nedenle, diş destekleyici alveolar kemik miktarı, preklinik ortamda önemli bir terapötik sonuçtur.

Hiçbir hayvan modeli, farklı terapötiklerin geliştirilmesi için gereken tüm biyolojik yönleri çoğaltamaz 3,4,5. Ligatur kaynaklı periodontitis fare modeli, nispeten kısa sürede (3-9 gün) ölçülebilir kemik yıkımı geliştirir; bu da periodontitin önlenmesi ve modülasyonu için yeni terapötik müdahaleleri test etmek için maliyet etkin bir model haline gelir. Faz II-III insan klinikdenemelerinin geliştirilmesini desteklemedeki başarısına rağmen, farelerde ligatur kaynaklı periodontit, genellikle preklinik model olarak kullanılmaz. Ligatürün dişi çevrelediği klasik modelin teknik zorluklarını aşmak için, basitleştirilmiş ligatür kaynaklı periodontitis faremodeli 11,12 oluşturuldu. Klasik modelin basit modifikasiyası, dişlerin etrafında değil, arası, odaklanmış bir kemik yok noktasına odaklanıyor. Bu değişikliğin faydaları çok katmanlıdır; bunlar arasında 1) personel eğitimi için daha kısa süre, 2) deneysel prosedürün teknik kolaylığı ve 3) kemik niceliklendirmesinin tekrarlanabilirliği dahildir. Ayrıca, bu basitleştirilmiş model altında gelişen ve ortaya çıkan birkaç mikrobiyolojik ve immünolojik olayın, yaygın insan periodontalhastalığı 2,11,12,13 ile güncel anlayışla örtüştüğü keşfedilmiştir. Son olarak, daha önce US 2,14 tarafından bildirilen etkili ilaç kaynaklı kemik kaybını önleme, yeni periodontal tedavilerin temel yönlerini değerlendirmek için in vivo bir araç olarak basitleştirilmiş ligatürle indüklenen periodontit modelinin kullanımını daha da desteklemektedir.

Basitleştirilmiş ligatürle indüklenen periodontit modelinin yenilikçi bir yönü, hastalık indüksiyon sürecini daha kolay kolaylaştırmak için 3D baskılı araçların geliştirilmesiolmuştur 11,12. Bazıları için sezgisel olsa da, araştırmacılar 3D baskılı araçları bir aradakuramadıklarını bildirdiler; bu da hayvan çalışmalarının başlamasını daha da engelleyebilir veya geciktirebilir. Bu çalışma, önceki protokolçalışmamız 11'desunulan bilgileri genişletmekte ve laboratuvar ortamında basitleştirilmiş ligatürle indüklenen periodontit modelinin başarılı bir şekilde uygulanmasını sağlayan ayrıntılı bilgiler sunmaktadır. Bu mevcut protokole dahil edilen detaylar, bilimsel bulguların sonuçların tekrarlanabilirliğinin eksikliğine katkıda bulunabilecek karmaşık bir faktör dizisininparçasıdır 15,16,17. Son 10 yılda 2,11,12,14,18 ve işbirlikçi araştırmagrupları 13,19,20,21 tarafından belirlenen tutarlı model kullanımı ve güvenilir kemik rezorpsiyonu, bilimsel camiada tekrarlanabilirliği teşvik etmek için ayrıntılı bilgilerin yayılmasının önemini desteklemektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, Hayvan Araştırmaları: In Vivo Deneylerin Raporlanması (ARRIVE)yönergelerine 22,23 uydu. Bu protokolde tanımlanan tüm deneysel prosedürler, Kuzey Carolina Üniversitesi Chapel Hill Merkezi tarafından onaylandı.

1. Deneysel tasarım

  1. Örneklem büyüklüğü hesaplaması
    NOT: Araştırma programının translasyonel yapısı nedeniyle, burada sunulan güç hesaplaması 8-12 haftalık vahşi tip C57Bl6 farelerinin alveolar kemik ölçümlerine dayanmaktadır.
    1. Kemiği, sementum-mineli birleşim ile alveolar kemik arması (CEJ-ABC) arasındaki doğrusal ölçümlere göre analiz edin.
      1. Sağlıklı farelerin ortalama bağlanma seviyesi (veya CEJ-ABC ölçümü) 0,2 mm'dirken, ligasyon sonrası 9 günlük zaman noktasında periodontitli farelerde bunun iki katı (CEJ-ABC mesafesi 0,4 mm)11 bulunur. Alveolar kemik kaybı, ligatür yerleştirildikten sonraki 9 günden 18 güne kadar anlamlı bir artışgöstermez.
      2. Bu etki boyutuna dayalı bir güç hesaplama analizi yaparak sağlık ve hastalık arasındaki bu farkları ortaya çıkarmak için gereken fare sayısını belirleyin (burada toplam 8-10 fare [Şekil 1A]).
        NOT: Güç, iki örneklemli ortalama güç kullanılarak 0.8 ile 0.95 arasında bir güç elde etmek üzere hesaplandı, α = 0.05. Grup ortalamaları ve standart sapmalar Şekil 1B'de sunulmuştur.
    2. Kemik kaybı üzerindeki terapötik etkiyi belirlemek için farklı bir güç hesaplaması yapın. Sağlıklı fareleri hasta farelerle karşılaştırmak yerine, hem deneysel hem de kontrol gruplarında fare periodontit geliştirirken, bu protokolde kemik kaybı modülasyonu testinde basitleştirilmiş ligatürle indüklenen periodontitis fare modeliyle sonuç tekrarlanabilirliğini sağlamak için 19 ila 31 fare arasında bir kenara ayrılın; bu protokolde temsil edici sonuçlar ve Şekil 1C'ye bakınız).
      NOT: Güç, yukarıda açıklanan aynı testle hesaplandı. Grup ortalamaları ve standart sapmalar Şekil 1D'de sunulmuştur.
  2. Prosedür standartlaştırması ve personel kalibrasyonu
    1. Çalışmaya başlamadan önce hastalığın indüksiyonu ve nicel belirlemede yer alan tüm personeli eğitin ve kalibre edin (kalibrasyon aralı;r 2 ≥ 0.90).
      NOT: Ligatür yerleştirme ve kemik kaybı niceliği için eğitimin 2-3 aylık bir dönem gerektirdiği tahmin edilmektedir (zaman çizelgesi Tablo 1'de sunulmuştur). Diğer gerekli adımlar Tablo 1'de bir zaman çizelgesi olarak sunulmuştur.
    2. Bağ yerleştirme işlemi için, işlem odasında iki eğitimli araştırmacının birlikte çalışması sağlanır. Ana araştırmacı (iç ve aralıklı kalibrasyonlu) ligatürleri yerleştiren operatör olarak kalır.
    3. İkinci araştırmacının prosedürel asistan olarak çalışmasını ve aşağıda listelenen adımları gerçekleştirmesini sağla:
      1. Fare ağırlığını kaydet.
      2. Fareyi anestezi kutusuna yerleştirin.
      3. Farenin üzerinde göz merhemi kondurmadan önce fareyi operatöre verin ve "fare diş yatağı"na yerleştirilmesini sağlar.
      4. ≥3 "ligatür tutucu"nun ligatürlerle uygun şekilde yüklendiğinden ve kullanıma hazır olduğundan emin olun.
        NOT: Verimliliği artırmak için, operatörün kullanımı için uygun şekilde yüklenmiş ≥3 "ligatür tutucusunun" olması idealdir. Kullanım hızlılığı önerilir (örneğin, fare başına 5-10 dakika işlem süresi), bu da bir günde yapılan deney sayısını artırır ve potansiyel parti etkilerini azaltır.
      5. Fare izleme yapın (işlemden önce ve sonra).
        NOT: Bağ indükü periodontit, insan dişini diş ipi kullanmasına benzeyen, invaziv olmayan, cerrahi olmayan bir işlemdir. Ligatür yerleştirmesinin farelerde çok hafif rahatsızlık yaratması beklenir (çoğunlukla iki diş arasında bakteri birikimi nedeniyle), ancak herhangi bir analjezik kullanımı gerektirmemelidir. Eğitilmiş bir birey tarafından yapılan ligatür yerleştirilmesinden sonra herhangi bir komplikasyon beklenmez. Tüm hayvanlar, ligatür yerleştirildikten sonra her 2-3 günde bir izlenir. İnsani son noktalar (örneğin bakım veya beslenme eksikliği, kalkıp yürüyememe, zorlanan solunum, nekrotik veya enfekte yaralar) onaylı hayvan protokolünde listelenmelidir, ancak herhangi bir komplikasyon oluşursa, uygun önlemler için veteriner personeline danışılmalıdır.

2. Farelerde ligatür periodontitini indüklemek için basılı aletlerin oluşturulması

NOT: Ligatür yerleşimini optimize etmek için, Fare Diş Yatağı ve Ligatür Tutucu adlı 3D baskılı araçlar geliştirildi; bunlar ayrı ayrı basılan ve manuel olarak monte edilen birkaç ayrı 3D baskı parçasından oluşuyordu. Bu cihazların plan spesifikasyonları daha önce11 kez yayımlanmış ve deneyimli araştırmacılar tarafından bireysel STL dosyaları oluşturmak için kullanılabilir. Mevcut çalışmadaki yeni cihazlar, Kuzey Carolina Üniversitesi Chapel Hill BeAM Tasarım Merkezi ile iş birliği içinde oluşturulmuştur. Materyaller, ilgili çekirdek tesis aracılığıyla veya Ek Dosya 1'deki STL dosyaları kullanılarak 3D basılarak elde edilebilir.

  1. Fare diş yatağı
    1. Fare Diş Yatağını (Şekil 2A) ve Ligatür Tutucuyu (Şekil 2B) standart baskı kalitesiyle, 3.0 mm polilaktik asit (PLA) filamenti kullanılarak 3D yazıcıda bastırın. Diş yatağını tasarlanmış yönde bastırın ve diğer parçaları düzgün yüzeyler baskı yatağına doğru aşağı doğru yönlendirilerek basın. Destek Yerleştirme ayarını etkinleştirerek destek materyali seçeneğini etkinleştirin. Destek malzemesinin önce yapı plakasına dokunduğundan emin olun ve Dokunma Yapı Plakası seçeneğini seçin.
      NOT: Ek Dosya 1'deki beş STL dosyasını kullanarak Ayrılmış Tüp, Ligatür (çentikli), Fare Diş Yatağı (çentikli), Kapak ve Ligatür Tutucu Kilidi dahil olmak üzere gerekli tüm elemanları yazdırın. Her öğenin boyutları için Malzeme Tablosu'na bakınız (önceden sunulan plan spesifikasyonları10).
    2. Baskı tamamlandıktan sonra, modellerden basılı destek materyal parçalarını tel kesiciler, iğne burunlu pense veya başka bir alet kullanarak kesin.
      NOT: Bu işlem sırasında güvenlik gözlüğü takın.
  2. Fare diş yatağı montajı
    1. Fare diş yatağını hazırlamak için, tüm parçaları gösterildiği gibi yerleştirin (Şekil 3A) ve yapıştırıcıyı hazırlayın (Şekil 3B).
    2. Birkaç damla yapıştırıcı yerleştirin (Şekil 3C) ve vidaları gösterildiği gibi takın (Şekil 3D). Yine, yapıştırıcıyı (Şekil 3E) uygulanacak alanlara aktarmaya hazırlanın. Baskılı tüpün yuvasını (Şekil 3F) dikenli ucu Fare Diş Yatağı'na bakacak şekilde yerine kaydırın (izofluran iletmek için hortum buraya bağlanacak).
    3. Başlık stabilizasyon parçalarını yapıştırıcı ile konumlarına sabitleyin (Şekil 3F).
    4. Fazla yapıştırıcıyı silin ve sıkı bir şekilde takılması için yerleştirilen tüm parçalara hafif basıncı uygulayın (Şekil 3F).
  3. Bağ tutucu ayarlamaları
    1. Mekanizmayı kilitlerken/kilitlerken/açarken rahatsızlığı azaltmak için, Ligatür Tutucu Kilidi'nin (Şekil 4A) dış kısmındaki tüm kare/keskin kenarların 15C bistil bıçak sapı ile 45° açıyla hafifçe eğimli olduğundan emin olun; 3 numaralı bıçak 15C bıçak ile kullanılmıştır.
    2. Kilitleme mekanizmasının Ligatür Tutucuya sıkı oturmasını sağlamak için, Ligatür Tutucu Kilidi'nin (Şekil 4B-F) iç yuvarlatılmış köşelerini 15C bistik bıçağı ile kare hale getirin.
      NOT: Bu, kilidin Ligatür Tutucuya tam olarak oturmasını sağlar ve sadece küçük ayarlamalar gerektirir.
      1. Desteğin çoğunu çıkardıktan sonra bile üst ve alt kenarlarda kalan "flaş"ı çıkarmak için 3D baskı kesme aracı veya 15C bistüri bıçağı kullanın ve sıkı bir kilit sağlamak için kenarları 45° açılıkta hafifçe eğimle (1. adımda Ligature Holder Lock'ta yapılan eğim gibi) kullanabilirsiniz.
        NOT: Çok fazla malzeme çıkarmayın, ancak kilidin direnç olmadan kayması için yeterli miktarda çıkarın.
    3. Çok inceyse, her uç uzunluğunu daha kalın bir kesit (en az 0,5 mm kalınlığında) elde edene kadar kesinleştirin; böylece ligatür yerleştirilirken uçlar arasında damak üzerine çarpmayı önlemek için yeterli boşluk kalmasını sağlayın. Kesimden sonra uçların en az 3 mm uzunluğunda olduğundan emin olun (Şekil 5A, "KES" ile gösterilmiştir).
    4. Ligatür Tutucu'nun uçlarında, aletin bastığı "destek"ten herhangi bir flaşı çıkararak uçların yanlarının düz olduğundan emin olun (Şekil 5B, ok).
    5. Her ucunun yanından 45° açıda bir "dilim" çıkarın; böylece ligatürü üzerine daha kolay yüklemek ve kenarları yumuşatmak için yumuşak dokulara travmatik zarar oluşmasını sağlamak için (Şekil 5C, oklarla gösterilmiştir).
    6. Ligatür Tutucu'nun her ucunda, dikiş ipeği ligatürlerinin dayanabileceği "V" şeklinde bir çentik içerdiğinden emin olun. Eğer bu madde 2.3.6 adımında ilk basılan uç çok ince olduğu için kaldırıldıysa, baskıda ince hale getirin veya tekrar üretin.
      1. Bu "V" şeklindeki çentik görünürse, Ligatür Tutucuyu her iki ucu masaya paralel olacak düz bir yüzeye koyun, 15C bistüri bıçağını çentikin tabanına nazikçe yerleştirin ve bıçağı nazikçe sağa sola sallayın; böylece bıçak kenarı "V"nin tabanında kalacak ve bıçağın yan kısmı "V"nin üst duvarlarına değecektir. Bıçak çentikin tabanındayken, bıçağı ucunun dış yüzeyine çok dikkatli bir şekilde açınız ve bu hareketi tekrarlayarak dış kenardaki "V" şeklindeki çentikin tabanını inceleyin; böylece dikiş ipliği daha kolay yerine oturabilir.
        NOT: Bu sallanma hareketi, filamentte yeterince hareket yaratır ve çentikten fazla malzeme çıkarmadan onu ortadan kaldırır.
      2. Bu "V" şeklindeki çentik görünmüyorsa , Ligatür Tutucuyu her iki ucu masaya dik olacak düz bir yüzeye koyun. Ligatür Tutucu'nun her iki ucundan doğrudan aşağıya bakarken, uçların ortasına 15C bir bistüri bıçağı yerleştirin ve kasıtlı bir hareketle sığ bir kesim yapın; böylece "V" şeklindeki çentikin başlangıcını oluşturun.
        NOT: Bu hareketi her iki ucda ayrı ayrı yapmak genellikle bıçağı aynı anda doğru noktaya yerleştirmeye çalışmaktan daha kolaydır.
      3. Gerekirse 2.3.7.2 adımını tekrarlayın, bistüri bıçağının kenarının her zaman ucunun ortasındaki aynı noktaya geri doğru izlendiğinden emin olun.
        NOT: Eğer kenar bıçağın aynı noktaya geri dönmemesi durumunda, birden fazla kesim yapılır, bu da filament katmanlarının o bölgelerde ayrılmaya başlamasına ve aletin performansını potansiyel olarak düşürmesine yol açar.
        NOT: "V" şeklindeki çentikin derinliği, bağlanmanın tuttuğunu veya sürekli kayıp kaymadığını belirlemek için bağlı bir dikiş-ipek ligatür kullanılarak periyodik olarak test edilmelidir (bu da daha fazla iyileştirmenin gereklidigini gösterebilir). Tutucu, çentik yapı plakasına bakacak şekilde ve Ligatür Tutucu Kilidi daha geniş açılan kısmı yapı plakasına değecek şekilde yönlendirilmiş şekilde basılmalıdır. Yine, destek materyali sadece Touching Buildplate olarak Destek Yerleştirme ayarlandığında kullanılabilir.
  4. Bağlama tutucu monte edildi
    NOT: Değişiklikler yapıldıktan sonra Ligatür Tutucu'yu birleştirin ve aşağıdakileri kontrol edin:
    1. Bir bağlayıcı yerinde kilitlendiğinde, kilidin ipliği Ligatür Tutucu'ya ( Şekil 6A'da ok ile gösterilmeyen, ancak Şekil 6B'de görülen) kilidin üst veya alt kısmına sıkıştırdığından emin olun (mümkünse her ikisi de olabilir, ancak bunu başarmak zor olabilir).
      NOT: Bu sürtünme, ligatürün yerinden kaymamasını sağlar.
    2. Ligatür Tutucu'nun oluklarına saplanırken, uçlardan kaymaya devam ederse, ya olukları derinleştirin ya da ipliğin oturacağı bir "iz" oluşturmak için uçun dışına daha fazla uzatın.
    3. İki düğümün ortada olup olmadığını (Şekil 6C) ve düz ( Şekil 6D'de düz çizgi) Ligatür Tutucu'nun önünden bakıldığında kontrol edin; Eğer değilse, bir oluk diğerinden daha derindir.
    4. Ligatürün oluk içinde olup olmadığını ve çok derin oturmadığını kontrol edin; aksi takdirde, Ligatür Tutucu'nun ucu yumuşak dokulara temas edip ligatür yerleştirme sırasında travmaya neden olma riski artar.
    5. Diş kaşifi (Şekil 6E) kullanarak, düğümler arasında hafif kuvvet uygulandığında ligatürün kaymadan yerine geri zıpladığını doğrulayın (bu, ligatür yerleştirilirken karşılaşacağı kuvveti simüle eder).

3. Bağ yerleşimi

NOT: Ligatürlerin, insan periodontal patojenleri eklenmiş veya eklenmeyen fare dişleri arasına yerleştirilmesi mümkündür11. Ligatürün mikrobiyal bileşiminin zamana bağlı analizi (insan bakteriyel türleriyle takviye olmadan), periodontit gelişimi sırasında mikrobiyom topluluğunda (disbiyoz) bir değişim olduğunugöstermiştir 12. Bu nedenle, ligatür değişimi önerilmez çünkü sonuç tekrarlanabilirliğini değiştirebilir. Bakteri türlerinin ligatürle birlikte dahil edilmesi, belirli bir çalışmada ele alınan soruna bağlıdır. Beklenen %10-15 ligatürkaybı nedeniyle, ligatürler tek bir farede iki taraflı olarak yerleştirilir. Bu yaklaşım, deney sırasında fare kaybını en aza indirir.

  1. Fare solulan izofluran ile anestezi edildikten sonra, anestezi edilen fareyi sırtı yatağa yaslanacak şekilde ve burnu burun konisine yakın konumlandıracak şekilde Fare Diş Yatağı'na yerleştirin.
    NOT: Fareler %4 (hacim/hacim) İzofluran ile anestezi edilmelidir. İzofloran buharlaştırıcı ve oksijen 0.2 μm hava filtresiyle filtrelenir. Fare tamamen anestezi edilip Fare Diş Yatağı'na yerleştirildikten sonra, burun konisinden %1,5-2,5 akışla tutulmalıdır. Fareler istemsiz vücut hareketleri ve nefes hızıyla (~dakikada 55-65 nefes) izlenir. Ligatür periodontitiyle indüklenen farelere herhangi bir analjezik verilmesi gerekmez; çünkü bu, insan dişini diş ipi ile kullanmaya benzer invaziv olmayan, cerrahi olmayan bir işlemdir. Bağ yerleştirmesinin farelerde çok hafif rahatsızlık yaratması beklenir (esas olarak iki diş arasında bakteri birikimi nedeniyle), ancak herhangi bir analjezik kullanımı gerektirmemelidir. Eğitilmiş bir birey tarafından yapılan ligatür yerleştirilmesinden sonra herhangi bir komplikasyon beklenmez.
  2. Lastik bantları kullanarak farenin başını stabilize edin ve ağzını açın.
    NOT: Mandibular kesici dişlerini çevreleyen bant da dili geri çeker ve gerginlik pasiftir, çeneyi çekmeden açmak için kullanılır. Aydın dişlerin görselleştirilmesi, ışık kaynağı açıdan yönlendirildiğinde gölgelerin görüş alanını engellemesi için daha kolay hale gelir. Fare diş yatağı, basitleştirilmiş ligatür kaynaklı periodontitis fare modeli için özel olarak tasarlanmıştır. Deneysel işlem sırasında farenin küçük vücut hareketleri yapabilmesi için farenin burnu ile koni arasındaki mesafe gereklidir. Bu fare hareketi, ligatür tutucu kullanılırken operatörün el hareketinin uygun şekilde izlenmesini sağlar ve ligatür yerleştirme sırasında kullanılan kuvvet miktarını kontrol eder. Ligatür yerleştirme fare başına 5-10 dakika sürmelidir. Hayvan deneyleri için işlemler iyi havalandırılan bir kaputun içinde yapılmalıdır
  3. Bir bağlayıcıyı sağ tarafa yerleştirmek için sağ elde Ligatür Tutucunu, sol elde kaşifi tutun.
    NOT: Bağ üzerindeki düğümler uçlar arasında değil ve bir uca daha yakınsa, ligatür belirli bir tarafta yerleştirilmek için daha uygun olabilir. Örneğin, düğümler Ligatür Tutucu'nun sağ ucuna daha yakın yerleştirilirse, bu bağ bağlamanın sağ tarafa yerleştirilmesi daha kolay olabilir.
  4. Kaşifin ucunu damak tarafındaki birinci ve ikinci azı dişlerin interproksimal temasının altına nazikçe yerleştirin.
    1. Explorer ucunun önce dişlere dokunması, ardından yumuşak dokuyu travmatize etmemek için aşağı kaydırıp diş eti üzerine yaslanmasını sağlamak; Doğru konumlandırıldıktan sonra Explorer sapını yatay bir kenara bırakın.
    2. Explorer'ın hangi ucunun sağ tarafta, hangisinin sol tarafta kullanıldığını not edin. Kaşifin ucunun, proksimal temas alanına yukarı doğru tutulduğundan emin olun, aynı zamanda şaftın bükülmesi karşı taraf boyunca uzanarak başı tepki gücüne karşı stabilize etmelidir.
  5. Ligatür Tutucu'yu yatay bir şekilde kullanarak yanağı geri çekin; önce Ligatür Tutucu'yu ikinci ve üçüncü azı dişleri arasındaki proksimal temasın üzerine yerleştirerek, Ligatür Tutucu'nun kenarını yanağa iterek hareket ettirin, ardından Ligatür Tutucu'yu birinci ve ikinci azı dişler arasındaki proksimal temas noktasına getirin.
    NOT: Bu adım, bukkal mukozanın ligatur ile dişler arasında sıkışıp kalmasını sağlar ve bu da yerleşimini engeller.
  6. Ligatür, birinci ve ikinci azı dişler arasındaki interproksimal temasın üzerine yerleştirildikten sonra, Ligatür Tutucusunun sapını 45°'ye kadar döndürün ve hafif sallama ile kaydırma kombinasyonuyla ligatürü temastan itin.
  7. Fazla ipliği kesmek:
    1. Sağ taraftaki düğüme bağlı fazla ipliği ince bir iğneli forseps ile kavrayın, ipliği dişlerin üzerinden sola doğru çekin ve hafifçe açık olan makaslarla makası iplik boyunca kaydırarak düğümden ~1,5 mm mesafeye kadar kesin.
      NOT: Bu, fazladan kesilirken kazara yapılacak mukozal travma olasılığını azaltmaya yardımcı olur.
    2. Yukarıdaki yönleri diğer düğüm için tersine çevirerek tekrarlayın.
  8. Yukarıdaki 3.3'teki adımları yansıtın. 3.7.2'ye kadar. Ağzın karşı tarafına bir bağ koyarken.
    NOT: Disbiyotik kayma farklı deneysel koşullar tarafından değiştirilebileceği için kurban yoluyla ligatür toplama önerilir12. Toplamayı kolaylaştırmak için fareler Mouse Diş Yatağı'na yerleştirilir ve bağın düğümlerinden biri kesilir, ardından pensle nazikçe interproksimal çıkarma yapılır. Ligatür toplama sırasında Fare Diş Yatağı'nın kullanılması, farenin uygun stabilitesini ve ligatür bölgesine kolay erişimi sağlar.

4. Kemik yok oluşu niceliği

  1. μCT analizi
    1. Yazılımı açın ve Dosya | Görsel İçe Aktar...
    2. Açılır menüde Göz At'a tıklayın, Dicom dosyalarının bulunduğu klasöre gidip bir tarama için gidin ve ilk dosyayı seçin.
    3. Aynı taranan örnekle ilgili klasör içindeki diğer dosyaları bulmak ve seçmek için İnsüzle'ye tıklayın. Tamam tuşuna tıklayın.
    4. Görsel yüklenmeye başladıktan sonra Visualize ve Isosurface seçeneklerine tıklayın.
    5. Görüntü eşiğini 5.000'e ve Yüzey Kalite Faktörünü (%) 55'e değiştirin.
    6. Görüntü Düzgünleştirmesini Etkinleştir ve Güncel ROI ile Kip Yüzeyi ile işaretlenmiş kutuları işaretle ve Güncelle seçeneğine tıklayın.
    7. Seviye Özellikleri'ni en alttaki Window/Level (Şekil 7A) üzerine sağ tıklayarak ve Window / Level Properties'i Düzenle seçeneğine tıklayarak ayarlayın. Tüm örnekler için standart bir kemik yoğunluğu değeri seçin. Bu protokolü takip etmek için 2.000 kullanın ancak örneklerin kemik yoğunluğuna göre değiştirin ve tüm ölçümlerde sabit kalın.
    8. Düzlemleri manipüle etmek için:
      1. Üç farklı düzlem için klavye kısayolları I/J/K hide / show kullanın.
      2. İmleci sağa tıklayıp yakınlaştırıp uzaklaştırmak için hareket ettirin.
      3. Shift tuşuna basın ve sonra sol tıklayın ve pan yapın.
      4. Düzlemleri hareket ettirmek ve döndürmek için Dilimle'e tıklayın.
      5. Düzlemin ortasına tıklayarak düzlemi ileri/geri hareket ettirin veya imleci istediğiniz düzlemin ortasına yerleştirin ve yukarı ve aşağı ok tuşlarını kullanarak düzlemi bir dilim olarak hareket ettirin.
      6. Düzlemin kenarına tıklayarak düzlemin ortasında bu kenara paralel bir çizgi etrafında döndürün.
      7. Bir düzlemin köşesine tıklayarak düzlemin etrafında döndürün.
    9. Z-eksenini (ekranın üstündeki mavi panel-z-dilimi) yöne yapın ki üç dişin yüzeyleri/şekilleri aynı anda (veya mümkün olduğunca yakın) görünür hale gelsin (Şekil 7B).
    10. Aynı düzlemde (ekran-z-diliminin üstündeki mavi panel) kaydırın, böylece 1. ve 2. azı dişlerin kökleri görünür (Şekil 7C). Köklerin aşağısında bir nokta seçmeye çalışın ki çevredeki tüm anatomi görünsün, ama aynı zamanda kanalların iyi tanımlanmış ve düz bir çizgide göründüğü yer.
      NOT: Kanalları dikey olarak yönlendirmek için düzlemin döndürülmesi gerekebilir.
    11. X eksenini (z-dilim panelinde dikey yeşil çizgi) 1. ve 2. azı dişin bukkal kökleriyle hizalayacak şekilde yönlendirin (mümkünse her kök/kanalın orta kısmından hizalamaya çalışın; aksi takdirde, 1. azı dişin bukkal kökü ve 2. azı dişin distobukkal kökü üzerinden hizalayın) (Şekil 7D).
    12. x-diliminin yönelimini, y-diliminin hizalanması için referans olarak kullanın (x-dilim panelinde dikey mavi çizgi).
      1. Y-dilimi, x-dilim panelindeki birinci azı dişin kökünden dikey olarak paralel olacak şekilde hizalayın (Şekil 7E). Kökü dikey olarak yönlendirmek için düzlemi döndürün. Mavi çizginin kökün ortasından geçtiğini gözlemleyin.
        NOT: Kemik kaybı olan bölgelerde (bu modelde beklendiği gibi), alveolar çıkıntıda bir kusur olabilir; Bu nedenle, çevredeki kemik yuvanın ortasını ideal olarak tanımlamak için mevcut olmayabilir, çünkü kökün orta hattı tahmin edilmelidir.
    13. Y-dilim panelinde, sementoenamel birleşiminden (CEJ) alveolar kemik tepesine (ABC) olan mesafeyi ölçün; imcörü CEJ'deki oluğun en derin noktasına yerleştirip 1 tuşuna basarak ve ardından imleci ABC'nin en yakın noktasına yerleştirip gösterildiği gibi 2'ye basarak (Şekil 7F). Birincinokta mavi okla, ikinci nokta ise yeşil okla gösterilir.
      1. Oklar her iki nokta da seçilene kadar görünmezse, oku istenen alanların üzerine getirerek ve klavyedeki sayı tuşlarına basarak onları seçin; çünkü sadece fareye tıklamak işe yaramaz.
      2. CEJ'yi belirlemek zorsa, yukarı ve aşağı ok tuşlarını kullanarak bitişik dilimler arasında kaydırarak konumunu doğrulayın.
      3. "En yakın nokta" belirlenmesi zorsa, ölçümde çok az veya hiç değişiklik olmadığını doğrulamak için ABC'nin birden fazla noktasını ölçün.
        NOT: Doğru ölçümün alındığını doğrulamak için, x ve z dilimlerinin istenen kök üzerinde kesişmesini görmeli ve düzlemleri gizleyerek ölçümü 3D görünümde görsel olarak doğrulayabilmelidir (Şekil 7F).
  2. Rankl/Opg ve Rankl/Rank'in diş eti ifadesinin nicelendirilmesi
    1. Daha önce tarif edildiği gibi diş eti dokusutoplayın 9.
      NOT: En iyi RNA çıkarımı sonuçları taze doku örnekleri kullanılarak elde edilir ve RNA arındırması mümkün olan en kısa sürede işlenmelidir.
    2. Referans edilen kit ve seramik boncuklarla boncuk vurarak diş eti dokusu RNA'sını çıkarın. Kitteki talimatları takip edin ve numuneyi -80 °C'de saklayıp qRT-PCR ile analiz edilene kadar saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

aBaşlangıç (sağlık) ve ligasyon sonrası 9 gün sonra WT dişi ve erkek farelerden alınan lineer alveolar kemik ölçümlerinin temsil veri analizi Şekil 1A'da sunulmaktadır. Güç hesaplaması, birincil sonuç μCT ile ölçülen doğrusal kemik seviyeleri ise, bu gruplar arasındaki farkları tespit etmek için toplam 10 fare (grup başına 4-5 fare) gerektiğini göstermektedir (Şekil 1B). Ancak, preklinik çalışmalar için güç hesaplaması, her iki ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mevcut çalışma, daha önce sunulan basitleştirilmiş ligatürle indüklenen periodontitis fare model protokolü hakkında ayrıntılı bilgiler ve detaylı, adım adım rehberlik sunmaktadır. 10. Mevcut makalede yer alan detaylar, tekrarlanabilirliği büyük ölçüde etkileyebilir ve grubun bu özel ligatür kaynaklı periodontitis faremodeli 11,12,13,18,19,21 ile yaşadığı deneyimle desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Öncekiyayın 9'da 3D baskılı cihazların oluşturulmasında kullanılan STL dosyaları, Kuzey Carolina Üniversitesi Chapel Hill ile yapılan telif hakkı anlaşması altındadır ("UNC-Mouse Surgical Bed and UNC-Ligature Holder" UNC Ref. No. 18-0024). Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarlar belirtmemektedir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yayında bildirilen araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Ulusal Diş ve Kraniofasiyal Araştırma Enstitüsü tarafından Ödül Numaraları K01DE027087 (JTM) ve R01DE032830 (JTM) kapsamında desteklenmiştir. Çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin Alerji ve Enfeksiyon Hastalıkları Ulusal Enstitüsü tarafından R01-AI153265 (KVS) ödül numarası altında desteklendi. İçerik tamamen yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini mutlaka yansıtmaz. Ayrıca, burada bildirilen araştırmalar Fulbright/CAPES programı finans kodu 001 (TA) ile de desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
BıçakIntegra4-315C15C bıçak
Seramik boncuklarVWR10158-6080.5 mL x 1.4 mm Seramik boncuklar
Yapıştırıcı/reçine malzemesiGorilla Yapıştırıcı Şirketi8401519
Ligatür Tutucu (çentikli)UNC at Chapel Hill BeAM Tasarım Merkezi tesis çekirdeğiGeçerli değil118,01 mm x 13 mm x 13,74 mm
Bağ Tutucu KilidiUNC at Chapel Hill BeAM Tasarım Merkezi tesis çekirdeğiGeçerli değil17,5 mm x 14,57 mm x 17,8 mm
Lulzbot mini v1.0 3D yazıcı Lulzbot (Fargo Katkı Üretim Ekipmanı 3D, LLC)Geçerli değilAleph Objects, Lulzbot Mini v1.0 model
MicroView YazılımıParallax Yenilikleri2.5.0-3139Kemik ölçümleri için kullanılan yazılımlar
Fare Diş Yatağı (Otikli)UNC at Chapel Hill BeAM Tasarım Merkezi tesis çekirdeğiGeçerli değil103,86 mm x 196,85 mm x 50,99 mm
Fare Diş Yatak ÜstüUNC at Chapel Hill BeAM Tasarım Merkezi tesis çekirdeğiGeçerli değil99,8 mm x 77 mm x 21,5 mm
Polilaktik asit (PLA) filamentiKelimesi kelimesine552593.0 mm PLA
Rapidpure RNA doku kitiMP Biyomedikal112721050
Bistür bıçak sapıBard-Parker37103015C bisçer bıçak sapı
Dikiş-ipekRoboz Cerrahi CihazSUT-15-1
Taqman qPCR primerleriThermo FisherRütbe (Mm00437135_ m1), Rankl (Mm00441906_ m1), Opg (Mm00435452_ m1), Gapdh (Mm99999915_g 1)
VX-765  InvivoGen, San Diego, ABD#inh-vx765-1Konak modülasyonu için kullanılan kaspaz-1 inhibitörü

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Offenbacher, S. Periodontal diseases: pathogenesis. Ann Periodontol. 1 (1), 821-878 (1996).
  2. Alves, T., Swanson, K. V., Girnary, M. S., Freire, M., Moss, K., Divaris, K., Beck, J., Santos, P. C. P., Brickey, W. J., Wrobel, J. A., Min, H. Y., Syed, M., Morelli, T., Seaman, W. T., Preisser, J. S., Hu, D., Preisser, H., Makhanova, N., Susin, C., Vias, N. P., Styner, M., Zhang, S., Pirih, F. Q., Chang, J., Gill, H. S., Lietzan, A. D., Webster-Cyriaque, J., Ting, J. P. Y., Marchesan, J. T. Inflammasome targeting for periodontitis prevention is sex dependent. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (44), e2507092122(2025).
  3. Padial-Molina, M., et al. Methods to .validate tooth-supporting regenerative therapies. Methods Mol Biol. 887, 135-148 (2012).
  4. Hajishengallis, G. Illuminating the oral microbiome and its host interactions: animal models of disease. FEMS Microbiol Rev. 47 (3), fuad018(2023).
  5. Graves, D. T., Fine, D., Teng, Y. T., Van Dyke, T. E., Hajishengallis, G. The use of rodent models to investigate host-bacteria interactions related to periodontal diseases. J Clin Periodontol. 35 (2), 89-105 (2008).
  6. Hasturk, H., et al. RvE1 protects from local inflammation and osteoclast- mediated bone destruction in periodontitis. FASEB J. 20 (2), 401-403 (2006).
  7. Hasturk, H., et al. Phase IIa clinical trial of complement C3 inhibitor AMY-101 in adults with periodontal inflammation. J Clin Invest. 131 (23), e152973(2021).
  8. Maekawa, T., et al. Genetic and intervention studies implicating complement C3 as a major target for the treatment of periodontitis. J Immunol. 192 (12), 6020-6027 (2014).
  9. Maekawa, T., et al. Antagonistic effects of IL-17 and D-resolvins on endothelial Del-1 expression through a GSK-3beta-C/EBPbeta pathway. Nat Commun. 6, 8272(2015).
  10. Hajishengallis, G., Hasturk, H., Lambris, J. D. Contributing authors. C3-targeted therapy in periodontal disease: moving closer to the clinic. Trends Immunol. 42 (10), 856-864 (2021).
  11. Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nat Protoc. 13 (10), 2247-2267 (2018).
  12. Ribeiro, A. A., et al. Oral biofilm dysbiosis during experimental periodontitis. Mol Oral Microbiol. 37 (6), 256-265 (2022).
  13. Jiao, Y., et al. Induction of bone loss by pathobiont-mediated Nod1 signaling in the oral cavity. Cell host & microbe. 13 (5), 595-601 (2013).
  14. Marchesan, J. T., et al. Role of inflammasomes in the pathogenesis of periodontal disease and therapeutics. Periodontol 2000. 82 (1), 93-114 (2000).
  15. Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. J Vis Exp. (155), e59667(2020).
  16. Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505 (7485), 612-613 (2014).
  17. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
  18. Swanson, K. V., et al. Interferon activated gene 204 (Ifi204) protects against bone loss in experimental periodontitis. J Periodontol. 93 (9), 1366-1377 (2022).
  19. Sun, L., et al. IL-10 dampens an IL-17-mediated periodontitis-associated inflammatory network. J Immunol. 204 (8), 2177-2191 (2020).
  20. Offenbacher, S., et al. GWAS for Interleukin-1beta levels in gingival crevicular fluid identifies IL37 variants in periodontal inflammation. Nat Commun. 9 (1), 3686(2018).
  21. Apaza Alccayhuaman, K. A., et al. FasL is a catabolic factor in alveolar bone homeostasis. J Clin Periodontol. 50 (3), 396-405 (2023).
  22. Percie du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. BMJ Open Sci. 4 (1), e100115(2020).
  23. Percie du Sert, N., et al. Reporting animal research: Explanation and elaboration for the ARRIVE guidelines 2.0. PLoS Biol. 18 (7), e3000411(2020).
  24. Marchesan, J. T. Inflammasomes as contributors to periodontal disease. J Periodontol. 91 Suppl (1), S6-S11 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Alveolar Kemik Y k m3B Yaz c yla retilmi Ara larFare Dental YataLigat r TutucuMikro BT AnaliziGingival Gen EkspresyonuOsteoklastojenik Sinyalizasyonnflamatuar Kemik Y k m

İlgili makaleler