Yöntem makalesi

İnsan Neonatal Hava Yolu Epitel Hücreleri Üzerindeki Hiperoksi Etkilerini Değerlendirmek için Translasyonel 3D Hücre Kültürü Modeli

1K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/65913

⸱

12 Temmuz 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Section of Neonatal-Perinatal Medicine, Center for Pregnancy and Newborn Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Medicine, Section of Pulmonary, Critical Care & Sleep Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

Bu makalede

Özet

Yenidoğan trakeal hava yolu epitel hücrelerini (nTAEC) kullanan bir hava-sıvı arayüzü (ALI) kültür modeli oluşturmak ve atmosferik olarak indüklenen oksidatif stresin gelişmekte olan yenidoğan hava yolu yüzey epitelinden türetilen hücreler üzerindeki etkisini incelemek için fizyolojik olarak ilgili hiperoksiye maruz kalma gerçekleştirmek için bir protokol açıklıyoruz.

Özet

Preterm neonatal hava yolu epiteli sürekli olarak çevresel stres faktörlerine maruz kalır. Akciğer hastalığı olan yenidoğanlarda bu stres faktörlerinden biri, ortam atmosferinden daha yüksek oksijen (O2) gerilimini içerir - hiperoksi (% >21 O2). Hiperoksinin hava yolu üzerindeki etkisi, hava yolunun gelişim aşaması, hiperoksi derecesi ve maruz kalma süresi dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır ve değişken maruziyetler potansiyel olarak benzersiz fenotiplere yol açar. Hiperoksinin neonatal akciğer alveolarizasyonu ve hava yolu hiperreaktivitesi üzerindeki etkisi hakkında kapsamlı araştırmalar yapılmış olsa da, hiperoksinin insan neonatal hava yolu epitel hücreleri üzerindeki kısa ve uzun vadeli altta yatan etkisi hakkında çok az şey bilinmektedir. Bunun önemli bir nedeni, insan neonatal hava yolu epitel gelişimini ve fonksiyonunu incelemek için etkili bir in vitro modelin azdır. Burada, insan neonatal trakeal hava yolu epitel hücrelerinin (nTAEC'ler) insan neonatal trakeal aspiratlarını kullanarak izole edilmesi ve genişletilmesi ve bu hücrelerin hava-sıvı arayüz (ALI) kültüründe kültürlenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. nTAEC'lerin ALI kültüründe olgun bir polarize hücre tek tabakası oluşturduğunu ve mukosiliyer farklılaşmaya uğradığını gösterdik. Ayrıca, özel bir inkübatör kullanarak ALI kültüründe hücre tek tabakasının orta derecede hiperoksi maruziyeti için bir yöntem sunuyoruz. Ek olarak, orta derecede hiperoksi maruziyetinin hücresel oksidatif stresi indüklediğini ancak önemli hücre zarı hasarına veya apoptoza neden olmadığını doğrulayan floresan kantifikasyonu kullanarak ALI kültüründe hiperoksi maruziyetini takiben hücresel oksidatif stresi ölçmek için bir test tarif ediyoruz. Bu model, Yenidoğan Yoğun Bakım Ünitesinde (NICU) yenidoğan hava yollarının karşılaştığı klinik olarak anlamlı hiperoksiya maruziyetini simüle etmek için potansiyel olarak kullanılabilir ve O2'nin yenidoğan hava yolu epitel programlaması üzerindeki kısa ve uzun süreli etkilerini incelemek için kullanılabilir. Bu modeli kullanan çalışmalar, eski prematüre bebeklerde uzun süreli hava yolu hastalıklarının gelişiminde rol oynayan gelişmekte olan hava yollarında erken yaşam oksidatif hasarını azaltmanın yollarını araştırmak için kullanılabilir.

Giriş

Terapötik oksijen (O2), yenidoğan yoğun bakım ünitesinde (NICU) en çok kullanılan tedavilerden biridir1. Sonuç olarak, hiperoksiye maruz kalma (% >21 O2), önemli akciğer hastalığı olan ve olmayan yenidoğanların karşılaştığı yaygın bir atmosferik stres faktörüdür. Hiperoksiye akciğer yanıtları, maruziyetin yoğunluğuna ve/veya süresine ve anatomik konuma, hücre tipine ve akciğer gelişiminin evresine bağlı olarak değişebilir 2,3,4,5,6. Neonatal hiperoksi akciğer hasarı ile ilgili araştırmaların büyük kısmı, preterm bebekleri etkileyen en yaygın kronik akciğer hastalığı olan bronkopulmoner displazi (BPD) modelinepostnatal alveolarizasyon bağlamında hiperoksi maruziyetinin etkisine odaklanmıştır 6,7,8,9,10,11. BPD şiddeti, solunum desteği miktarına göre sınıflandırılır ve adet sonrası 36 haftadaihtiyaç duyulan O 2 9. BPD'li bebeklerin çoğu, akciğerler büyümeye devam ettikçe zamanla klinik olarak iyileşir ve çoğunluğu ilk doğum günlerinden önce solunum desteğini keser12,13. Doğumdan sonra BPD'nin ciddiyetinden bağımsız olarak, eski preterm bebekleri etkileyen önemli morbiditeler arasında okul öncesi hırıltılı solunum, astım, çocukluk boyunca tekrarlayan solunum yolu enfeksiyonları ve erken başlangıçlı kronik obstrüktif akciğer hastalığı riskinin 5 kat artması yer alır 12,14,15,16,17,18,19. Preterm bebeklerde hiperoksinin uzun süreli hava yolu hastalığı ve akciğer enfeksiyonları üzerindeki etkisi in vitro ve in vivo hayvan modelleri kullanılarak araştırılmıştır 20,21,22,23,24. Bununla birlikte, bu modellerin çoğu mezenkimal doku, alveolar epitel ve hava yolu düz kasının rolüne odaklanmıştır 25,26,27,28.

Hava yolu yüzey epiteli, solunum sisteminin tüm yolunu kaplar, trakeadan terminal bronşiole kadar uzanır ve alveol29 seviyesinden hemen önce sona erer. Hava yolu bazal hücreleri, hava yolu epitelinde bulunan birincil kök hücrelerdir ve kirpikli ve salgı hücrelerini içeren olgun hava yolu epitel soylarının tüm repertuarına farklılaşma kapasitesine sahiptir (kulüp hücreleri: mukus üretmeyen ve goblet hücreleri: mukus üreten)29,30,31,32. Neonatal hiperoksik akciğer hasarı bağlamında hücre kültürü çalışmaları çoğunlukla yetişkin insan veya fare kanseri hücre hatlarını kullanmıştır33,34. Ek olarak, çoğu in vitro deney, hücrelerin insanlarda in vivo hava yolu epiteline benzeyen bir mukosiliyer hava yolu epiteline farklılaşmasına izin vermeyen batık kültür sistemlerini kullanmıştır35. Sonuç olarak, insan yenidoğanların gelişmekte olan hava yolu epitel hücrelerinde hiperoksinin neden olduğu akciğer hasarının etkilerine ilişkin bilgilerde bir boşluk vardır. Bunun bir nedeni, atmosferik maruziyetin insan yenidoğan hava yolu epiteli üzerindeki etkilerini incelemek için translasyonel modellerin azlığıdır. Yaşamın erken dönemlerinde hiperoksik akciğer hasarı, uzun süreli hava yolu hastalığına ve enfeksiyon riskinin artmasına neden olabilir, bu da eski prematüre bebeklerde yaşamı değiştiren sonuçlara yol açabilir 14,36,37. Şiddetli BPD'li hayatta kalmayan bebeklerde, hava yolu yüzey epiteli, goblet hücre hiperplazisi ve düzensiz siliyer gelişim dahil olmak üzere belirgin anormalliklere sahiptir, bu da anormal mukosiliyer klerensi ve hava yolu kalibresini tehlikeye atan artmış epitel yüksekliğini gösterir38. Son on yılda, doğum sonrası hava yolu epitel gelişimini incelemek için hava-sıvı arayüzünde (ALI) birincil hava yolu epitel hücrelerinin kültürlenmesine artan bir ilgi olmuştur 39,40,41,42. Bununla birlikte, neonatal hava yolu epitel hücrelerinin ALI modelleri, hiperoksi maruziyeti gibi atmosferik redoks pertürbasyon modelleri bağlamında kullanılmamıştır.

Daha önce yayınlanmış bir yöntem39 kullanılarak, YYBÜ'deki entübe yenidoğanlardan elde edilen neonatal trakeal aspirat örneklerini kullandık ve primer neonatal trakeal hava yolu epitel hücrelerini (nTAEC'ler) başarılı bir şekilde izole ettik ve genişlettik. Daha önce tarif edildiği gibi bu hücrelerde genleşme kapasitesini artırmak ve yaşlanmayı geciktirmek için Rho, Smad, Glikojen sentaz kinaz (GSK3) inhibitörleri ve memeli rapamisin hedefi (mTOR) sinyalini kullandık39,42, bu da nTAEC'lerin verimli ve daha sonra geçmesine izin verir. Protokol, nTAEC'leri kullanarak 3D ALI kültürleri oluşturma ve nTAEC tek katmanlarında hiperoksi maruziyeti gerçekleştirme yöntemlerini açıklar. Rho ve Smad inhibisyonu, ALI kültürünün ilk 7 günü (ALI günleri 0 ila 7) için kullanılır, daha sonra bu inhibitörler, ALI kültürü süresinin geri kalanı için farklılaşma ortamından çıkarılır. ALI kültürlü hava yolu epitel hücresi tek tabakasının apikal yüzeyi, atmosferik pertürbasyon çalışmalarına olanak tanıyan ve in vivo hiperoksidiye maruz kalan gelişmekte olan bir yenidoğan hava yolunun patobiyolojisine çok benzeyen çevreye43 maruz kalır. Yenidoğan hiperoksik akciğer hasarının önceki hücre kültürü çalışmalarında (ölümsüzleştirilmiş veya birincil hücrelerden bağımsız olarak) kullanılan O2 konsantrasyonu, maruz kalma süresi (15 dakika ila 10 gün arasında değişen) gibi önemli ölçüde değişir (%40 ila %95 arasında değişir)36,44,45,46,47. Bu çalışma için, ALI hücre tek tabakası, ALI 7. günden 14. güne kadar 7 gün boyunca% 60O2'ye maruz bırakıldı (Rho / Smad inhibitörlerinin farklılaşma ortamından çıkarılmasından sonra). Hiperoksi maruziyeti, tamamen farklılaşmış olgun epitelin aksine, mukosiliyer farklılaşmanın erken-orta fazında (ALI 7 ila 14. gün) gerçekleştirildi ve bu nedenle preterm bebeklerde in vivo gelişen hava yolu epitelini simüle etti. Bu maruz kalma stratejisi, akut O2 toksisitesi riskini (daha yüksek O2 konsantrasyonları ile beklenirken) en aza indirirken, fizyolojik olarak ilgili bir aralıkta oksidatif stres uygular ve nispeten hipoksik intrauterin ortamdan hiperoksik bir dış ortama geçişin kritik penceresini andırır.

Protokol

Neonatal trakeal aspirat örnekleri sadece ebeveynlerden bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra toplandı ve toplama, taşıma ve saklama için kullanılan protokol Oklahoma Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylandı (IRB 14377).

1. nTAEC'in izolasyonu, geçişi ve ALI kültürü için hazırlık

  1. Medya hazırlığı
    1. İnhibitörler (BLEAM-I) ile bronşiyal epitelyal hava yolu ortamı (BLEAM): 1.25 mL HLL takviyesi (500 μg/mL insan serum albümini, 0.6 μM Linoleik asit, 0.6 μg/mL Lesitin), 15 mL L-Glutamin (6 mM), 2 mL Ekstrakt P (% 0.4, sığır hipofiz ekstresi), 5 mL TM1 (1 μM Epinefrin) ekleyerek 500 mL (1 şişe, 4 ° C'de saklanır) BLEAM hazırlayın. 5 μg/mL Transferrin, 10 nM Triiyodotironin, 0.1 μg/mL Hidrokortizon, 5 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF), 5 ng/mL insülin), 1 mL antibiyotik solüsyonu (Normosin, 0.1 mg/mL). Birincil hücrelerin yaşlanmasını önlemek ve genişleme verimliliğini artırmak için, daha önce tarif edildiği gibi aşağıdaki büyüme faktörü inhibitörlerini ekleyin39: Y-27632 (Rho ile ilişkili protein kinaz veya ROCK inhibitörü) 5 μM nihai konsantrasyona sahip, A83-01 (Smad sinyalini inhibe eder) 1 μM nihai konsantrasyona sahip, CHIR 99021 (Glikojen sentaz kinaz-3 veya GSK3 inhibitörü) 0.4 μM nihai konsantrasyona sahip ve Rapamisin (rapamisin veya mTOR'un moleküler hedefinin inhibitörü) 5 nm konsantrasyon. Ortamı 0,22 μm gözenek boyutunda bir filtreden geçirin. Ortam bileşenlerinin listesi için Tablo 1'e bakın.
    2. İnsan bronşiyal / trakeal epitel hücresi (HBTEC) ALI ortamı: Şişeyi 37 ° C'de çözdürerek ve 1 mL antibiyotik çözeltisi (Normosin, 0.1 mg / mL) ekleyerek 500 mL HBTEC ortamı yapın. Eklendikten sonra, ortamı 0,22 μm gözenek boyutunda bir filtreden geçirin.
    3. İnhibitörlü HBTEC ortamı (HBTEC-I): HBTEC ortamını yukarıdaki gibi hazırlayın. Filtrelemeden önce, aşağıdaki inhibitörleri ekleyin: 5 μM nihai konsantrasyona sahip Y-27632 ve 0.5 μM nihai konsantrasyona sahip A83-01. Ortamı 0,22 μm gözenek boyutunda bir filtreden süzün.
      NOT: BLEAM-I, HBTEC ve HBTEC-I ortamlarını 4 °C'de, tarihli ve etiketli, karanlıkta (folyoya sarılı) saklayın ve yalnızca ihtiyaç duyulanların kısımlarını ısıtın (raf ömrü 30 gündür).
    4. HEPES / FBS: 500 mL HEPES tamponlu salin ve 88 mL FBS ekleyin (nihai konsantrasyon% 15'tir). Eklendikten sonra, çözeltiyi 0,22 μm gözenek boyutunda bir filtreden süzün ve 4 °C'de, tarihli ve etiketli olarak saklayın.
      NOT: Kullanmadan önce BLEAM, HEPES-FBS ve Tripsin-EDTA'yı 37 ° C'ye (en az 30 dakika) ısıtın ve ısıtın.
  2. Kültür şişelerinin ve ALI hücre kültürü eklerinin 804G şartlandırılmış bir ortamla kaplanması
    1. 804G hücresi (sıçan mesanesi epitel hücre hattı) matris şartlandırılmış ortamı daha önce tarif edildiği gibi hazırlayın39.
    2. Hücre kültürü şişesini ve hücre kültürü eklerini 37 °C inkübatörde en az 4 saat boyunca %5 CO2 olmak üzere 804G şartlandırılmış ortamla kaplayın. Farklı kültür şişelerini ve hücre kültürü eklerini kaplamak için gereken ortam miktarları için Tablo 2'ye bakın.

2. nTAEC'lerin izolasyonu ve genişletilmesi ve sonraki ALI kültürü için hazırlık

  1. Entübe yenidoğanların endotrakeal tüpünün rutin emilmesi sırasında taze trakeal aspirat (yaklaşık 1 mL) alın ve aspiratı bir mukus tuzağında toplayın. Aspirat hacmi mukus tuzağına ulaşmak için yetersizse, aspirasyon kateterini 1-3 mL steril tuzlu su ile durulayın.
  2. Numuneyi etiketleyin ve buz üzerinde biyolojik tehlike torbasında saklayın.
    NOT: Numuneler buz üzerinde 4 °C'de en fazla 24 saat saklanabilir. Bununla birlikte, taze numunelerde verim daha yüksektir.
  3. Numuneyi YYBÜ'den laboratuvara taşıyın. Bir T25 şişesini 804G şartlandırılmış ortamla kaplayın ve trakeal aspiratın laboratuvara taşınması sırasında numunenin aşılanması için hazırlanın.
  4. Mukus tuzağını biyolojik tehlike torbasından çıkarın ve herhangi bir kontaminasyonu önlemek için dış yüzeyleri %70 etanol ile iyice temizleyin. Steril bir hücre kültürü başlığının altındaki mukus tuzağının kapağını dikkatlice açın.
  5. Trakeal aspirat örneğini steril PBS ile 5 mL'ye seyreltin (mukusu seyreltmek için) ve tüm içeriği 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
  6. Tüpü 250 x g, 20 °C-23 °C'de 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı (mukus dahil) atın.
    NOT: Buradaki tüm santrifüjlemeler, aksi belirtilmedikçe 250 x g, 20 °C-23 °C'de 5 dakika süreyle yapılır.
  7. Peleti 5 mL BLEAM-I içinde tekrar süspanse edin.
  8. T25 şişesini inkübatörden çıkarın ve numuneyi kaplamadan önce 804G şartlandırılmış ortamı atın.
  9. Numuneyi T25 şişesine yerleştirin ve 37 °C, %5CO2'de inkübatöre yerleştirin (bu, Geçiş 0 veya P0 olarak adlandırılacaktır).
  10. Bağlanmamış hücreleri yıkamak için kaplamadan 24 saat sonra ve ardından her 48 saatte bir ortamı BLEAM-I ile değiştirin.
    NOT: Trakeal aspirat örneği işlendikten ve BLEAM-I ortamında inkübe edildikten sonra, küboidal şekilli hücreler kaplamadan 7-10 gün sonra ortaya çıkar. Kaplamadan yaklaşık 3 hafta sonra, hücreler yoğun bir şekilde paketlenir ve sonraki geçiş, genişleme ve depolama için tripsinizasyon gerektirir. Erken geçiş (P1 - P2) hücreleri kriyotüplere yerleştirilir (kriyotüp başına 500 μL dondurma ortamı başına 2,5 x10 6 hücre) ve uzun süreli depolama için sıvı nitrojen içinde saklanır.
  11. Donmuş hücreleri 37 °C'lik bir su banyosunda sıvı nitrojenden hızla çözün ve hücre süspansiyonunu BLEAM-I içeren uygun boyutta steril bir tüpe aktarın.
  12. Daha önce48 tarif edildiği gibi bir tripan mavisi lekesi ve otomatik veya manuel hücre sayacı kullanarak toplam ve canlı hücre sayısını belirlemek için hücreleri sayın. Hücre süspansiyonunu uygun bir hacimde BLEAM-I ile seyreltin, böylece nihai konsantrasyon 15 mL hücre süspansiyonunda (T75 şişesi için) 2.1 x10 6 hücredir.
    NOT: Bir T25 şişesi için, tohumlama için genellikle 5 mL hücre süspansiyonunda 0,7 x10 6 hücre kullanılır.
  13. 15 mL hücre süspansiyonunu bir T75 şişesine aktarın ve gece boyunca 37 °C,% 5 CO2'de inkübe edin.
  14. Ertesi sabah, medyayı yeni BLEAM-I ile değiştirin. Ardından, medyayı her 2 günde bir yeni bir BLEAM-I ile değiştirin. Hücreler %80-90 civarında olduğunda, ALI kültürü için tripsinizlenmeye hazırdırlar.
  15. Hücre tek tabakasına 5 mL tripsin-EDTA (T75) uygulayın.
    NOT: Taze tripsin kullanmayı unutmayın. Birden çok kez ısıtılmış tripsin kullanmaktan kaçının.
  16. Şişeyi 37 °C'de inkübatörde 5 dakika inkübe edin. Ardından, hücreleri çıkarmak için şişenin 8x-10x tarafına hafifçe vurun. Tripsinizasyondan sonra hücrelerin yerinden çıktığını doğrulamak için mikroskop altında kontrol edin. Hücrelerin% >50'si şişede kalırsa, PBS 2x ile yıkayın ve tripsinizasyon adımını 2-3 dakikalık azaltılmış bir inkübasyon süresi ile tekrarlayın.
  17. 15 mL HEPES-FBS ile reaksiyonu durdurun ve 4x-5x yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücreleri uygun boyutta bir steril tüpe aktarın ve hücreleri peletlemek için 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleyin.
  18. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanı dikkatlice aspire edin. Hücre peletini 1 mL BLEAM-I'de 5x-10x yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek çözün.
  19. Toplam ve canlı hücre sayısını belirlemek için hücreleri sayın. Hücre süspansiyonunu uygun bir hacimde BLEAM-I ile seyreltin, böylece nihai konsantrasyon 100 μl hücre süspansiyonu başına 1 x10 5 canlı hücre olur.

3. nTAEC'lerin ALI kültürü

NOT: Hücre kültürü ekleri, 804G şartlandırılmış ortam ile kaplanmalı ve bir sonraki adımdan önce 37 °C'de en az 4 saat, %5 CO2 inkübe edilmelidir (bkz. adım 1.2).

  1. Hücre kültürü eklerini içeren 24 oyuklu hücre kültürü plakalarını inkübatörden çıkarın ve 804G ile koşullandırılmış ortamı atın.
  2. Her ALI kuyucuğunun bazolateral (alt) odasına 1 mL BLEAM-I ekleyin. ALI hücre kültürü eklerinin apikal odasına 100 μL hücre süspansiyonu (1 x 105 hücre) ekleyin ve hücreleri 37 ° C,% 5 CO2'de inkübe edin. Bu aşama ALI günü -2 olarak tanımlanır.
  3. Ertesi gün, bazolateral (1 mL) ve apikal (100 μL) odacıklardaki ortamı taze BLEAM-I ile değiştirin. Apikal odadaki ortamı değiştirirken, hücre tek tabakasını rahatsız etmemeye dikkat edin. Bu aşama ALI günü -1 olarak tanımlanır.
  4. Ertesi gün, ortamı hem bazolateral hem de apikal odalardan çıkarın.
    NOT: Hücre kültürü zarındaki hücrelerin su altında birleştiği koşullar altında birleştiği 2 gün sürer. Bu aşamada ALI kurulabilir.
  5. Bazolateral odaya 1 mL HBTEC-I ortamı ekleyin, ancak apikal oda ortamını serbest bırakın ve havaya maruz bırakın. Bu aşama ALI günü 0 olarak tanımlanır.
  6. ALI günü 0'dan 6'ya kadar her 48 saatte bir bazolateral odadaki HBTEC-I ortamını (1 mL) değiştirmeye devam edin. İstenilen hasat zaman noktasına kadar ALI 7. günde normal HBTEC ortamına (inhibitörler olmadan) geçin.
    NOT: ALI kültürünün ilk 7 günü boyunca, bazolateral odadan gelen ortam apikal odaya sızabilir. Hücre tabakasının sağlığını korumak ve farklılaşmalarına izin vermek için bu ortamın her gün dikkatli bir şekilde aspire edilmesi gerekir.
  7. Moleküler teknikler, tahliller ve analiz için hücreleri, hücre kültürü eklerini ve bazolateral ortamları farklı zaman noktalarında hasat edin.
    1. Bu protokol için, ALI 0, 7 ve 28. günlerde, epitelyal farklılaşma belirteçlerinin qPCR gen ekspresyon analizi (standart üretici protokolü) için hücreleri hasat edin. ALI 0, 7, 14 ve 28. günlerde, bariyer fonksiyonunu test etmek için hücre kültürü eklerini hasat edin (aşağıda açıklanan yöntemler).
    2. ALI 0 ve 28. günlerde, epitelyal farklılaşma belirteçleri ile immünofloresan boyama için formalinle sabitlenmiş hücre kültürü ekleri kullanın (önceden yayınlanmış protokolü kullanarak)49. ALI 14. günde, laktat dehidrojenaz (LDH) salınımı (standart üretici protokolü), oksidatif stres belirteçlerinin qPCR'si için hücre lizatları ve kaspaz-3 ve bölünmüş kaspaz-3 antikorları (standart üretici protokolü) ile immünoblot ve oksidatif stres testi için hücre kültürü ekleri (aşağıda açıklanan yöntem) hasat edin.

4. ALI farklılaşması sırasında bariyer fonksiyonunun test edilmesi

  1. Trans-Epitelyal Elektrik Direncinin (TEER) Ölçülmesi
    NOT: Hücre katmanı bütünlüğünü değerlendirmek için ALI farklılaşması sırasında Epitelyal Volt/Ohm Metre (EVOM) kullanarak TEER'i ölçün50.
    1. Test filtresi direnç değerlerini ölçmeden önce, Ohm (Ω) cinsinden arka plan direnci değerini ölçmek için 804G ile koşullandırılmış ortam kaplı bir hücre kültürü (herhangi bir hücre içermeyen) kullanın
    2. Arka plan direnç değerini test filtresi direnç değerlerinden çıkarın ve her test filtresi için TEER değerini elde etmek için farkı hücre büyüme yüzey alanı ile çarpın.
      TEER = (ΩT - ΩB) X C
      TEER = Trans Epitelyal Elektrik Direnci (Ω.cm2)
      ΩT = Test filtresi direnç değeri (Ω)
      ΩB = Arka plan direnç değeri (Ω)
      C = Hücre büyümesi yüzey alanı (cm2)
      NOT: TEER ölçümleri için kullanılan hücre kültürü ekleri daha sonra %10 tamponlu formalin ile sabitlenir ve hemen immünofloresan boyama ve floresan mikroskobu (aşağıda açıklanan yöntem) için kullanılır veya daha sonra boyama için 4 °C'de saklanır.
  2. Floresein Isethionate Dextran (FITC-dekstran) epitel geçirgenlik testi
    NOT: Epitelyal geçirgenlik testi, ALI farklılaşması sırasında iki farklı moleküler ağırlık FITC-dekstran (10 kD ve 20 kD) kullanılarak gerçekleştirildi.
    1. FITC-dekstran çalışma solüsyonu (1 mg / mL) hazırlayın: 5 mg FITC ölçün ve 1 mL DMSO (5 mg / mL) ile karıştırın. 37 °C'ye ısıtılmış ve 1 mg/mL konsantrasyona ısıtılmış HBTEC ortamındaki 5 mg/mL stoğu yeniden süspanse edin. Çözeltiyi ışıktan koruyun.
    2. Test filtrelerini (hücreler içeren) yeni bir 12 oyuklu plakaya aktarın ve bazolateral bölmeye 1 mL HBTEC ortamı ekleyin.
    3. Apikal bölme ortamını (varsa) aspire edin ve 250 μL FITC-dekstran çalışma solüsyonu ile değiştirin. 60 dakika boyunca ışıktan korunarak oda sıcaklığında inkübe edin.
    4. 12 oyuklu plakadan test filtrelerini (FITC-dextran çalışma solüsyonu içeren) çıkararak FITC-dekstran testini sonlandırın.
    5. Bazolateral ortamı 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerinde ve girdapta 12 oyuklu plakadan toplayın.
    6. Her tüpten 100 μL'lik alikotları üçlü kopyalar halinde 96 oyuklu şeffaf tabanlı siyah polistiren mikroplakaya aktarın. Arka plan floresansını ölçmek için negatif kontrol olarak 100 μL HBTEC ortamını 96 oyuklu plakadaki ek kuyucuklara aktarın.
    7. 490 nm uyarma ve maksimum 520 nm emisyon kullanan bir spektrofotometre kullanarak floresan yoğunluğunu ölçün.
    8. Düzeltilmiş floresan elde etmek için test filtresi floresan değerlerinden ortalama arka plan floresan değerini çıkarın ve değerleri, FITC 0 kD ve 10 kD için ALI 20 günündeki düzeltilmiş floresan değerlerine karşı yüzde olarak ifade edin.

5. TriGas inkübatörü kullanılarak hiperoksi maruziyeti

  1. ALI 7. günde, deneysel ve hasat ihtiyaçlarına göre hiperoksiye konulacak hücre kültürü eklerinin sayısını belirleyin.
  2. TriGas inkübatördeki O2 seviyesini %60 O2'ye ayarlayın. O2 seviyesinin %60'a ulaşması genellikle ~ 30-45 dakika sürer.
  3. O2 seviyesi %60'ta stabilize olduğunda, 24 oyuklu hücre kültürü plakasını hiperoksi grubuna atanan hücre kültürü ekleri ile birlikte inkübatörün içine yerleştirin ve inkübatör kapısını kapatın.
    NOT: İnkübatörün içindeki O2 seviyesinde önemli bir düşüşü önlemek için bu adımın mümkün olduğunca verimli bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.
  4. Hiperoksiye maruz kalan hücre kültürü eklerindeki ortamı, kontrol (%21O2'ye maruz kalan) kuyucuklarıyla aynı programı izleyerek değiştirin. Hücre kültürü eklerinde ortam sızıntısı olup olmadığını her gün kontrol edin ve hücre kültürü odasına herhangi bir sızıntı olup olmadığını nazikçe aspire edin.
  5. 7 gün boyunca hiperoksi maruziyetine devam edin (ALI günleri 7 ila 14). Hiperoksi maruziyeti tamamlandıktan sonra, ALI 14. günde hücreleri hasat edin veya hücre kültürü eklerini kullanarak tahliller yapın.

6. Hiperoksinin etkilerini değerlendirmek için oksidatif stres deneyi

NOT: CM-H2DCFDA test kitini kullandık veO2 maruziyetini takiben hücre kültürü eklerinde oksidatif stresin bir belirteci olarak ALI 14. günde floresan yoğunluğunu ölçtük. H2DCFDA, reaktif oksijen türlerinin (ROS) canlı hücre başına kullanılan bir göstergesi olan 2 ", 7" -diklorofloreseinin (DCF) kimyasal olarak indirgenmiş ve asetillenmiş bir formudur. CM-H2DCFDA, H2DCFDA'nın tiyol-reaktif klorometil türevidir, bu da hücre içi bileşenlere daha fazla kovalent bağlanmayı teşvik eder ve boyanın hücre içinde daha uzun süre tutulmasını sağlar. Bu moleküller, asetat grupları hücre içi esterazların etkisiyle uzaklaştırılana vehücre 51'de oksidasyon meydana gelene kadar floresan değildir. Hücre içi oksidasyonu takiben, floresansta ortaya çıkan artış, hücresel oksidatif stresin52 vekil bir ölçüsü olarak bir floresan mikroskobu ile ölçülebilir. Reaktif hafif ve havaya duyarlıdır ve bu nedenle ışıktan korunması ve mümkün olduğunca hava geçirmez tutulması gerekir.

  1. CM-H2DCFDA tahlil çözeltisinin hazırlanması: Her flakon, toz halinde 50 μg reaktif boyası içerir. 1 mM'lik bir stok çözeltisi yapmak için, şişeye 80 μL steril DMSO ekleyin, bir pipetle iyice karıştırın ve hafifçe girdaplayın. Hücre kültürü eklerindeki boyanın 1 μM nihai konsantrasyonu için, 100 μL PBS başına 0,1 μL 1 mM stok ekleyin (örneğin, 6 hücre kültürü eki için 600 μL PBS'ye 0,6 μL stok çözeltisi ekleyin).
    NOT: Boyanın nihai konsantrasyonu 1-5 μM arasında değişebilir. Dozun her kültür koşulu için optimize edilmesi gerekir.
  2. Hem hiperoksiye maruz kalan hem de normoksiye maruz kalan grup için her hücre kültürüne 1 μM boya çözeltisinden 100 μL ekleyin. Her tedavi grubundan negatif kontrol olarak en az 1 hücre kültürü kullanın (boyasız 100 μL PBS). 37 °C'de 30 dakika inkübe edin, ışıktan koruyun. 1x'i PBS ile yıkayın.
  3. Slayt hazırlığı: Fazla PBS'yi boşaltın. Hücre kültürü eklerini dikkatlice tutun ve hücre kültürü zarını yavaşça kesmek için bir bıçak kullanın. Slaytın üzerine 1-2 damla montaj sıvısı dökün. Düz uçlu forsepslerle, zarın köşesini dikkatlice tutun, hücre tarafı aşağı bakacak şekilde montaj parçasına yerleştirin ve bir kapak kaymasıyla. Fazla montaj sıvısını çıkarın ve ışıktan korunan oda sıcaklığında 15 dakika kurumaya bırakın. Slaytlar artık görüntülenmeye hazırdır.
    NOT: Floresan yoğunluğu 2-3 saat içinde önemli ölçüde azaldığından, slayt ve floresan mikroskobunun hazırlanması mümkün olduğunca hızlı yapılmalıdır.
  4. Floresan mikroskobu: Cy2 (siyanin-2) kanalını kullanan bir floresan mikroskobu kullanarak görüntü yakalayın. Hücre kültürü başına üç ayrı, örtüşmeyen alandan görüntüler yakalayın.
  5. Oksidatif stresin floresan tespiti
    NOT: ImageJ yazılımını (https://imagej.nih.gov/ij/) ve aşağıda açıklanan iş akışını kullanarak düzeltilmiş toplam hücre floresansını (CTCF) ölçmek için floresan mikroskobundan alınan görüntüleri kullanın. CTCF, hiperoksi maruziyetini takiben hücre kültürü eklerinde oksidatif stres için bir belirteç görevi görür ve ImageJ yazılımının yardımıyla arka plan floresansının ortadan kaldırılmasıyla ölçülür.
    1. Mikroskopi görüntüsünü ImageJ'de açın ve dikdörtgen aracını kullanarak ilgilendiğiniz alanı seçin. Sağ tıklayarak seçim alanını (α) kaydedin ve ROI (ilgilenilen bölge) yöneticisine ekle'yi seçin. Görüntülerde bu seçim alanını kullanın.
    2. Analiz Et > Ölçümleri Ayarla altında ölçüm parametrelerini seçin ve ayarlar sekmesinde Alan, Entegre Yoğunluk ve Ortalama Gri Değer'i seçin.
    3. Her görüntü için ROI yöneticisinden aynı seçim alanını kullanın ve Analiz Et > Ölç'ü seçin. Entegre yoğunluk değeri, seçilen alanın toplam floresansını (Ft) temsil eder. Açılır pencereden ölçüm değerlerini not edin.
    4. Her görüntüdeki arka plan floresansını (Fb) düzeltmek için, dikdörtgen aracını kullanarak floresan olmayan küçük bir alan seçin. Bu bölge için Analiz Et > Ölç'ü seçin. Ortalama yoğunluk değeri Fb'yi temsil eder. Açılır pencereden ölçüm değerlerini not edin.
    5. Arka plan okumalarının ortalama floresan yoğunluğunu ROI'nin toplam alanıyla çarparak ve bu sayıyı ROI'nin entegre yoğunluk değerinden çıkararak CTCF'yi hesaplayın. Her iki tedavi grubu (Kontrol ve Hyperoxia) için tüm görüntüler için bu iş akışını tekrarlayın.
      CTCF = Ft - (Fb x α)
      CTCF = Düzeltilmiş toplam hücre floresansı (AU)
      Ft = Toplam floresan
      Fb = Arka plan floresansı
      α = Seçim alanı

Sonuçlar

nTAEC'leri izole etmek için, YYBÜ'deki entübe yenidoğanlardan trakeal aspiratlar topladık ve aspiratları daha sonraki işlemler için buz üzerinde laboratuvara taşıdık (Şekil 1A). Trakeal aspirat örnekleri hava yolu epitelyal büyüme ortamında (Rho / Smad, GSK3 ve mTOR inhibitörleri içeren BLEAM-I) tohumlandıktan sonra, küboidal hücreler 7-10 gün içinde ortaya çıktı. 14 gün sonra, hücreler% 50 -% 60 birleşikti ve kaplamadan yaklaşık 21 gün sonra, hücreler yoğun bir şekilde paketlendi ve sonraki geçiş ve genişleme için tripsinasyon gerektirdi. Bu hücrelerin seri geçişleri (P3'e kadar) uzun süreli depolama için sıvı nitrojen içinde dondurularak saklandı. Hücreler (≤ geçiş 3) daha sonra ALI kültürü için çözüldü.

nTAEC'ler, batık koşullarda bir T75 plakasında yaklaşık% 80 -% 90 birleşmeye ulaştıklarında ALI'de kültürlendi. ALI 0. günde bazal hücreye özgü belirteçler olan sitokeratin-5 (KRT5)53 ve tümör proteini p63 (TP63)54 (Şekil 1B) ile nTAEC tek tabakasının immünofloresan boyamasını gerçekleştirdik. ALI 0. günde, neredeyse tüm hücreler KRT5 ve TP63 pozitiftir, bu da minimal farklılaşma ile hava yolu bazal hücre fenotipini düşündürür. ALI kurulduktan sonra, TEER, EVOM (Şekil 1C) kullanılarak ölçüldü ve nTAEC'ler olgun bir polarize hücre tek tabakası oluşturmaya başladığında, ALI kültürünün erken fazında (ALI gün 0 ila 7) hızla arttı ve ardından ALI 7. gün ile 28. gün arasında TEER'in platosu oldu (Şekil 1D). Ayrıca, ALI farklılaşması sırasında paraselüler geçirgenliği değerlendirmek için iki moleküler ağırlıkta (10 kD ve 20 kD) FITC-dekstran kullanıldı ve zaman içinde genel olarak kademeli bir floresan azalması gösterdi (Şekil 1E). Bu, ALI farklılaşması sırasında olgun bir hücre tek tabakasının oluşumu ile ilişkilidir ve çözünen maddelere karşı geçirgenliğin azalması ile ilişkilidir. 

ALI kültürü sırasında, bazal hücreler, kirpikli hücreleri, mukus salgılamayan kulüp hücrelerini ve mukus salgılayan goblet hücrelerini içeren olgun epitel soylarına farklılaşır39. ALI 0. günde olgun epitel hücresine özgü belirteçlerin gen ekspresyonu analizi, çatal başlı kutu proteini J155 (FOXJ1, siliyer hücre belirteci), uteroglobin56 (SCGB1A1, kulüp hücre belirteci) ve müsin-5AC57 (MUC5AC, goblet hücre belirteci; Şekil 2A), müteakip artışla (ALI gün 7 ve 28), ALI kültürü sırasında bu olgun hava yolu epitel alt tiplerine farklılaşmayı düşündürmektedir. Ek olarak, olgun epitel hücresine özgü belirteçler ve asetillenmiş tübülin58 (TUBA4A) pozitif siliyer hücreler (~% 22), SCGB1A1 pozitif kulüp hücreleri (~% 13) ve MUC5AC pozitif goblet hücrelerinden (~% 3) oluşan nicel epitel farklılaşması kullanılarak ALI 28. günde immünofloresan boyama gerçekleştirdik, geri kalanı KRT5 pozitif bazal hücreler (~% 51) ve diğer nadir hücre tipleri (Şekil 2B).

Rho ve Smad inhibitörleri, ALI kültürünün ilk 7 günü boyunca (ALI günleri 0 ila 7) kullanıldı ve daha sonra ALI kültürü süresinin geri kalanı boyunca farklılaşma ortamından çıkarıldı (Şekil 3A). ALI kültürü sırasında hücre tek tabakasının apikal yüzeyi havaya maruz bırakılır ve atmosferik pertürbasyon çalışmalarına olanak tanır. Hücre tek tabakasının hiperoksi maruziyeti, TriGas İnkübatörü kullanılarak ALI 7. günden 14. güne kadar 7 gün boyunca sürekli olarak `O2 ile gerçekleştirildi. Kontrol grubu, oda havasına (! O2) maruz kalan ayrı bir inkübatörde tutuldu. O2 maruziyetinin hava yolu epitel gelişimi ve rejenerasyonu üzerindeki uzun süreli sonuçlarını (O2 maruziyetinin tamamlanmasını takiben 1-2 hafta) incelemek için gelecekteki niyet göz önüne alındığında, O2 maruziyetinin akut olarak ciddi sitotoksisite veya ALI hücre tek tabakasını önemli ölçüde bozacak ölçüde membran hasarı ile sonuçlanmaması esastı. Hücre zarı hasarını değerlendirmek için, ALI 14. günde bazolateral ortamda LDH salınımını ölçtük, bu da hiperoksi ve oda havası ile muamele edilmiş kültürler arasında anlamlı bir fark göstermedi (Şekil 3B). O2'den kaynaklanan sitotoksik etkilerin nTAEC'lerde apoptozu indükleyecek kadar önemli olup olmadığını daha fazla değerlendirmek için, ALI 14. günde hiperoksi ve oda havasına maruz kalan gruplardan hasat edilen hücre lizatları üzerinde toplam kaspaz-3 ve parçalanmış kaspaz-359 için immünoblot gerçekleştirdik (Şekil 3C). Toplam kaspaz-3 ekspresyonu iki grup arasında karşılaştırılabilirdi ve bölünmüş kaspaz-3 ekspresyonu tespit edilmedi, bu da 7 günlük `O2 maruziyetinin ALI 14. günde nTAEC'lerde apoptozu indüklemediğini düşündürdü. Ek olarak, artan staurosporin konsantrasyonları (0.5 μM, 1 μM ve 2 μM), bir sitotoksik ajan ve bir apoptoz indükleyicisi ile batık koşullar altında nTAEC'lerin gece boyunca inkübasyonu ile pozitif bir kontrol tasarlanmıştır. Total kaspaz-3 ve bölünmüş kaspaz-3 ekspresyonu için immünoblotlama, apoptozun başarılı indüksiyonunu doğruladı. % 60O2 maruziyetinin neden olduğu oksidatif stresi ölçmek için, ALI 14 üzerindeki nTAEC hücre tek tabakaları üzerinde floresan yoğunluk ölçümü ile bir hücresel oksidatif stres testi yapıldı (Şekil 3D). Hiperoksiya maruz kalma, oda havasına maruz kalan hücrelere kıyasla floresan yoğunluğunda (düzeltilmiş toplam hücre floresansı veya CTCF ile hesaplanan) önemli bir artışa neden oldu ve bu da hücresel oksidatif stresin arttığını düşündürdü. Antioksidan genlerin gen ekspresyonu analizi,% 60O2'nin ALI 14. günde bu antioksidan genlerin yukarı regülasyonuna neden olduğunu, katalaz, SOD1, SOD2 ve GPX3'ün önemli ölçüde yukarı regüle edildiğini gösterdi (Şekil 3E).

figure-results-1
Şekil 1: Neonatal trakeal hava yolu epitel hücreleri (nTAEC'ler) neonatal trakeal aspiratlardan başarılı bir şekilde izole edildi ve hava-sıvı arayüzünde (ALI) kültürlendi. (A) Entübe yenidoğanlardan trakeal aspirasyon kullanılarak izole edilen nTAEC'ler, müteakip ALI kültürü ile batık durumda pasaja tabi tutuldu. (B) Hücreler, hava yolu bazal hücre belirteçleri - KRT5 (kırmızı) ve TP63 (kırmızı) ile immünofloresan boyama için ALI 0. günde hasat edildi. Çekirdekler DAPI ile maviye boyanır. Ölçek çubuğu = 50 μm. (C) Bir Epitelyal Volt/Ohm Ölçer (EVOM) kullanılarak hücre kültürü eklerinde trans-epitelyal elektrik direncinin (TEER) ölçümü. (D) TEER, ALI farklılaşması sırasında ölçüldü. Veriler ortalama olarak sunulmuştur (n = 2 donör, zaman noktası başına donör başına 5-10 kuyu). (E) Floresein izotiyosiyanat-dekstran (FITC-dekstran) trans-epitelyal geçirgenlik testi, iki farklı FITC-dekstran moleküler ağırlığı (10 kD ve 20 kD) kullanılarak ALI farklılaşması sırasında gerçekleştirildi. FITC-dekstran çözeltisi (10 kD veya 20 kD) apikal odaya ilave edildi ve hücre kültürü ekleri oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edildi. Bazolateral oda ortamındaki floresan, 96 oyuklu plakalarda spektrofotometrik olarak ölçüldü. Düzeltilmiş bir floresan değeri elde etmek için arka plan floresansı (HBTEC ortamı) test ölçümlerinden çıkarıldı (0. gün değerlerine kıyasla yüzde olarak ifade edilir). Veriler ortalama olarak sunuldu (n = 2 donör, FITC-dekstranın her moleküler ağırlığı için zaman noktası başına donör başına üç kuyu). Hata çubukları SEM'i gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Neonatal trakeal hava yolu epitel hücreleri (nTAEC'ler), hava-sıvı arayüz (ALI) kültürü sırasında mukosiliyer farklılaşmaya uğrar. (A) Hücreler, epitel hücresine özgü belirteçlerin qPCR analizi için ALI 0, 7 ve 28. ALI günlerinde toplandı: bazal için sitokeratin-5 (KRT5), kirpikler için çatal başlı kutu proteini J1 (FOXJ1), kulüp için uteroglobin (SCGB1A1) ve goblet hücreleri için müsin-5AC (MUC5AC). Her bir genin nispi ekspresyonu, endojen kontrol olarak GAPDH ile δCt yöntemi kullanılarak belirlendi. Ortalama olarak sunulan veriler (n = 3 donörden, zaman noktası başına donör başına üç kuyu). Hata çubukları SEM'i gösterir. İstatistiksel analiz, Tukey post-hoc analizi ile iki yönlü ANOVA kullanılarak yapıldı, *p=0.0114, ***p=0.0005, ***p<0.0001. (B) Bazal (KRT5, kırmızı), siliyer (asetillenmiş tübülin veya TUBA4A, yeşil), kulüp (SCGB1A1, kırmızı) ve kadeh (MUC5AC, yeşil) hücrelerin immünofloresan boyaması, epitel farklılaşmasını ölçmek için ALI 28. günde gerçekleştirildi. Çekirdekler DAPI ile maviye boyanır. Ortalama olarak sunulan yüzde (%) pozitif hücreler için veriler (n = 2 donör, donör başına iki hücre kültürü eki, slayt başına 6-8 örtüşmeyen görüntü, slayt başına en az 3000 hücre sayılır). Hata çubukları SEM'i gösterir. Ölçek çubuğu = 50 μm.  Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Hiperoksi, neonatal trakeal hava yolu epitel hücrelerinde (nTAEC'ler) hücresel oksidatif strese neden olur, ancak önemli hücre zarı hasarına veya apoptoza neden olmaz. (A) Trigas inkübatörü kullanılarak nTAEC'lerin hiperoksi maruziyeti için deneysel zaman çizelgesi. Oksijen maruziyeti, ALI 7. günde inhibitörler farklılaşma ortamından çıkarıldıktan sonra başladı ve 7 gün boyunca devam etti (ALI 7 ila 14. gün). (B) ALI 14. günde oda havası (kontrol) ve% 60O2'ye (hiperoksi) maruz kalan grup arasındaki hücre zarı hasarını değerlendirmek için LDH salınım testi için bazolateral ortam hasat edildi. Veriler, her grup için genel ortalamayı gösteren çizgilerle bireysel veri noktaları (düzeltilmiş absorbans) olarak sunuldu, n=3 bağışçılar sırasıyla siyah daireler, kareler ve verici başına dört kuyucuklu üçgenlerle gösterilir. İstatistiksel analiz, eşleşmemiş t-testi (p=0.6184) kullanılarak yapıldı. (C) Hücreler ALI 14. günde toplandı ve oda havası ile O2'ye maruz kalan nTAEC'ler arasındaki yanıtları karşılaştırmak için apoptoz belirteçleri (kaspaz-3 ve bölünmüş kaspaz-3) için immünoblotlama yapıldı. Test için pozitif kontrol, nTAEC'lerin gece boyunca staurosporin (Stau 0.5 μM, 1 μM ve 2 μM) veya batık kültür koşulunda araç kontrolü (Veh Ctrl) ile inkübe edilmesiyle tasarlanmıştır. Hücreler, total kaspaz-3 ve parçalanmış kaspaz-3 antikoru ile immünoblot için toplandı. Dansitometri, temizlik geni olarak α-tübülin ile yapıldı. Ortalama olarak sunulan veriler (n = 2-3 donörden, donör başına bir ila iki kuyu). Hata çubukları SEM'i gösterir. Oda havası ile `O2 grubu arasındaki toplam kaspaz-3 ekspresyonunu karşılaştırmak için eşleşmemiş bir t-testi kullanıldı, p=0.4. Veh Ctrl ve Stau'ya maruz kalan gruplar arasında total kaspaz-3 ve bölünmüş kaspaz-3 ekspresyonunu karşılaştırmak için tek yönlü ANOVA kullanıldı, *p<0.05, ***p<0.0005. (D) Hücresel oksidatif stres için CM-H2DCFDA testi, oda havasındanve O2'ye maruz kalan nTAEC'lerden hasat edilen hücre kültürü ekleri ile ALI 14. günde gerçekleştirildi. Oda havası (kontrol) ve `O2 (hiperoksi) ile maruz kalan hücre kültürü eklerinin temsili floresan mikroskobu görüntüleri gösterilmektedir. Oda havası ile ` O2'ye maruz kalan nTAEC'ler arasındaki hücresel oksidatif stresi karşılaştırmak için düzeltilmiş toplam hücre floresansı (CTCF) hesaplandı. CTCF verileri, her grup için genel ortalamayı gösteren çizgi ile bireysel veri noktaları, 2 bireysel donörden (siyah daireler ve kareler) 6-7 görüntü/grup ve donör başına iki kuyucuk olarak sunulmuştur. İstatistiksel analiz, eşleşmemiş bir t-testi, *p<0.05 kullanılarak yapıldı. Ölçek çubuğu = 50 μm. (E) Hücreler, ALI 14. günde oda havasından ve katalaz, süperoksit dismutaz 1 ve 2 (SOD1 ve SOD2), glutatyon peroksidaz 1, 2 ve 3 (GPX1, GPX2 ve GPX3) dahil olmak üzere oksidatif stres genlerinin qPCR analizi için hiperoksiye maruz kalan kuyulardan toplandı. Her bir genin kat değişim verileri, endojen kontrol olarak 18s rRNA ile δCt yöntemi kullanılarak belirlendi. Veriler ortalama olarak sunulmuştur (n = 3 donörden, donör başına iki kuyu). Hata çubukları SEM'i gösterir. İstatistiksel analiz, eşleşmemiş bir t-testi, *p<0.05, **p=0.006 kullanılarak yapıldı.  Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Medya bileşeniMiktarSon konsantrasyon
BLEAM-I
BLEAM ortamı500 mL
HLL takviyesi1,25 mL500 μg/mL insan serum albümini
0.6 μM Linoleik asit; 0.6 μg/mL Lesitin
L-Glutamin15 mL6 milyon
P'yi Çıkar2 mL% 0.4 sığır hipofiz özü
TM1 Serisi5 mL1 μM Epinefrin; 5 μg/mL Transferrin
10 nM Triiyodotironin; 0.1 μg/mL Hidrokortizon
5ng/mL Epidermal büyüme faktörü (EGF)
5 ng/mL İnsülin
Normosin1 mL0.1 mg / mL
Y-27632 SerisiLot numarasına göre değişiklik gösterebilir5 μM
A83-01 SerisiLot numarasına göre değişiklik gösterebilir1 μM
CHIR 99021Lot numarasına göre değişiklik gösterebilir0,4 μM
RapamisinLot numarasına göre değişiklik gösterebilir5 nM
HBTEC (HBTEC)
HBTEC ortamı500 mL
Normosin1 mL0.1 mg / mL
HBTEC-I (İngilizce)
HBTEC ortamı500 mL
Normosin1 mL0.1 mg / mL
Y-27632 SerisiLot numarasına göre değişiklik gösterebilir5 μM
A83-01 SerisiLot numarasına göre değişiklik gösterebilir0,5 μM

Tablo 1: İnhibitörlü bronşiyal epitelyal hava yolu ortamı (BLEAM-I), İnsan bronşiyal/trakeal epitel hücresi inhibitörlü ALI ortamı (HBTEC-I) ve HBTEC için ortam bileşenleri.

Hücre kültürü şişesi/Hücre kültürü ekleri804G hücreli ortam (mL)
T25 şişesi3 mL
T75 şişesi5 mL
24 oyuklu hücre kültürü eki (0,4 μm gözenek boyutu, 0,33 cm2 yüzey alanı)400 μL

Tablo 2: Kültür şişeleri ve hücre kültürü ekleri için gerekli olan 804G hücreden türetilmiş matris şartlandırılmış ortamın hacimleri.

Tartışma

Burada açıklanan protokol, YYBÜ'de entübe edilmiş yenidoğanlardan neonatal trakeal aspirat örneklerinin toplanması ve işlenmesi için bir yöntemi detaylandırır ve daha önce belirlenmiş yöntemler kullanılarak bu örneklerden canlı nTAEC'lerin daha sonra izolasyonu ve genişletilmesi39. Ayrıca, nTAEC'leri ALI üzerinde kültürlemek ve TEER, FITC-dekstran testi, immünofloresan boyama ve hücre tipine (yani, bazal, siliyer, kulüp ve kadeh) spesifik belirteçlerin qPCR analizi yoluyla zamanın bir fonksiyonu olarak polarize bir mukosiliyer hava yolu epiteline farklılaşmalarını karakterize etmek için bir yöntem tanımladık. Bu protokolün yeni yönü, gelişmekte olan nTAEC tek tabakalarında orta derecede hiperoksi (%60O2) maruziyeti yoluyla gerçekleştirilen atmosferik redoks pertürbasyonudur. 7 gün boyunca% 60 O2 maruziyetinin nTAEC'lerde hücresel oksidatif strese neden olduğunu gösterdik. Ayrıca, O2 maruziyet stratejisinin, bu nTAEC'lerin O2 maruziyetinin tamamlanma süresinin ötesinde ALI kültüründe korunmasına izin veren önemli hücresel apoptoz veya hücre zarı hasarını akut olarak indüklemediğini gösterdik. Bu nedenle, model potansiyel olarak O2 maruziyetinin yenidoğan hava yolu epitel programlaması üzerindeki hem kısa hem de uzun süreli etkilerini incelemek için kullanılabilir.

ALI'de nTAEC'lerin kültürlenmesi, sıkı bağlantı oluşumu ve mukosiliyer farklılaşma ile polarize bir hava yolu epitel tek tabakasının oluşumunu teşvik ettiği için geleneksel batık kültüre göre belirli avantajlar sağlar60,61. nTAEC'lerle yapılan önceki çalışmalar, ALI kültürünün erken evresinde (ALI günü 0 ila 7), hücrelerin psödo-tabakalaşmaya uğradığını (tek hücre tabakasının aksine çok katmanlı olarak görünen) ve nihayet ikinci haftanın sonunda olgun bir psödostratifiye epitel oluşturduğunu göstermiştir42,62. Sıkı bağlantı oluşumu, ALI kültürünün erken evresinde benzer bir yörüngeyi takip eder ve buna eşlik eden TEER'de hızlı bir artış ve daha sonra nTAEC'lerle modelde gösterilenplato 63 ile birlikte. Ayrıca, ALI'de kültürlenen hava yolu epitel hücreleri, CLAUDIN-1'in (sıkı bağlantı kompleksinin bir bileşeni) ekspresyonunu ve apiko-lateral lokalizasyonunu arttırır, bu da ALI kültürü sırasında sıkı bağlantıların sızdırmazlık özelliklerini arttırır ve olgun bir hücre monotabakasının oluşumunu teşvik eder63. Bu, modelde FITC-dekstran testi ile test edilen ve tek tabaka geçirgenliğinde genel olarak azalan bir eğilim gösteren azalmış paraselüler geçirgenliği ile ilişkilidir. ALI 28. günde kirpikli (TUBA4A), kulüp (SCGB1A1) ve goblet (MUC5AC) hücreye özgü belirteçler için immün boyama ile nTAEC'lerde mukosiliyer farklılaşma paterni belirledik. Ek olarak, ALI zaman seyri boyunca siliyer (FOXJ1), kulüp (SCGB1A1) ve kadeh (MUC5AC) hücreye özgü belirteçlerin gen ekspresyonunu gerçekleştirdik. Diğer gruplar, transkripsiyon faktörü FOXJ1'in motil siliogenez için gerekli olduğunu, TUBA4A'nın ise hem primer hem de motil siliogenezde mevcut olduğunu göstermiştir64,65. Bu modelde, nTAEC'lerin ALI farklılaşması sırasında FOXJ1 için gen ekspresyon paterni, önceki çalışmalardan64,66 hava yolu epitel kültüründe motil kirpiklerin ortaya çıkma zamanı ile kabaca ilişkilidir.

Teape ve ark. tarafından yakın zamanda yapılan bir çalışmada, hiperoksi maruziyetinin ALI kültürü67 üzerindeki proteomik ve metabolik etkileri değerlendirilmiştir. Bununla birlikte, hücreler yetişkin donörlerden elde edildi. Respiratuar sinsityal virüs (RSV)62,68,69,70 ve son COVID-19 pandemisi 71 ile ilgili önceki çalışmalar, hava yolu epitel yanıtı ve fonksiyonunda yaşa bağlı farklılıkların önemini vurgulamıştır. Zhao ve ark. yenidoğan ve yetişkin hava yolu epitel hücrelerini izole etmek için benzer iş akışlarını kullandılar ve 21 günlük ALI farklılaşmasından sonra, yenidoğan ve yetişkin hava yolu epitel hücreleri arasında hücresel bileşimde önemli bir fark olmadığını gösterdi62. Bununla birlikte, RSV enfeksiyonuna yanıtlarında belirgin farklılıklar vardı, yenidoğan hücreleri yetişkinlere kıyasla daha fazla RSV ile enfekte hücre ve epitel hasarı gösterdi. Genel olarak, Zhao ve ark. tarafından kullanılan kültür koşulları, nTAEC'lerde bizimkine kıyasla daha sağlam bir farklılaşma üretti, daha fazla sayıda siliyer (%41'e karşı %22) ve kadeh (%10'a karşı %3) hücre vardı. Bu farklılıklar, farklı büyüme ortamlarının kullanımına bağlanabilir. Grupları tarafından kullanılan PneumaCult-ALI ortamının (HBTEC-ALI ortamının aksine) daha fazla sayıda kirpikli ve goblet hücresi ile daha sağlam farklılaşmaya neden olduğu gösterilmiştir72. Bu modelde, kirpikli, kulüp ve goblet hücreleri için hücre tipine özgü belirteçlerin gen ekspresyonu, başlangıçta hızlı bir artış (ALI günü 0 ila 7) gösterdi ve daha sonra ALI günü 28 civarında azalma gösterdi. Olası bir neden, nTAECs42 ile yapılan önceki çalışmalarda gösterilmiş olan ALI 14. günden sonra farklılaşmanın platosu olabilir.

Akut O 2toksisitesi riskininarttığı çok yüksek O2 seviyelerinin (>% 80 O2) kullanımına kıyasla YYBÜ'deki erken doğmuş yenidoğanların gerçek yaşam deneyimlerini daha yakından simüle ettiğini düşündüğümüz 7 gün boyunca orta derecede hiperoksi (% 60 O2) maruziyetinin kullanımını tanımladık.67 1, 5. Gerçekten de, yenidoğan akciğer dokusunun% 95 O2 maruziyetinin, kaspaz aktivasyonu73 yoluyla hücresel apoptozu indüklediği gösterilmiştir. Bununla birlikte, bu maruz kalma stratejisi, O2'nin neden olduğu akut akciğer hasarının bir sonucu olarak, kronik bronşiyal patolojileri olan ciddi BPD gelişen NICU'daki bebeklerin yalnızca küçük bir yüzdesi ile ilgilidir (akut akciğer hasarı modeli)37. O2 terapisinin makul kullanımının modern çağında, çoğu prematüre bebek bu kadar yüksek O2'ye maruz kalmaz; Bununla birlikte, hala gelecekte hava yolu hastalığı geliştirme riski altındadırlar (gelişimsel pertürbasyon modeli). Bu ikinci grupta, erken yaştaki redoks pertürbasyonundan kaynaklanan yaralanma başlangıçta sessiz olabilir, ancak daha sonra yürümeye başlayan çocuk çağında veya sonrasında kronik hava yolu hastalığı37 şeklinde ortaya çıkabilir. Hücresel oksidatif stres testini kullanan verilerimiz, orta derecede hiperoksiya maruziyetinin (% 60 O2) nTAEC hücre tek tabakası içindeki oksidatif stresi önemli ölçüde artırdığını gösterdi. LDH salınımı ve hücresel kaspaz-3 aktivasyonunun analizi, hiperoksiye maruz kalma stratejimizin önemli hücre ölümüne neden olmadığını göstermiştir. Tanımladığımız yöntemler ve model sistem, eski preterm bebeklerde daha sonraki akciğer hastalığı gelişimine bir bağlantı olarak yaşamın erken dönemlerinde O2'ye duyarlı moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmak için potansiyel olarak kullanılabilir.

Fetal yaşam sırasında, hava yolu epitel hücreleri akciğer sıvısına batırılır ve nispeten hipoksik intrauterin ortamda bulunur26. Yenidoğan hava yolu epitel hücreleri hızlı bir şekilde yenilenir ve farklılaşır ve akciğer ile dış dünya arasında kritik bir bariyer oluşturur. Yenidoğanlar doğum sonrası yaşama geçerken, hava yolu epitel hücreleri nispeten hiperoksik bir doğum sonrası ortama maruz kalır. Bu geçiş, preterm ve klinik olarak hasta yenidoğanlarda daha ani hale gelir, çünkü bakımlarının bir parçası olarak rutin olarak terapötik O2'ye ihtiyaç duyarlar40,74 ve bu da onları doğumdan sonra oksidatif yaralanma riskine sokar1. Hiperoksinin doğum sonrası akciğer alveolarizasyonu üzerindeki etkileri hayvan modelleri75 kullanılarak iyi karakterize edilmiş olsa da, hiperoksi maruziyetinin gelişmekte olan hava yolu epitel hücreleri üzerindeki etkileri nispeten az çalışılmıştır38. ALI sırasında fizyolojik olarak anlamlı hiperoksi maruziyeti ile insan yenidoğan kaynaklı hava yolu epitel hücrelerinin kullanılması, modelimize translasyonel alaka düzeyi katmaktadır. Ek olarak, tamamen diferansiye olgun hava yolu epiteli67 yerine aktif farklılaşma ve hücre tek tabaka oluşumunun erken-orta fazı sırasında hiperoksi maruziyetinin kullanılması, alveolar evre7'den ziyade akciğer gelişiminin daha erken aşamalarında (kanalikülerden sakküler) doğan aşırı preterm yenidoğanlarda (gebeliğin 28. haftasından <) klinik senaryoyu potansiyel olarak simüle eder.

Modelimizin, insan gelişimi ve hastalığına uygulanırken göz önünde bulundurulması gereken sınırlamaları vardır. Daha önce nTAEC'lerin39 bir ALI modelinde yayınlanan primer neonatal hava yolu epitel hücrelerinin koşullu yeniden programlanmasını kullandık. Büyüme faktörü inhibitörlerinin (Rho/Smad/GSK3/mTOR) kullanımı bu hücrelerin daha hızlı ve daha geç geçmesini sağlar. Büyüme ortamında inhibitörler olmadan hem batık hem de ALI koşullarında nTAEC'leri kültürlemeye çalıştık; bununla birlikte, bu hücrelerin genişlemesi ve pasajı önemli ölçüde daha yavaştı ve ALI'deki hücre tek tabakası ikinci haftanın sonunda sızdırıyordu (veriler gösterilmemiştir). Primer neonatal hava yolu epitel hücrelerini kültürlemek için aynı inhibitörleri kullanan başka bir grup42 , bu inhibitörlerin varlığının oksidatif stres, epitelyal-mezenkimal geçiş veya hücresel yaşlanma ile ilgili genlerin önemli diferansiyel ekspresyonuna neden olmadığını göstermek için tek hücreli RNA dizilemesi gerçekleştirdi. Bununla birlikte, modelimizde bu sınırlılığı göz önünde bulundurduk ve Rho ve Smad inhibitörleri farklılaşma ortamından çıkarıldıktan sonra hiperoksi maruziyeti gerçekleştirmeye karar verdik. Bu çalışma için, nTAEC'ler üzerinde sadece orta derecede hiperoksi (% 60 O2) etkilerini test ettik. Bununla birlikte, gelecekteki çalışmalar, kademeli hiperoksia maruziyetini (%40, %60 ve %95 O2) kullanmayı ve nTAEC'lerdeki yanıtları karşılaştırmayı amaçlamaktadır. Burada açıklanan model, NICU'ya kabul edilen insan yenidoğanlarından alınan hücrelerin kullanımı göz önüne alındığında translasyonel çekiciliğe sahip olsa da, bu bir in vitro hücre kültürü modelidir ve bu nedenle, bu modeli kullanan önemli bulgular, tamamlayıcı bir in vivo hayvan modeli ile doğrulamayı garanti edecektir.

Sonuç olarak, YYBÜ'de entübe yenidoğanların trakeal aspiratlarından izole edilen neonatal hava yolu epitel hücrelerini kullanarak bir in vitro 3D ALI kültür modeli oluşturmak için adım adım yöntemi tanımladık. Bu modeli, YYBÜ'deki prematüre yenidoğanlarda yaygın bir çevresel hakaret olan orta derecede hiperoksi maruziyetinin etkilerini incelemek için kullandık. Hiperoksi maruziyeti, önemli hücre zarı hasarına veya hücre ölümüne neden olmadan hücre tek tabakasında hücresel oksidatif strese neden oldu ve ALI kültürününO2 maruziyetinin yenidoğan hava yolu epitel gelişimi ve fonksiyonu üzerindeki uzun süreli etkilerini incelemek için devam etmesine izin verdi. Bu yöntemleri kullanan gelecekteki uygulamalar, eski preterm bebeklerde sıklıkla görülen hiperoksi kaynaklı uzun vadeli akciğer hastalıklarının gelişiminde rol oynayan erken hastalık mekanizmalarını potansiyel olarak ortaya çıkarabilir.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi ve bildirecek çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Presbiteryen Sağlık Vakfı (PHF) ve Oklahoma Paylaşılan Klinik ve Translasyonel Kaynaklar (NIGMS'den Kurumsal Gelişim Ödülü (IDeA) ile U54GM104938) AG'ye sağlanan fonlarla desteklenmektedir. Boston, Massachusetts'teki Harvard Tıp Okulu, Massachusetts General Hospital'dan Dr. Paul LeRou ve Dr. Xingbin Ai'ye, bazı deneylerde kullanılan yenidoğan donör hücrelerini sağladıkları için teşekkür ederiz. Figürler Biorender ile oluşturuldu. İstatistiksel analizler GraphPad Prism ile yapıldı.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 10 Tamponlu FormalinFisher Scientific23-426796
1X PBS (Fosfat Tamponlu Salin) Çözeltisi, pH 7.4Gibco10010049
A 83-01Tocris29-391-0
ALI Transwell Ekleri, 6.5mmCorning3470
Anti-Asetillenmiş Tubulin antikoru, Fare monoklonalSigmaT7451
Anti-alfa Tubulin antikoruAbcamab7291
Anti-Sitokeratin 5 antikoruAbcamab53121
BronchiaLife Epitelyal Hava Yolu Ortamı (BLEAM)LifeLine Hücre TeknolojisiLL-0023
CHIR 99021Tocris44-231-0
Bölünmüş kaspaz-3 antikoruHücre sinyalizasyonu9664T
SCGB1A1 veya Kulüp Hücre Proteini (CC16) İnsan, Tavşan Poliklonal AntikoruBioVendor R& DRD181022220-01
CM-H2DCFDA (Genel Oksidatif Stres Göstergesi)Thermo ScientificC6827
Corning Hücre Kültürü ile İşlenmiş T25 ŞişeleriCorning430639
Corning U-Şekilli Hücre Kültürü T75 ŞişeleriCorning430641U
CyQUANT LDH Sitotoksisite TestiThermo ScientificC20300
DAPI Çözelti (1 mg/mL)Fisher ScientificEN62248
Dimetil sülfoksit [DMSO] Hybri-MaxSigmaD2650
Damıtılmış suGibco15230162
EVOM TEER Ölçümü için El KitabıHassas AletiEVM-MT-03-01
FBS (Fetal Sığır Serumu)Gibco10082147
Floresein İzotiyosiyanat Dekstran (ortalama mol ağırlık 10.000)Fisher ScientificF0918100MG
Floresein izotiyosiyanat & dekstran (ortalama mol ağırlık 20,00)SigmaFD20-100MG
Keçi Anti-Fare IgG(H+L), İnsan reklamları-HRPSouthern Biotech1031-05
Keçi anti-Fare IgG2b Çapraz Adsorbe Edilmiş İkincil Antikor, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21141
Keçi anti-Tavşan IgG (H + L) Yüksek Çapraz Adsorbe İkincil Antikor, Alexa Fluor 546InvitrogenA-11035
Keçi Anti-Tavşan IgG (H + L), Fare / İnsan reklamları-HRPSouthern Biotech4050-05
HBTEC Hava-Sıvı Arayüzü (ALI) Farklılaşma OrtamıYaşam Hattı Hücre TeknolojisiLM-0050
HEPESLonzaCC-5024
Heracell VIOS 160i Tri-Gaz CO2 İnkübatör, 165 LThermo Scientific51030411
Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon KitiThermo Scientific4368814
HLL takviyesiYaşam Hattı Hücre TeknolojisiLS-1001
ImageJNIHN/A
imagej.nih.gov/ij/ Invivogen Normocin - AntimikrobiyalReaktif Fisher ScientificNC9273499
L-GlutaminLifeLine Hücre TeknolojisiLS-1013
Normal Keçi Serumu Gibco
NormocinInvivogenant-nr-05
p63 antikoruSanta Cruz Biyoteknolojisc-25268
ProLong Altın Antifade MountantInvitrogenP36930
PureLink RNA Mini KitTermo Bilimsel12183025
RAPAMISINTermo BilimselAAJ62473MC
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Scientific4444964
Taqman Gen Ekspresyonu Deneyleri: 18S rRNAThermo ScientificHs99999901_s1
Taqman Gen Ekspresyonu Deneyleri: CATThermo ScientificHs00156308_m1
Taqman Gen Ekspresyonu Deneyleri: FOXJ1Thermo ScientificHs00230964_m1
Taqman Gen Ekspresyonu Deneyleri: GAPDHThermo ScientificHs02786624_g1
Taqman Gen Eksression Deneyleri: GPX1Thermo ScientificHs00829989_gH
Taqman Gen Eksression Deneyleri: GPX2Thermo ScientificHs01591589_m1
Taqman Gen Eksression Testleri: GPX3Thermo ScientificHs01078668_m1
Taqman Gen Eksression Deneyleri: KRT5Thermo Scientific
Taqman Gen Eksression Testleri: MUC5ACThermo ScientificHs01365616_m1
Taqman Gen Ekspresyonu Deneyleri: SCGB1A1Thermo ScientificHs00171092_m1
Taqman Gen Ekspresyonu Deneyleri: SOD1Thermo ScientificHs00533490_m1
Taqman Gen Ekspresyonu Deneyleri: SOD2Thermo ScientificHs00167309_m1
Thermo Scientific Nalgene Hızlı Akışlı PES Membranlı Steril Tek Kullanımlık Filtre Üniteleri (0.22 μ m gözenekler, 500 ml)Thermo Scientific5660020
TM-1 Kombine Takviye YaşamHattı Hücre TeknolojisiLS-1055
Toplam kaspaz-3 antikorHücre sinyalizasyonu14220S
Triton X-100Sigma9036-19-5
Tripsin-EDTA (%0.05), Fenol kırmızısıGibco25300062
Y-27632 2 HClTocris12-541-0
Dünya PCN5000Hs00361185_m1

Kaynaklar

  1. Torres-Cuevas, I., et al. Oxygen and oxidative stress in the perinatal period. Redox Biol. 12, 674-681 (2017).
  2. Hanidziar, D., Robson, S. C. Hyperoxia and modulation of pulmonary vascular and immune responses in COVID-19. Am J Physiol-Lung Cell Mol Physiol. 320 (1), L12-L16 (2021).
  3. Amarelle, L., Quintela, L., Hurtado, J., Malacrida, L. Hyperoxia and lungs: What we have learned from animal models. Front Med. 8, 606678(2021).
  4. Mach, W. J., Thimmesch, A. R., Pierce, J. T., Pierce, J. D. Consequences of hyperoxia and the toxicity of oxygen in the lung. Nursing Res Pract. 2011, 260482(2011).
  5. Kallet, R. H., Matthay, M. A. Hyperoxic acute lung injury. Respir Care. 58 (1), 123-141 (2013).
  6. Penkala, I. J., et al. Age-dependent alveolar epithelial plasticity orchestrates lung homeostasis and regeneration. Cell Stem Cell. 28 (10), 1775-1789 (2021).
  7. Thébaud, B., et al. Bronchopulmonary dysplasia. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 78(2019).
  8. Ibrahim, J., Bhandari, V. The definition of bronchopulmonary dysplasia: an evolving dilemma. Pediatr Res. 84 (5), 586-588 (2018).
  9. Higgins, R. D., et al. Bronchopulmonary Dysplasia: Executive summary of a workshop. J Pediatr. 197, 300-308 (2018).
  10. Collins, J. J. P., Tibboel, D., de Kleer, I. M., Reiss, I. K. M., Rottier, R. J. The future of bronchopulmonary Dysplasia: Emerging pathophysiological concepts and potential new avenues of treatment. Front Med (Lausanne). 4, 61(2017).
  11. Northway, W. H., Rosan, R. C., Porter, D. Y. Pulmonary disease following respirator therapy of hyaline-membrane disease. Bronchopulmonary dysplasia. N Engl J Med. 276 (7), 357-368 (1967).
  12. Collaco, J. M., McGrath-Morrow, S. A. Bronchopulmonary dysplasia as a determinant of respiratory outcomes in adult life. Pediatr Pulmonol. 56 (11), 3464-3471 (2021).
  13. Tepper, R. S., Morgan, W. J., Cota, K., Taussig, L. M. Expiratory flow limitation in infants with bronchopulmonary dysplasia. J Pediatr. 109 (6), 1040-1046 (1986).
  14. Davidson, L. M., Berkelhamer, S. K. Bronchopulmonary Dysplasia: Chronic lung disease of infancy and long-term pulmonary outcomes. J Clin Med. 6 (1), 4(2017).
  15. Filbrun, A. G., Popova, A. P., Linn, M. J., McIntosh, N. A., Hershenson, M. B. Longitudinal measures of lung function in infants with bronchopulmonary dysplasia. Pediatr Pulmonol. 46 (4), 369-375 (2011).
  16. Stoll, B. J., et al. Neonatal outcomes of extremely preterm infants from the NICHD Neonatal Research Network. Pediatrics. 126 (3), 443-456 (2010).
  17. Colin, A. A., McEvoy, C., Castile, R. G. Respiratory morbidity and lung function in preterm infants of 32 to 36 weeks gestational age. Pediatrics. 126 (1), 115-128 (2010).
  18. Doyle, L. W., Ranganathan, S., Cheong, J. Bronchopulmonary dysplasia and expiratory airflow at 8 years in children born extremely preterm in the post-surfactant era. Thorax. 78 (5), 484-488 (2022).
  19. Doyle, L. W., et al. Ventilation in extremely preterm infants and respiratory function at 8 Years. N Engl J Med. 377 (4), 329-337 (2017).
  20. Brozmanova, M., Hanacek, J., Tatar, M., Strapkova, A., Szepe, P. Effects of hyperoxia and allergic airway inflammation on cough reflex intensity in guinea pigs. Physiol Res. 51 (5), 529-536 (2002).
  21. Burghardt, J. S., Boros, V., Biggs, D. F., Olson, D. M. Lipid mediators in oxygen-induced airway remodeling and hyperresponsiveness in newborn rats. Am J Respir Crit Care Med. 154, 4 Pt 1 837-842 (1996).
  22. Mazurek, H., Haouzi, P., Belaguid, A., Marchal, F. Persistent increased lung response to methacholine after normobaric hyperoxia in rabbits. Respir Physiol. 99 (2), 199-204 (1995).
  23. Onugha, H., et al. Airway hyperreactivity is delayed after mild neonatal hyperoxic exposure. Neonatology. 108 (1), 65-72 (2015).
  24. Regal, J. F., Lawrence, B. P., Johnson, A. C., Lojovich, S. J., O'Reilly, M. A. Neonatal oxygen exposure alters airway hyper-responsiveness but not the response to allergen challenge in adult mice. Pediatr Allergy Immunol. 25 (2), 180-186 (2014).
  25. Mayer, C. A., et al. CPAP-induced airway hyper-reactivity in mice is modulated by hyaluronan synthase-3. Pediatr Res. 92 (3), 685-693 (2022).
  26. Ganguly, A., Martin, R. J. Vulnerability of the developing airway. Respir Physiol Neurobiol. 270, 103263(2019).
  27. Yee, M., Buczynski, B. W., O'Reilly, M. A. Neonatal hyperoxia stimulates the expansion of alveolar epithelial type II cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 50 (4), 757-766 (2014).
  28. Balasubramaniam, V., Mervis, C. F., Maxey, A. M., Markham, N. E., Abman, S. H. Hyperoxia reduces bone marrow, circulating, and lung endothelial progenitor cells in the developing lung: implications for the pathogenesis of bronchopulmonary dysplasia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292 (5), L1073-L1084 (2007).
  29. Crystal, R. G., Randell, S. H., Engelhardt, J. F., Voynow, J., Sunday, M. E. Airway epithelial cells. Proc Am Thoracic Soc. 5 (7), 772-777 (2008).
  30. Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Ann Am Thor Soc. 15, Supplement_3 S143-S148 (2018).
  31. Davis, J. D., Wypych, T. P. Cellular and functional heterogeneity of the airway epithelium. Mucosal Immunol. 14 (5), 978-990 (2021).
  32. Whitsett, J. A., Kalin, T. V., Xu, Y., Kalinichenko, V. V. Building and regenerating the lung cell by cell. Physiol Rev. 99 (1), 513-554 (2019).
  33. Maeda, H., et al. Involvement of miRNA-34a regulated Krüppel-like factor 4 expression in hyperoxia-induced senescence in lung epithelial cells. Respir Res. 23 (1), 340(2022).
  34. Zhu, Y., Mosko, J. J., Chidekel, A., Wolfson, M. R., Shaffer, T. H. Effects of xenon gas on human airway epithelial cells during hyperoxia and hypothermia. J Neonatal Perinatal Med. 13 (4), 469-476 (2020).
  35. Cao, X., et al. Invited review: human air-liquid-interface organotypic airway tissue models derived from primary tracheobronchial epithelial cells-overview and perspectives. In Vitro Cell Dev Biol - Animal. 57 (2), 104-132 (2021).
  36. Garcia, D., et al. Short exposure to hyperoxia causes cultured lung epithelial cell mitochondrial dysregulation and alveolar simplification in mice. Pediatr Res. 90 (1), 58-65 (2020).
  37. Crist, A. P., Hibbs, A. M. Prematurity-associated wheeze: current knowledge and opportunities for further investigation. Pediatr Res. 94 (1), 74-81 (2022).
  38. Lee, R. M., O'Brodovich, H. Airway epithelial damage in premature infants with respiratory failure. Am Rev Respir Dis. 137 (2), 450-457 (1988).
  39. Amonkar, G. M., et al. Primary culture of tracheal aspirate-derived human airway basal stem cells. STAR Protoc. 3 (2), 101390(2022).
  40. Shui, J. E., et al. Prematurity alters the progenitor cell program of the upper respiratory tract of neonates. Sci Rep. 11 (1), 10799(2021).
  41. Hillas, J., et al. Nasal airway epithelial repair after very preterm birth. ERJ Open Res. 7 (2), 00913-02020 (2021).
  42. Lu, J., et al. Rho/SMAD/mTOR triple inhibition enables long-term expansion of human neonatal tracheal aspirate-derived airway basal cell-like cells. Pediatr Res. 89 (3), 502-509 (2020).
  43. Jiang, D., Schaefer, N., Chu, H. W. Air-liquid interface culture of human and mouse airway epithelial cells. Meth Mol Biol. 1809, 91-109 (2018).
  44. You, K., et al. Moderate hyperoxia induces senescence in developing human lung fibroblasts. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 317 (5), L525-L536 (2019).
  45. Wang, H., et al. Severity of neonatal hyperoxia determines structural and functional changes in developing mouse airway. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307 (4), L295-L301 (2014).
  46. Ravikumar, P., et al. α-Klotho protects against oxidative damage in pulmonary epithelia. Am J Physi-Lung Cell Mol Physiol. 307 (7), L566-L575 (2014).
  47. Hartman, W. R., et al. Oxygen dose responsiveness of human fetal airway smooth muscle cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303 (8), L711-L719 (2012).
  48. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnol Rep. 7, 9-16 (2015).
  49. Bodas, M., et al. Cigarette smoke activates NOTCH3 to promote goblet cell differentiation in human airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 64 (4), 426-440 (2021).
  50. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  51. Jakubowski, W., Bartosz, G. 2,7-dichlorofluorescin oxidation and reactive oxygen species: what does it measure. Cell Biol Int. 24 (10), 757-760 (2000).
  52. Oksvold, M. P., Skarpen, E., Widerberg, J., Huitfeldt, H. S. Fluorescent histochemical techniques for analysis of intracellular signaling. J Histochem Cytochem. 50 (3), 289-303 (2002).
  53. Hewitt, R. J., et al. Lung extracellular matrix modulates KRT5(+) basal cell activity in pulmonary fibrosis. Nat Commun. 14 (1), 6039(2023).
  54. Hawkins, F. J., et al. Derivation of airway basal stem cells from human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 28 (1), 79-95 (2021).
  55. Zou, X. L., et al. Down-expression of Foxj1 on airway epithelium with impaired cilia architecture in non-cystic fibrosis bronchiectasis implies disease severity. Clin Respir J. 17 (5), 405-413 (2023).
  56. Li, X., et al. Low CC16 mRNA expression levels in bronchial epithelial cells are associated with asthma severity. Am J Respir Crit Care Med. 207 (4), 438-451 (2023).
  57. Li, T., Wang, Y., Huang, S., Tang, H. The regulation mechanism of MUC5AC secretion in airway of obese asthma. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 68 (7), 153-159 (2022).
  58. Nekooki-Machida, Y., Hagiwara, H. Role of tubulin acetylation in cellular functions and diseases). Med Mol Morphol. 53 (4), 191-197 (2020).
  59. Creagh, E. M., Conroy, H., Martin, S. J. Caspase-activation pathways in apoptosis and immunity. Immunol Rev. 193, 10-21 (2003).
  60. Abo, K. M., et al. Air-liquid interface culture promotes maturation and allows environmental exposure of pluripotent stem cell-derived alveolar epithelium. JCI Insight. 7 (6), e155589(2022).
  61. Guénette, J., Breznan, D., Thomson, E. M. Establishing an air-liquid interface exposure system for exposure of lung cells to gases. Inhal Toxicol. 34 (3-4), 80-89 (2022).
  62. Zhao, C., et al. Age-related STAT3 signaling regulates severity of respiratory syncytial viral infection in human bronchial epithelial cells. bioRxiv. , (2023).
  63. Lochbaum, R., et al. Retinoic acid signalling adjusts tight junction permeability in response to air-liquid interface conditions. Cellular Signalling. 65, 109421(2020).
  64. Jain, R., et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (6), 731-739 (2010).
  65. You, Y., et al. Role of f-box factor foxj1 in differentiation of ciliated airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (4), L650-L657 (2004).
  66. Pan, J., You, Y., Huang, T., Brody, S. L. RhoA-mediated apical actin enrichment is required for ciliogenesis and promoted by Foxj1. J Cell Sci. 120, Pt 11 1868-1876 (2007).
  67. Teape, D., et al. Hyperoxia impairs intraflagellar transport and causes dysregulated metabolism with resultant decreased cilia length. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 324 (3), L325-L334 (2023).
  68. Hall, C. B. Respiratory syncytial virus and parainfluenza virus. N Engl J Med. 344 (25), 1917-1928 (2001).
  69. Guillien, A., et al. Determinants of immunoglobulin G responses to respiratory syncytial virus and rhinovirus in children and adults. Front Immunol. 15, 1355214(2024).
  70. Ito, K., Daly, L., Coates, M. An impact of age on respiratory syncytial virus infection in air-liquid-interface culture bronchial epithelium. Front Med (Lausanne). 10, 1144050(2023).
  71. Zimmermann, P., Curtis, N. Why does the severity of COVID-19 differ with age?: Understanding the mechanisms underlying the age gradient in outcome following SARS-CoV-2 infection. Pediatr Infect Dis J. 41 (2), e36-e45 (2022).
  72. Leung, C., Wadsworth, S. J., Yang, S. J., Dorscheid, D. R. Structural and functional variations in human bronchial epithelial cells cultured in air-liquid interface using different growth media. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 318 (5), L1063-L1073 (2020).
  73. Dieperink, H. I., Blackwell, T. S., Prince, L. S. Hyperoxia and apoptosis in developing mouse lung mesenchyme. Pediatric research. 59 (2), 185-190 (2006).
  74. Looi, K., et al. Preterm birth: Born too soon for the developing airway epithelium. Paediatr Respir Revi. 31, 82-88 (2019).
  75. Hilgendorff, A., Reiss, I., Ehrhardt, H., Eickelberg, O., Alvira, C. M. Chronic lung disease in the preterm infant. Lessons learned from animal models. Am J Respir Cell Mol Biol. 50 (2), 233-245 (2014).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

3B H cre K lt rHiperoksi MaruziyetiNeonatal Hava Yolu H creleriHava S v Aray zOksidatif Stres AnaliziTrakeal Aspirat zolasyonuMukosiliyer DiferansiyasyonH cre Monotabakas PolarizasyonuNeonatal Akci er Hastal
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.