Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kırmızı Deniz Yosunu Gracilaria gracilis'in Biyorafineri Yaklaşımı ile Değerlendirilmesi

3.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/65923

⸱

21 Kasım 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, ESTM, Polytechnic University of Leiria, 2MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, Department of Life Sciences, University of Coimbra

Bu makalede

Özet

Burada, Gracilaria gracilis'in entegre bir şekilde değerlendirilmesini amaçlayan birkaç protokolü açıklıyoruz: yabani türlerin toplanması, kurum içi büyüme ve biyoaktif bileşenlerin ekstraksiyonu. Ekstraktların antioksidan, antimikrobiyal ve sitotoksik etkileri, bütün deniz yosunu biyokütlesi ve pigmentleri ile zenginleştirilmiş gıdaların beslenme ve stabilite değerlendirmesi ile birlikte değerlendirilir.

Özet

Değerli ve çok hedefli biyoaktif bileşenler elde etmek için bol miktarda hammadde olarak deniz yosunlarına olan ilgi sürekli artmaktadır. Bu çalışmada, kozmetik, farmakolojik, gıda ve yem uygulamaları için bir agar ve diğer bileşenlerin kaynağı olarak ticari çıkarları nedeniyle dünya çapında yetiştirilen yenilebilir bir kırmızı deniz yosunu olan Gracilaria gracilis'in potansiyelini araştırıyoruz.

G. gracilis büyüme koşulları, büyük bir biyokütle stoğu elde etmek için fizikokimyasal koşulları manipüle ederken vejetatif çoğaltma ve sporülasyon yoluyla optimize edildi. Deniz yosunu biyokütlesi üzerinde etanol ve su ile yeşil ekstraksiyon metodolojileri gerçekleştirildi. Ekstraktların biyoaktif potansiyeli, sitotoksisiteleri, antioksidanları ve antimikrobiyal özellikleri ile ilgili bir dizi in vitro test ile değerlendirildi. Ek olarak, kurutulmuş deniz yosunu biyokütlesi, gıdanın besin değerini artırmak için makarna formülasyonlarına dahil edildi. G. gracilis'ten ekstrakte edilen pigmentler de doğal bir renklendirici olarak yoğurda dahil edilmiş ve stabiliteleri değerlendirilmiştir. Her iki ürün de pazara ulaşmadan önce en iyi nihai formülasyonu elde etmeyi amaçlayan yarı eğitimli bir duyusal panelin takdirine sunuldu.

Sonuçlar, G. gracilis'in bütün bir biyokütle, ekstrakt ve/veya pigment olarak uygulanıp uygulanmadığına bakılmaksızın çok yönlülüğünü desteklemektedir. Bu çalışma, birkaç optimize edilmiş protokolün uygulanmasıyla, gıda, kozmetik ve su ürünleri pazarlarından kâr etme potansiyeline sahip ürünlerin geliştirilmesine olanak tanıyarak çevresel sürdürülebilirliği ve mavi döngüsel ekonomiyi teşvik eder.

Ayrıca, bir biyorafineri yaklaşımına uygun olarak, artık deniz yosunu biyokütlesi, bitki büyümesi için biyostimülan olarak kullanılacak veya Leiria, Portekiz'deki MARE-Polytechnic'in kurum içi su ürünleri yetiştiriciliği sistemlerinin su arıtmasında kullanılmak üzere karbon malzemelerine dönüştürülecektir.

Giriş

Deniz yosunları, ilaç, gıda, yem ve çevre sektörleri tarafından yararlanılacak ilginç bir doğal hammadde olarak kabul edilebilir. Birçoğu karasal organizmalarda bulunmayan ve ilgili biyolojik özelliklere sahip bir dizi molekülü biyosentezlerler 1,2. Bununla birlikte, büyük bir biyokütle stoğu sağlamak için deniz yosunu için optimize edilmiş yetiştirme protokollerinin uygulanması gerekir.

Yetiştirme yöntemleri her zaman deniz yosunu thalli'nin doğasını ve genel morfolojisini dikkate almalıdır. Gracilaria gracilis klonal bir taksondur, yani bağlanma organı birden fazla vejetatif eksen üretir. Parçalanma (vejetatif üreme) yoluyla çoğaltma böylece elde edilir, çünkü bu eksenlerin her biri ana thallus3'ten bağımsız bir yaşamı tamamen benimseyebilir. Klonal taksonlar, basit ve hızlı tek adımlı yetiştirme metodolojileriyle başarılı bir şekilde entegre edilebilir, çünkü büyük miktarlarda biyokütle, thallusun hızla yenilenen ve yeni, genetik olarak özdeş bireylere dönüşen küçük parçalara bölünmesiyle elde edilir. Bu süreçte hem haplontik hem de diplontik thalli kullanılabilir. Cins, karmaşık bir haplo-diplontik izomorfik trifazik yaşam döngüsü sergilemesine rağmen, gelişmiş mahsuller elde etmek için stokların genetik yenilenmesinin gerekli olduğu durumlar dışında, sporülasyon nadiren gereklidir. Bu durumda, hem tetrasporlar (mayoz bölünme tarafından oluşturulan haplontik sporlar) hem de karposporlar (mitoz tarafından oluşturulan diplontik sporlar), daha sonra vejetatif üreme ile yetiştirilebilen ve çoğaltılabilen makroskopik thallilere yol açar4. Büyüme döngüleri, epifitlerin ortaya çıkması ve diğer organizmaların yapışması gibi diğer biyolojik faktörlerin yanı sıra çevresel koşullar ve bireylerin fizyolojik durumu tarafından belirlenir. Bu nedenle, yüksek verimlilik sağlamak ve kaliteli biyokütle üretmek için yetiştirme koşullarını optimize etmek çok önemlidir5.

G. gracilis de dahil olmak üzere deniz yosunundan biyoaktif bileşiklerin ekstraksiyonu çeşitli yöntemlerle gerçekleştirilebilir 6,7. Ekstraksiyon yönteminin seçimi, ilgilenilen spesifik bileşiklere, hedef uygulamaya ve deniz yosununun özelliklerine bağlıdır. Bu çalışmada, deniz yosunu biyokütlesinden biyoaktif bileşikleri çözmek ve çıkarmak için su veya etanol gibi yeşil çözücülerin kullanılmasını içeren çözücü ekstraksiyonuna odaklandık. Ekstraksiyon, maserasyon yoluyla çok yönlü ve etkili bir şekilde gerçekleştirilebilir ve çok çeşitli bileşikler için kullanılabilir. Biyokütlenin bir çözücü içinde uzun bir süre, tipik olarak oda veya biraz yüksek sıcaklıklarda bekletilmesini içeren basit ve yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Ekstraksiyon işlemini geliştirmek için çözücü karıştırılır. İstenilen ekstraksiyon süresinden sonra çözücü, filtrasyon veya santrifüjleme ile katı malzemeden ayrılır.

Su, güvenliği, bulunabilirliği ve çok çeşitli gıda ürünleriyle uyumluluğu nedeniyle gıda uygulamalarında yaygın olarak kullanılan bir çözücüdür. Su ekstraksiyonu, polisakkaritler, peptitler ve bazı fenolikler gibi polar bileşikler için uygundur. Bununla birlikte, polar olmayan bileşikleri etkili bir şekilde çıkaramayabilir. Etanol ayrıca gıda uygulamalarında yaygın olarak kullanılan bir çözücüdür ve fenolik bileşikler, flavonoidler ve belirli pigmentler dahil olmak üzere çeşitli biyoaktif moleküllerin ekstraksiyonunda etkili olabilir. Etanol genellikle gıdalarda kullanım için güvenli olarak kabul edilir ve ekstrakte edilen bileşikleri geride bırakarak kolayca buharlaştırılabilir. Ekstraksiyon yöntemi seçiminin verimlilik, seçicilik, maliyet etkinliği ve çevresel etki gibi faktörleri dikkate alması gerektiğini belirtmekte fayda var. Çözücü konsantrasyonu, ekstraksiyon süresi, sıcaklık ve basınç gibi ekstraksiyon parametrelerinin optimizasyonu, G. gracilis veya diğer deniz yosunlarından biyoaktif bileşiklerin optimum verimini elde etmek için çok önemlidir.

Deniz yosunlarının bakteriler, mantarlar ve virüsler dahil olmak üzere çok çeşitli mikroorganizmalara karşı antimikrobiyal aktivite sergilediği bulunmuştur8. Bu aktivite, fenolikler, polisakkaritler, peptitler ve yağ asitleri dahil olmak üzere biyoaktif bileşenlere atfedilir. Çeşitli çalışmalar, diğerlerinin yanı sıra Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. ve Pseudomonas aeruginosa gibi patojenlere karşı etkinliklerini göstermiştir9. Deniz yosunlarının antimikrobiyal aktivitesi, mikrobiyal hücre duvarlarına, zarlara, enzimlere ve sinyal yollarına müdahale edebilen biyoaktif bileşiklerin varlığına atfedilir10. Bu bileşikler mikrobiyal büyümeyi bozabilir, biyofilm oluşumunu engelleyebilir ve bağışıklık tepkilerini modüle edebilir.

Ormangülü olarak da bilinen kırmızı deniz yosunları, çeşitli mikroorganizmalara karşı antimikrobiyal aktivite gösterebilen bir alg grubudur. Bu grup içinde, G. gracilis , bildirilen antimikrobiyal aktivitesine katkıda bulunabilecek çeşitli biyoaktif bileşikler içerir. Spesifik moleküller değişebilse de, G. gracilis'te bildirilen ve antimikrobiyal özelliklere sahip olabilen ortak sınıflar polisakkaritler, fenolikler, terpenoidler ve pigmentlerdir11. Bununla birlikte, bu bileşenlerin varlığının ve miktarlarının deniz yosununun toplandığı yer, mevsimsellik, talinin fizyolojik durumu ve çevresel koşullar gibi faktörlere bağlı olarak değişebileceğini unutmamak önemlidir. Bu nedenle, G. gracilis'teki antimikrobiyal bileşiklerin spesifik sınıfı ve konsantrasyonu buna göre değişebilir.

G. gracilis'in ayrıca serbest radikalleri temizlediği ve oksidatif stresi azalttığı gösterilen çeşitli fenolik bileşikler içeren antioksidan özelliklere sahip olduğu bulunmuştur12.Antioksidanlar, hücreleri reaktif oksijen türlerinin neden olduğu hasarlardan korumaya yardımcı olur ve potansiyel sağlık yararları vardır. Antioksidan kapasite, 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) serbest radikal süpürücü aktivitesi dahil olmak üzere farklı yöntemlerle doğrudan ve dolaylı olarak toplam polifenolik içeriğin (TPC) miktarının belirlenmesi yoluyla değerlendirilebilir13.

Bir bileşenin belirgin bir biyoaktiviteye sahip olduğu bildirilse de, sitotoksisite değerlendirmesi, canlı hücreler veya dokularla temas halinde kullanılacak doğal ve sentetik maddelerin değerlendirilmesinde vazgeçilmezdir. Sitotoksisiteyi ölçmek için her biri avantajları ve sınırlamaları olan birkaç yöntem vardır. Genel olarak, birçok maddenin hücreler üzerindeki zararlı etkilerini değerlendirmek ve aynı zamanda hücre hasarı ve ölüm mekanizmalarını araştırmak için bir dizi seçenek sunarlar14.

Bu çalışmada, Mosmann (1983)15 tarafından tanıtılan kolorimetrik bir yöntem olan 3-(4,5-dimetiltiyazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolyum bromür (MTT) testini kullanıyoruz. Bu yöntem, tetrazolyum tuzlarının metabolik olarak aktif hücreler tarafından mor bir formazan ürününe indirgenmesini ölçer. Formazan kristallerinin miktarı ne kadar yüksek olursa, canlı hücrelerin sayısı da o kadar yüksek olur, böylece dolaylı bir sitotoksisiteölçüsü sağlanır 14. Bu çalışmada, G. gracilis su ve etanol ekstraktlarının dermo-kozmetik formülasyonlara dahil edilmesi amaçlandığından, in vitro sitotoksisite değerlendirmesi bir keratinosit (HaCaT) hücre hattında gerçekleştirilir.

Gıda uygulamasıyla ilgili olarak, deniz yosunları genellikle kalorileri düşüktür ve diyet lifleri, esansiyel elementler ve amino asitler, polisakkaritler, çoklu doymamış yağ asitleri, polifenoller ve vitaminleraçısından besleyici açıdan zengindir 2,16. G. gracilis, ilginç bir besin değerine sahip bir istisna değildir. Freitas ve ark. (2021)4, ekili G. gracilis'in yabani deniz yosununa kıyasla daha yüksek protein ve C vitamini seviyelerine sahip olduğunu ve toplam lipit seviyesini koruduğunu buldu. Bu, ekonomik ve çevresel bir avantajı temsil edebilir, çünkü beslenme açısından konuşursak, üretim vahşi kaynakların sömürülmesine tercih edilir. Buna ek olarak, tüketiciler yedikleri yiyeceklerin türü hakkında giderek daha fazla endişe duyuyorlar, bu nedenle gıda zenginleştirme için yeni bileşenler sunmak ve bir ürüne değer katabilecek ve "temiz bir etiket" talep edebilecek özler elde etmek için yeni kaynaklar kullanmak önemlidir. Ayrıca, mevcut pazar çok rekabetçidir ve üreticileri rakiplerinden farklılaştırmak için yeni ürünlerin ve yenilikçi stratejilerin geliştirilmesini gerektirir17.

Makarna gibi besin değeri düşük olan ürünlerin deniz yosunu da dahil olmak üzere deniz kaynakları ile zenginleştirilmesi, bu kaynağın yeni bir gıda olarak tanıtılması ve farklı besin değerine sahip bir ürün aracılığıyla pazarda farklılaşma stratejisidir. Öte yandan, G. gracilis , gıda endüstrisindeki uygulamalar için yüksek potansiyele sahip, ficobiliproteinler18 gibi doğal kırmızı pigmentlerin kaynağıdır. Bu deniz yosunu birçok alanda büyük ilgi görmüştür ve uygulaması tüm deniz yosunu, özler ve/veya kalan biyokütle kullanılarak yapılabilir. Bu çalışmada, bu tür uygulamaların bazı örneklerini gösteriyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Biyokütle hasadı ve hazırlanması

  1. Düşük gelgit sırasında G. gracilis örneklerini hasat edin ve kuruma, ışığa ve havaya maruz kalmayı önlemek için bunları karanlık, soğutulmuş kutularda hızlı bir şekilde laboratuvara taşıyın.
  2. Laboratuvarda, her bir thallusu akan deniz suyuyla yıkayın ve yüzeydeki kalıntıları, nekrotik parçaları, epifitleri ve diğer organizmaları temizlemek için iyice temizleyin.
  3. Yabani biyokütleyi sürekli havalandırılan deniz suyunda (31-35 psu) gün ışığı, soğuk beyaz ± flüoresan lambalar ve 7 gün boyunca 16:08'de (açık: karanlık) fotoperiyot ile sağlanan düşük ışınımlı bir iklim odasında (20 1 °C) tutun. Bu süre zarfında, herhangi bir besin ortamı sağlamayın; Bu, deniz yosununun yeni iç mekan koşullarına yavaş yavaş uyum sağlamasını sağlar.

2. Stok bakımı

  1. İklimlendirme dönemini takiben, steril bir bıçakla deniz yosunu thalli'nin sağlıklı uçlarını kesin. Redmond ve ark. (2014)19 ve steril koşullar altında, kalan kirleticileri gidermek için her bir ucu daha önce Petri kaplarında (%1,0 bakteriyolojik agar, 1:1 damıtılmış su/deniz suyu oranında) hazırlanmış bir agar jeli boyunca sürükleyin. Her uç için agar sürüklemesini üç kez gerçekleştirin ve ucu her zaman agar jelinin kullanılmayan kısımlarından sürükleyin.
  2. Asitle cam eşyaları bir hidroklorik asit çözeltisinde (HCl,% 15) yıkayın ve damıtılmış suyla iyice durulayın. Temizleme işleminde kullanılan tüm aletleri, cam eşyaları, agarı, deniz suyunu ve damıtılmış suyu otoklavda (121 °C, 15 dakika) sterilize edin.
    DİKKAT: Tedarikçi tarafından sağlanan HCl'nin güvenlik bilgi formuna bakın.
  3. Redmond ve ark. (2014)19'a göre, kırmızı deniz yosunları için modifiye edilmiş Von Stosch Zenginleştirilmiş çözelti (VSE) ile desteklenmiş 35 psu'da sterilize deniz suyunda büyür. Epifitik diatomların büyümesini önlemek için ortama (1 mL/L) germanyum dioksit (GeO2) ekleyin.
    DİKKAT: Tedarikçi tarafından sağlanan GeO2'nin güvenlik veri sayfasına bakın.
    NOT: Kısmi veya tam renk değişikliği ile gözlemlendiği gibi pigmentasyon kaybı gösteren uçlar stres altındadır veya zaten ölmüştür ve atılmalıdır.

3. Yetiştirme ve ölçek büyütme

  1. İklimlendirme periyodundan sonra, 20 ± 0,5 μmol fotonlar m-2 s-1 (1500 lüks) beyaz soğuk ışık, 16 saat: 8 saat (açık: koyu) olarak ayarlanmış bir fotoperiyot ve her hafta yenilenen VSE kültür ortamı ile zenginleştirilmiş steril deniz suyu ile 20 ± 1 °C'ye ayarlanmış bir iklim odasında yaklaşık 8-10 sağlıklı ucu 250 mL düz tabanlı şişelere rastgele dağıtın.
  2. Haftalık ağırlık ölçümleri yapın, thallusu aşırı zorlamaktan kaçının20. Bunun için, uçları kültür ortamından dikkatlice çıkarın, hafifçe durulayın ve miligramları bir laboratuvar ölçeğinde tartın.
    NOT: Bu prosedür, kültür ortamının haftalık yenilenmesi ile birlikte gerçekleştirilebilir.
  3. Thalli bu şişelerde 2 g/L yoğunluğa kadar büyüyebilir. Bu noktada, bir alıcı ölçeği büyütme (250 mL, 1 L ve 5 L) gerçekleştirin. Hacim 5 L'ye ulaştığında ekimi 50 L ve daha büyük dış mekan açık beyaz kaplara aktarın.
  4. Patarra ve ark. (2017)21'e göre nispi büyüme oranını (RGR) hesaplayın:
    RGR (% fw/gün) = ([Ln (fw) - Ln (iw)]/t) x 100
    burada iw ve fw, sırasıyla gram cinsinden ifade edilen ilk ve son taze ağırlıktır ve t, gün cinsinden zamandır.
    NOT: Bu laboratuvar kurulumunda RGR günde !'e varan değerlere ulaşmaktadır. Biyokütle hasadı herhangi bir zamanda yapılabilir. Biyokütle, kullanım amacına bağlı olarak fırında kurutma, dondurarak kurutma veya sadece donmuş (-20 °C) olarak depolanarak bozulmayı önlemek için hızlı bir şekilde işlenmelidir. Kurutulmuş biyokütle oda sıcaklığında (RT) korunabilir veya donmuş olarak da saklanabilir.

4. Ekstraksiyon prosedürü

NOT: G. gracils ekstraktlarının in vitro sitotoksisitesini, antioksidan ve antimikrobiyal özelliklerini değerlendirmek için hazırlanması iki farklı parametreyi dikkate alır: ekstraksiyon sıcaklığı ve çözücü tipi.

  1. Ekstraksiyonları gerçekleştirmek için, G. gracilis biyokütlesini fırında kurutun ve toz 200 μm'lik bir elekten geçene kadar biyokütleyi (örneğin bir ev tipi kahve değirmeninde) öğütün.
  2. Kurutulmuş biyokütleyi (10 g) tartın ve 100 mL çözücü (mutlak etanol veya steril su) içinde çözün.
  3. Işıktan korunan bir kapta 30 dakika karıştırın.
  4. RT, 40 °C ve 70 °C'de su ve su > etanol ekstraksiyonları > sıralı etanol gerçekleştirin.
  5. Her sıcaklık için, etanol ve su ile ekstraksiyonları iki kez ayrı ayrı gerçekleştirin.
  6. Sıvı ekstraktları kalan biyokütleden filtre kağıdından (Whatman No.1) süzülerek ayırın, ardından RT'de 10 dakika boyunca 8000 x g'da santrifüjleyin.
  7. Kalan alg biyokütlesini diğer çözücü ile daha fazla ekstraksiyon için yeniden kullanın. Bir numune ilk olarak etanol ile ekstrakte edildiyse, daha sonra su ile ekstrakte edin ve bunun tersi de geçerlidir.
  8. Sulu ekstraktları dondurarak kurutun ve etanol ekstraktlarını 40 °C'de döner bir buharlaştırıcıda buharlaştırın.
  9. Kurutulmuş ekstraktları 4 °C'de saklayın.
  10. Ekstraktları 50 mg / mL (antimikrobiyal testler) veya 10 mg / mL (antioksidan deneyler) konsantrasyonda çözün. Sulu ekstraktları steril suda ve etanolik ekstraktları mutlak etanolde çözün.

5. Antimikrobiyal aktivite

NOT: Etanolik ve sulu ekstraktlar, Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347), Escherichia coli (DSM 5922) ve Listonella anguillarum'a (DSM 21597). Antimikrobiyal testler, Ulusal Klinik Laboratuvar Standartları Komitesi'nin (NCCLS, 2012)22 tavsiyelerine göre yapılmalıdır. Tüm kültürler Alman Mikroorganizmalar ve Hücre Kültürleri Koleksiyonu'ndan (DSMZ) elde edildi. L. anguillarum , %1 sodyum klorür (NaCl) ile desteklenmiş triptik soya suyu (TSB) veya triptik soya agar (TSA) üzerinde yetiştirildi. Kalan iki suş LB ortamında (VWR Chemicals) büyütüldü. Bacillus subtilis subsp . spizizenii (DSM 347) ve Listonella anguillarum (DSM 21597) kültürleri 30 °C'de inkübe edilirken, Escherichia coli (DSM 5922) tedarikçinin talimatlarına göre 37 °C'de inkübe edildi. Et suyu mikrodilüsyon yöntemi, sıvı bir ortamda antimikrobiyal aktivitenin belirlenmesi için kullanılabilir ve bu, antimikrobiyal potansiyelin hızlı ve verimli bir şekilde belirlenmesine izin verecek şekilde mikro ölçekte gerçekleştirilmelidir. Bu düşük maliyetli yöntem, sonuçların sadece 24 saat içinde elde edilmesini sağlar, bu nedenle, belirli bir mikrobiyal suş için büyüme inhibitör etki açısından sonuçların elde edilmesine izin veren en iyi ekstraksiyon koşullarının erken bir aşamada belirlenmesi için uygundur. Bununla birlikte, metodoloji, mikrobiyal büyümeye özgü bir kapaklı steril mikroplakaların kullanılmasını ve ayrıca 600 nm dalga boyu için bir mikroplaka okuyucunun bulunmasını gerektirir.

  1. Et suyu mikrodilüsyon testlerini, 10 μL standartlaştırılmış aşı (0.5 McFarland standardında) ve 20 μL her ekstrakt (50 mg / mL) ile aşılanmış 170 μL Muller-Hinton Et Suyu (MHB) ile işlenmemiş ve yuvarlak tabanlı 96 oyuklu mikroplakalar kullanarak gerçekleştirin.
  2. Plakaları her suş için en uygun sıcaklıkta 24 saat inkübe edin.
  3. Optik yoğunluğun (OD 600) 0 saat ve 24 saatte bir mikroplaka spektrofotometresine kaydedilmesiyle ölçülen görünür bulanıklığın azaltılmasıyla antimikrobiyal aktiviteyi tespit edin.
  4. Sonuçları inhibisyon yüzdesi olarak ifade edin:
    figure-protocol-1
    burada Abs. ext, ekstrakt varlığında büyüyen bakteri suşu içeren kuyucuklarda 0 saat ile 24 saat arasında ölçülen absorbanstaki farktır ve Abs, bakteri suşu ve çözücü içeren kuyucuklarda aynı ölçüyü ifade eder.
  5. Bu yöntemde, negatif kontrol olacak sadece kültür ortamı içeren kuyucuklarla, aynı zamanda çözücüye eklenen standart suşla (etanol veya su) aşılanmış ortama ve bakteriyel suş ve pozitif kontrol antibiyotiğine sahip ortama sahip kuyucuklarla kontrol reaksiyonlarını içerir (kloramfenikol).

6. Antioksidan aktivite ve toplam polifenollerin miktar tayini

  1. Toplam polifenolik içerik
    NOT: Toplam polifenolik içerik (TPC), Folin-Ciocalteu yöntemi23 kullanılarak gerçekleştirilir ve mikro ölçeğe uyarlanır.
    1. Işıktan korunan 96 oyuklu bir mikroplakanın her bir kuyucuğuna 158 μL ultra saf su, 2 μL numune ve 10 μL Folin-Ciocalteu reaktifi ekleyin.
      DİKKAT: Tedarikçi tarafından teslim edilen Folin-Ciocalteu reaktifinin güvenlik veri sayfasına bakın.
    2. 2 dakika sonra 30 μLNa2CO3 (%20) ekleyin.
    3. RT'de karanlıkta 1 saat inkübasyondan sonra, numuneleri 755 nm'de spektrofotometrik olarak ölçün.
    4. Kontrol olarak gallik asit (kalibrasyon eğrisinin çizilmesine izin verir) veya ultra saf su (2 μL) kullanın.
    5. Sonuçları gallik asit eşdeğerleri (mg GAE/g ekstraktı) olarak ifade edin.
  2. 2,2 difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) radikal süpürücü aktivite
    NOT: Ekstraktların antioksidan aktivitesi, Duan ve ark. (2006)24, mikro ölçeğe uyarlanmıştır
    1. Işıktan korunan 96 oyuklu bir mikroplakaya, her numuneden 2 μL (10 mg/mL konsantrasyonda) ve mutlak etanol (0.1 mM) içinde çözülmüş 198 μL DPPH yerleştirin.
      DİKKAT: Tedarikçi tarafından sağlanan DPPH'nin güvenlik bilgi formuna bakın.
    2. Reaksiyonu karanlıkta RT'de 30 dakika çalıştırın. Bir mikroplaka spektrofotometresinde 517 nm'de absorbansı ölçün.
    3. 2 μL mutlak etanol/damıtılmış su ve 198 μL DPPH çözeltisi ile bir kontrol reaksiyonu gerçekleştirin. 2 μL ekstrakt ve 198 μL mutlak etanol ile boş bir ölçüm yapın.
    4. Aşağıdaki denklemi kullanarak sonuçları DPPH inhibisyonunun yüzdesi olarak ifade edin:
      figure-protocol-2
      burada Alg ekstraktının absorbansı gibi, Ab boş numunelerin absorbansıdır ve Ac kontrolün absorbansıdır.

7. Epidermal hücrelerde sitotoksisite değerlendirmesi

NOT: G. gracilis'in sulu ve etanol ekstraktlarının in vitro sitotoksik etkisi, daha önce tarif edildiği gibi MTT kolorimetrik testi yoluyla insan keratinositlerinde (HaCaT hücreleri - 300493) değerlendirilir25. Hücreler Cell Lines Services, Almanya'dan (CLS) alındı ve yöntem kurumsal yönergelere ve CLS talimatlarına uygun olarak gerçekleştirildi.
DİKKAT: Tedarikçi tarafından sağlanan MTT'nin güvenlik bilgi formuna bakın)

  1. Hücre kültürü bakımı
    1. fetal sığır serumu (FBS) ve %1 antibiyotik/antimikotik solüsyon (amfoterisin B, 0.25 mM; penisilin, 60 mM; streptomisin, 100 mM) ile takviye edilmiş Dulbecco'nun Modifiye Eagle'ın yüksek glikoz ortamındaki (DMEM) HaCaT hücrelerini kültürleyin.
    2. Hücreleri ayırmak için tripsin-EDTA kullanın.
      NOT: HaCaT hücrelerinin alt kültürü, hücreler toplam birleşmeye ulaştıktan sonra gerçekleştirilir.
    3. Hücreleri 37 °C'de% 5 CO2 ve% 95 nem ile bir odada kültürleyin.








      6. figure-protocol-3


      14. figure-protocol-4






      36. figure-protocol-5

      41. figure-protocol-6

      45. figure-protocol-7









Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Antimikrobiyal aktivite

Elde edilen sonuçları yorumlarken, inhibisyon yüzdesi ne kadar yüksek olursa, ekstraktın o spesifik suşun büyümesini inhibe etmedeki etkinliğinin o kadar büyük olduğu ve sonuç olarak ekstraktın bir antimikrobiyal olarak o kadar ilginç olduğu unutulmamalıdır. Bu metodoloji sayesinde, hangi ekstraktların belirli bakteri suşları üzerinde daha fazla aktiviteye sahip olduğunu hızlı bir şekilde...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Sıvı bir ortamda antimikrobiyal aktivite testleri, antimikrobiyal maddelerin sıvı bir ortamda asılı kalan mikroorganizmalara karşı etkinliğini değerlendirmek için kullanılmaktadır ve genellikle bir maddenin büyümeyi engelleme veya mikroorganizmaları öldürme yeteneğini belirlemek için yapılmaktadır35,36,37,38. Mikroorganizmaların antimikrobiyal ajanlara duyarlılığını değerlendirmek için kullanıl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Portekiz Bilim ve Teknoloji Vakfı (FCT) tarafından MARE-Deniz ve Çevre Bilimleri Merkezi'ne (UIDP/04292/2020 ve UIDB/04292/2020) ve Ortak Laboratuvar ARNET'e (LA/P/0069/2020) verilen Stratejik Projeler aracılığıyla desteklenmiştir. FCT ayrıca Marta V. Freitas (UI/BD/150957/2021) ve Tatiana Pereira'ya (2021) verilen bireysel doktora hibelerini de finanse etti. 07791. BD). Bu çalışma aynı zamanda Portekiz 2020 Programı kapsamında ERDF - Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu tarafından ortaklaşa finanse edilen HP4A - HERKES IÇIN SAĞLIKLI MAKARNA (ortak tanıtım no. 039952) projesi tarafından COMPETE 2020 - Rekabet Edebilirlik ve Uluslararasılaşma Operasyonel Programı aracılığıyla finansal olarak desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Mutlak EtanolAga, Portekiz64-17-5
Amonyum KlorürPanReac12125-02-9
Amfoterisin BSigma-Aldrich1397-89-3
Analitik terazi terazisiSartorius, TE124S22105307
Bacillus subtilis subsp. spizizeniiAlman Mikroorganizmalar Koleksiyonu ve Hücre Kültürleri (DSMZ)DSM 347
BiotinPanreac AppliChem58-85-5
SantrifüjEppendorf, 5810R5811JH490481
KloramfenikolPanReac56-75-7
CO2 HazneMemmertN/A
Soğuk Beyaz Floresan LambalarOSRAM Lumilux SkywhiteN/A
Densitometre McFarlandHibe AletleriN/A
DMEM ortamıSigma-AldrichD5796
DMSOSigma-Aldrich67-68-5
DPPHSigma, Steinheim, Almanya1898-66-4
Escherichia coli (DSM 5922)Alman Mikroorganizmalar ve Hücre Kültürleri Koleksiyonu (DSMZ)
Etanol %96AGA-Portekiz64-17-5
Etilendiamintetraasetik Asit Disodyum Tuzu Dihidrat (Na2EDTA)JTBaker6381-92-6
Fetal Sığır Serumu (FBS)Sigma-AldrichF7524
Filtre Kağıdı (Whatman No.1)WhatmanWHA1001320
ŞişeleriVWR International, Alcabideche, Portekiz N/A
Folin-CiocalteuVWR Kimyasalları31360.264
Gallik Asit Merck149-91-7
Germanyum (IV) Oksit, %99,999AlfaAesar1310-53-8
HaCaT hücreleri & 300493CLS-Cell Lines Services, Almanya 
Sıcak Plakalı Manyetik KarıştırıcıIKA, C-MAG HS706.090564
Demir SülfatVWR Kimyasalları10124-49-9
Laminer akış başlığıTelStar, Portekiz526013
LB Medium VWR ChemicalsJ106
Listonella anguillarumAlman Mikroorganizmalar ve Hücre Kültürleri Koleksiyonu (DSMZ)  DSM 21597
Manganez KlorürVWR Kimyasalları7773.01.5
Mikropipetler Eppendorf, PortekizN/A
MicroplatesVWR International, Alcabideche, Portekiz 10861-666
MikroplakalarGreiner738-0168
Mikroplakalar (steril)Fisher Scientific10022403
Mikroplaka okuyucu  Epoch Mikroplaka Spektrofotometresi, BioTek, Vermont, ABD1611151E
MTTSigma-Aldrich289-93-1
Muller-Hinton Et Suyu (MHB)VWR Kimyasalları90004-658
Fırın Bağlayıcı, FD11512-04490
Fırın Bağlayıcı, BD11504-62615
PenisilinSigma-Aldrich1406-05-9
pH metre Inolab  VWR International, Alcabideche, Portekiz 
Pippete ipuçlarıEppendorf, Portekiz5412307
Pyrex Bottles Medya Depolama  VWR International, Alcabideche, Portekiz 16157-169
Döner EvaporatörHeidolph, Laborota 400080409287
RotavaporIKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portekiz07.524254
Sodyum Karbonat (Na2< / sub>CO3< / sub>)Chem-Lab497-19-8
Sodyum Klorür (NaCl) Normax Kimya7647-14-5
Sodyum Fosfat DibazikRiedel-de Haë n7558-79-4
SpectraMagic NXKonica Minolta, Japonyarenk veri analiz yazılımı
SpektrofotometreEvrimi 201, Thermo Scientific, Madison, WI, ABD5A4T092004
StreptomisinSigma-Aldrich57-92-1
TiaminPanreac AppliChem59-43-8
Tripsin-EDTASigma-AldrichT4049
Triptik Soya Agar (TSA)VWR KimyasallarıICNA091010617
Triptik Soya Suyu (TSB) VWR Kimyasalları22091
Ultra saf su Avantaj A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, AlmanyaF5HA17360B
Vakum pompasıBuchi, İsviçreFIS05-402-103
B12 VitaminiMerck68-19-9
DSM592230049315212099

Kaynaklar

  1. Charoensiddhi, S., Abraham, R. E., Su, P., Zhang, W. Seaweed and seaweed-derived metabolites as prebiotics. Advances in Food and Nutrition Research. 91, 97-156 (2020).
  2. Roohinejad, S., Koubaa, M., Barba, F. J., Saljoughian, S., Amid, M., Greiner, R. Application of seaweeds to develop new food products with enhanced shelf-life, quality, and health-related beneficial properties. Food Research International. 99, 1066-1083 (2017).
  3. Hurd, C. L., Harrison, P. J., Bischof, K., Lobban, C. S. Seaweed Ecology and Physiology. (second). , Cambridge University Press, UK. (2014).
  4. Freitas, M. V., Mouga, T., Correia, A. P., Afonso, C., Baptista, T. New insights on the sporulation, germination, and nutritional profile of Gracilaria gracilis (Rhodophyta) grown under controlled conditions. Journal of Marine Science and Engineering. 9 (6), 562(2021).
  5. Friedlander, M. Advances in cultivation of Gelidiales. Journal of Applied Phycology. 20 (5), 451-456 (2008).
  6. Matos, G. S., Pereira, S. G., Genisheva, Z. A., Gomes, A. M., Teixeira, J. A., Rocha, C. M. R. Advances in extraction methods to recover added-value compounds from seaweeds: Sustainability and functionality. Foods. 10, 516(2021).
  7. Ummat, V., Sivagnanam, S. P., Rajauria, G., O'Donnell, C., Tiwari, B. K. Advances in pre-treatment techniques and green extraction technologies for bioactives from seaweeds. Trends in Food Science & Technology. 110, 90-106 (2021).
  8. Pérez, M. J., Falqué, E., Domínguez, H. Seaweed Antimicrobials, Present Status and Future Perspectives. Handbook of Algal Technologies andPhytochemicals:Volume I Food, Health and Nutraceutical Applications. Ravishankar, G., Ambati, R. R. , 1st ed, CRC Press, Boca Raton, Florida. (2019).
  9. Cavallo, R. A., Acquaviva, M. I., Stabili, L., Cecere, E., Petrocelli, A., Narracci, M. Antibacterial activity of marine macroalgae against fish pathogenic Vibrio species. Central European Journal of Biology. 8, 646-653 (2013).
  10. Shannon, E., Abu-Ghannam, N. Antibacterial derivatives of marine algae: An overview of pharmacological mechanisms and applications. Marine Drugs. 14 (4), 81(2016).
  11. Capillo, G., et al. New insights into the culture method and antibacterial potential of Gracilaria gracilis. Marine Drugs. 16 (12), 492(2018).
  12. Francavilla, M., Franchi, M., Monteleone, M., Caroppo, C. The red seaweed Gracilaria gracilis as a multi products source. Marine Drugs. 11 (10), 3754-3776 (2013).
  13. Sánchez-Ayora, H., Pérez-Jiménez, J. Antioxidant Capacity of Seaweeds: In Vitro and In Vivo Assessment. Marine Phenolic Compounds. Pérez-Correa, J. R., Mateos, R., Domínguez, R. , Elsevier. 299-341 (2023).
  14. Anil, S., Sweety, V. K., Vikas, B., Betsy-Joseph, B. Cytotoxicity and Cell Viability Assessment of Biomaterials. Cytotoxicity. , Intechopen. 111822(2023).
  15. Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cytotoxicity assays. Journal of Immunological Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
  16. Roleda, M. Y., et al. Variations in polyphenol and heavy metal contents of wild-harvested and cultivated seaweed bulk biomass: Health risk assessment and implication for food applications. Food Control. 95, 121-134 (2019).
  17. Souza, K. D., et al. Gastronomy and the development of new food products: Technological prospection. International Journal of Gastronomy and Food Science. 33, 100769(2023).
  18. Pereira, T., et al. Optimization of phycobiliprotein pigments extraction from red algae Gracilaria gracilis for substitution of synthetic food colorants. Food Chemistry. 321, 126688(2020).
  19. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. New England Seaweed Culture Handbook-Nursery Systems. Redmond, S., Green, L., Yarish, C., Kim, J., Neefus, C. , Connecticut Sea Grant, University of Connecticut. (2014).
  20. Yong, Y. S., Yong, W. T. L., Anton, A. Analysis of formulae for determination of seaweed growth rate. Journal of Applied Phycology. 25 (6), 1831-1834 (2013).
  21. Patarra, R. F., Carreiro, A. S., Lloveras, A. A., Abreu, M. H., Buschmann, A. H., Neto, A. I. Effects of light, temperature and stocking density on Halopteris scoparia growth. Journal of Applied Phycology. 29 (1), 405-411 (2017).
  22. NCCLS, National Committee for Clinical Laboratory Standards, Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests: Approved Standard. 32, 11th ed, Wayne, PA, USA. M02-M11 (2012).
  23. Singleton, V. L., Rossi, J. A. J. Colorimetry to total phenolics with phosphomolybdic acid reagents. American Journal of Enology and Viticulture. 16, 144-158 (1965).
  24. Duan, X. J., Zhang, W. W., Li, X. M., Wang, B. G. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga, Polysiphonia urceolata. Food Chemistry. 95 (1), 37-43 (2006).
  25. Freitas, R., et al. Highlighting the biological potential of the brown seaweed Fucus spiralis for skin applications. Antioxidants. 9 (7), 611(2020).
  26. Duarte, A., et al. Seasonal study of the nutritional composition of unexploited and low commercial value fish species from the Portuguese coast. Food Science and Nutrition. 10 (10), 3368-3379 (2020).
  27. Folch, J., Lees, M., Stanley, G. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
  28. ISO 6865. Animal feeding stuffs - Determination of crude fibre content - Method with intermediate filtration. Bureau of Indian Standards (BIS). , (2000).
  29. Fernández, A., Grienke, U., Soler-Vila, A., Guihéneuf, F., Stengel, D. B., Tasdemir, D. Seasonal and geographical variations in the biochemical composition of the blue mussel (Mytilus edulis L.) from Ireland. Food Chemistry. 177, 43-52 (2015).
  30. Pinto, F., et al. Annual variations in the mineral element content of five fish species from the Portuguese coast. Food Research International. 158, 111482(2022).
  31. FAO. Food energy - methods of analysis and conversion factors. , FAO Food and Nutrition Paper 77 at https://www.fao.org/fileadmin/templates/food_composition/documents/book_abstracts/Food_energy.pdf (2003).
  32. Regulation (EU) Nr. 1169/2011 of the European Parliament and of the Council of 25 -10-2011. 25, https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/ALL/?uri=CELEX%3A32011R1169 (2011).
  33. Pathare, P. B., Opara, U. L., Al-Said, F. A. J. Colour measurement and analysis in fresh and processed foods: A review. Food and Bioprocess Technology. 6 (1), 36-60 (2013).
  34. ISO 4120. Sensory analysis - Methodology - Triangle test. International Standard. , https://www.iso.org/standard/33495.html (2004).
  35. Reller, L. B., Weinstein, M., Jorgensen, J. H., Ferraro, M. J. Antimicrobial susceptibility testing: A review of general principles and contemporary practices. Clinical Infectious Diseases. 49 (11), 1749-1755 (2009).
  36. Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
  37. Gajic, I., et al. Antimicrobial susceptibility testing: A comprehensive review of currently used methods. Antibiotics. 11 (4), 427(2022).
  38. Gonzalez-Pastor, R., et al. Current landscape of methods to evaluate antimicrobial activity of natural extracts. Molecules. 28 (3), 1068(2023).
  39. Li, J., et al. Antimicrobial activity and resistance: Influencing factors. Frontiers in Pharmacology. 13 (8), 364(2017).
  40. Silva, A., et al. Macroalgae as a source of valuable antimicrobial compounds: Extraction and applications. Antibiotics. 9 (10), 642(2020).
  41. Munteanu, I. G., Apetrei, C. Analytical methods used in determining antioxidant activity: A review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3380(2021).
  42. Ma, S., et al. Comparison of common analytical methods for the quantification of total polyphenols and flavanols in fruit juices and ciders. Journal of Food Science. 84 (8), 2147-2158 (2019).
  43. Tziveleka, L. A., Tammam, M. A., Tzakou, O., Roussis, V., Ioannou, E. Metabolites with antioxidant activity from marine macroalgae. Antioxidants. 10 (9), 1431(2021).
  44. Ghasemi, M., Turnbull, T., Sebastian, S., Kempson, I. The MTT assay: Utility, limitations, pitfalls, and interpretation in bulk and single-cell analysis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12827(2021).
  45. Pereira, T., Barroso, S., Mendes, S., Gil, M. M. Stability, kinetics, and application study of phycobiliprotein pigments extracted from red algae Gracilaria gracilis. Journal of Food Science. 85 (10), 3400-3405 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Deniz Yosunu EkstraksiyonuBiyoaktif BileşiklerAntioksidan AktiviteSitotoksisite AnaliziDuyusal AnalizYağ Asidi ProfiliGıda Zenginleştirme
Kırmızı Deniz Yosunu Gracilaria gracilis'in Biyorafineri Yaklaşımı ile Değerlendirilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.