Pseudomonas aeruginosa Tarafından Üretilen Mono-Ramnolipidlerin ve Di-Ramnolipidlerin Tespiti ve Miktarının Belirlenmesi

Özet

Pseudomonas aeruginosa, ramnolipid biyoyüzey aktif maddelerini üretir. İnce tabaka kromatografisi, her bir suş tarafından üretilen mono- ve di-ramnolipidlerin oranını tespit eder ve belirler. Toplam ramnolipidlerin miktar tayini, orsinol yöntemi kullanılarak kültür süpernatanlarından ekstrakte edilen bu biyoyüzey aktif maddelerde bulunan ramnoz eşdeğerlerinin değerlendirilmesini içerir.

Özet

Çevresel bakteri Pseudomonas aeruginosa, sağlık açısından tehlike oluşturan yüksek antibiyotik direncine sahip fırsatçı bir patojendir. Bu bakteri, önemli biyoteknolojik değere sahip moleküller olan ancak aynı zamanda virülans özellikleriyle ilişkili olan ramnolipidler (RL) olarak bilinen yüksek düzeyde biyoyüzey aktif maddeler üretir. Bu bağlamda, RL'nin tespiti ve miktarının belirlenmesi hem biyoteknoloji uygulamaları hem de biyomedikal araştırma projeleri için yararlı olabilir. Bu makalede, ince tabaka kromatografisi (TLC) kullanılarak P. aeruginosa tarafından üretilen iki RL formunun üretimini tespit etme tekniğini adım adım gösteriyoruz: mono-ramnolipidler (mRL), bir ramnoz parçasına bağlı yağ asitlerinin (esas olarak C10-C10) bir dimerinden oluşan moleküller ve di-ramnolipidler (dRL), iki ramnoz parçasına bağlı benzer bir yağ asidi dimerinden oluşan moleküller. Ek olarak, bir P. aeruginosa kültür süpernatantından ekstrakte edilen bu biyoyüzey aktif maddelerin asit hidrolizine ve ardından orsinol ile reaksiyona giren ramnoz konsantrasyonunun tespitine dayalı olarak toplam RL miktarını ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Her iki tekniğin kombinasyonu, burada PAO1 (filogrup 1), PA14 (filogrup 2) ve PA7 (filogrup 3) tip suşları ile örneklendiği gibi, belirli bir suş tarafından üretilen mRL ve dRL'nin yaklaşık konsantrasyonunu tahmin etmek için kullanılabilir.

Giriş

Pseudomonas aeruginosa, virülansla ilişkili özelliklerin üretilmesi ve yüksek antibiyotik direnci ^1,2 nedeniyle çevresel bir bakteri ve büyük endişe kaynağı olan fırsatçı bir patojendir. Bu bakteri tarafından üretilen karakteristik bir ikincil metabolit, redoks aktivitesine sahip bir antibiyotik olan fenazin piyosiyanin ve proteaz^{elastaz 3} gibi virülansla ilişkili çeşitli özelliklerle koordineli bir şekilde üretilen biyosürfaktan RL'dir. RL'nin tensio-aktif ve emülsifikasyon özellikleri farklı endüstriyel uygulamalarda kullanılmıştır ve şu anda ticarileştirilmiştir⁴.

Filogrup 1 ve 2'ye ait çoğu P. aeruginosa suşları, iki tip RL üretir: mRL, esas olarak 10 karbonlu bir yağ asidi dimerine bağlı bir ramnoz parçasından oluşur ve dRL, ilk ramnoz^4'e bağlı ek bir ramnoz parçası içerir (bkz. Şekil 1). Bununla birlikte, iki minör P. aeruginosa filogrubunun (grup 3 ve 5) sadece mRL ^5,6 ürettiği bildirilmiştir. İki tip RL, belirtildiği gibi, esas olarak C10-C10 olan bir yağ asidi dimer karışımı içerir, ancak C12-C10, C12-C12 ve C10-C12: 1 dimerleri içeren daha küçük oranlarda moleküller de üretilir. HPLC MS/MS kullanılarak farklı suşlar tarafından üretilen RL türdeşlerinin karakterizasyonu bildirilmiştir ^7,8. Bu çalışmada açıklanan yöntemler yalnızca mRL ve dRL arasında ayrım yapabilir, ancak RL türdeşlerinin karakterizasyonu için kullanılamaz.

P. aeruginosa ve bazı Burkholderia türleri, RL^9'un doğal üreticileridir, ancak eski bakteri en verimli üreticidir. Bununla birlikte, ticari olarak kullanılan RL şu anda bu fırsatçı patojenin kullanımından kaçınmak için P. aeruginosa genlerini eksprese eden Pseudomonas putida KT2440 türevlerinde üretilmektedir^10,11. P. aeruginosa tarafından üretilen RL'nin tespiti ve miktarının belirlenmesi, virülansla ilgili özelliklerin¹² ekspresyonunda, 3 veya 5¹³ numaralı sınıflara ait suşların karakterizasyonunda yer alan moleküler mekanizmaların incelenmesi ve virülansı azaltırken bu biyosürfaktanları aşırı üreten P. aeruginosa türevlerinin oluşturulması için büyük önem taşımaktadır¹⁴. Biyoyüzey aktif maddelerin farklı mikroorganizmalar tarafından üretimi, bu bileşiklerin çökme damlası yöntemi veya emülsifikasyon indeksi¹⁵ gibi bazı genel özelliklerine dayalı olarak tespit edilmiştir, ancak bu yöntemler ne doğru ne de spesifik^{değildir 16}.

Burada, farklı P. aeruginosa tipi suşların kültür süpernatantlarından toplam RL'nin sıvı ekstraksiyonunu ve TLC kullanılarak her iki RL tipinin ayrılmasını kullanarak mRL ve dRL'yi tespit etmek için protokolü açıklıyoruz. Bu yöntemde, kültür süpernatından ekstrakte edilen RL, TLC için kullanılan çözücülerdeki diferansiyel çözünürlükleri ile ayrılır ve silika jel plakası üzerinde diferansiyel migrasyona neden olur. Bu nedenle, mRL, dRL'den daha hızlı bir migrasyona sahiptir ve plakalar kurutulduğunda ve α-naftol ile boyandığında ayrı noktalar olarak tespit edilebilirler.

TLC ile mRL ve dRL'yi tespit etmek için burada açıklanan yöntem, daha önce yayınlanmış, gerçekleştirilmesi kolay ve pahalı ekipman gerektirmeyen bir makale^17'ye dayanmaktadır. Bu yöntem, RL üretemeyen bir P. aeruginosa türevi mutant gibi uygun kontroller kullanılarak çeşitli P. aeruginosa izolatlarında¹³ RL'yi tespit etmek için yararlı olmuştur. Bununla birlikte, özgüllük eksikliği nedeniyle Pseudomonas aeruginosa dışındaki bakteriler tarafından üretilen yeni biyoyüzey aktif maddeleri karakterize etmek için tercih edilen yöntem değildir.

Ek olarak, bir P. aeruginosa kültür süpernatantından ekstrakte edilen toplam RL'nin ramnoz eşdeğerlerini ölçmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntem, orsinolün indirgeyici şekerlerle reaksiyonuna dayalı olarak bu biyoyüzey aktif maddelerin miktarını belirler ve daha önce açıklandığı gibi 421 nm'de spektrofotometrik olarak ölçülebilen bir ürünle^{sonuçlanır 18}. Orsinol ile reaksiyon ramnoza özgü olmadığından, bu yöntemin, lipopolisakkaritler (LPS) gibi önemli miktarda diğer şeker içeren molekülleri içermeyen kültür süpernatantından ekstrakte edilen RL ile gerçekleştirilmesi önemlidir. Burada RL^18'in sıvı ekstraksiyonu için asitleştirilmiş bir kloroform / metanol karışımı kullanılır, ancak etil asetat da kullanılabilir ve katı faz ekstraksiyonu (SPE) çok iyi sonuçlar verir¹⁹. Burada açıklanan orsinol yöntemi, karmaşık ekipman gerektirmez ve tartışıldığı gibi, analiz edilen numunelerin hazırlanmasında özel bir dikkatle gerçekleştirilirse güvenilir sonuçlar sağlayabilir. Uygun numune hazırlığını sağlamak için, RL²⁰ üretemeyen bir Pseudomonas aeruginosa rhlA mutantının dahil edilmesi ve her belirleme için üç biyolojik ve üç teknik kopya gerçekleştirilmesi önemlidir.

Literatürde^16,21 orsinol yöntemi ile RL tayini ile ilgili önemli tartışmalar olmuştur, bazı çalışmalar RL üretiminin fazla tahmin edildiğini ve testin ramnoz için özgüllükten yoksun olduğunu ve potansiyel olarak diğer şekerleri tespit ettiğini öne sürmektedir. Bununla birlikte, burada açıklanan yöntemlerin uygun koşullar altında doğru ve spesifik olabileceğini gösteriyoruz. Ayrıca, bu makalede özetlenen prosedürlerle karşılaştırma için, bir dRL standardının UPLC-MS/MS tespitini kullanıyoruz ve orsinol yöntemiyle benzer sonuçların elde edildiğini gösteriyoruz. Bu yöntemi kullanarak RL'yi ölçmek için ayrıntılı protokol Ek Dosya 1'de yer almaktadır.

Bu protokoller, PAO1 (filogrup 1), PA14 (filogrup 2) ve PA7 (filogrup 3) tip suşları kullanılarak örneklendirilir. Bu suşlar, iyi karakterize edildikleri ve farklı RL profilleri ürettikleri için seçilmiştir.

Protokol

Bu prosedür Ek Şekil 1'de şematize edilmiştir. Çalışma için kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. TLC kullanılarak P. aeruginosa'nın kültür süpernatantlarında mRL ve dRL'nin saptanması

1. 24 saat boyunca sıvı ortamda yetiştirilen P. aeruginosa ilgilenilen suşun santrifüjlenmiş suyu ile başlayın (RL'nin üretildiği sabit büyüme fazına ulaşmak için). Tipik olarak, bu kültürler mL başına 1 x 10⁹ bakteri içerir.
2. Konsantre HCl kullanarak kültürün pH'ını 2'ye ayarlayın.
3. 50 mL'lik bir polipropilen tüpe 5 mL asitlenmiş kültür süpernatantı koyun ve 5 mL 2: 1 kloroform: metanol karışımı ekleyin.
4. Tüpü her seferinde 10 saniye boyunca üç kez ters çevirerek çalkalayın ve her çalkalama arasında 2 dakika boyunca tüpü ters çevirmeden bırakın.
5. İki faz ayrılana kadar tüpü yaklaşık 3 saat çalkalamadan bırakın veya tüpü 4 ° C'de 3.000 x g'de 10 dakika santrifüjleyin.
6. Organik fazı (alt tabaka) temiz bir tüpe aktarın ve kuruluk oluşana kadar tüpü bir ekstraksiyon başlığında bırakın.
7. İkinci kloroformdan organik fazı koyarak adım 1.3'ten başlayarak işlemi tekrarlayın: metanol ekstraksiyonu, ilk ekstraksiyonda kullanılan tüpe koyun.
8. Organik fazı 1 mL veya 1,5 mL kalana kadar buharlaştırın. Bu hacmi 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve çözücüyü gece boyunca kuruyana kadar buharlaştırın.
9. RL'yi yeniden süspanse etmek için kurutulmuş tüpe 50 μL metanol ekleyin.
10. Silika jel plakaları üzerinde ince tabaka kromatografisi yapın.
    NOT: TLC plakasının boyutu, analiz edilecek numune sayısına göre kesilmelidir. Her numune 1,5 cm'de uygulanmalı ve uygulama noktası plakanın kenarından 1 cm uzakta olmalıdır (kurşun kalemle yatay bir çizgi çizin).
11. 10 μL'lik bir mikropipet kullanarak her numuneden 5 μL uygulayın.
12. TLC sıvı fazı, 65:15:2 kloroform: metanol: asetik asit karışımından oluşur. Bu karışımın 35 mL'sini hazırlamak için 26 mL kloroform, 6 mL metanol ve 0.8 mL %20'lik bir asetik asit stok çözeltisini karıştırın. Bu çözücüleri karıştırın ve kromatografiye başlamadan önce en az 10 dakika kapalı TLC haznesine koyun, böylece atmosfer uçucu çözücülerle doyurulur.
13. Numunelerin uygulandığı nokta ile temastan kaçınarak TLC plakasını hazneye yerleştirin.
14. Hazneyi kapatın ve çözücü plakanın kenarından 1 cm öncesine ulaşana kadar TLC'yi bırakın. Bu noktada, plakayı çıkarın ve kurumasını bekleyin (işlemi hızlandırmak için bir hava akışı uygulanabilir).
15. Bu bileşiğin 5 g'ını 33 mL etanol içinde çözerek bir α-naftol çözeltisi hazırlayın. Çözündükten sonra 127.5 mL etanol, 12.6 mL su ve 20.5 mL soğuk H_2S04 ekleyin.
16. mRL ve dRL'nin varlığını tespit etmek için, α-naftol solüsyonunu ekstraksiyon davlumbazındaki plakaya püskürtün ve püskürtülen plakayı, RL'nin pembemsi işareti görünene kadar birkaç dakika boyunca 85 °C'de bir fırına koyun.
17. Her noktanın yoğunluğunu algılayan bir yazılım kullanarak her örnekte bulunan mono- ve di-RL oranını hesaplamak için TLC'nin bir resmini kullanın.

2. Biyosürfaktaktan içinde bulunan ramnoz eşdeğerlerinin ölçülmesi toplam RL miktarının ölçülmesi

1. 1.2 mL sabit faz kültürünü (24 saat büyütülmüş) 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve 4 ° C'de 3.000 x g'da 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı temiz bir tüpte toplayın.
2. 333 μL'yi temiz bir tüpe aktarın (bu adımı üç kopya halinde gerçekleştirin) ve 1 mL eter ekleyin.
3. 30 saniye boyunca bir girdapta kuvvetlice karıştırın. Bu işlemi her seferinde bir tüp ile tekrarlayın.
4. 4 ° C'de 3.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin. Organik fazı (üst faz) toplayın, temiz bir tüpe aktarın ve kuruluk oluşana kadar davlumbazda açık bırakın.
5. Ekstraksiyon işlemini adım 2.2'de açıklandığı gibi eter ile tekrarlayın. 2.3 ve 2.4 adımlarını tekrarlayın.
6. Tamamen kuruduktan sonra, her tüpe 1 mL su ekleyin. RL'nin nemlenmesine izin vermek için tüpleri 12 saat bekletin, ardından girdapta kuvvetlice çalkalayın.
7. Temiz bir şişeyi 5 dakika boyunca buza koyun (ekzotermik bir reaksiyon olduğu için). % 60 H_2S04 'lük bir çözelti hazırlayın (şişeyi ışıktan koruyun).
8. Temiz bir tüpte, damıtılmış suda% 1.6'lık bir orsinol çözeltisi hazırlayın. Orsinol reaktifini hazırlamak için,% 60 H_2S04 çözeltisinin 4.4 mL'sini% 1.6 orsinol çözeltisinin 0.6 mL'sini karıştırın.
9. Gerekli orsinol reaktifinin son hacmini hesaplayın. Farklı ramnoz konsantrasyonları kullanarak (tipik olarak, 1 μg/mL ila 9 μg/mL aralığında 9 ramnoz konsantrasyonu kullanılır) ve biri 100 μL su ile her numuneye ve kalibrasyon eğrisinin her konsantrasyonuna bu reaktiften 900 μL ekleyin, hepsinin üç kopya halinde gerçekleştirilmesini sağlayın.
10. Bir cam tüp içinde 900 μL orsinol reaktifine her RL örneğinden 100 μL ekleyin ve iki çözeltiyi karıştırın.
11. Önceden 80 °C'ye ısıtılmış bir su banyosunda 30 dakika inkübe edin.
12. Tüplerin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
13. Bir kuvars hücresi kullanarak numunelerin absorbansını ve 421 nm'deki kalibrasyon eğrisini okuyun.
14. Kalibrasyon eğrisi üzerindeki absorbansı enterpolasyon yaparak ve belirleme için kullanılan hacmi göz önünde bulundurarak her bir numunedeki ramnoz konsantrasyonunu hesaplayın.
15. μM konsantrasyonunu hesaplamak için, μg/mL cinsinden elde edilen konsantrasyonu 182.2'ye (ramnozun moleküler ağırlığı) bölün ve 1000 ile çarpın.

Sonuçlar

Bu makalede, her biri farklı RL üretim seviyelerine ve mRL ve dRL oranlarına sahip üç filogrubu temsil etmek için üç farklı P. aeruginosa tipi suş kullanılmıştır. Bu suşlar arasında PAO1 (Avustralya'dan bir yara izolatı, 1955²²), PA14 (ABD'den bir bitki izolatı, 1977²³) ve PA7 (Arjantin'den bir klinik izolat,^{2010 24}) bulunur. Negatif bir kontrol olarak, RL üretimi yapamayan PAO1 rhlA mutantı kullanıldı. Tüm suşlar, 37 ° C'de yüksek RL seviye...

Tartışma

RL'yi tespit etmek ve ölçmek için en doğru yöntem, kütle spektrometresi (MS) ile birleştirilmiş HPLC'dir7,8,27; Bununla birlikte, birçok araştırmacı tarafından erişilemeyebilecek özel ve pahalı ekipman gerektirir. Burada açıklanan yöntemler, RL konsantrasyonlarını tespit etmek ve tahmin etmek için temel laboratuvar malzemeleri ve ekipmanları ile rutin olarak gerçekleştirilebilir, ancak özellikle mRL ve dRL karışımlarını belirlem...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
1-NAPHTHOL	SIGMA-ALDRICH	70442
ASETİK ASİT	J.T. BAKER	9508-02
SANTRİFÜJ			1.5 mL ve  50 mL
KLOROFORM	J.T. BAKER	9180-02
KURUTMA FIRINI
ETER	J.T. BAKER	9244-02
CAM PIPET	SIGMA-ALDRICH
HIDROKLORIK ASIT	J.T. BAKER	5622-02
LB
L-RAMNOZ MONOHIDRAT	SIGMA-ALDRICH	R-3875
METANOL	J.T. BAKER	9049-02
ORSINOL MONOHIDRAT	SIGMA-ALDRICH	O1875
PPGAS Et Suyu			Tris HCL (0.12M), Potasyum Klorür (0.02M) Amonyum Klorür (0.02M),   Pepton (% 1), pH 7.4    Otoklavlanmış. Ekle  Glikoz (% 5) ve Magnezyum Sülfat (0.0016M)
KUVARS HÜCRELİ (KÜVET)	SIGMA-ALDRICH	Z276669
DİKDÖRTGEN TLC GELİŞTİRME	TANKI FISHER SCIENTIFIC
RAMNOLİPTİPLER	SIGMA-ALDRICH	R-90
SPEKTROFOTOMETRE			VIS
PÜSKÜRTÜCÜ	SIGMA-ALDRICH	Z529710-1EA
SÜLFÜRİK ASİT	JT BAKER	9681-02
TES TÜPLERİ 5mL	CORNING	352002
TLC SILIKA JEL 60 F254	MERCK	1.05554.0001
SU BANYOSU			> 80 derece Ç

CLS706510 K4161801020