Yöntem makalesi

Pseudomonas aeruginosa Tarafından Üretilen Mono-Ramnolipidlerin ve Di-Ramnolipidlerin Tespiti ve Miktarının Belirlenmesi

DOI:

10.3791/65934

⸱

29 Mart 2024

 ,  , 
1Departamento de Biología Molecular y Biotecnología, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Departamento de Infectología e Inmunología, Instituto Nacional de Perinatología

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pseudomonas aeruginosa, ramnolipid biyoyüzey aktif maddelerini üretir. İnce tabaka kromatografisi, her bir suş tarafından üretilen mono- ve di-ramnolipidlerin oranını tespit eder ve belirler. Toplam ramnolipidlerin miktar tayini, orsinol yöntemi kullanılarak kültür süpernatanlarından ekstrakte edilen bu biyoyüzey aktif maddelerde bulunan ramnoz eşdeğerlerinin değerlendirilmesini içerir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çevresel bakteri Pseudomonas aeruginosa, sağlık açısından tehlike oluşturan yüksek antibiyotik direncine sahip fırsatçı bir patojendir. Bu bakteri, önemli biyoteknolojik değere sahip moleküller olan ancak aynı zamanda virülans özellikleriyle ilişkili olan ramnolipidler (RL) olarak bilinen yüksek düzeyde biyoyüzey aktif maddeler üretir. Bu bağlamda, RL'nin tespiti ve miktarının belirlenmesi hem biyoteknoloji uygulamaları hem de biyomedikal araştırma projeleri için yararlı olabilir. Bu makalede, ince tabaka kromatografisi (TLC) kullanılarak P. aeruginosa tarafından üretilen iki RL formunun üretimini tespit etme tekniğini adım adım gösteriyoruz: mono-ramnolipidler (mRL), bir ramnoz parçasına bağlı yağ asitlerinin (esas olarak C10-C10) bir dimerinden oluşan moleküller ve di-ramnolipidler (dRL), iki ramnoz parçasına bağlı benzer bir yağ asidi dimerinden oluşan moleküller. Ek olarak, bir P. aeruginosa kültür süpernatantından ekstrakte edilen bu biyoyüzey aktif maddelerin asit hidrolizine ve ardından orsinol ile reaksiyona giren ramnoz konsantrasyonunun tespitine dayalı olarak toplam RL miktarını ölçmek için bir yöntem sunuyoruz. Her iki tekniğin kombinasyonu, burada PAO1 (filogrup 1), PA14 (filogrup 2) ve PA7 (filogrup 3) tip suşları ile örneklendiği gibi, belirli bir suş tarafından üretilen mRL ve dRL'nin yaklaşık konsantrasyonunu tahmin etmek için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pseudomonas aeruginosa, virülansla ilişkili özelliklerin üretilmesi ve yüksek antibiyotik direnci 1,2 nedeniyle çevresel bir bakteri ve büyük endişe kaynağı olan fırsatçı bir patojendir. Bu bakteri tarafından üretilen karakteristik bir ikincil metabolit, redoks aktivitesine sahip bir antibiyotik olan fenazin piyosiyanin ve proteazelastaz 3 gibi virülansla ilişkili çeşitli özelliklerle koordineli bir şekilde üretilen biyosürfaktan RL'dir. RL'nin tensio-aktif ve emülsifikasyon özellikleri farklı endüstriyel uygulamalarda kullanılmıştır ve şu anda ticarileştirilmiştir4.

Filogrup 1 ve 2'ye ait çoğu P. aeruginosa suşları, iki tip RL üretir: mRL, esas olarak 10 karbonlu bir yağ asidi dimerine bağlı bir ramnoz parçasından oluşur ve dRL, ilk ramnoz4'e bağlı ek bir ramnoz parçası içerir (bkz. Şekil 1). Bununla birlikte, iki minör P. aeruginosa filogrubunun (grup 3 ve 5) sadece mRL 5,6 ürettiği bildirilmiştir. İki tip RL, belirtildiği gibi, esas olarak C10-C10 olan bir yağ asidi dimer karışımı içerir, ancak C12-C10, C12-C12 ve C10-C12: 1 dimerleri içeren daha küçük oranlarda moleküller de üretilir. HPLC MS/MS kullanılarak farklı suşlar tarafından üretilen RL türdeşlerinin karakterizasyonu bildirilmiştir 7,8. Bu çalışmada açıklanan yöntemler yalnızca mRL ve dRL arasında ayrım yapabilir, ancak RL türdeşlerinin karakterizasyonu için kullanılamaz.

P. aeruginosa ve bazı Burkholderia türleri, RL9'un doğal üreticileridir, ancak eski bakteri en verimli üreticidir. Bununla birlikte, ticari olarak kullanılan RL şu anda bu fırsatçı patojenin kullanımından kaçınmak için P. aeruginosa genlerini eksprese eden Pseudomonas putida KT2440 türevlerinde üretilmektedir10,11. P. aeruginosa tarafından üretilen RL'nin tespiti ve miktarının belirlenmesi, virülansla ilgili özelliklerin12 ekspresyonunda, 3 veya 513 numaralı sınıflara ait suşların karakterizasyonunda yer alan moleküler mekanizmaların incelenmesi ve virülansı azaltırken bu biyosürfaktanları aşırı üreten P. aeruginosa türevlerinin oluşturulması için büyük önem taşımaktadır14. Biyoyüzey aktif maddelerin farklı mikroorganizmalar tarafından üretimi, bu bileşiklerin çökme damlası yöntemi veya emülsifikasyon indeksi15 gibi bazı genel özelliklerine dayalı olarak tespit edilmiştir, ancak bu yöntemler ne doğru ne de spesifikdeğildir 16.

Burada, farklı P. aeruginosa tipi suşların kültür süpernatantlarından toplam RL'nin sıvı ekstraksiyonunu ve TLC kullanılarak her iki RL tipinin ayrılmasını kullanarak mRL ve dRL'yi tespit etmek için protokolü açıklıyoruz. Bu yöntemde, kültür süpernatından ekstrakte edilen RL, TLC için kullanılan çözücülerdeki diferansiyel çözünürlükleri ile ayrılır ve silika jel plakası üzerinde diferansiyel migrasyona neden olur. Bu nedenle, mRL, dRL'den daha hızlı bir migrasyona sahiptir ve plakalar kurutulduğunda ve α-naftol ile boyandığında ayrı noktalar olarak tespit edilebilirler.

TLC ile mRL ve dRL'yi tespit etmek için burada açıklanan yöntem, daha önce yayınlanmış, gerçekleştirilmesi kolay ve pahalı ekipman gerektirmeyen bir makale17'ye dayanmaktadır. Bu yöntem, RL üretemeyen bir P. aeruginosa türevi mutant gibi uygun kontroller kullanılarak çeşitli P. aeruginosa izolatlarında13 RL'yi tespit etmek için yararlı olmuştur. Bununla birlikte, özgüllük eksikliği nedeniyle Pseudomonas aeruginosa dışındaki bakteriler tarafından üretilen yeni biyoyüzey aktif maddeleri karakterize etmek için tercih edilen yöntem değildir.

Ek olarak, bir P. aeruginosa kültür süpernatantından ekstrakte edilen toplam RL'nin ramnoz eşdeğerlerini ölçmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntem, orsinolün indirgeyici şekerlerle reaksiyonuna dayalı olarak bu biyoyüzey aktif maddelerin miktarını belirler ve daha önce açıklandığı gibi 421 nm'de spektrofotometrik olarak ölçülebilen bir ürünlesonuçlanır 18. Orsinol ile reaksiyon ramnoza özgü olmadığından, bu yöntemin, lipopolisakkaritler (LPS) gibi önemli miktarda diğer şeker içeren molekülleri içermeyen kültür süpernatantından ekstrakte edilen RL ile gerçekleştirilmesi önemlidir. Burada RL18'in sıvı ekstraksiyonu için asitleştirilmiş bir kloroform / metanol karışımı kullanılır, ancak etil asetat da kullanılabilir ve katı faz ekstraksiyonu (SPE) çok iyi sonuçlar verir19. Burada açıklanan orsinol yöntemi, karmaşık ekipman gerektirmez ve tartışıldığı gibi, analiz edilen numunelerin hazırlanmasında özel bir dikkatle gerçekleştirilirse güvenilir sonuçlar sağlayabilir. Uygun numune hazırlığını sağlamak için, RL20 üretemeyen bir Pseudomonas aeruginosa rhlA mutantının dahil edilmesi ve her belirleme için üç biyolojik ve üç teknik kopya gerçekleştirilmesi önemlidir.

Literatürde16,21 orsinol yöntemi ile RL tayini ile ilgili önemli tartışmalar olmuştur, bazı çalışmalar RL üretiminin fazla tahmin edildiğini ve testin ramnoz için özgüllükten yoksun olduğunu ve potansiyel olarak diğer şekerleri tespit ettiğini öne sürmektedir. Bununla birlikte, burada açıklanan yöntemlerin uygun koşullar altında doğru ve spesifik olabileceğini gösteriyoruz. Ayrıca, bu makalede özetlenen prosedürlerle karşılaştırma için, bir dRL standardının UPLC-MS/MS tespitini kullanıyoruz ve orsinol yöntemiyle benzer sonuçların elde edildiğini gösteriyoruz. Bu yöntemi kullanarak RL'yi ölçmek için ayrıntılı protokol Ek Dosya 1'de yer almaktadır.

Bu protokoller, PAO1 (filogrup 1), PA14 (filogrup 2) ve PA7 (filogrup 3) tip suşları kullanılarak örneklendirilir. Bu suşlar, iyi karakterize edildikleri ve farklı RL profilleri ürettikleri için seçilmiştir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu prosedür Ek Şekil 1'de şematize edilmiştir. Çalışma için kullanılan reaktifler ve ekipmanlar Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. TLC kullanılarak P. aeruginosa'nın kültür süpernatantlarında mRL ve dRL'nin saptanması

  1. 24 saat boyunca sıvı ortamda yetiştirilen P. aeruginosa ilgilenilen suşun santrifüjlenmiş suyu ile başlayın (RL'nin üretildiği sabit büyüme fazına ulaşmak için). Tipik olarak, bu kültürler mL başına 1 x 109 bakteri içerir.
  2. Konsantre HCl kullanarak kültürün pH'ını 2'ye ayarlayın.
  3. 50 mL'lik bir polipropilen tüpe 5 mL asitlenmiş kültür süpernatantı koyun ve 5 mL 2: 1 kloroform: metanol karışımı ekleyin.
  4. Tüpü her seferinde 10 saniye boyunca üç kez ters çevirerek çalkalayın ve her çalkalama arasında 2 dakika boyunca tüpü ters çevirmeden bırakın.
  5. İki faz ayrılana kadar tüpü yaklaşık 3 saat çalkalamadan bırakın veya tüpü 4 ° C'de 3.000 x g'de 10 dakika santrifüjleyin.
  6. Organik fazı (alt tabaka) temiz bir tüpe aktarın ve kuruluk oluşana kadar tüpü bir ekstraksiyon başlığında bırakın.
  7. İkinci kloroformdan organik fazı koyarak adım 1.3'ten başlayarak işlemi tekrarlayın: metanol ekstraksiyonu, ilk ekstraksiyonda kullanılan tüpe koyun.
  8. Organik fazı 1 mL veya 1,5 mL kalana kadar buharlaştırın. Bu hacmi 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve çözücüyü gece boyunca kuruyana kadar buharlaştırın.
  9. RL'yi yeniden süspanse etmek için kurutulmuş tüpe 50 μL metanol ekleyin.
  10. Silika jel plakaları üzerinde ince tabaka kromatografisi yapın.
    NOT: TLC plakasının boyutu, analiz edilecek numune sayısına göre kesilmelidir. Her numune 1,5 cm'de uygulanmalı ve uygulama noktası plakanın kenarından 1 cm uzakta olmalıdır (kurşun kalemle yatay bir çizgi çizin).
  11. 10 μL'lik bir mikropipet kullanarak her numuneden 5 μL uygulayın.
  12. TLC sıvı fazı, 65:15:2 kloroform: metanol: asetik asit karışımından oluşur. Bu karışımın 35 mL'sini hazırlamak için 26 mL kloroform, 6 mL metanol ve 0.8 mL %20'lik bir asetik asit stok çözeltisini karıştırın. Bu çözücüleri karıştırın ve kromatografiye başlamadan önce en az 10 dakika kapalı TLC haznesine koyun, böylece atmosfer uçucu çözücülerle doyurulur.
  13. Numunelerin uygulandığı nokta ile temastan kaçınarak TLC plakasını hazneye yerleştirin.
  14. Hazneyi kapatın ve çözücü plakanın kenarından 1 cm öncesine ulaşana kadar TLC'yi bırakın. Bu noktada, plakayı çıkarın ve kurumasını bekleyin (işlemi hızlandırmak için bir hava akışı uygulanabilir).
  15. Bu bileşiğin 5 g'ını 33 mL etanol içinde çözerek bir α-naftol çözeltisi hazırlayın. Çözündükten sonra 127.5 mL etanol, 12.6 mL su ve 20.5 mL soğuk H2S04 ekleyin.
  16. mRL ve dRL'nin varlığını tespit etmek için, α-naftol solüsyonunu ekstraksiyon davlumbazındaki plakaya püskürtün ve püskürtülen plakayı, RL'nin pembemsi işareti görünene kadar birkaç dakika boyunca 85 °C'de bir fırına koyun.
  17. Her noktanın yoğunluğunu algılayan bir yazılım kullanarak her örnekte bulunan mono- ve di-RL oranını hesaplamak için TLC'nin bir resmini kullanın.

2. Biyosürfaktaktan içinde bulunan ramnoz eşdeğerlerinin ölçülmesi toplam RL miktarının ölçülmesi

  1. 1.2 mL sabit faz kültürünü (24 saat büyütülmüş) 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve 4 ° C'de 3.000 x g'da 3 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı temiz bir tüpte toplayın.
  2. 333 μL'yi temiz bir tüpe aktarın (bu adımı üç kopya halinde gerçekleştirin) ve 1 mL eter ekleyin.
  3. 30 saniye boyunca bir girdapta kuvvetlice karıştırın. Bu işlemi her seferinde bir tüp ile tekrarlayın.
  4. 4 ° C'de 3.000 x g'da 2 dakika santrifüjleyin. Organik fazı (üst faz) toplayın, temiz bir tüpe aktarın ve kuruluk oluşana kadar davlumbazda açık bırakın.
  5. Ekstraksiyon işlemini adım 2.2'de açıklandığı gibi eter ile tekrarlayın. 2.3 ve 2.4 adımlarını tekrarlayın.
  6. Tamamen kuruduktan sonra, her tüpe 1 mL su ekleyin. RL'nin nemlenmesine izin vermek için tüpleri 12 saat bekletin, ardından girdapta kuvvetlice çalkalayın.
  7. Temiz bir şişeyi 5 dakika boyunca buza koyun (ekzotermik bir reaksiyon olduğu için). % 60 H2S04 'lük bir çözelti hazırlayın (şişeyi ışıktan koruyun).
  8. Temiz bir tüpte, damıtılmış suda% 1.6'lık bir orsinol çözeltisi hazırlayın. Orsinol reaktifini hazırlamak için,% 60 H2S04 çözeltisinin 4.4 mL'sini% 1.6 orsinol çözeltisinin 0.6 mL'sini karıştırın.
  9. Gerekli orsinol reaktifinin son hacmini hesaplayın. Farklı ramnoz konsantrasyonları kullanarak (tipik olarak, 1 μg/mL ila 9 μg/mL aralığında 9 ramnoz konsantrasyonu kullanılır) ve biri 100 μL su ile her numuneye ve kalibrasyon eğrisinin her konsantrasyonuna bu reaktiften 900 μL ekleyin, hepsinin üç kopya halinde gerçekleştirilmesini sağlayın.
  10. Bir cam tüp içinde 900 μL orsinol reaktifine her RL örneğinden 100 μL ekleyin ve iki çözeltiyi karıştırın.
  11. Önceden 80 °C'ye ısıtılmış bir su banyosunda 30 dakika inkübe edin.
  12. Tüplerin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
  13. Bir kuvars hücresi kullanarak numunelerin absorbansını ve 421 nm'deki kalibrasyon eğrisini okuyun.
  14. Kalibrasyon eğrisi üzerindeki absorbansı enterpolasyon yaparak ve belirleme için kullanılan hacmi göz önünde bulundurarak her bir numunedeki ramnoz konsantrasyonunu hesaplayın.
  15. μM konsantrasyonunu hesaplamak için, μg/mL cinsinden elde edilen konsantrasyonu 182.2'ye (ramnozun moleküler ağırlığı) bölün ve 1000 ile çarpın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, her biri farklı RL üretim seviyelerine ve mRL ve dRL oranlarına sahip üç filogrubu temsil etmek için üç farklı P. aeruginosa tipi suş kullanılmıştır. Bu suşlar arasında PAO1 (Avustralya'dan bir yara izolatı, 195522), PA14 (ABD'den bir bitki izolatı, 197723) ve PA7 (Arjantin'den bir klinik izolat,2010 24) bulunur. Negatif bir kontrol olarak, RL üretimi yapamayan PAO1 rhlA mutantı kullanıldı. Tüm suşlar, 37 ° C'de yüksek RL seviyeleri25'i teşvik etmek için özel olarak tasarlanmış PPGAS ortamında 24 saat boyunca yetiştirildi. PPGAS kültürleri, bir LB ortamı26 gece kültürü kullanılarak 600 nm'de 0.05'lik bir optik yoğunlukta aşılandı. Tipik olarak, P. aeruginosa suşları, 24 saat sonra PPGAS ortamında 600 nm'de ölçülen 2'lik bir optik yoğunluğa ulaşır, bu da kabaca mL başına 1 x 109 bakteriye karşılık gelir. RL tespiti ve miktar tayini için kültür süpernatantlarını toplamak için, kültürler 15 dakika boyunca 4 ° C'de 3.000 x g'da santrifüjlendi ve hücre peleti atıldı. Bu iki yöntem kullanılarak elde edilen sonuçlar (Şekil 2 ve Şekil 3), her bir suş tarafından üretilen hem RL tiplerinin hem de üretim miktarlarının analiz edilen üç suş arasında farklılık gösterdiğini göstermektedir. Şekil 2'de gösterildiği gibi, PAO1 yaklaşık 0 mRL ve p dRL üretirken, PA14 P mRL ve P dRL'lik eşit bir oran üretir ve PA7 yalnızca mRL üretir. Bu RL üretim profili, öncekiraporlarla tutarlıdır 12,14.

Şekil 3A , bu üç tip suşun her biri tarafından üretilen RL'de bulunan ramnoz eşdeğerlerinin miktarını göstermektedir. Tespit edilen ramnoz miktarlarından, PA14 suşunun en yüksek miktarda RL ürettiği, PA7 suşunun ise en düşük miktarı ürettiği açıktır. Bununla birlikte, bu sonuçlar tek başına her bir suş tarafından üretilen μM RL konsantrasyonunu tahmin etmek için kullanılamaz. Ek olarak, orsinol yöntemi tek başına yaklaşık bir RL konsantrasyonu sağlayamaz, çünkü ilgilenilen her bir suş tarafından üretilen mRL ve dRL oranlarının karakterize edilmesine dayanır. Bu nedenle, μM RL konsantrasyonunun bir tahminini elde etmek için, TLC'de belirlenen her bir RL tipinin oranı dikkate alınmalı ve farklı ramnoz konsantrasyonlarına sahip standart bir eğri dahil edilmelidir (Şekil 3B).

Orsinol yöntemi, bu biyo-yüzey aktif maddenin yalnızca bir türü üretildiğinde RL konsantrasyonunu ölçmek için gerçekten de kullanılabilir. Bu gibi durumlarda, tespit edilen ramnozun μM konsantrasyonu doğrudan mRL'nin μM konsantrasyonuna karşılık gelir. dRL için, her bir dRL molekülünün hidrolizi ile iki ramnoz üretildiğinden, RL'de tespit edilen μM ramnoz konsantrasyonunun, μM konsantrasyonlarını elde etmek için 2'ye bölünmesi gerekir (bkz. Şekil 4).

Bununla birlikte, P. aeruginosa suşlarının çoğu, değişen oranlarda ( Şekil 2'de gösterildiği gibi) her iki tip RL'yi de üretir, bu da toplam RL'nin yalnızca yaklaşık bir konsantrasyonunu belirlemeyi mümkün kılar. Bunu dikkate alarak, her bir suş için RL üretimini aşağıdaki gibi tahmin ettik: PA7 suşu için, sadece mRL ürettiğinden, RL'nin ramnoz oluşturan kısmı (44.6 μg/mL + 4.5 μg/mL) doğrudan μM konsantrasyonuna (244.78) karşılık gelir, bu da kültür süpernatantındaki bu biyosürfaktağın konsantrasyonunu temsil eder, çünkü her RL molekülü bir ramnoz parçası içerir. Bununla birlikte, PAO1 suşu için, tespit edilen ramnoz konsantrasyonu 111.55 μg/mL + 11.41 μg/mL olmasına rağmen, sadece 0'u mRL'ye karşılık gelir. Bu nedenle, RL moleküllerinin p'i molekül başına iki ramnoz içerir. RL konsantrasyonunu tahmin etmek için, μM ramnoz konsantrasyonu (612.24), 1/5'in mRL (122.49) ve 2/5'in (244.89) dRL'ye μM konsantrasyonuna karşılık geldiği göz önüne alındığında 5'e bölündü. Bu nedenle, bu suş tarafından üretilen yaklaşık μM RL konsantrasyonu 367.39'dur.

PA14 suşu için tespit edilen ramnoz konsantrasyonu 194.39 μg / mL + 11.5 μg / mL idi, bu da μM konsantrasyonuna (1.066.9) dönüştürüldü ve 3'e bölündü. Sonuç, her tipin P'de üretildiği ve dRL'nin molekül başına 2 ramnoz içerdiği göz önüne alındığında, her bir RL tipinin konsantrasyonunu temsil eder. Bu nedenle, bu suş 355.63 μM mRL ve aynı dRL konsantrasyonu üretir, bu da yaklaşık 711.27'lik bir μM RL konsantrasyonu ile sonuçlanır, bu da PAO1 suşunun neredeyse iki katı ve PA7 suşu tarafından üretilen konsantrasyonun neredeyse üç katı olur.

figure-results-1
Şekil 1: Mono-ramnolipidlerin ve di-ramnolipidlerin ana türdeşlerinin kimyasal bileşimi. (A) Mono-ramnolipidler. (B) Di-ramnolipidler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: İnce tabaka kromatografisi ile mono-ramnolipidlerin ve di-ramnolipidlerin tespiti. (A) RL standartlarını ve PAO1, PA14, PA7 suşları ve PAO1'den türetilen ΔrhlA mutantı tarafından üretilen RL'yi gösteren bir TLC plakasının resmi. (B) (A)'da test edilen numunelerin her birindeki her bir RL tipinin (mRL ve dRL) oranının ImageJ yazılımı kullanılarak tahmini. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Orsinol yöntemi kullanılarak RL konsantrasyonunun miktar tayini. (A) PAO1 (siyah çubuk), PA14 (açık gri çubuk) ve PA7 (koyu gri çubuk) suşlarının kültür süpernatantlarından ekstrakte edilen RL'de bulunan ramnoz konsantrasyonu (μg/mL). Çubuklar standart sapmayı gösterir. (B) (A)'da gösterilen deney için ramnoz kalibrasyon eğrisi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: dRL miktar tayini için UPLC-MS/MS ile karşılaştırıldığında orsinol yönteminin doğrulanması. (A) dRL standardı, UPLC-MS/MS kullanılarak ölçülmüştür. (B) mM cinsinden ifade edilen ramnoz konsantrasyonu ile karşılaştırıldığında orsinol yöntemi. (C) Ramnoz ile aynı mM dRL konsantrasyonu, beklendiği gibi 421 nm'de yaklaşık iki kat daha fazla absorbans sağlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Protokolün şematik gösterimi. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: dRL'yi UPLC-MS/MS ile ölçmek için ayrıntılı protokol. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RL'yi tespit etmek ve ölçmek için en doğru yöntem, kütle spektrometresi (MS) ile birleştirilmiş HPLC'dir7,8,27; Bununla birlikte, birçok araştırmacı tarafından erişilemeyebilecek özel ve pahalı ekipman gerektirir. Burada açıklanan yöntemler, RL konsantrasyonlarını tespit etmek ve tahmin etmek için temel laboratuvar malzemeleri ve ekipmanları ile rutin olarak gerçekleştirilebilir, ancak özellikle mRL ve dRL karışımlarını belirlemedeki yanlışlıkları olmak üzere bazı sınırlamaları vardır. Ayrıca, RL miktar tayini için kullanılan numunenin hazırlanması dikkatli bir şekilde yürütülmelidir. RL tespiti ve miktar tayini için kullanılan kültürler, hücreler toplanabileceğinden veya parçalanabileceğinden, elde edilen sonuçlarda değişkenliğe neden olabilecek homojen olmayan hücre süspansiyonlarına neden olabileceğinden, geç durağan fazda olmamalıdır. Ek olarak, hücresel kalıntılar orsinol yöntemiyle etkileşime girebilir.

Açıklanan protokol, RL üretemeyen bir Pseudomonas aeruginosa suşu gibi uygun kontrollerle gerçekleştirildiğinde doğru sonuçlar elde edilebilir (bu çalışmada kullanılan PAO1 ΔrhlA mutant20 gibi, Şekil 2). Bu sonuçlar, farklı P. aeruginosa izolatlarını12,13 karakterize etmek, RL üretimini artırmak için suşları genetik olarak modifiye etmek14 veya çeşitli P. aeruginosa izolatları12 tarafından RL üretiminin moleküler genetiğini incelemek için yararlıdır.

Bu nedenle, burada açıklanan yöntemler, Pseudomonas aeruginosa suşlarını virülans faktörleri üretimi için karakterize etmek ve özellikle araştırmanın erken aşamalarında biyoteknolojik potansiyellerini değerlendirmek için kullanılabilir. Bu yöntemlerin HPLC / MS gibi tekniklerin yerine geçmediğini, bunun yerine ilk suş karakterizasyonu ve P. aeruginosa suşlarının genetik manipülasyonu için erişilebilir teknikler olarak tasarlandığını belirtmek önemlidir.

Ayrıca, araştırma odağı biyomedikal amaçlar için RL üretimi üzerineyse, RL üretiminin Pseudomonas aeruginosa tarafından üretilen birkaç faktörden sadece biri olduğunu kabul etmek çok önemlidir. Ek olarak, üretilen RL'nin tipi veya üretim miktarı, virülans birden fazla faktörden etkilendiğinden, belirli bir suşun virülansı ile sıkı bir şekilde ilişkili değildir28.

Burada açıklanan yöntemlerin tekrarlanabilirliği ile ilgili olarak, hem TLC ile RL'nin tespitinde (adım 1.6) hem de orsinol yöntemi kullanılarak RL'nin ölçümünde (adım 2.4) organik fazlar elde edilirken özel dikkat gösterilmelidir. Ekstraksiyon sırasında alınan diğer fazın küçük bir miktarı bile elde edilen sonuçlarda önemli değişikliklere yol açabilir. RL'nin kültür süpernatantından ekstraksiyonu, orsinol yöntemi ile güvenilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmede kritik bir adımdır. Organik faz toplanırken, ara faz ve sıvı fazın hariç tutulması çok önemlidir. Bir eter fazı 3 saat içinde tamamen kurutulmazsa, muhtemelen su içerir ve bu da yeni bir ekstraksiyon gerektirir.

RL kantitasyonu için orsinol yönteminin kullanımı, doğruluğuna ve özgüllüğüne karşı argümanlarla tartışılmıştır. RL'nin genellikle fazla tahmin edildiği iddia edilmiştir ve orsinol sadece ramnozla değil, farklı şekerlerle de reaksiyona girebildiğinden yöntem spesifik değildir. Mevcut veriler, RL'nin kültür süpernatından verimli bir şekilde ekstrakte edilmesi durumunda, rhlA mutantı negatif bir kontrol olarak kullanıldığında reaksiyon eksikliği ile gösterildiği gibi, bu tekniğin spesifik olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, ekstraksiyon prosedüründen bağımsız olarak, yöntemin tespitteki doğruluğuna dair ek kanıt sağlamak için, daha önce27 tarif edildiği gibi UPLC-MS/MS ile bir dRL standardı tespit ettik ve elde edilen sonuçları orsinol yöntemi18 ile karşılaştırdık (Ek Dosya 1, Şekil 4A). Raporedildiği gibi, 18 olarak, bu yöntem kullanılarak ölçülen RL konsantrasyonu arasında çok iyi bir korelasyon bulduk, burada tespit edilen her μM dRL konsantrasyonu, aynı ramnoz μM konsantrasyonunun 421 nm'de absorbansın yaklaşık iki katına karşılık gelir (Şekil 4B, C). Bu kontrol deneyi, RL miktar tayini için bu yöntemin doğruluğunu açıkça göstermektedir.

Bununla birlikte, mRL ve dRL karışımlarının konsantrasyonunun orsinol yöntemi ile ölçülmesinin zorluğu nedeniyle, çoğu yayın sonuçları RL'de ramnoz eşdeğerleri olarak rapor etmektedir. Bu değer, burada sunulan örneklerde gösterildiği gibi gerçek RL konsantrasyonu ile doğrudan bir korelasyona sahip olmayabilir, ancak yine de, özellikle aynı P. aeruginosa suşu kullanıldığında, farklı koşullar altında RL miktarlarını karşılaştırmak için yararlı bir araç olarak hizmet eder.

Tükenmez kalemlerde yaygın olarak kullanılan hidrofobik boya Victoria Pure Blue BO'nun çözündürülmesine dayanan mRL ve dRL miktar tayini için alternatif bir yöntem bildirilmiştir29. Bu yöntem hızlı ve ucuzdur. Bununla birlikte, bu protokol, P. putida tarafından RL'nin heterolog üretimini ölçmek için geliştirilmiştir ve mavi toksin pyocyanin'in ekspresyonu bu yöntemle etkileşime girdiğinden, P. aeruginosa tarafından üretilen RL ile kullanım için uygun değildir.

Özetle, burada açıklanan yöntemler, karmaşık ve pahalı ekipman gerektirmeyen P. aeruginosa tarafından üretilen RL'nin tespiti ve miktarının belirlenmesi için uygun bir alternatif sunmaktadır. Araştırmacıların çeşitli deneysel ortamlarda RL üretimini değerlendirmeleri için pratik bir yaklaşım sağlarlar.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GSCh laboratuvarı kısmen Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), Dirección General de Asuntos del Personal Académico -UNAM'dan hibe IN201222 ile desteklenmektedir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1-NAPHTHOLSIGMA-ALDRICH70442
ASETİK ASİTJ.T. BAKER9508-02
SANTRİFÜJ1.5 mL ve  50 mL
KLOROFORMJ.T. BAKER9180-02
KURUTMA FIRINI
ETERJ.T. BAKER9244-02
CAM PIPETSIGMA-ALDRICH
HIDROKLORIK ASITJ.T. BAKER5622-02
LB
L-RAMNOZ MONOHIDRATSIGMA-ALDRICHR-3875
METANOLJ.T. BAKER9049-02
ORSINOL MONOHIDRATSIGMA-ALDRICHO1875
PPGAS Et SuyuTris HCL (0.12M), Potasyum Klorür (0.02M) Amonyum Klorür (0.02M),   Pepton (% 1), pH 7.4    Otoklavlanmış. Ekle  Glikoz (% 5) ve Magnezyum Sülfat (0.0016M)
KUVARS HÜCRELİ (KÜVET)SIGMA-ALDRICHZ276669
DİKDÖRTGEN TLC GELİŞTİRMETANKI FISHER SCIENTIFIC
RAMNOLİPTİPLER SIGMA-ALDRICHR-90
SPEKTROFOTOMETREVIS
PÜSKÜRTÜCÜSIGMA-ALDRICHZ529710-1EA
SÜLFÜRİK ASİTJT BAKER9681-02
TES TÜPLERİ 5mLCORNING352002
TLC SILIKA JEL 60 F254MERCK1.05554.0001
SU BANYOSU> 80 derece Ç
CLS706510 K4161801020

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. A. Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Frontiers in Cell Infection and Microbiology. 7, 1-29 (2017).
  2. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: New insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).
  3. Williams, P., Cámara, M. Quorum sensing and environmental adaptation in Pseudomonas aeruginosa: a tale of regulatory networks and multifunctional signal molecules. Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 182-191 (2009).
  4. Soberón-Chávez, G., González-Valdez, A., Soto-Aceves, M. P., Cocotl-Yañez, M. Rhamnolipids produced by Pseudomonas: From molecular genetics to the market. Microbial Biotechnology (MBT). 14 (1), 136-146 (2021).
  5. Freschi, L., et al. The Pseudomonas aeruginosa pan-genome provides new insights on its population structure, horizontal gene transfer, and pathogenicity. Genome Biology and Evolution. 11 (1), 109-120 (2019).
  6. Quiroz-Morales, S. E., García-Reyes, S., Ponce-Soto, G. Y., Servin-Gonzalez, L. Tracking the origins of Pseudomonas aeruginosa phylogroups by diversity and evolutionary analysis of important pathogenic marker genes. Diversity. 14 (5), 345(2022).
  7. Déziel, E., et al. Liquid chromatography/mass spectrometry analysis of mixtures of rhamnolipids produced by Paeudomonas aeruginosa strain 57RP grown on mannitol or naphthalene. Biochemistry and Biophysic Acta. 1440 (2-3), 244-252 (1999).
  8. Abdel-Mawgoud, A. M., Lépine, F., Déziel, E. Rhamnolipids: Diversity of structures, microbial origins, and roles. Applied Microbiology and Biotechnology. 86 (5), 1323-1336 (2010).
  9. Toribio, J., Escalante, A. E., Soberón-Chávez, G. Production of rhamnolipids in bacteria other than Pseudomonas aeruginosa. European Journal of Lipid Science and Technology. 112, 1082-1087 (2010).
  10. Filbig, M., et al. Metabolic and process engineering on the edge-Rhamnolipids are a true challenge: A review. Biosurfactants. Foundations and Frontiers in Enzymology. Soberón-Chávez, G., et al. , Academic Press. New York. Chapter 8 157-181 (2023).
  11. Noll, P., et al. Limits for sustainable biosurfactant production: Techno-economic and environmental assessment of a rhamnolipid production process. Bioresource Technology. 25, 101767(2024).
  12. García-Reyes, S., Cocotl-Yañez, M., González-Valdez, A., Servín-González, L., Soberón Chávez, G. The PqsR-independent quorum-sensing response of Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 outlier-strain reveals new insights on the PqsE effect on RhlR activity. Molecular Microbiology. 116 (4), 1113-1123 (2021).
  13. Grosso-Becerra, M. V., et al. Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 is a non-virulent strain suitable for mono-rhamnolipids production. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (23), 9995-10004 (2016).
  14. Gutiérrez-Gómez, U., Soto-Aceves, M. P., Servín-González, L., Soberón-Chávez, G. Overproduction of rhamnolipids in Pseudomonas aeruginosa PA14 by redirection of the carbon flux from polyhydroxyalcanoate synthesis and overexpression of the rhlAB-R operon. Biotechnology Letters. 40 (11), 1561-1566 (2018).
  15. Zibek, S., Soberón-Chávez, G. Overview on glycosylated lipids produced by bacteria and fungi: Rhamno-, Sophoro-, Mannosylerythritol and Cellobiose Lipids. Biosurfactants for a Biobased. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. Hausmann, R., Henkel, M. , Springer. Berlin, Heidelberg. Chapter 4 181(2022).
  16. Twigg, M. S., et al. Microbial biosurfactant research: time to improve the rigour in the reporting of synthesis, functional characterization and process development. Microbial Biotechnology. 14 (1), 147-170 (2021).
  17. Matsuyama, T., Sogawa, M., Yano, I. Direct colony thin layer chromatography and rapid characterization of Serratia marscescens wetting agents. Applied and Environmental Microbiology. 53 (5), 1186-1188 (1987).
  18. Chandrasekaran, E. V., Bemiller, J. N. Constituent analyses of glycosaminoglycans. Methods on Carbohydrate Chemistry. 8, 89-96 (1980).
  19. Behrens, B., Engelen, J., Tiso, T., Blank, L. M., Hayen, H. Characterization of rhamnolipids by liquid chromatography/mass spectrometry after solid-phase extraction. Analytic and Bioanalytic Chemistry. 408 (10), 2505-2514 (2016).
  20. Rahim, R., et al. Cloning and functional characterization of the Pseudomonas aeruginosa rhlC gene that encodes rhamnosyltransferase 2, an enzyme responsible for di-rhamnolipid biosynthesis. Molecular Microbiology. 40 (3), 708-718 (2001).
  21. Irorere, V. U., Tripathi, L., Marchant, R., McClean, S., Banat, I. M. Microbial rhamnolipid production: A critical re-evaluation of published data and suggested future publication criteria. Applied Microbiology and Biotechnology. 101 (10), 3941-3951 (2017).
  22. Holloway, B. W. Genetic Recombination in Pseudomonas aeruginosa. Journal of General Microbiology. 13 (3), 572-581 (1955).
  23. Mathee, K. Forensic investigaction into the origin of Pseudomonas aeruginosa PA14-old but not lost. Journal of Medical Microbiology. 67 (8), 1019-1021 (2018).
  24. Roy, P. H., et al. Complete genome sequence of the multiresistant taxonomic outlier Pseudomonas aeruginosa PA7. PLoS ONE. 5, e8842(2010).
  25. Zhang, Y., Miller, R. M. Enhanced octadecane dispersion and biodegradation by a Pseudomonas rhamnolipid surfactant (biosurfactant). Applied and Environmental Microbiology. 58 (10), 3276-3282 (1992).
  26. Miller, J. Experiments in Molecular Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory. New York. 352-355 (1992).
  27. Abdel-Mawgoud, A. M., Lépine, F., Déziel, E. Liquid chromatography/mass spectrometry for the identification and quantification of rhamnolipids. Pseudomonas Methods and Protocols. 30, 359-373 (2014).
  28. Lee, D. G., et al. Genomic analysis reveals that Pseudomonas aeruginosa virulence is combinatorial. Genome Biology. 7 (10), 90(2006).
  29. Kubicki, S., et al. A straightforward assay for screening and quantification of biosurfactants in microbial culture supernatants. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 958(2020).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Rhamnolipid TespitiRhamnolipid Kantifikasyonunce Tabaka KromatografisiAsit HidroliziBiyos rfaktan EkstraksiyonuRamnoz l mVir lans Fakt rleri

İlgili makaleler