Allerjik Rinit Sıçanlarının Nazal Mukoza Dokusu Kesitlerinde Çok Renkli İmmünoassay ile İmmünofloresan Etiketleme

Allerjik rinit (AR), primer olarak spesifik immünoglobulin E (IgE)^1,2'nin aracılık ettiği burun mukozasının kronik, enfeksiyöz olmayan inflamatuar bir hastalığıdır. Hapşırma, burun akıntısı, burun tıkanıklığı ve burun kaşıntısı gibi semptomlarla karakterizedir. Sanayileşme ve kentleşme ile birlikte, AR prevalansı giderek artmakta ve dünya nüfusunun yaklaşık %10-20'sini etkilemektedir¹. İmmünofloresan (IF) tekniği, bir antikor-antijen bağlanma reaksiyonu kullanan bir floresan boyama yöntemidir. Biyolojik dokularda veya hücrelerde spesifik proteinlerin dağılımını ve ekspresyon seviyelerini tespit etmek ve ölçmek için kullanılabilir. AR araştırmasında IF, AR ile ilişkili sitokinler, inflamatuar hücreler, reseptörler ve daha fazlası dahil olmak üzere birden fazla hedefi aynı anda tespit edebilir ve AR patogenezinin ve ilaçların etkilerinin^{araştırılmasını} kolaylaştırır 3,4,5,6.

Çok renkli immünofloresan (mIF) boyama işlemi, her boyama turu sırasında bir antikor elüsyon adımının eklenmesiyle geleneksel IF'ye çok benzer. Bu modifikasyon, sıralı tek etiketleme ve çoklu yeniden boyama turları yoluyla aynı doku kesitinde birden fazla biyobelirteçin aynı anda saptanmasını sağlar. mIF, tiramid sinyal amplifikasyonuna (TSA) dayanır ve tekrarlanan TSA floresan boyama döngülerine ve floresan sinyallerini^korurken antikorları uzaklaştırmak için mikrodalga ısıtmanın kullanılmasına izin verir ^7,8. Konvansiyonel IF ile karşılaştırıldığında, mIF çeşitli avantajlar sunar: (1) konvansiyonel IF ^9,10 ile tanımlanması zor olan zayıf eksprese edilmiş antijenleri tespit edebilir; (2) geliştirilmiş sinyal-gürültü oranı ile yüksek kaliteli boyama sağlar; (3) dokuya özgü yapıların ve ilgilenilen bölgelerin nicelleştirilmesine izin verir¹¹; (4) çoklu yolakların çoğullanması, dokuları verimli bir şekilde kullanır ve sınırlı patolojik kaynakları korur¹²; (5) mIF aracılığıyla çok parametreli analiz, gizli biyolojik bilgileri ortaya çıkararak dokular hakkında daha derin bilgiler sunar¹³.

Genel olarak, mIF, aynı numune içinde farklı antijen ekspresyonlarının ve dağılımlarının gözlemlenmesine izin vererek hedef proteinlerin incelenmesini kolaylaştırır. Gelecekte, çoklu hedef proteinlerin ekspresyonunu ve dağılımını anlamak isteyen araştırmacılar bu tekniği değerli bir seçim olarak göreceklerdir. Bu çalışma, sıçanlardan alınan nazal mukoza örneklerinin AR ile boyanması için mIF'nin uygulanmasını göstermekte ve bir AR sıçan modelinin oluşturulmasını değerlendirmektedir.

Deneysel protokol ve prosedürler, Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi İdari ve Hayvan Araştırma Komitesi'nden onay almıştır (Kayıt numarası: 2022DL-010). 180-200 g ağırlığındaki sekiz haftalık erkek Sprague Dawley (SD) sıçanları ticari olarak elde edildi (Malzeme Tablosuna bakınız) ve kontrollü sıcaklık (23 ± 2 °C) ve bağıl nem (%55 ± %10) ile doğal bir aydınlık/karanlık döngüsü altında barındırıldı. On iki sıçan rastgele iki gruba ayrıldı: kontrol grubu ve AR grubu. Tüm sıçanlar bu koşullara alıştırıldı ve denemeden önce bir hafta boyunca yiyecek ve suya ücretsiz erişim sağlandı.

1. AR'nin sıçan modelinin kurulması

1. Hassaslaştırıcı çözeltinin hazırlanması: 30 mg ovalbümin (OVA) ve 3 g Al(OH)₃ 100 mL salin içinde süspanse edin (bkz. Malzeme Tablosu)^14,15.
2. Temel duyarlılık: Tamamen uyanık sıçanı karnı yukarı bakacak şekilde kavrayın ve tutun. % 75 alkole batırılmış pamuk topları kullanarak karnı dezenfekte edin. Adım 1.1'de hazırlanan hassaslaştırıcı solüsyonun 1.5 mL'sini AR grubundaki sıçanların sol karın boşluğuna enjekte etmek için 1.5 mL'lik bir şırınga kullanın. Bu enjeksiyonu 14 gün boyunca iki günde bir tekrarlayın (Şekil 1A).
   NOT: Şırıngayı yerleştirirken kalın ve ince bağırsaklara zarar vermemek için sıçanın kafasının kuyruğundan daha aşağıda olduğundan emin olun. Enjeksiyon bölgesi ventral orta hattan 1,5 cm uzaktadır. Kontrol grubundaki sıçanlar, 14 gün boyunca iki günde bir 1 mL normal salin intraperitoneal enjeksiyonu almalıdır.
3. Nazal zorluk: Bazal duyarlılığı takip eden gün 100 μL'lik bir pipet (Şekil 1B) kullanarak burun damlaları yoluyla 50 μL% 5 OVA uygulayın ve bu prosedürü 7 gün boyunca tekrarlayın (Şekil 1C).
   NOT: 5 g OVA'yı 100 mL salin ile karıştırarak %5 OVA çözeltisini hazırlayın. Kontrol grubu için, aynı hacimde salin damlaları uygulayın.

2. Sıçanların davranışsal puanlaması

1. Son burun zorluğunu tamamladıktan sonraki 30 dakika içinde, Tablo 1'de belirtilen puanlama kriterlerine göre burun kaşıma, hapşırma ve burun akıntısı gibi semptomları tanımlamak için bir dijital kamera kullanarak sıçanları gözlemleyin ve kaydedin (Şekil 1D).
   NOT: Başarılı AR modellemesinin teyidi, toplam ≥5 puan¹⁴ elde edilmesine dayanmaktadır.

3. Burun mukozası örneklerinin alınması

1. Sıçanları kurban etmek: Sıçanları aşırı dozda_CO2'ye maruz bırakarak kurban edin. Daha sonra, sıçanları% 75 etanol ile dezenfekte edin (Malzeme Tablosuna bakınız). Kas dokusunu ortaya çıkarmak için ağzın iki köşesi boyunca bir kesi yapmak için bir neşter kullanın (Şekil 2A). Daha sonra, doku makası kullanarak kafatasının her iki tarafındaki elmacık kemiğinin ve mandibulanın eklemlerini kesin (Şekil 2B) ve mandibulayı çıkarın (Şekil 2C).
2. Burun boşluğuna maruz kalma: burun boşluğunu ortaya çıkarmak için bir hemostat (Şekil 2D) kullanarak maksillanın derisini ayırın (Şekil 2E). Burun boşluğu ile maksilla arasındaki kemik bağlantısını doku makası ile kesin (Şekil 2F). Daha sonra, infraorbital foramende burun boşluğu ile her iki taraftaki orbital kemikler arasındaki bağlantıyı kesin (Şekil 2G) ve burun boşluğunu çıkarın (Şekil 2H).
3. Fiksasyon: Çıkarılan burun boşluğunu fiksasyon için% 4 paraformaldehit içine yerleştirin ve 24-72 saat oda sıcaklığında saklayın (bkz.
   NOT: Kullanılan paraformaldehit fiksatif miktarının, uygun fiksasyon için bölümleri tamamen kaplamaya yeterli olduğundan emin olun.

4. Burun mukozası örneklerinin ön işleme tabi tutulması

1. Dekalsifikasyon: 3.1. adımdan çıkarılan dokuları sabitleyerek başlayın. Her biri 20 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. Bunu, her seferinde 20 dakika boyunca damıtılmış suyla üç kez yıkayarak takip edin. Daha sonra, dokuları oda sıcaklığında dokuların 20-30 katı hacme sahip bir dekalsifikasyon solüsyonunda kireçten arındırın.
   1. Dekalsifikasyon çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) pH'ı 7.2-7.4 arasında tutmalıdır. Son olarak, kireçten arındırılmış dokuyu bir dehidrasyon kutusuna yerleştirin.
      NOT: Kireç çözücü solüsyonun haftalık olarak değiştirilmesi gerekir. Dekalsifikasyon işlemi, doku yumuşadığında (yaklaşık 2 ay) sonuçlandırılabilir.
2. Dehidrasyon ve ağda: dehidrasyon kutusunu bir kurutucuya aktarın (bkz. 4 saat boyunca %75 alkolle başlayın, ardından 2 saat boyunca %85 alkol, 2 saat boyunca %90 alkol ve 1 saat boyunca %95 alkol ile başlayın.
   1. Daha sonra, dokuyu 30 dakika susuz etanole batırın, işlemi 30 dakika daha tekrarlayın, 5-10 dakika ksilen kullanın, bu adımı 5-10 dakika daha tekrarlayın, dokuyu 1 saat balmumuna batırın, bu adımı bir saat daha tekrarlayın ve son olarak dokuyu 1 saat daha balmumuna batırın.
3. Gömme: Erimiş balmumu bloğunu gömme kutusuna yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve -20 °C'lik bir dondurucuda saklayın. Balmumu katılaştığında, çıkarın ve balmumu bloğunu kesin.
4. Dilimleme: Kesilmiş balmumu bloğunu bir parafin mikrotomuna yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve 3 μm kalınlığında dilimler halinde kesin. Dilimleri bir slayt yayıcı üzerinde 40 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Dokuyu düzleştirin, ardından bir cam sürgü ile kaldırın ve 60 °C fırında pişirin.
   1. Su buharlaştıktan ve balmumu uygun şekilde ayarlandıktan sonra, slaytları çıkarın ve 25 °C sıcaklıkta saklayın.

5. Nazal mukozal dokunun H & E boyaması

1. Mum alma ve hidrasyon: dilimleri 20 dakika ksilene koyun, işlemi 20 dakika daha, 5 dakika mutlak etanol tekrarlayın, bu adımı 5 dakika daha tekrarlayın, 5 dakika boyunca %75 alkol ve son olarak 5 dakika yıkayın.
2. Hematoksilen boyama: 100 μL'lik bir pipet kullanarak 3-5 dakika boyunca 100 μL hematoksilen boyama solüsyonu ( Malzeme Tablosuna bakınız) dağıtın, 5-10 saniye durulayın, 10-30 saniye boyunca 100 μL %0.5 hidroklorik asit etanol ekleyin, 5-10 saniye durulayın, 10-30 saniye boyunca 100 μL %0.2 amonyak suyu ekleyin ve 30 saniye durulayın.
   NOT: Hematoksilen boyamadan sonra, çekirdeğe bağlı ve sitoplazma tarafından emilen aşırı hematoksilen boyasını çıkarmak için% 0.5 hidroklorik asit etanol ile farklılaşma gereklidir. Eozin boyama yapıldığında, çekirdekler ve sitoplazma açıkça boyanacaktır. % 0.5 hidroklorik asit etanol ile farklılaşmadan sonra dilimler kırmızı veya pembe görünecektir, bu nedenle farklılaşmayı durdurmak için asidi doku dilimlerinden çıkarmak için farklılaşmadan hemen sonra durulayın. Ardından, nükleer lekelenmeyi arttırmak için% 0.2 amonyak suyu kullanın.
3. Eozin boyama: 100 μL eozin boyama solüsyonunu dağıtmak için 100 μL'lik bir pipet kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız) 5 dakika ve 30 saniye durulayın.
4. Dehidrasyon ve sızdırmazlık: dilimleri 5 dakika mutlak etanole batırın, işlemi 5 dakika daha tekrarlayın, bir kez daha 5 dakika, dimetil 5 dakika ve ksileni 5 dakika tekrarlayın. Son olarak, nötr reçine ile kapatın (Malzeme Tablosuna bakın).
5. Lekeli bölümün mikroskoba yerleştirilmesi: lekeli bölümü mikroskoba yerleştirin, görüntü net bir şekilde görünene kadar mikroskobun odağını ayarlayın, büyütmeyi 40x'e ayarlayın ve görüntüyü yakalayın.

6. Nazal mukozal dokunun çok renkli immün boyaması

1. Mum alma ve nemlendirme: adım 5.1'de belirtilenin aynısını izleyin.
2. Sitrat-fosfat tampon işlemi: sitrat-fosfat tamponunu (pH 6.0) ( Malzeme Tablosuna bakınız) mikrodalgaya dayanıklı bir kaba koyun. Kaynayana kadar ısıtın, çıkarın ve ardından slaytları kaba ekleyin. Kaynayana kadar 8 dakika orta ateşte mikrodalga, 8 dakika ısıyı kapatın ve ardından 7 dakika orta-düşük ısıya geçin.
   1. Doğal soğuduktan sonra, dilimleri PBS'ye (pH 7.4) aktarın, çalkalayın ve her seferinde 5 dakika boyunca renk giderici bir çalkalayıcı kullanarak üç kez yıkayın.
      NOT: Bu işlem sırasında tamponun buharlaşmadığından emin olun ve dilimlerin kurumasını önleyin.
3. Endojen peroksidazı bloke etme: dilimleri kurutun, immünohistokimyasal bir kalemle dokunun etrafına bir daire çizin (antikorun akmasını önlemek için) ve% 3 hidrojen peroksit çözeltisi uygulayın (hidrojen peroksit: saf su = 1: 9).
   1. Oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika inkübe edin. Doğal soğuduktan sonra, dilimleri PBS'ye (pH 7.4) yerleştirin ve her biri 5 dakikalık üç döngü boyunca renk giderici bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayın.
4. Engelleme: Daire içine %5 keçi serumu uygulayın ve 30 dakika inkübe edin.
5. Birincil antikor ilavesi: bloke edici çözeltiyi yavaşça çıkarın, dilime FOXP3 (seyreltme: 1:200, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve nemli bir odaya yerleştirin. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
   NOT: Antikor buharlaşmasını önlemek için nemli odaya az miktarda su ekleyin.
6. İkincil antikor ilavesi: dilimleri PBS'ye (pH 7.4) yerleştirin ve her biri 5 dakikalık üç döngü boyunca renk giderici bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. Dilimleri nazikçe kurutun ve ikincil antikoru (Keçi Anti-Tavşan IgG H & L, bkz. Malzeme Tablosu) daire içine uygulayın. Karanlıkta 50 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
7. Tiramid seyreltme çözeltisinin hazırlanması: 100 μL %3_H2O2'yi100 mL 1x TBST ile birleştirin (bkz.
8. TSA çalışma çözeltisinin eklenmesi: TSA çalışma çözeltisini hazırlamak için 1 mL Tiramid seyrelticiyi 2 μL CY3-Tiramid ile karıştırın. Her dilime 100 μL TSA çalışma solüsyonu uygulayın ve oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika inkübe edin. Ardından, dilimleri PBS ile her seferinde 5 dakika olmak üzere üç kez yıkayın.
   NOT: TSA çalışma solüsyonunu hemen hazırlayıp kullanın ve karanlıkta 4 °C'de saklayın; 24 saate kadar geçerlidir.
9. Adım 6.2-6.8'i tekrarlayın: 1:200 RORγt (FITC floresan boya) seyreltmesine ve ardından 1:200 TICAM1 (TYP620 boya) seyreltmesine geçin (bkz.
10. DAPI karşı boyalı çekirdekler: dilimleri kurutmak için hafifçe sallayın, DAPI boyama solüsyonu uygulayın ve oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika inkübe edin.
11. Söndürme otofloresansı: dilimleri PBS'ye (pH 7.4) yerleştirin ve her biri 5 dakikalık üç döngü boyunca renk giderici bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. Otofloresan söndürücüyü ( Malzeme Tablosuna bakınız) dilimlere uygulayın, 5 dakika bekleyin ve ardından 10 dakika yıkayın.
12. Engelleme: dilimleri PBS'ye (pH 7.4) yerleştirin ve her biri 5 dakikalık üç döngü boyunca renk giderici bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. Dilimleri kurutmak için hafifçe sallayın ve floresan önleyici söndürücü ile kapatın (bkz.
13. Mikroskopi: lekeli bölümü mikroskobun üzerine yerleştirin, net görünürlük için mikroskobun odağını ayarlayın, büyütmeyi 20x ve 40x'e ayarlayın ve görüntüyü yakalayın.
    NOT: DAPI, 330-380 nm UV uyarma dalga boyuna ve 420 nm (mavi ışık) emisyon dalga boyuna sahiptir. FITC, 465-495 nm'lik bir uyarma dalga boyuna ve 515-555 nm'lik bir emisyon dalga boyuna (yeşil ışık) sahiptir. CY3, 510-560 nm'lik bir uyarma dalga boyuna ve 590 nm'lik bir emisyon dalga boyuna (kırmızı ışık) sahiptir. TYP-690, 630 nm'lik bir uyarma dalga boyuna ve 690 nm'lik bir emisyon dalga boyuna (pembe ışık) sahiptir.

Altı SD sıçan, OVA intraperitoneal enjeksiyon ve nazal zorlama yoluyla AR modeline başarılı bir şekilde indüklendi. AR, AR grubundaki tüm sıçanlarda indüklendi ve grubun% 100'ünü oluşturdu. AR grubundaki tüm sıçanlar hapşırma, burun akıntısı ve burun kaşıntısı gibi tipik semptomlar sergiledi. Tüm davranışsal gözlemler ≥5 puan aldı (Tablo 2).

Modellemenin 21. günündeki H & E boyama sonuçları, kontrol sıçanlarında, burun mukozasının epitel hücrelerinin ve kirpiklerin iyi düzenlenmiş olduğunu ve inflamatuar hücre infiltrasyonu belirtisi olmadığını ortaya koydu. Tersine, AR grubunda, nazal septumun mukozası hasar görmüş ve ayrılmış, kayda değer nötrofil infiltrasyonu olmuştur (Şekil 3).

AR sıçanlarının burun mukoza dokusu kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, RORγt (Th17 hücresine özgü bir transkripsiyon faktörü) ve TICAM-1 (Toll benzeri reseptör bağlayıcı molekül-1) ekspresyonunun arttığı, Foxp3'ün (Treg hücresine özgü bir transkripsiyon faktörü) azaldığı gözlenmiştir (Şekil 4).

Şekil 1: Deneysel iş akışı . (A) İntraperitoneal enjeksiyonun şematik diyagramı. (B) Burun akıntısının şematik diyagramı. (C) Allerjik rinit sıçanlarının modellenmesinin akış şeması. (D) Davranışsal gözlemin şematik diyagramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Burun alma işlemi . (A) Ağzın köşelerindeki kas dokusunun kesilmesi. (B) Elmacık kemiği ile mandibula arasındaki bağlantının kesilmesi. (C) Mandibulanın ayrılması. (D) Maksilla derisinin çıkarılması. (E) Burun boşluğunu açığa çıkarmak. (F) Burun boşluğu ile maksilla arasındaki bağlantının kesilmesi. (G) Burun boşluğu ile orbital kemik arasındaki bağlantının kesilmesi. (H) Çıkarılan burun boşluğu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: AR modellemesinden sonra 14. günde temsili histopatolojik H&E boyama görüntüleri (n = 6). (A) Kontrol sıçanlarının nazal mukozasındaki epitel hücreleri ve kirpikler iyi düzenlenmiştir ve inflamatuar hücre infiltrasyonu gözlenmemiştir. (B) AR grubunun nazal septumunun mukozası hasar gördü ve nötrofil infiltrasyonu ile ayrıldı. Ölçek çubukları = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: RORγt, Foxp3 ve TICAM-1'in MIF boyama analizi (n = 6). Kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, AR grubundaki sıçanların burun mukoza dokularında RORγt ve TICAM-1 ekspresyonu yükselirken, Foxp3 ekspresyonu azaldı. Ölçek çubukları = 100 μm (sol paneller); 50 μm (sağ paneller). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: mIF tekniğinin prensibi. mIF tekniği, floresan sinyalin antijene kovalent olarak bağlanmasını içeren TSA tekniğine dayanmaktadır. Bu süreçte, ikincil antikor üzerinde etiketlenmiş yaban turpu peroksidaz floresein substratının inaktif durumdan aktive duruma geçişini katalize eder. Bu aktive durum, antijen üzerindeki tirozine kovalent olarak bağlanabilir ve bu da numuneye kararlı bir kovalent floresein bağlanmasına neden olur. Daha sonra, kovalent bağlı olmayan antikorlar termal onarım yoluyla uzaklaştırılır. Prosedür daha sonra tamamen farklı bir antijenin saptanmasını sağlamak için ek primer antikorlar, sekonder antikorlar ve floresein ile tekrarlanır. Bu görüntü, mIF şematik diyagramı17'ye referansla yeniden çizildi ve renk eşleştirmesi yapıldı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: Sıçan davranış testinin nicel ölçek tablosu.

Tablo 2: Davranışsal puanlama sonuçları.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.