Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Allerjik Rinit Sıçanlarının Nazal Mukoza Dokusu Kesitlerinde Çok Renkli İmmünoassay ile İmmünofloresan Etiketleme

3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/65937

⸱

22 Eylül 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Meishan Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, alerjik rinitin sıçan modelini değerlendirmek için çok renkli bir immünofloresan tekniğini açıklar.

Özet

Allerjik rinit (AR), dünya nüfusunun yaklaşık %10-20'sini etkileyen, primer olarak spesifik immünoglobulin E (IgE) aracılık eden, burun mukozasının kronik, enfeksiyöz olmayan inflamatuar bir hastalığıdır. İmmünofloresan (IF) boyama, hastalığa özgü protein ekspresyonunu tespit etmek için uzun süredir standart bir teknik olsa da, geleneksel IF teknikleri, aynı numunedeki üç veya daha fazla proteinin ekspresyon seviyelerini tespit etme yeteneklerinde sınırlıdır. Sonuç olarak, son yıllarda, hücrelerde veya dokularda birden fazla hedefin aynı anda etiketlenmesine izin veren çok renkli IF teknikleri geliştirilmiştir.

Bu protokol, bir AR sıçan modeli oluşturma, nazal mukozal örneklerin alınması ve çok renkli immünofloresan için teknik prosedürler için kapsamlı bir genel bakış sağlar. AR grubundaki tüm sıçanlar hapşırma, burun akıntısı ve burun kaşıntısı gibi tipik semptomlar sergiledi ve davranışsal gözlemler ≥5 puan aldı. Hematoksilen ve eozin (H&E) boyama, AR grubunda artmış inflamatuar hücre sayısı ve bozulmuş nazal mukozal bütünlük ortaya çıkardı. Çok renkli immünofloresan (mIF), RORγt ve TICAM-1 ekspresyonunun arttığını gösterirken, AR sıçanlarının burun mukoza dokusunda Foxp3 ekspresyonu azaldı.

Giriş

Allerjik rinit (AR), primer olarak spesifik immünoglobulin E (IgE)1,2'nin aracılık ettiği burun mukozasının kronik, enfeksiyöz olmayan inflamatuar bir hastalığıdır. Hapşırma, burun akıntısı, burun tıkanıklığı ve burun kaşıntısı gibi semptomlarla karakterizedir. Sanayileşme ve kentleşme ile birlikte, AR prevalansı giderek artmakta ve dünya nüfusunun yaklaşık %10-20'sini etkilemektedir1. İmmünofloresan (IF) tekniği, bir antikor-antijen bağlanma reaksiyonu kullanan bir floresan boyama yöntemidir. Biyolojik dokularda veya hücrelerde spesifik proteinlerin dağılımını ve ekspresyon seviyelerini tespit etmek ve ölçmek için kullanılabilir. AR araştırmasında IF, AR ile ilişkili sitokinler, inflamatuar hücreler, reseptörler ve daha fazlası dahil olmak üzere birden fazla hedefi aynı anda tespit edebilir ve AR patogenezinin ve ilaçların etkilerininaraştırılmasını kolaylaştırır 3,4,5,6.

Çok renkli immünofloresan (mIF) boyama işlemi, her boyama turu sırasında bir antikor elüsyon adımının eklenmesiyle geleneksel IF'ye çok benzer. Bu modifikasyon, sıralı tek etiketleme ve çoklu yeniden boyama turları yoluyla aynı doku kesitinde birden fazla biyobelirteçin aynı anda saptanmasını sağlar. mIF, tiramid sinyal amplifikasyonuna (TSA) dayanır ve tekrarlanan TSA floresan boyama döngülerine ve floresan sinyallerinikorurken antikorları uzaklaştırmak için mikrodalga ısıtmanın kullanılmasına izin verir 7,8. Konvansiyonel IF ile karşılaştırıldığında, mIF çeşitli avantajlar sunar: (1) konvansiyonel IF 9,10 ile tanımlanması zor olan zayıf eksprese edilmiş antijenleri tespit edebilir; (2) geliştirilmiş sinyal-gürültü oranı ile yüksek kaliteli boyama sağlar; (3) dokuya özgü yapıların ve ilgilenilen bölgelerin nicelleştirilmesine izin verir11; (4) çoklu yolakların çoğullanması, dokuları verimli bir şekilde kullanır ve sınırlı patolojik kaynakları korur12; (5) mIF aracılığıyla çok parametreli analiz, gizli biyolojik bilgileri ortaya çıkararak dokular hakkında daha derin bilgiler sunar13.

Genel olarak, mIF, aynı numune içinde farklı antijen ekspresyonlarının ve dağılımlarının gözlemlenmesine izin vererek hedef proteinlerin incelenmesini kolaylaştırır. Gelecekte, çoklu hedef proteinlerin ekspresyonunu ve dağılımını anlamak isteyen araştırmacılar bu tekniği değerli bir seçim olarak göreceklerdir. Bu çalışma, sıçanlardan alınan nazal mukoza örneklerinin AR ile boyanması için mIF'nin uygulanmasını göstermekte ve bir AR sıçan modelinin oluşturulmasını değerlendirmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Deneysel protokol ve prosedürler, Chengdu Geleneksel Çin Tıbbı Üniversitesi İdari ve Hayvan Araştırma Komitesi'nden onay almıştır (Kayıt numarası: 2022DL-010). 180-200 g ağırlığındaki sekiz haftalık erkek Sprague Dawley (SD) sıçanları ticari olarak elde edildi (Malzeme Tablosuna bakınız) ve kontrollü sıcaklık (23 ± 2 °C) ve bağıl nem (%55 ± %10) ile doğal bir aydınlık/karanlık döngüsü altında barındırıldı. On iki sıçan rastgele iki gruba ayrıldı: kontrol grubu ve AR grubu. Tüm sıçanlar bu koşullara alıştırıldı ve denemeden önce bir hafta boyunca yiyecek ve suya ücretsiz erişim sağlandı.

1. AR'nin sıçan modelinin kurulması

  1. Hassaslaştırıcı çözeltinin hazırlanması: 30 mg ovalbümin (OVA) ve 3 g Al(OH)3 100 mL salin içinde süspanse edin (bkz. Malzeme Tablosu)14,15.
  2. Temel duyarlılık: Tamamen uyanık sıçanı karnı yukarı bakacak şekilde kavrayın ve tutun. % 75 alkole batırılmış pamuk topları kullanarak karnı dezenfekte edin. Adım 1.1'de hazırlanan hassaslaştırıcı solüsyonun 1.5 mL'sini AR grubundaki sıçanların sol karın boşluğuna enjekte etmek için 1.5 mL'lik bir şırınga kullanın. Bu enjeksiyonu 14 gün boyunca iki günde bir tekrarlayın (Şekil 1A).
    NOT: Şırıngayı yerleştirirken kalın ve ince bağırsaklara zarar vermemek için sıçanın kafasının kuyruğundan daha aşağıda olduğundan emin olun. Enjeksiyon bölgesi ventral orta hattan 1,5 cm uzaktadır. Kontrol grubundaki sıçanlar, 14 gün boyunca iki günde bir 1 mL normal salin intraperitoneal enjeksiyonu almalıdır.
  3. Nazal zorluk: Bazal duyarlılığı takip eden gün 100 μL'lik bir pipet (Şekil 1B) kullanarak burun damlaları yoluyla 50 μL% 5 OVA uygulayın ve bu prosedürü 7 gün boyunca tekrarlayın (Şekil 1C).
    NOT: 5 g OVA'yı 100 mL salin ile karıştırarak %5 OVA çözeltisini hazırlayın. Kontrol grubu için, aynı hacimde salin damlaları uygulayın.

2. Sıçanların davranışsal puanlaması

  1. Son burun zorluğunu tamamladıktan sonraki 30 dakika içinde, Tablo 1'de belirtilen puanlama kriterlerine göre burun kaşıma, hapşırma ve burun akıntısı gibi semptomları tanımlamak için bir dijital kamera kullanarak sıçanları gözlemleyin ve kaydedin (Şekil 1D).
    NOT: Başarılı AR modellemesinin teyidi, toplam ≥5 puan14 elde edilmesine dayanmaktadır.

3. Burun mukozası örneklerinin alınması

  1. Sıçanları kurban etmek: Sıçanları aşırı dozdaCO2'ye maruz bırakarak kurban edin. Daha sonra, sıçanları% 75 etanol ile dezenfekte edin (Malzeme Tablosuna bakınız). Kas dokusunu ortaya çıkarmak için ağzın iki köşesi boyunca bir kesi yapmak için bir neşter kullanın (Şekil 2A). Daha sonra, doku makası kullanarak kafatasının her iki tarafındaki elmacık kemiğinin ve mandibulanın eklemlerini kesin (Şekil 2B) ve mandibulayı çıkarın (Şekil 2C).
  2. Burun boşluğuna maruz kalma: burun boşluğunu ortaya çıkarmak için bir hemostat (Şekil 2D) kullanarak maksillanın derisini ayırın (Şekil 2E). Burun boşluğu ile maksilla arasındaki kemik bağlantısını doku makası ile kesin (Şekil 2F). Daha sonra, infraorbital foramende burun boşluğu ile her iki taraftaki orbital kemikler arasındaki bağlantıyı kesin (Şekil 2G) ve burun boşluğunu çıkarın (Şekil 2H).
  3. Fiksasyon: Çıkarılan burun boşluğunu fiksasyon için% 4 paraformaldehit içine yerleştirin ve 24-72 saat oda sıcaklığında saklayın (bkz.
    NOT: Kullanılan paraformaldehit fiksatif miktarının, uygun fiksasyon için bölümleri tamamen kaplamaya yeterli olduğundan emin olun.

4. Burun mukozası örneklerinin ön işleme tabi tutulması

  1. Dekalsifikasyon: 3.1. adımdan çıkarılan dokuları sabitleyerek başlayın. Her biri 20 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. Bunu, her seferinde 20 dakika boyunca damıtılmış suyla üç kez yıkayarak takip edin. Daha sonra, dokuları oda sıcaklığında dokuların 20-30 katı hacme sahip bir dekalsifikasyon solüsyonunda kireçten arındırın.
    1. Dekalsifikasyon çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) pH'ı 7.2-7.4 arasında tutmalıdır. Son olarak, kireçten arındırılmış dokuyu bir dehidrasyon kutusuna yerleştirin.
      NOT: Kireç çözücü solüsyonun haftalık olarak değiştirilmesi gerekir. Dekalsifikasyon işlemi, doku yumuşadığında (yaklaşık 2 ay) sonuçlandırılabilir.
  2. Dehidrasyon ve ağda: dehidrasyon kutusunu bir kurutucuya aktarın (bkz. 4 saat boyunca %75 alkolle başlayın, ardından 2 saat boyunca %85 alkol, 2 saat boyunca %90 alkol ve 1 saat boyunca %95 alkol ile başlayın.
    1. Daha sonra, dokuyu 30 dakika susuz etanole batırın, işlemi 30 dakika daha tekrarlayın, 5-10 dakika ksilen kullanın, bu adımı 5-10 dakika daha tekrarlayın, dokuyu 1 saat balmumuna batırın, bu adımı bir saat daha tekrarlayın ve son olarak dokuyu 1 saat daha balmumuna batırın.
  3. Gömme: Erimiş balmumu bloğunu gömme kutusuna yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakın) ve -20 °C'lik bir dondurucuda saklayın. Balmumu katılaştığında, çıkarın ve balmumu bloğunu kesin.
  4. Dilimleme: Kesilmiş balmumu bloğunu bir parafin mikrotomuna yerleştirin (Malzeme Tablosuna bakın) ve 3 μm kalınlığında dilimler halinde kesin. Dilimleri bir slayt yayıcı üzerinde 40 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin. Dokuyu düzleştirin, ardından bir cam sürgü ile kaldırın ve 60 °C fırında pişirin.
    1. Su buharlaştıktan ve balmumu uygun şekilde ayarlandıktan sonra, slaytları çıkarın ve 25 °C sıcaklıkta saklayın.

5. Nazal mukozal dokunun H & E boyaması

  1. Mum alma ve hidrasyon: dilimleri 20 dakika ksilene koyun, işlemi 20 dakika daha, 5 dakika mutlak etanol tekrarlayın, bu adımı 5 dakika daha tekrarlayın, 5 dakika boyunca %75 alkol ve son olarak 5 dakika yıkayın.
  2. Hematoksilen boyama: 100 μL'lik bir pipet kullanarak 3-5 dakika boyunca 100 μL hematoksilen boyama solüsyonu ( Malzeme Tablosuna bakınız) dağıtın, 5-10 saniye durulayın, 10-30 saniye boyunca 100 μL %0.5 hidroklorik asit etanol ekleyin, 5-10 saniye durulayın, 10-30 saniye boyunca 100 μL %0.2 amonyak suyu ekleyin ve 30 saniye durulayın.
    NOT: Hematoksilen boyamadan sonra, çekirdeğe bağlı ve sitoplazma tarafından emilen aşırı hematoksilen boyasını çıkarmak için% 0.5 hidroklorik asit etanol ile farklılaşma gereklidir. Eozin boyama yapıldığında, çekirdekler ve sitoplazma açıkça boyanacaktır. % 0.5 hidroklorik asit etanol ile farklılaşmadan sonra dilimler kırmızı veya pembe görünecektir, bu nedenle farklılaşmayı durdurmak için asidi doku dilimlerinden çıkarmak için farklılaşmadan hemen sonra durulayın. Ardından, nükleer lekelenmeyi arttırmak için% 0.2 amonyak suyu kullanın.
  3. Eozin boyama: 100 μL eozin boyama solüsyonunu dağıtmak için 100 μL'lik bir pipet kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız) 5 dakika ve 30 saniye durulayın.
  4. Dehidrasyon ve sızdırmazlık: dilimleri 5 dakika mutlak etanole batırın, işlemi 5 dakika daha tekrarlayın, bir kez daha 5 dakika, dimetil 5 dakika ve ksileni 5 dakika tekrarlayın. Son olarak, nötr reçine ile kapatın (Malzeme Tablosuna bakın).
  5. Lekeli bölümün mikroskoba yerleştirilmesi: lekeli bölümü mikroskoba yerleştirin, görüntü net bir şekilde görünene kadar mikroskobun odağını ayarlayın, büyütmeyi 40x'e ayarlayın ve görüntüyü yakalayın.

6. Nazal mukozal dokunun çok renkli immün boyaması

  1. Mum alma ve nemlendirme: adım 5.1'de belirtilenin aynısını izleyin.
  2. Sitrat-fosfat tampon işlemi: sitrat-fosfat tamponunu (pH 6.0) ( Malzeme Tablosuna bakınız) mikrodalgaya dayanıklı bir kaba koyun. Kaynayana kadar ısıtın, çıkarın ve ardından slaytları kaba ekleyin. Kaynayana kadar 8 dakika orta ateşte mikrodalga, 8 dakika ısıyı kapatın ve ardından 7 dakika orta-düşük ısıya geçin.
    1. Doğal soğuduktan sonra, dilimleri PBS'ye (pH 7.4) aktarın, çalkalayın ve her seferinde 5 dakika boyunca renk giderici bir çalkalayıcı kullanarak üç kez yıkayın.
      NOT: Bu işlem sırasında tamponun buharlaşmadığından emin olun ve dilimlerin kurumasını önleyin.
  3. Endojen peroksidazı bloke etme: dilimleri kurutun, immünohistokimyasal bir kalemle dokunun etrafına bir daire çizin (antikorun akmasını önlemek için) ve% 3 hidrojen peroksit çözeltisi uygulayın (hidrojen peroksit: saf su = 1: 9).
    1. Oda sıcaklığında karanlıkta 15 dakika inkübe edin. Doğal soğuduktan sonra, dilimleri PBS'ye (pH 7.4) yerleştirin ve her biri 5 dakikalık üç döngü boyunca renk giderici bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayın.
  4. Engelleme: Daire içine %5 keçi serumu uygulayın ve 30 dakika inkübe edin.
  5. Birincil antikor ilavesi: bloke edici çözeltiyi yavaşça çıkarın, dilime FOXP3 (seyreltme: 1:200, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve nemli bir odaya yerleştirin. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
    NOT: Antikor buharlaşmasını önlemek için nemli odaya az miktarda su ekleyin.
  6. İkincil antikor ilavesi: dilimleri PBS'ye (pH 7.4) yerleştirin ve her biri 5 dakikalık üç döngü boyunca renk giderici bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. Dilimleri nazikçe kurutun ve ikincil antikoru (Keçi Anti-Tavşan IgG H & L, bkz. Malzeme Tablosu) daire içine uygulayın. Karanlıkta 50 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
  7. Tiramid seyreltme çözeltisinin hazırlanması: 100 μL %3H2O2'yi100 mL 1x TBST ile birleştirin (bkz.
  8. TSA çalışma çözeltisinin eklenmesi: TSA çalışma çözeltisini hazırlamak için 1 mL Tiramid seyrelticiyi 2 μL CY3-Tiramid ile karıştırın. Her dilime 100 μL TSA çalışma solüsyonu uygulayın ve oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika inkübe edin. Ardından, dilimleri PBS ile her seferinde 5 dakika olmak üzere üç kez yıkayın.
    NOT: TSA çalışma solüsyonunu hemen hazırlayıp kullanın ve karanlıkta 4 °C'de saklayın; 24 saate kadar geçerlidir.
  9. Adım 6.2-6.8'i tekrarlayın: 1:200 RORγt (FITC floresan boya) seyreltmesine ve ardından 1:200 TICAM1 (TYP620 boya) seyreltmesine geçin (bkz.
  10. DAPI karşı boyalı çekirdekler: dilimleri kurutmak için hafifçe sallayın, DAPI boyama solüsyonu uygulayın ve oda sıcaklığında karanlıkta 10 dakika inkübe edin.
  11. Söndürme otofloresansı: dilimleri PBS'ye (pH 7.4) yerleştirin ve her biri 5 dakikalık üç döngü boyunca renk giderici bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. Otofloresan söndürücüyü ( Malzeme Tablosuna bakınız) dilimlere uygulayın, 5 dakika bekleyin ve ardından 10 dakika yıkayın.
  12. Engelleme: dilimleri PBS'ye (pH 7.4) yerleştirin ve her biri 5 dakikalık üç döngü boyunca renk giderici bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayın. Dilimleri kurutmak için hafifçe sallayın ve floresan önleyici söndürücü ile kapatın (bkz.
  13. Mikroskopi: lekeli bölümü mikroskobun üzerine yerleştirin, net görünürlük için mikroskobun odağını ayarlayın, büyütmeyi 20x ve 40x'e ayarlayın ve görüntüyü yakalayın.
    NOT: DAPI, 330-380 nm UV uyarma dalga boyuna ve 420 nm (mavi ışık) emisyon dalga boyuna sahiptir. FITC, 465-495 nm'lik bir uyarma dalga boyuna ve 515-555 nm'lik bir emisyon dalga boyuna (yeşil ışık) sahiptir. CY3, 510-560 nm'lik bir uyarma dalga boyuna ve 590 nm'lik bir emisyon dalga boyuna (kırmızı ışık) sahiptir. TYP-690, 630 nm'lik bir uyarma dalga boyuna ve 690 nm'lik bir emisyon dalga boyuna (pembe ışık) sahiptir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Altı SD sıçan, OVA intraperitoneal enjeksiyon ve nazal zorlama yoluyla AR modeline başarılı bir şekilde indüklendi. AR, AR grubundaki tüm sıçanlarda indüklendi ve grubun% 100'ünü oluşturdu. AR grubundaki tüm sıçanlar hapşırma, burun akıntısı ve burun kaşıntısı gibi tipik semptomlar sergiledi. Tüm davranışsal gözlemler ≥5 puan aldı (Tablo 2).

Modellemenin 21. günündeki H & E boyama sonuçları, kontrol sıçanlarında, burun mukozasının epitel hücrelerinin ve kirpikle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Allerjik Rinit (AR), çevresel ve genetik faktörlerin bir kombinasyonundan kaynaklanan burun mukozasının enfeksiyöz olmayan inflamatuar bir hastalığıdır. İş verimliliğini etkileyen, yaşam kalitesini düşüren, uykuyu, bilişsel işlevi bozan, sinirlilik ve yorgunluğa neden olan küresel bir sağlık sorunu haline geldi. AR, dünya nüfusunun %10-20'sini¹ etkilemekte ve önemli ekonomik maliyetler taşıyarak AB ülkelerinde yıllık 30-50 milyar avroya varan kayıplara neden olmaktadır18. Ayrıca, birkaç çalışma AR...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Sichuan Eyaleti Bilim ve Teknoloji Departmanı (2021YJ0175) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Al (OH) < sub > 3 < / sub >Sollerbauer Biotechnology Co., LtdA7130
75 etanolAnhui Yiren An Co., Ltd20210107
AmonyakChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2021070101
Susuz etanolChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2022070501
Anti-floresan söndürme mühürleyenSouthernBiotech0100-01
Otomatik boyama makinesiTermo bilimselVaristain Gemini ES
Taşıyıcı slaytlarNantong Mei Wei De Experimental Equipment Co., Ltd220518001
Sitrat-fosfat tamponu Servicebio biyoteknoloji co., LtdG1201
Sitrik asit antijen onarım çözeltisi (PH 6.0)Xavier Biotechnology Co., LtdG1201
LamelNantong Mei Wei De Deneysel Ekipman A.Ş.
LamelNantong Mewtech Life Science Co., LtdCS01-2450
CY3-TyramideSawell Biotechnology Co., LtdG1223-50UL
DAPISawell Biyoteknoloji Co., LtdG1012
Renk Açıcı ÇalkalayıcıSCILOGEXS1010E
EDTA kireç çözme çözümüWuhan Xavier Biotechnology Co., Ltd
Elektrikli ısıtma yüksek kurutucu ve nbsp;Shanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240A
Gömme kutusu markalama makinesiThermo scientific  PrintMate AS
Gömme makinesiWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-P5
Hızlı doku susuzlaştırma makinesiTermo bilimselSTP420 ES
Film mühürleyenTermo bilimselAutostainer 360
FITC-TyramideSawell Biotechnology Co., LtdG1222-50UL
Floresan mikroskobuGüneşli Optik Teknoloji Co.LtdCX40
Foxp3Affinity Biosciences Co., Ltdbs-10211R
Donma masasıWuhan Junjie Electronics Co., LtdJB-L5
Keçi Anti-Tavşan IgG H & L (HRP)Liankebio Co., LtdGAR0072
Keçi serumuBiosharpBL210A
H & E boyama kitiLeageneDH0020
Hemostatik forsepsŞangay Tıbbi Cihazlar Co, LtdJ31010
Hidroklorik asitSichuan Xilong Science Co., Ltd210608
İmmünohistokimyasal kalemBiosharpBC004
Mikrodalga fırınMideaM1-L213B
Nötr sakızSinopharm Grubu Kimyasal Reaktif Co, Ltd10004160
Ovalbumin Sollerbauer Biotechnology Co., LtdA804010
FırınShanghai Yiheng Scientific Instruments Co., LtdDHG-9240A
Avuç içi santrifüjüSCILOGEXD1008E
ParaformaldehitBeyotime Biotechnology Co., LtdP0099-100ml
Patoloji kesiti tarayıcı3DHISTECH KftPannoramic SCAN 
PBS tamponBiosharpG4202
Pipet ve nbsp;EjderhaKE0003087/KA0056573
Rorγ tAffinity Biosciences Co., LtdDF3196
NeşterQuanzhou Excellence Medical Co., Ltd20170022
Kendinden floresan söndürme maddesi Sudan Black BBioengineering Co., LtdA602008-0025
DilimleyiciTermo bilimselHM325
Dilimleme makinesiTermo bilimselHM325
SlaytNantong Mewtech Yaşam Bilimleri Co, LtdPC2-301
Sprague Dawley sıçanlarıSichuan Geleneksel Çin Tıbbı AkademisiSYX figure-materials-1 2023-0100
TICAM-1Affinity Biosciences Co., LtdDF6289
Doku makasıShanghai Medical Devices Co., LtdJ22120
Doku serpme fırın tepsisi makinesiWuhan Junjie Electronics Co., LtdJK-6
TYR-690 floresan boyalarŞangay Rutron Biyoteknoloji Co., LtdRC0086-34RM
Vorteks karıştırıcıSCILOGEXSLK-O3000-S
Su banyosu sürgülü kurutucuWuhan Junjie Electronics Co., LtdJK-6
Balmumu düzelticiWuhan Junjie Electronics Co., LtdJXL-818
KsilenChengdu Kolon Chemical Co., Ltd2022051901
% 220518001CR2203047

Kaynaklar

  1. Brożek, J. L., et al. Allergic rhinitis and its impact on asthma (ARIA) Guidelines-2016 revision. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 140 (4), 950-958 (2017).
  2. Maurer, M., Zuberbier, T. Undertreatment of rhinitis symptoms in Europe: findings from a cross-sectional questionnaire survey. Allergy. 62 (9), 1057-1063 (2007).
  3. Ding, Y., et al. Alpha-linolenic acid improves nasal mucosa epithelial barrier function in allergic rhinitis by arresting CD4+ T cell differentiation via IL-4Rα-JAK2-STAT3 pathway. Phytomedicine: International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology. 116, 154825(2023).
  4. Zhou, H., et al. Activation of NLRP3 inflammasome contributes to the inflammatory response to allergic rhinitis via macrophage pyroptosis. International Immunopharmacology. 110, 109012(2022).
  5. Watts, A. M., Cripps, A. W., West, N. P., Cox, A. J. Modulation of allergic inflammation in the nasal mucosa of allergic rhinitis sufferers with topical pharmaceutical agents. Frontiers in pharmacology. 10, 294(2019).
  6. Patel, N., et al. Fungal extracts stimulate solitary chemosensory cell expansion in noninvasive fungal rhinosinusitis. International Forum of Allergy & Rhinology. 9 (7), 730-737 (2019).
  7. Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1(+)CD8(+) T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
  8. Badoua, C., et al. PD-1-ex pressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
  9. Fedchenko, N., Reifenrath, J. Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue - a review. Diagnostic Pathology. 9, 221(2014).
  10. Faget, L., Hnasko, T. S. Tyramide signal amplification for immunofluorescent enhancement. Methods in Molecular Biology. 1318, 161-172 (2015).
  11. Parra, E. R., Villalobos, P., Rodriguez-Canales, J. The multiple faces of programmed cell death ligand 1 expression in malignant and nonmalignant cells. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology.: AIMM. 27 (4), 287-294 (2019).
  12. Welsh, A. W., et al. Standardization of estrogen receptor measurement in breast cancer suggests false-negative results are a function of threshold intensity rather than percentage of positive cells. Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology. 29 (22), 2978-2984 (2011).
  13. Parra, E. R., et al. Validation of multiplex immunofluorescence panels using multispectral microscopy for immune-profiling of formalin-fixed and paraffin-embedded human tumor tissues. Scientific Reports. 7 (1), 13380(2017).
  14. Miao, M., Xiang, L., Miao, Y. Specification for preparation of allergic rhinitis animal model (draft). Chinese Traditional and Herbal Drugs. 49 (1), 50-57 (2018).
  15. Xu, J., et al. Astragalus polysaccharides attenuate ovalbumin-induced allergic rhinitis in rats by inhibiting nlrp3 inflammasome activation and nod2-mediated nf- κ b activation. Journal of Medicinal Food. 24 (1), 1-9 (2021).
  16. Bousquet, J., et al. Allergic rhinitis. Nature reviews. 6 (1), 95(2020).
  17. Free Thinking. Multiplex fluorescence immunohistochemistry. , http://www.freethinking.com.cn/?xinwendongtai/156.html (2023).
  18. Huang, C., et al. Expression of activated signal transducer and activator of transcription-3 as a predictive and prognostic marker in advanced esophageal squamous cell carcinoma. World Journal of Surgical Oncology. 13, 314(2015).
  19. Leynaert, B., Bousquet, J., Neukirch, C., Liard, R., Neukirch, F. Perennial rhinitis: An independent risk factor for asthma in nonatopic subjects: results from the European Community Respiratory Health Survey. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 104 (2), 301-304 (1999).
  20. Guerra, S., et al. Rhinitis is an independent risk factor for developing cough apart from colds among adults. Allergy. 60 (3), 343-349 (2005).
  21. Greisner, W. A., Settipane, R. J., Settipane, G. A. Co-existence of asthma and allergic rhinitis: a 23-year follow-up study of college students. Allergy and Asthma Proceedings. 19 (4), 185-188 (1998).
  22. Pawankar, R., Mori, S., Ozu, C., Kimura, S. Overview on the pathomechanisms of allergic rhinitis. Asia Pacific Allergy. 1 (3), 157-167 (2011).
  23. Van Nguyen, T., et al. Anti-allergic rhinitis activity of α-lipoic acid via balancing th17/treg expression and enhancing nrf2/ho-1 pathway signaling. Scientific Reports. 10 (1), 12528(2020).
  24. Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor rorγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
  25. Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
  26. Zhou, X., et al. Instability of the transcription factor Foxp3 leads to the generation of pathogenic memory T cells in Vivo. Nature Immunology. 10 (9), 1000-1007 (2009).
  27. Ziegler, S. F., Buckner, J. H. Foxp3 and the regulation of Treg/Th17 differentiation. Microbes and Infection. 11 (5), 594-598 (2009).
  28. Yaling, Y., Gui, Y., Shuqi, Q. Recent research advances of toll-like receptors and allergic rhinitis. Medical Recapitulate. 23 (7), 1273-1276 (2017).
  29. Shan, H., Jie, C. Correlation between TLR4 gene polymorphisms and allergic rhinitis. Journal of Clinical Otorhinolaryngology, Head, and Neck Surgery. 31 (13), 991-994 (2017).
  30. Xu, O., et al. Immunoregulatory mechanism of Treg cells and TICAM-1 patients with severe allergic rhinitis. Chinese Journal of Coal Industry Medicine. 23 (3), 303-306 (2020).
  31. Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
  32. Badoual, C., et al. PD-1 expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in hpv-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
  33. Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using automated quantitative analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
  34. Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
  35. Hernandez, S., et al. Multiplex immunofluorescence tyramide signal amplification for immune cell profiling of paraffin-embedded tumor tissues. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 667067(2021).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

ok Renkli mm nofloresanDoku Kesiti BoyamaHematoksilin Eozin BoyamaFoxp3 EkspresyonuROR Gamma TTICAM 1 EkspresyonuS an Modeli
Allerjik Rinit Sıçanlarının Nazal Mukoza Dokusu Kesitlerinde Çok Renkli İmmünoassay ile İmmünofloresan Etiketleme
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.