Bu protokol, Drosophila melanogaster kullanılarak şeker açığa çıkarılan arama davranışını kaydetmek için davranışsal bir testi açıklar. Test, beslenme ve yiyecek arama ile ilgili davranışların yanı sıra altta yatan nöronal mekanizmaları incelemek için kullanılabilir.
Yöntem makalesi
Drosophila'da Şeker Kaynaklı Yerel Arama Davranışının İzlenmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Yiyecek arama davranışı, organizmaların temel besin kaynaklarını bulmalarını ve edinmelerini sağladığı için hayatta kalmaları için gereklidir. Drosophila'da açlık, az miktarda şeker çözeltisinin tüketilmesini takiben farklı bir arama davranışını tetikler. Bu rapor, altta yatan mekanizmaları ortaya çıkarmak amacıyla şeker kaynaklı arama davranışını incelemek için basit bir deney düzeneği sunmaktadır. Çok az miktarda konsantre şeker çözeltisi, sineklerde sürekli arama davranışı ortaya çıkarır. Sinekler şeker konumuna geri dönmek için yörüngelerini kullandığından, yol entegrasyonunun bu davranışa katılımı kurulmuştur. En son bulgular, şeker alımından sonra arama davranışının başlatılmasında ve yoğunluğunda zamansal modülasyonun kanıtını sağlar. Bu kurulumu, arama davranışını ortaya çıkaran farenksteki spesifik tat reseptör nöronlarının yapay aktivasyonu için de kullandık. Drosophila nörogenetik araç seti, yiyecek aramanın altında yatan nöral ve genetik mekanizmaları incelemek için şeker açığa çıkaran arama davranışı paradigmasıyla birleştirilebilecek çok çeşitli araçlar ve teknikler sunar. Sineklerde açlığa bağlı arama davranışının sinirsel temelini anlamak, bir bütün olarak nörobiyoloji alanına katkıda bulunur ve yalnızca diğer organizmalarda değil, insanlarda da beslenme davranışlarını yöneten düzenleyici mekanizmalar hakkında fikir verir.
Giriş
Yiyecek arama ve yiyecek arama davranışı, taksonlar arasında organizmalar tarafından sergilenen temel bir hayatta kalma stratejisidir. Böceklerde iki tür yiyecek arama davranışı tanımlanmıştır: açlığa bağlı yiyecek arama ve yemek sonrası yerel arama1. Acıktıklarında, böcekler yiyecek kaynaklarını bulmak için duyusal ipuçlarına güvenirler. Küçük bir yiyecek yamasıyla karşılaşıp tükettikten sonra, dolambaçlı yollarla karakterize edilen ve yiyecek yerinin etrafında dönen yerel bir arama davranışı başlatırlar.
Yerel aramanın belirli bir biçimi olan şekerle ortaya çıkan arama davranışı, ilk olarak 60 yıl önce Amerikalı biyolog Vincent Dethier tarafından sinekler2'de incelenmiştir. Aç kaldıklarında, sineklere onları doyurmayacak kadar az miktarda şeker sunulur, yerel bir aramaya başlarlar. Tipik arama davranışı, düşük lokomotor ve yüksek dönüş hızı ile oldukça dolambaçlı bir yürüyüş ve şeker damlasının bulunduğu yere geri dönüş ile karakterize edilir. Daha sonraki çalışmalarda bu davranış karasineklerde ve meyve sineklerinde araştırılmıştır 3,4. Araştırmanın başlatılması, yoğunluğu ve süresi, hayvanın iç durumu (örneğin, yoksunluk ve motivasyon) ile kaynak mevcudiyeti ve kalitesi gibi dış faktörler tarafından düzenlenir 1,5,6.
İzleme teknolojilerindeki gelişmeler, araştırmacılara kontrollü alanlardaki davranışları yakalamak ve analiz etmek için değerli araçlar sağlamıştır. Burada, şeker alımından sonra serbestçe yürüyen sinekleri izlemek için davranışsal bir paradigma sunuyoruz. Bu basit kurulum, bir arenada sağlanan konsantre şeker çözeltisine yanıt olarak sineğin hareketini yakalayıp analiz ederek Drosophila'da şeker kaynaklı arama davranışının incelenmesini sağlar. Gelişmiş izleme teknolojisi ve veri analizi teknikleri kullanılarak, lokomotor modeller, mekansal keşif ve şeker uyaranlarına tepki dinamikleri başarıyla ölçülmüştür.
Bu tahlil kullanılarak, şeker ortaya çıkan aramanın yol entegrasyonunun kullanımını içerdiği ve şeker alımından mekansal-zamansal olarak ayrılabileceği deneysel olarak gösterilmiştir 7,8. Ayrıca, davranışın faringeal tat nöronlarınınaktivasyonu ile tetiklenebileceği gösterilmiştir 9. Son sonuçlar, şeker uyaranının doğuştan gelen bir salma mekanizması olmadığını, aynı zamanda modülatör olduğunu ve davranışın başlamasını zamansal olarak kontrol ettiğinigöstermektedir 8. Bu paradigmayı kullanarak, bu davranışı bal arılarında da inceledik (Apis mellifera)7,8.
Bu araştırmanın nihai amacı, hedeflenen genetik manipülasyonlar ve nörogörüntüleme teknikleri yoluyla arama davranışının düzenlenmesinde rol oynayan nöral devreleri ve yeni genetik bileşenleri çözmektir. Yiyecek arama davranışlarının, böceklerde navigasyon ve uzamsal hafızayı incelemek için oldukça etkili deneysel paradigmalar olduğu kanıtlanmıştır. Bu davranışlar, sineklerde ödüllendirici besin kaynakları arayışında yer alan duyusal algıyı, karar verme süreçlerini ve motor koordinasyonu araştırmak için eşsiz bir fırsat sağlar. Ek olarak, bu çalışmalardan elde edilen bulgular, birçok temel genetik ve sinirsel mekanizma evrimsel olarak korunduğundan, insanlar da dahil olmak üzere diğer organizmalardaki beslenme davranışlarını anlamak için daha geniş etkilere sahiptir. Beslenme davranışlarının düzensizliği çeşitli nörolojik ve metabolik bozukluklarla ilişkilidir10. Bu nedenle, sineklerde arama davranışının altında yatan sinirsel ve genetik mekanizmalar, bu karmaşık insan sağlığı zorluklarını anlamak ve potansiyel olarak ele almak için yeni yollar sunabilir.
Protokol
Bu çalışma için Drosophila melanogaster Canton-S (CS) yabani tip suşunun ergin erkek sinekleri kullanıldı.
1. Deneysel hazırlık
- Sinek yetiştirme
- 12 saatlik bir süre içinde ortaya çıkan yetişkin erkek sinekleri toplayın ve bunları 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsünde %75 bağıl nem ile 25 ° C'de 48 saat boyunca standart sinek ortamında (evde hazırlanmış) muhafaza edin.
NOT: Kullanılan Drosophila ortam bileşimi (1 L ortam için) mısır unu (80 g), D-glikoz (20 g), şeker (40 g), agar (8 g), maya tozu (15 g), propiyonik asit (4 mL), metil 4-hidroksibenzoat (3 mL etanol içinde 1.25 g) ve ortofosforik asit (600 μL) idi (bkz. İlk beslenme dönemi, sineklerin açlık aşamasından önce yeterli yiyecek ve besin maddelerine erişmesini sağlar. Hem erkek hem de dişi sinekler arama davranışını ortaya çıkarırken, açlık süresi erkek sinekler arasında daha tutarlıdır. Ek olarak, dişi sinekler çiftleştikten sonra beslenme tercihlerini değiştirirler11.
- 12 saatlik bir süre içinde ortaya çıkan yetişkin erkek sinekleri toplayın ve bunları 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsünde %75 bağıl nem ile 25 ° C'de 48 saat boyunca standart sinek ortamında (evde hazırlanmış) muhafaza edin.
- Açlık prosedürü
- Beslenme döneminden sonra, yiyecek sineklerini aç bırakın, ancak suya erişimi var.
NOT: Açlık durumunu denemeler ve suşlar arasında standartlaştırmak için, gıda açlığı koşulları altında nüfusun %90'ının hayatta kalma süresinin belirlenmesi önerilmektedir. Bu sonuca dayanarak, sirkadiyen ritimler ve diğer faktörler arama davranışını etkileyebileceğinden CS sinekleri 28 saat aç bırakıldı (Şekil 1A)12. Günün farklı saatlerinde sinek arama aktivitelerinin sirkadiyen değişimleri de ölçülmüştür (Şekil 1B). Sineklerde ışık fazına kıyasla geceleri göreceli arama aktivitesinin azaldığını fark ettik. - İki günlük sinekleri yiyeceklerden mahrum bırakarak yiyecek açlığı toleransını hesaplayın. Altta ıslatılmış kağıt mendil bulunan bir şişeye 15-20 sinek yerleştirin. Bu bir substrat görevi görür ve sineklerin açlık süresi boyunca suya erişmesini sağlar.
- Yiyecek açlığı döneminde sinek sayısını düzenli aralıklarla 1 saat sayın. Aç kalan sineklerin %90'ının hayatta kaldığı süre açlık süresi olarak kullanılmıştır (Şekil 1A). Bireysel varyasyonların etkisini en aza indirmek ve açlık toleransının daha güvenilir bir değerlendirmesini sağlamak için birden fazla kopya (her suş için 3-4) kullanın.
NOT: Farklı suşlar ve deneyler arasında standartlaştırılmış bir açlık durumu oluşturmak için her bir suşun gıda açlığı toleransı belirlenmiştir. Bu aralıklarla hayatta kalan sinekleri sayarak, zaman içinde hayatta kalma oranı izlenebilir ve her bir suşun açlığa yenik düşmeden önce gıda yoksunluğuna ne kadar süre tahammül edebileceği belirlenebilir.
- Beslenme döneminden sonra, yiyecek sineklerini aç bırakın, ancak suya erişimi var.
- Davranışı kaydetme prosedürü
- Aç bırakılan sinekleri tek tek küçük tüplere aktarın (Şekil 2A). İzolasyon süresini en aza indirmek için bunu 5-6 sinekten oluşan gruplar halinde yapın. Tek sinekleri test ederek, her bir sineği izole ederek, gözlemlenen herhangi bir değişiklik veya eylem, diğer sineklerle etkileşimlerden etkilenmek yerine, gözlemlenen belirli sineğe atfedilebilir.
- Davranışsal tahliller için bir arena olarak 90 mm Petri kapları kullanın (daha büyük petri kapları kullanılabilir. Daha büyük çaplı Petri kaplarında davranışta bir fark yoktu). Yüzeye monte soğuk beyaz LED'lerden oluşan bir panel ile arenayı alttan aydınlatın (Şekil 2B,C). Tek tip bir görsel ortam sağlamak ve dış dikkat dağınıklığını en aza indirmek için, deney alanını beyaz bir polivinil klorür boru (51,5 mm yükseklik, 114 mm iç çap) ile çevreleyin.
NOT: Bu boru, arena dışından gelen herhangi bir görsel uyaranın sineğin davranışını etkilemesini engelleyen bir bariyer görevi görür. Dış dikkat dağıtıcı unsurları azaltarak, yalnızca sineğin besin kaynağı ile etkileşimine odaklanılabilir ve deney boyunca tutarlılık korunabilir. - Arenanın merkezinde 320 lux ışık yoğunluğu kullanın.
- 0,2 μL şeker çözeltisini arenanın ortasına yerleştirin. Rapor edilen deneylerde 500 mM sükroz çözeltisi kullanılmıştır, ancak bu değişebilir. 2 mL'lik bir mikro santrifüj tüpü kullanarak sineği arenaya getirin (iç çap 8,7 mm, alttan pamuk doldurularak uzunluk 5 mm'ye düşürüldü; Şekil 2A) şeker damlasının üzerine ters çevrilmiş tek bir sinek barındırmak.
- Sinek damlacığı yutmaya başladığında, sinek kabını çıkarın ve sineğin besin kaynağına sınırsız erişimini sağlayın.
- Arenanın 2D konumunu bir tepe kamerasıyla filme alın.
NOT: Bu çalışma için Flea3 (Nokta Gri, 1214 mm lens, Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılmış ve saniyede 40 kare (fps) hızında kaydedilmiştir. Ancak, arka planla iyi kontrast sağlayan herhangi bir kamera kullanılabilir. Deneyin niteliğine bağlı olarak 30-60 fps'de kayıt yapılabilir. İzleme yazılımı ile uyumlu olduğu için .avi formatında kayıt yapın. - Sineğin arenadan kaçtığı zamana kadar denemeyi kaydedin. Sinekler serbestçe yürüyordu ve arenada kapak yoktu.
- Sineğin aramayı ne zaman bırakacağına, uçup gideceğine veya arenanın çevresine ne zaman yürüyeceğine karar vermesine izin vererek, sineğin doğal davranışını ve yiyecek arama stratejisini gözlemleyin. Denemeler arasında Petri kaplarını %70 etanol ile silin ve tamamen kurutun veya yeni bir Petri kabı kullanın.
NOT: Tüm deneylerin, sineklerin sürekli olarak yüksek aktivite seviyeleri sergilediği ışıklar yandıktan sonra 2 saat ile 6 saat arasında yapılması önemlidir. Bu zaman dilimi, sineklerin aktif bir durumda olmasını sağlar, doğal yiyecek arama davranışlarını gözlemleme şanslarını en üst düzeye çıkarır ve sirkadiyen ritimler gibi davranışlarını etkileyebilecek diğer faktörlerin etkisini azaltır. Davranış düzeni, sıcaklık ve nem kontrollü bir odaya yerleştirildi. Arena titreşimsiz bir masaya yerleştirildi. Bu deney düzeneği, şekere tepkileri için tek tek sineklerin izole edilmesini ve test edilmesini içeriyordu. Aç bırakılan sineklere şeker damlası sağlandı ve davranışları videoya kaydedildi (Şekil 2B,C, Video 1). Deneyler, sineklerin tutarlı yüksek aktivite seviyeleri sergilediği belirli bir zaman diliminde gerçekleştirildi.
- Arama davranışını belirlemek için 2. adımı izleyerek yörüngeleri analiz edin.
2. Yerel arama için yörüngelerin analizi
- Kaydedilen videoları Ctrax yazılımı11 kullanarak analiz edin (Malzeme Tablosuna bakın).
NOT: Yazılım, sineğin videodaki konumunu izler ve x, y koordinatlarına dönüştürür, böylece hareketlerinin hassas bir şekilde izlenmesini ve analiz edilmesini sağlar. Ctrax'ın nasıl kullanılacağına ilişkin ayrıntılar için Ek Dosya 1'e bakın. - Yörüngeleri iki aşamaya ayırın: ilk besleme aşaması ve arama aşaması. Beslenmenin sonunu ve yürümenin başlangıcını, ardışık üç karede >4 mm s-1 hızında hareket eden sinekler olarak tanımlayın.
NOT: Beslenme bittikten sonra, yörüngenin geri kalanı sineklerin arama tepkisi olarak kullanıldı. Bu çalışmada, izlemeden önce videolardan besleme aşamasını kaldırmak için VirtualDub (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılmıştır. - Aramayı aşağıdaki parametrelerle ölçün:
- Yol uzunluğu: Bu parametre, yiyecek arama sırasında sineğin başlangıç noktasından yürüdüğü mesafeyi (mm cinsinden) temsil eder.
- Kalış süresi: Sineklerin arama sırasında yürüdükleri süre (s cinsinden). Aramanın süresini ve sineğin yiyecek aramadaki ısrarını gösterir.
- Menderes: Bunu, yolun çizgi çizgisini (yolun ilk ve son noktası arasındaki mesafe) toplam yol uzunluğuna bölerek ve 1'den çıkararak bir oran olarak hesaplayın. Yüksek menderes değerleri, yörüngede daha fazla kıvrımlılık olduğunu gösterir.
- Dönüş sayısı: İki eşmerkezli daire kullanarak iade sayısını belirlemek ve saymak için geliştirilen algoritmayı kullanın.
NOT: Aramanın kökenini gösteren bir iç daire, Rin (2,5 mm) ve sineğin orijinden uzaklaşması gereken minimum Rota mesafesini (4 mm) gösteren dış daire. Geri dönüş, dış çemberden (Rout) bir hareket ve ardından iç çembere (Rin) geri dönme olarak tanımlandı. - Aktivite oranı: Yüzde olarak ifade edilen, sineğin yürüme hızı 2 mm/s'yi aştığında yiyecek arama sırasında geçen süreyi belirleyerek aktivite oranını hesaplayın. Bu parametre, sineğin aktivite düzeyini ve yiyecek aramadaki katılımını yansıtır. Aktif toplayıcıları daha az aktif bireylerden ayırır.
NOT: Bu çalışmada yörüngelerin daha fazla analizi için MATLAB ve Python kullanılmıştır. Komut dosyalarına buradan erişilebilir: https://github.com/eagermeagre/sugar_elicited_search. Analiz prosedürü, sineğin hareketlerini izlemek ve yiyecek arama süresi, toplam yol uzunluğu, arama süresi, menderes, geri dönüş sayısı ve aktivite oranı gibi parametreleri belirlemek için Ctrax yazılımının kullanılmasını içerir. Bu parametreler, kaydedilen yiyecek arama deneyleri sırasında sineğin davranışı ve yiyecek arama verimliliği hakkında değerli bilgiler sağlar.
Sonuçlar
Sineklerin, gıda açlığı toleransı tarafından tahmin edilen süre boyunca aç bırakılması gerekiyordu ve şekere verilen tepki ayrı ayrı test edildi (Şekil 1A ve Şekil 2A). Davranış, sıcaklık ve nem kontrollü bir odada kaydedildi. Rapor edilen deneyler için 0.2 μL 500 mM sükroz çözeltisi kullanıldı. Şeker damlası arenanın ortasına yerleştirildi ve sinekler şekere sokuldu (Şekil 2B). Davranış, sinekler arenadan kaçana kadar kaydedildi. Videolar, sineklerin x,y koordinatlarını ve yörüngelerini çıkarmak için analiz edildi. Davranışsal yanıtı ölçmek için çeşitli parametreler kullanıldı: yol uzunluğu, kalış süresi, kıvrım, geri dönüş sayısı ve aktivite oranı.
Aç sineklerde şeker alımı, kıvrımlı bir yol ve döngülerle yerel bir aramaya yol açar (Şekil 3A, C). Negatif bir kontrol olarak, şeker8 sunulmayan aç sinekler kaydedildi. Bu sinekler arenaya getirildiklerinde ve boş olduklarında bir arama başlatmadılar ve arenadan kaçtılar (Şekil 3B,D). Bu grup beslenmemiş sinekler olarak adlandırılır. Aramanın parametreleri: yol uzunluğu, kalış süresi, menderes ve geri dönüş sayısı, beslenmemiş sineklerde şeker damlası verilen sineklere göre anlamlı olarak daha düşüktü (Şekil 4A-D).
Şekil 1: Vahşi tip CS suşunun açlık eğrileri. (A) Yabani tip CS erkek ve dişi sinekler için hayatta kalma oranını gösteren açlık eğrisi. (B) Günün farklı saatlerinde sinek arama faaliyetlerinin sirkadiyen değişiklikleri. Hata çubukları S.E.M.'yi temsil eder (n = 10). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Açlık toleransı hesaplaması, davranış kayıt prosedürleri ve yörünge analizi dahil olmak üzere deney düzeneği. (A) Standartlaştırılmış bir açlık durumu oluşturmak için gıda açlığı toleransı belirlendi. Davranış kaydı için, deneyden önce küçük tüplerde bireysel sinekler izole edildi. 90 mm'lik bir Petri kabı olan davranış alanı, alttan eşit şekilde aydınlatıldı. Merkeze bir damla şeker çözeltisi yerleştirildi ve sineklerin besin kaynağına sınırsız erişimi sağlandı. (B) Davranış, sinekler arenadan kaçana kadar kaydedildi. Video analizi, izleme için Ctrax yazılımını ve yörünge analizi için MATLAB/Python kullandı. (C) Deney düzeneğinin fotoğrafı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Yerel aramayı başlatmak için şeker alımının gerekliliği. (A) 500 mM, 0.2 μL şeker çözeltisi ile beslenen sineklerin bireysel yörüngeleri. (B) Şeker verilmeyen sineklerin bireysel yörüngeleri. (C) Arama yörüngelerinin üst üste binmesi kontrol grubundan uçar (n = 11). (D) Şeker verilmeyen sineklerin (n = 11) yollarının üst üste binmesi. Tüm yörüngeler, yürüyüşün başlangıç noktasına normalleştirilmiştir. Bu rakam Shakeel ve Brockmann8'den uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Beslenmemiş sineklerde davranışsal parametrelerin azaltılması. (A-D) Şeker ödülü verilmeyen aç sineklerin yol uzunluğu, kalış süresi, menderes ve geri dönüş sayısı, şekerle uyarılan kontrol sineklerine göre daha küçüktü. **p < 0.001, ***p < 0.0001, ****p < 0.00001, Wilcoxon Sıra Toplamı Testi. Bu rakam Shakeel ve Brockmann8'den uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: Yolun gerçek zamanlı yörüngesi ile bir sineğin arama davranışı. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: CTRAX kullanarak video dosyasını izlemek için adım adım talimatlar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Tartışma
Bu çalışma, ilk olarak Dethier2 tarafından tanımlanan Drosophila'da şeker kaynaklı arama davranışını araştırmak için basit bir paradigma sunmaktadır. Bu doğuştan gelen davranış, sineklerin bir yiyecek ödülüyle karşılaştıktan sonra ek yiyecek kaynakları için yerel bir arayışa girmelerini sağlar. Deney protokolünün en önemli yönü, sinekleri uygun şekilde motive etmeyi içerir. İlk olarak, sineklerin şeker alımını sağlamak için suya erişimleri varken yiyeceklerden mahrum bırakılmış açlık durumunda olmaları gerekir. Deneysel denemelerde tek tip açlık durumuna sahip olmak için, nüfusun% 90'ının hayatta kaldığı süre açlık süresi olarak kullanılmıştır. En önemlisi, beslenme sonrası bir arama yanıtının başlatılması, yeterli kalitede ancak sinekleri tam olarak doyurmak için yeterli olmayan bir gıda uyaranının sağlanmasını gerektirir. Bu nedenle, şeker konsantrasyonunun ve miktarının ve açlık süresinin standartlaştırılması zaman alıcı olabilir, ancak sağlam ve güvenilir davranış için zorunludur.
Bu çalışmada, aç sinekler için uyarıcı olarak 500 mM, 0.2 μL sükroz çözeltisi kullanılmıştır. Şeker alımı, artan dönme davranışı ve şeker damlasının bulunduğu yere sık sık geri dönüşlerle karakterize edilen karakteristik bir yerel arama davranışını çağrıştırır (Video 1). Tersine, herhangi bir şeker verilmeyen aç sinekler bir arama yanıtı gösteremezler. Özellikle, yol uzunluğu, kalış süresi, menderes ve geri dönüş sayısı dahil olmak üzere davranışla ilgili tüm parametreler, beslenmemiş sineklerde önemli ölçüde daha düşüktü. Daha önce, tek başına su yutulmasının bir arama yanıtı ortaya çıkarmadığını göstermiştik9.
Bu kurulum, bu doğuştan gelen davranışı incelemek için uygun maliyetli ve az bakım gerektiren bir yaklaşım sunar. Bu çalışmada arkadan aydınlatmalı bir arena kullanılırken, sinek ve arka plan arasında yeterli kontrast olduğu sürece üstten aydınlatma da kullanılabilir. Kullanılan izleme yazılımı, statik bir arka plana karşı sinek hareketinin algılanmasına dayanır13. Kamera ve çözünürlük ayarları, incelenen belirli davranış ölçeğine göre ayarlanabilir. Daha da önemlisi, bu metodoloji, yiyecek arama sırasında duyusal işaret dikkati, gıda katılımı ve beslenme, aramanın lokomotor kontrolü ve diğerlerinin yanı sıra sömürü ve keşifle ilgili karar verme süreçleri dahil olmak üzere yiyecek arama davranışının çeşitli bileşenlerinin incelenmesini sağlar. Ayrıca, bu paradigma, çeşitli ekolojik bağlamlarda çeşitli taksonlarda yaygın olarak gözlemlenen bir davranış olan yerel aramanın araştırılmasını kolaylaştırır6. Drosophila'da bu davranışı incelemek, yiyecek aramada yer alan nöral yolları anlamayı amaçlayan bilimsel araştırma için yollar açar. Bal arılarında yerel araştırmayı inceledik ve davranışın sineklerebenzerlik gösterdiğini gösterdik 7,8.
Son çalışmalar, yerel arama davranışının sineklerde çeşitli şeker duyusal nöronlarının optogenetik aktivasyonu ile tetiklenebileceğini göstermiştir 14,15,16. Bununla birlikte, bu çalışmalarda gözlemlenen yerel aramaların, gerçek şeker alımına yanıt olarak sineklerin doğal davranışlarını ne ölçüde doğru bir şekilde temsil ettiği belirsizliğini korumaktadır. Sineklerde beslenme davranışı sıkı bir şekilde düzenlenir ve bu bulgular faringeal şeker reseptörlerinin aktivasyonunun arama davranışını başlattığını gösterir. Tarsal tat sensillaları şekeri tespit etmekten ve hortum uzatma refleksini indüklemekten sorumluyken, faringeal tat nöronları beslenmenin devam edip etmeyeceğini belirler17,18. Yutulduktan sonra, şeker çözeltisi yemek borusundan proventriküle gider ve genişlemesi tekrarlayan bir sinir19 tarafından izlenerek mahsule girer. Ek olarak, yukarıda belirtilen çalışmalardan bazılarının sineklerin kullanılmasını veya hapsedilmesini içerdiğini, oysa bu yöntemin hayvanların deney boyunca serbestçe yürümesine izin verdiğini belirtmekte fayda var. Deneylerimizdeki sinekler, bir kapak dayatmadan arenada kalmak ve aramak için yeterince motive oldular.
Sineklerde arama davranışını yöneten nöral yollar, genetik faktörler ve çevresel ipuçları arasındaki karmaşık etkileşimi anlamak, bilgi işleme, öğrenme ve hafıza oluşumunun temel ilkelerine ışık tutabilir. Ayrıca, yiyecek arama davranışının düzensizliği, yeme bozuklukları ve obezite dahil olmak üzere çeşitli insan bozukluklarında rol oynamıştır. Drosophila'da bulunan kapsamlı nörogenetik araçlar dizisi, şekerle ortaya çıkan arama davranışını araştırmak ve yiyecek aramanın altında yatan sinirsel ve genetik mekanizmaları çözmek için değerli bir kaynak sağlar. Optogenetik manipülasyon ve fonksiyonel görüntüleme ile birlikte, bu paradigma güçlü ve umut verici bir yaklaşım sunmaktadır 20,21,22. Bununla birlikte, optogenetik ile nöronal aktivitenin gerçek zamanlı manipülasyonu için kurulumu değiştirmek zor olabilir. Bir sinek arama davranışını gerçekleştirirken beyindeki nöronal aktiviteyi izlemek için, bir sırt topu üzerindeki bağlı sinek gibi farklı bir kuruluma ihtiyaç duyulacaktır. Beslenme düzenlemesi ve karar verme süreçleri gibi yiyecek arama davranışının birçok yönü, türler arasında yüksek oranda korunur. Bu nedenle, sineklerde yiyecek aramanın sinirsel mekanizmalarının incelenmesinden elde edilen içgörüler, insanlar da dahil olmak üzere diğer organizmalardaki benzer süreçler hakkında değerli bilgiler sağlayabilir.
Açıklamalar
Yazar(lar), bu makalenin araştırılması, yazarlığı ve/veya yayınlanması ile ilgili herhangi bir potansiyel çıkar çatışması beyan etmez.
Teşekkürler
Arenanın kurulmasına yardımcı olduğu için Ravikumar Boyapati'ye teşekkür ederiz. Bu çalışma, Wellcome trust DBT Intermediate India Alliance hibesi (Hibe numarası IA/I/15/2/502074) tarafından PK'ye finanse edilmektedir. A.B., NCBS-TIFR kurumsal fonları (No. 12P4167) ve Hindistan Hükümeti Atom Enerjisi Departmanı (No. 12-R& D-TFR-5.04-0800 ve 12-R& D-TFR-5.04-0900).
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 2 mL Eppendorf tüp | Sigma Aldrich | BR780546 | Sineği şeker damlasına tanıtmak için kullanılır |
| Agar | SRL | 9002-18-0 | |
| Azure lens | https://www.rmaelectronics.com/azure-photonics-azure-1214mm/ | ||
| Camera | Logicool, Japonya | ||
| Mısır unu | yerel olarak temin edilebilir | ||
| Ctrax yazılımı | https://ctrax.sourceforge.net/ | ||
| D-glukoz | SRL | 50-99-7 | |
| Flea3 | Sony | https://www.flir.com/products/flea3-usb3/?vertical=machine+vision&segment=iis | |
| cam tüp | Borozil | Sinekleri ayrı ayrı barındırmak için kullanılır | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34155 | Yiyecek açlığı sırasında sinekler için suya erişim sağlamak için kullanılır |
| Atölyede özel olarak üretilen | LED ışık paneli | ||
| Işık Ölçer | TENMARS | TM-203 | |
| Metil 4-hidroksibenzoat | Fisher Scientific | 99-76-3 | |
| Ortofosfotik asit | SRL | 7664-38-2 | |
| Petri kabı (90 mm) | Tarsons | 460090 | |
| Propiyonik asit | SRL | 79-09-4 | |
| Sükroz | Qualigens | Q28105 | |
| Şeker | yerel olarak mevcut | ||
| VirtualDub | https://www.virtualdub.org/ | ||
| Beyaz polivinil klorür boru (67 mm iç çap ve 100 mm yükseklik) | atölyede özel yapım | ||
| Maya tozu | SRL | REF-34266 |
Kaynaklar
- Jander, R. Ecological aspects of spatial orientation. Annu Rev Ecol Evol Syst. 6 (1), 171-188 (1975).
- Dethier, V. G. Communication by insects: Physiology of dancing. Science. 125 (3243), 331-336 (1957).
- White, J., Tobin, T. R., Bell, W. J. Local search in the housefly Musca domestica after feeding on sucrose. J. Insect Physiol. 30 (6), 477-487 (1984).
- Bell, W. J., Cathy, T., Roggero, R. J., Kipp, L. R., Tobin, T. R. Sucrose stimulated searching behaviour of Drosophila melanogaster in a uniform habitat: modulation by period of deprivation. Animal Behav. 33, 436-448 (1985).
- Dethier, V. G. Microscopic Brains. Science. 143 (3611), 1138-1145 (1964).
- Bell, W. J. Searching behavior patterns in insects. Annu Rev Entomol. 35 (1), 447-467 (1990).
- Brockmann, A., et al. Sugar intake elicits intelligent searching behavior in flies and honey bees. Front Behav Neurosci. 12, 280(2018).
- Shakeel, M., Brockmann, A. Temporal effects of sugar intake on fly local search and honey bee dance behaviour. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. , (2023).
- Murata, S., Brockmann, A., Tanimura, T. Pharyngeal stimulation with sugar triggers local searching behavior in Drosophila. J Exp Biol. 220 (Pt 8), 3231-3237 (2017).
- Nishijo, H., Ono, T. Neural mechanisms of feeding behavior and its disorders new insights into metabolic syndrome. IntechOpen. , (2021).
- Carvalho, G. B., Kapahi, P., Anderson, D. J., Benzer, S. Allocrine modulation of feeding behavior by the sex peptide of Drosophila. Curr Biol. 16 (7), 692-696 (2006).
- Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Corfas, R. A., Sharma, T., Dickinson, M. H. Diverse food-sensing neurons trigger idiothetic local search in Drosophila. Curr Biol. 29 (10), 1660-1668.e4 (2019).
- Behbahani, A. H., Palmer, E. H., Corfas, R. A., Dickinson, M. H. Drosophila re-zero their path integrator at the center of a fictive food patch. Curr Biol. 31 (20), 4534-4546.e5 (2021).
- Titova, A. V., et al. Displacement experiments provide evidence for path integration in Drosophila. J Exp Biol. 226 (12), jeb245289(2023).
- Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a review. Cell Tissue Res. 275 (1), 3-26 (1994).
- LeDue, E. E., Chen, Y. C., Jung, A. Y., Dahanukar, A., Gordon, M. D. Pharyngeal sense organs drive robust sugar consumption in Drosophila. Nat Commun. 6, 6667(2015).
- Gelperin, A. Abdominal sensory neurons providing negative feedback to the feeding behavior of the blowfly. Zeitschrift für vergleichende Physiologie. 72 (1), 17-31 (1971).
- Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Genetics. 208 (4), 1291-1309 (2018).
- DeAngelis, B. D., Zavatone-Veth, J. A., Gonzalez-Suarez, A. D., Clark, D. A. Spatiotemporally precise optogenetic activation of sensory neurons in freely walking Drosophila. Elife. 9, e54183(2020).
- Grover, D., Katsuki, T., Li, J., Dawkins, T. J., Greenspan, R. J. Imaging brain activity during complex social behaviors in Drosophila with Flyception2. Nat Commun. 11 (1), 623(2020).
Yeniden basım ve izinler
