Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Fare omurilik mikrogliasının hızlı ve verimli bir şekilde zenginleştirilmesi

2.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/65961

⸱

22 Eylül 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Epidemiology, Endocrinology & Nutrition, Mexico Children's Hospital, 2Pharmacy Department, National School of Biological Sciences, National Polytechnic Institute, 3Graduate Department, Dr. Eduardo Liceaga General Hospital of Mexico, 4Pain Clinic and Palliative Care, Dr. Eduardo Liceaga General Hospital of Mexico, 5General Surgery Service, Metropolitan Angeles Hospital

Bu makalede

Özet

Mikroglia, morfolojik ve fonksiyonel adaptasyon yeteneğine sahip, vücuttaki en çok yönlü hücrelerden biri olarak kabul edilir. Heterojenlikleri ve çok işlevlilikleri, beyin homeostazının korunmasını sağlarken, aynı zamanda çeşitli nörolojik patolojilerle de bağlantılıdır. Burada, omurilik mikrogliasını saflaştırmak için bir teknik açıklanmaktadır.

Özet

Vertebral kolon bir omurgalıyı tanımlar ve omuriliği çevreleyen ve koruyan bir boşluk olan omurilik kanalını şekillendirir. Memeli merkezi sinir sisteminin uygun gelişimi ve işlevi, önemli ölçüde mikroglia olarak bilinen yerleşik makrofajların aktivitesine dayanır. Mikroglia, omurilik ve beyinde farklı gen ekspresyonu ve davranışı sağlayan heterojenlik ve çok işlevlilik gösterir. Çok sayıda çalışma, saflaştırma yöntemlerini kapsamlı bir şekilde detaylandıran serebral mikroglia fonksiyonunu araştırmıştır. Bununla birlikte, farelerde mikroglia'nın omurilikten saflaştırılması kapsamlı bir açıklamadan yoksundur. Buna karşılık, rafine edilmemiş bir ekstraktın aksine, yüksek oranda saflaştırılmış bir kollajenazın kullanılması, merkezi sinir sistemi dokularında raporlamadan yoksundur. Bu çalışmada, 8-10 haftalık C57BL/6 farelerinden vertebral kolon ve omurilik eksize edildi. Sonraki sindirim, yüksek oranda saflaştırılmış bir kollajenaz kullandı ve mikroglia saflaştırması, bir yoğunluk gradyanı kullandı. Hücreler, CD11b ve CD45 boyama yoluyla canlılık ve saflığı değerlendiren akış sitometrisi için boyandı. Sonuçlar ortalama %80 canlılık ve ortalama %95 saflık verdi. Sonuç olarak, fare mikrogliasının manipülasyonu, yüksek oranda saflaştırılmış bir kollajenaz ve ardından bir yoğunluk gradyanı ile sindirimi içeriyordu. Bu yaklaşım, önemli miktarda omurilik mikroglia popülasyonunu etkili bir şekilde üretti.

Giriş

Omurgalıların tanımlayıcı özelliği, notokordun yerini, omurlar arası disklere bölünmüş, omur adı verilen bir dizi parçalı kemik ile değiştirdiği vertebral kolon veya omurgadır. Bu kemik materyalinin art arda gelmesi, omuriliği çevreleyen ve koruyan bir boşluk olan omurilikkanalını şekillendirir 1. Rodentia cinsinde, omurga genellikle yedi servikal omur, on üç torasik omur, altı lomber omur ve değişken sayıda kaudal vertebradanoluşur 2,3. Omuriliğin uzunluğu omurganınkine benzer ve terminal filum, omuriliği sakruma bağlayan sinirsel olmayan bir yapıdır. Ek olarak, sinir lifleri intervertebral foramen1'den çıkar.

Memelilerde merkezi sinir sisteminin gelişimi ve düzgün işlevi, kritik olarak sinir sisteminin mikroglia4 adı verilen yerleşik makrofajlarının aktivitesine bağlıdır. Mikroglia başlangıçta beyinde yerleşik fagositler olarak tanımlansa da, son araştırmalar bu hücrelere birçok dinamik fonksiyon atfetmiştir 5,6. Mikroglia'nın boyutu homeostazda 7 ila 10 μm arasında değişir; Vücuttaki en çok yönlü hücreler arasında kabul edilirler ve sürekli değişen çevrelerine morfolojik ve işlevsel olarak uyum sağlayabilirler7. Bu hücreler hem embriyonik hem de yetişkin aşamalarda yüksek heterojenlik sergilerler8,9, yetişkin aşamasında ise uzay-zamansal bağlamlarına göre karmaşık fonksiyonel heterojenlik sergilerler10. Mikroglia'nın heterojenliği ve çoklu işlevleri, omurilik ve beyinde diferansiyel gen ekspresyonu ve davranışına izin verir. Omurilikte CD11b, CD45, CD86 ve CCR9 ekspresyonunun beyne göre daha yüksek olduğu gösterilmiştir 8,9.

Serebral mikroglia izolasyonu için çoklu protokoller mevcuttur11,12; Bununla birlikte, omurilik mikroglia13,14 için sadece birkaçı mevcuttur. Mikroglia'yı omurilikten arındırmak için bir yöntemin optimize edilmesi, mikroglia fizyolojisini keşfetmeye odaklanan çok sayıda çalışmanın geliştirilmesini kolaylaştırır. Bu protokol, fare omuriliğinin basit ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir ekstraksiyonunu ve mikroglia'nın saflaştırılmasını tanımlamayı amaçlamaktadır (Şekil 1).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Çalışma, resmi Meksika standardı NOM-062-ZOO-1999'a ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımına ilişkin kılavuza uygun olarak yürütülmüştür. Çalışma için onay, Meksika Çocuk Hastanesi Araştırma, Etik ve Biyogüvenlik Komitelerinden (HIM/2023/006) ve Meksika Eduardo Liceaga Genel Hastanesi Araştırma ve Biyoetik Komitesinden (DI/21/501/04/62) alınmıştır. Yaşları 6 ila 8 hafta arasında değişen üç C57BL/6 faresi, kurumsal hayvan bakımı ve kullanım yönergelerine uygun olarak havalandırmalı raflarda izole koşullar altında yetiştirildikleri Meksika Çocuk Hastanesi'nden elde edildi.

1. Malzemelerin ve reaktiflerin hazırlanması

  1. Ca 2+ ve Mg2+ içermeyen PBS'nin yanı sıra Hank'in dengeli tuz çözeltisini (HBSS) 37 °C'ye kadar önceden ısıtın.
  2. HBSS çözeltisini 100 μg / mL Liferaz ve 4 μg / mL DNaz (HBSS-LD) ile destekleyin. Çözeltinin fizyolojik pH'ını 7.4 olduğundan emin olun.
    NOT: Omurilik başına 1 mL çalışma solüsyonu gerekli olacaktır.
  3. Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme için izotonik %90'lık bir çözelti hazırlayın (ticari olarak temin edilebilir, Malzeme Tablosuna bakın) ve 37 °C'ye ısıtın.
  4. % 5 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumunu (FBS) PBS ile birleştirerek boyama tamponunu hazırlayın ve karışımı buz üzerinde saklayın.
  5. Dulbecco'nun Modifiye Eagle'ın Orta-yüksek glikozunu (1 g / L) (DMEM) 37 ° C'ye önceden ısıtın.
  6. DMEM-S'yi hazırlamak için DMEM ortamını %10 FBS, 2 mM L-glutamin, 200 U/mL penisilin, 200 μg/mL streptomisin ve 500 pg/mL amfoterisin B ile destekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).

2. Omuriliğin diseksiyonu ve hazırlanması

  1. Fareyi 150 mg / kg'lık bir dozda intraperitoneal aşırı dozda pentobarbital ile ötenazi yapın. Farenin göğsünü ve sırtını %70 etanol kullanarak sterilize edin.
    NOT: Fare diseksiyonuna devam etmeden önce ötenazinin başarılı olduğunu onaylayın.
  2. Torakolomber bölgeyi tıraş edin ve ekstremiteleri yapışkan bant kullanarak diseksiyon tahtasına sabitleyin.
  3. Bir neşter kullanarak, oksipitalden sakral bölgeye dorsal orta hat boyunca dikkatli bir kesi yapın (Şekil 2).
  4. Stereoskopik cerrahi mikroskop yardımıyla, lomber omurgaya ulaşana ve son kostal kemeri belirleyene kadar katmanlar halinde inceleyin.
    NOT: 13 kostal kemer torasik omurlarda eklemlidir; diseke edildiklerinde, L1 omuru2'den daha üstün görünür hale gelirler.
  5. Son servikal vertebrayı ve sakrumu belirleyin, ardından omurgayı ayırmak için bir kesi yapın (Şekil 2).
  6. Diseksiyon forsepslerini kullanarak, omuriliği çıkarmak için omurların dorsal laminektomisini gerçekleştirin (Şekil 3A-D).
    NOT: İlk iki servikal omur (atlas ve axis) hariç, tüm hareketli omurlar çeşitli bölgelerde (servikal, torasik veya lomber) ortak bir morfolojik tasarımı paylaşır. Her tipik hareketli omurun ön ucunda silindirik bir omur gövdesi bulunur. Vücudun arkasına tutturulmuş, vertebral ark (nöral ark) olarak bilinen, lamina ve dikenli süreçlerden oluşan kemikli bir kemerdir. Bu yapılar arasında vertebral foramenbulunur 15.
  7. Periferik sinir sistemini oluşturan ve infiltre makrofajlar içerebilen foramina (dorsal ve ventral kökler) yoluyla çıkan sinirleri çıkarın (Şekil 3D).
    NOT: Yoğunluk gradyan ortamı kirletici astrositleri etkili bir şekilde ortadan kaldırdığı için pia mater veya meninkslerin çıkarılması gereksizdir. Ek olarak, meninkslerin tutulması saflaştırma süresini azaltır ve canlılığı artırır.

3. Doku sindirimi ve mikroglia izolasyonu

  1. Omuriliği diseksiyon tahtasına yerleştirin ve Vannas makası kullanarak omuriliği 2 mm'lik parçalar halinde kesin ve ortalama 10 parça elde edin.
  2. Omuriliğin bölümlerini 2 mL düz tabanlı bir mikrotüpe aktarın (Şekil 3E, F).
  3. 1 mL HBSS-LD çalışma solüsyonu ekleyin (adım 1.2). 37 °C'de 25 dakika inkübe edin, her 5 dakikada bir kuvvetlice girdap yapın.
  4. Her sindirimin içeriğini 40 μm'lik bir süzgeçten geçirin ve ardından sindirimi nötralize etmek için% 2 FBS ile 7 mL HBSS ekleyin.
  5. Kalan dokuyu 1 mL'lik bir şırınga pistonu kullanarak ezin. Süspansiyonu 50 mL'lik konik bir tüpte 5 x g, 220 °C'de 4 dakika santrifüjleyin.
  6. Süpernatanı 1 mL'lik bir mikropipet kullanarak atın ve peleti 15 mL'lik bir konik tüpte% 2 FBS ile 2 mL HBSS'de yeniden süspanse edin. 2 mL% 90 izotonik yoğunluk gradyan ortamı ile birleştirin. 160 x g, 18 °C'de 25 dakika santrifüjleyin.
    NOT: Yavaş hızlanmayı kullanın ve freni kullanmaktan kaçının.
  7. Arayüzü almak ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktarmak için bir transfer pipeti kullanın. Hücreleri 10 mL PBS ile yıkayın ve 220 x g, 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  8. DMEM-S'deki hücreleri yeniden süspanse edin (adım 1.6) ve buz üzerinde saklayın.

4. Saflığın/canlılığın belirlenmesi

  1. Bir hemositometre odası kullanarak canlı hücreleri ölçmek için,% 0.4 Tripan mavisi lekesi kullanın (bkz. Malzeme Tablosu).
    NOT: Ortalama olarak, tek bir fare 4-6 milyon hücre sağlar.
  2. Canlı hücreleri bir akış sitometresi aracılığıyla ölçmek için, ticari olarak temin edilebilen amin-reaktif floresan boya boyası kullanın (bkz.
    1. 1 milyon hücreyi 5 mL'lik polistiren yuvarlak tabanlı (FACS) bir tüpe aktarın. Floresan boyayı PBS ile 1:1000 oranında seyreltin (canlılık çalışma solüsyonunu oluşturur).
    2. Numuneleri canlılık çözeltisi ile karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin. Hücreleri buz gibi PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri 400 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin (adım 1.4).
    3. Hücreleri 2.4G2 anti-FcRIII/I ile bloke edin (Malzeme Tablosuna bakınız) buz gibi soğuk boyama tamponunda 4 ° C'de 15 dakika boyunca.
    4. Floresan etiketli monoklonal antikorlar CD45-PerCP ve CD11b-eFluor 450'yi boyama tamponuna (1:300 seyreltmede) ekleyerek antikor boyama kokteylini formüle edin (bkz.
      NOT: Her iki teknik de mevcut olsa da, sonraki protokole en uygun olanı seçin.
    5. Numuneleri antikor boyama kokteyli ile karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin. Hücreleri buz gibi soğuk boyama tamponu ile iki kez yıkayın. Hücreleri 400 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin.
    6. Adım 6'daki geçit stratejisinde belirtildiği gibi bir akış sitometresinde 250.000 olay elde edin (Şekil 4).

5. İmmünofloresan boyama

  1. Ön işlemden geçirilmiş bir lamel 6 oyuklu bir plakanın kuyusuna yerleştirin.
    NOT: Lamelleri tedavi etmek için, bunları 500 μL L-polilisin (0.01 mg/mL, Malzeme Tablosuna bakınız) çözeltisi içeren bir Petri kabına koyun ve 1 saat inkübe edin. Daha sonra üç kez damıtılmış suyla yıkayın ve kurumasını bekleyin.
  2. 500 μL DMEM-S çözeltisi kullanarak 200.000 hücreyi işlenmiş lamel üzerine tohumlayın. 24 saat inkübe edin.
  3. Lamelleri çıkarın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 3.7 paraformaldehit (PFA) kullanarak hücreleri sabitleyin. Lamelleri buz gibi PBS ile üç kez yıkayın.
  4. Hücreleri% 0.2 Triton X-100 ile PBS'de oda sıcaklığında 15 dakika geçirgenleştirin. Daha sonra, lamelleri soğuk PBS ile üç kez yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS'de% 0.2 BSA ile bloke edin.
  5. Floresan etiketli monoklonal antikorları (1:300 seyreltmede, Malzeme Tablosuna bakınız) bloke edici çözelti içinde seyreltin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Lamelleri buz gibi PBS ile üç kez yıkayın.
  6. Kızağa DAPI içeren montaj ortamı uygulayın ve ardından bir lamel ile kapatın.
    NOT: Slaytlar bir floresan veya konfokal mikroskop kullanılarak hemen analiz edilebilir veya -20°C'de 3 aya kadar saklanabilir.

6. Omurilik mikrogliası için geçit stratejisi

  1. Bir nokta grafiği oluşturun ve canlılık boyamaya ve boş bir floresan kanalına dayalı olarak canlı hücreleri izole etmek için bir kapı oluşturun16. Canlı olmayan hücreleri hariç tutun.
  2. Enkazı ortadan kaldırmak için ileri ve yan saçılma parametrelerini kullanarak başka bir çizim oluşturun16.
  3. Ek bir nokta grafiği geliştirin ve mikroglia'yı ayırt etmek için CD11b ve CD45'in ekspresyonunu analiz edin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

figure-results-1

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Beyin homeostazındaki önemi nedeniyle mikroglia çalışması için çok sayıda protokol geliştirilmiştir. Bu yöntemlerde, mikroglia tipik olarak embriyonik veya yenidoğan sıçanların ve farelerin serebral hemisferlerindenkaynaklanır 17. Sınırlı sayıda çalışma, yetişkin farelerin omuriliklerinden mikroglia'nın saflaştırılmasını ele almıştır13,14. Bu teknikler, genellikle Percoll veya OptiPrep kullanılarak gradyan ayırma ile birleştirilen DNAse il...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi (CONACYT) (702361) tarafından verilen bursla desteklenmiştir. Yazarlar Ph.D. Ulusal Politeknik Enstitüsü Ulusal Biyolojik Bilimler Okulu'nun Biyolojik Kimya Bilimleri programı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
15 mL toplama tüpleriCorning, ABD430790
2 mL mikrotüplerAxygen, ABDMCT-200-G
2.4G2 anti-FcRBioLegend, ABD101302
50 mL toplama tüpleriCorning, ABD430829
%70 etanol
Antibiyotik-Antimikotik (penisilin, streptomisin, amfoterisin b)Gibco, ABD15240062
Antikor CD11b eFluor 450 anti-fareeBioscience, ABD48-0112
Antikor CD45 PerCP anti-fare   BioLegend, ABD103130
Dengeli tuz çözeltisi (PBS) kalsiyum- magnezyum içermeyenCorning, ABD46-013-CM
Mavi Hücre Süzgeci 40 & mu; mCorning, ABD352340
Costar 6 kuyulu Şeffaf Tedavi Edilmedi Corning, ABDCLS3736
Lameller
Dijital Isıtma Sallama Kuru Banyosu Thermo Scientific Digital HS Drybath, ABD88870001
DUMONT
DNaseRoche, ABD4536282001
Dulbecco ve akut; s Modifiye Kartal ve akut; s Orta-yüksek glukoz (DMEM) Merck, ABDD6429
Elektrikli tıraş makinesi
FACS tüpThermo, ABD352058
Fetal sığır serumu (FBS)PAN Biotech, AlemaniaP30-3306
Akış sitometresi Cytoflex ve nbsp;Beckman Coulter
Hank' S Dengeli Tuz Çözeltisi Merck, ABDH2387
L-glutaminCorning, ABD 
Liberase TM Roche, ABD5401119001
Neubauer odası Sayım OdalarıÇin1103
Pentobarbital
Percoll Merck, ABD17089101yoğunluk gradyan santrifüjü 
Poli-L-lizin çözeltisi Merck, ABDP8920
Neşter No. 25 HERGOM, MeksikaH23
Snaplock Mikrosantrifüj Tüpleri 2 mLAxygen, ABD10011-680
Stereoskopik mikroskopVelab, MeksikaHG927831
Düz cerrahi makas (10 cm)HERGOM, Meksika
Düz Vannas makasıHERGOM, Meksika
Triton X100Merck, ABDX100
Tripan mavisi Leke% 0.4 & nbsp;Merck, ABD15250-061
Vorteks karıştırıcıDLAB, Çin8031102000
Zombie Aqua Tamir Edilebilir Canlılık KitiBioLegend, ABD423102amin-reaktif floresan boya boyama 
15393631

Kaynaklar

  1. Schröder,, Moser,, Huggenberger, Neuroanatomy of the Mouse. , Springer, Switzerland. 59-78 (2020).
  2. Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
  3. Bab, I., et al. Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, First ed, Springer. 205(2007).
  4. Nayak, D., et al. Microglia development and function. Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).
  5. Martinez, F. O., et al. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, 453-461 (2008).
  6. Masuda, T., et al. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).
  7. Prinz, M. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
  8. de Haas, A. H., et al. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
  9. Xuan, F. L., et al. Differences of microglia in the brain and the spinal cord. Front Cell Neurosci. 13, 504(2019).
  10. Paolicelli, R. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
  11. Li, Q., et al. Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway. Glia. 67 (3), 438-451 (2019).
  12. Prinz, M., et al. Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation. Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).
  13. Yip, P. K., et al. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).
  14. Akhmetzyanova, E. R., et al. Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury. Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).
  15. Mahadevan, V. Anatomy of the vertebral column. Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).
  16. Krukowski, K., et al. Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits. Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).
  17. Cardona, A., et al. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
  18. Schmidt, V. M., et al. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).
  19. Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk. Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Mikrogliya SaflaştırmaYoğunluk GradyanıKollagenaz SindirimiAkış SitometrisiCD11b BoyamaCD45 BoyamaMikrogliya HeterojenitesiDorsal Laminektomi
Fare omurilik mikrogliasının hızlı ve verimli bir şekilde zenginleştirilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.