Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Pseudomonas aeruginosa'dan Siderofor Üretiminin Kalitatif ve Kantitatif Analizi

7.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/65980

⸱

15 Mart 2024

 ,  , 
1Department of Microbiology and Biotechnology Centre, Faculty of Science, The Maharaja Sayajirao University of Baroda

Bu makalede

Özet

Bu protokol, Pseudomonas aeruginosa'dan toplam sideroforlar, pyoverdin ve pyochelin'in hem kalitatif hem de kantitatif analizlerini sağlar.

Özet

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), konakçıda enfeksiyon oluşturmak için çok çeşitli virülans faktörleri üretmesiyle bilinir. Böyle bir mekanizma, siderofor üretimi yoluyla demirin temizlenmesidir. P. aeruginosa iki farklı siderofor üretir: daha düşük demir şelatlama afinitesine sahip pyochelin ve daha yüksek demir şelatlama afinitesine sahip pyoverdine. Bu rapor, pyoverdin'in bakteriyel süpernatantlardan doğrudan ölçülebildiğini, piyochelin'in ise nicelemeden önce süpernatantlardan ekstrakte edilmesi gerektiğini göstermektedir.

Siderofor üretimini kalitatif olarak analiz etmek için birincil yöntem, Krom Azurol Sülfonat (CAS) agar plakası testidir. Bu tahlilde, Fe3+-Boya kompleksinden CAS boyasının salınması, maviden turuncuya bir renk değişimine yol açarak siderofor üretimini gösterir. Toplam sideroforların miktar tayini için, bakteriyel süpernatantlar bir mikrotitre plakasında CAS boyası ile eşit oranlarda karıştırıldı, ardından 630 nm'de spektrofotometrik analiz yapıldı. Pyoverdine, 50 mM Tris-HCl ile eşit oranlarda karıştırılarak bakteri süpernatantından doğrudan ölçüldü ve ardından spektrofotometrik analiz yapıldı. 380 nm'de bir zirve, pyoverdine'in varlığını doğruladı. Pyochelin'e gelince, bakteriyel süpernatanttan doğrudan miktar tayini mümkün değildi, bu yüzden önce ekstrakte edilmesi gerekiyordu. Daha sonraki spektrofotometrik analiz, 313 nm'de bir tepe noktası ile piyochelin varlığını ortaya çıkardı.

Giriş

Organizmalar, elektron taşınması ve DNA replikasyonu gibi çeşitli hayati işlevleri yerine getirmek için demire ihtiyaç duyar1. Gram-negatif fırsatçı bir patojen olan Pseudomonas aeruginosa'nın, konakçıda enfeksiyon oluşturmak için çeşitli virülans faktörlerine sahip olduğu bilinmektedir, bunlardan biri siderofor oluşumudur2. Demir tüketen koşullar sırasında, P. aeruginosa , çevredeki demiri söndüren siderofor adı verilen özel molekülleri serbest bırakır. Sideroforlar demiri hücre dışı olarak şelatlar ve ortaya çıkan ferrik-siderofor kompleksi aktif olarak hücre3'e geri taşınır.

P. aeruginosa'nın iki siderofor, pyoverdine ve pyochelin ürettiği bilinmektedir. Pyoverdinin daha yüksek bir demir şelatlama afinitesine (1:1) sahip olduğu bilinirken, pyochelin'in daha az demir şelatlama afinitesine (2:1) sahip olduğu bilinmektedir4. Pyochelin ayrıca ikincil bir siderofor olarak da adlandırılır çünkü daha düşük bir demir şelatlama afinitesinesahiptir 5. Sideroforların üretimi ve düzenlenmesi, P. aeruginosa6'daki Çekirdek Algılama (QS) sistemleri tarafından aktif olarak kontrol edilmektedir.

Demir söndürmenin yanı sıra, sideroforlar virülans faktörlerinin düzenlenmesinde de rol oynar ve biyofilm oluşumunda aktif rol oynar7. Sideroforlar, hücre sinyalizasyonuna katılım, oksidatif strese karşı savunma ve mikrobiyal topluluklar arasındaki etkileşimlerin kolaylaştırılması dahil olmak üzere ek önemli rollere hizmet eder8. Sideroforlar tipik olarak demiri şelatladıkları spesifik fonksiyonel gruplara göre kategorize edilir. Bu sınıflandırmadaki üç birincil iki dişli ligand, katekolat, hidroksiamat ve α-hidroksikarboksilat3'tür. Pioverdinler, P. aeruginosa ve P. fluorescens5 gibi floresan Pseudomonas türlerinin ayırt edici özellikleridir. 6-12 amino asit içeren bir oligopeptide bağlı karışık bir yeşil floresan kromofordan oluşurlar. Birkaç ribozomal olmayan peptit sentetaz (NRP) sentezlerinde yer alır9. Pioverdin üretimi ve regülasyonunda yer alan dört gen pvdL, pvdI, pvdJ ve pvdD'dir10. Pyoverdine ayrıca memelilerde enfeksiyon ve virülanstan sorumludur11. P. aeruginosa'nın orta derecede demir sınırlayıcı koşullarda pyochelin ürettiği, pyoverdin'in ise şiddetli demir sınırlayıcı ortamlarda üretildiğibelirtilmektedir 12. Pyochelin üretiminde yer alan iki operon pchDCBA ve pchEFGHI13'tür. Piyosiyanin varlığında, piyochelin'in (katekolat) oksidatif hasara ve iltihaplanmaya neden olduğu ve konakçı dokulara zararlı olan hidroksil radikalleri ürettiğibelirtilmektedir 11.

Krom Azurol Sülfonat (CAS) testi, hassas olmasına rağmen aşırı spesifik olabilen mikrobiyolojik tahlillere kıyasla kapsamlılığı, yüksek hassasiyeti ve daha fazla rahatlığı nedeniyle yaygın olarak benimsenmiştir14. CAS testi, agar yüzeylerinde veya bir çözelti içinde gerçekleştirilebilir. Ferrik iyon yoğun mavi kompleksinden turuncuya geçtiğinde meydana gelen renk değişimine dayanır. CAS kolorimetrik testi, bir Fe-CAS-yüzey aktif madde üçlü kompleksinden demirin tükenmesini ölçer. Metal, organik boya ve yüzey aktif maddeden oluşan bu özel kompleks, mavi bir renge sahiptir ve 630 nm'de bir absorpsiyon zirvesi sergiler.

Bu rapor, bir agar plakası üzerinde siderofor üretiminin tespit edilebildiği siderofor üretiminin kalitatif tespiti için bir yöntem sunmaktadır. Bir mikrotitre plakasında toplam siderofor üretiminin kantitatif tahmini ve P. aeruginosa'dan iki sideroforun, pyoverdine ve pyochelin'in tespiti ve kantitatif analizi için bir yöntem de sağlanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

P. aeruginosa'nın tüm bakteri izolatları, Hindistan'ın Vadodara ve Jaipur kentindeki tıbbi mikrobiyoloji laboratuvarlarından elde edilmiştir. Seçilen tüm klinik izolatlar Biyogüvenlik Kabini'nde (BSL2) ele alındı ve deneyler sırasında bakteri izolatları kullanılırken azami özen gösterildi. Tüm reaktiflerin/çözeltilerin ticari detayları Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. Krom Azurol Sülfonat (CAS) boya ve agar ortamının hazırlanması

  1. Aşağıdaki bileşimle CAS boyasını (100 mL) hazırlayın:
    1. 60 mg CAS'ı 50 mL damıtılmış suda çözün (Çözelti 1).
    2. 2.7 mg FeCl3·6H2O'yu 10mL 10 mM HCl (Çözelti 2) içinde çözün.
    3. 73 mg Setrimonyum bromür (HDTMA) 40 mL damıtılmış suda (Çözelti 3) çözülür.
    4. Çözüm 1, Çözüm 2 ve Çözüm 3'ü dikkatlice karıştırın. Cam bir şişede saklayın.
  2. Aşağıdaki adımları izleyerek CAS agarını hazırlayın:
    1. 750 mL damıtılmış suya 100 mL MM9 tuz çözeltisi ekleyin.
    2. 32.24 g piperazin-N,N'-bis (2-etansülfonik asit) (PIPES) serbest asidi çözün.
    3. 15 g Agar agar ekleyin. Otoklavlayın ve soğumaya bırakın.
    4. Karışıma 30 mL steril Casamino asit çözeltisi ve 10 mL steril% 20 glikoz çözeltisi ekleyin.
    5. 100 mL CAS boyası ekleyin, karıştırın ve aseptik koşullarda dökün.
      NOT: MM9 ortamının, Kasamino asit çözeltisinin ve 8-Hidroksikinolinin hazırlanması Ek Dosya 1'de verilmiştir. PIPES tamponu pH'a duyarlıdır. PH 5.6'ya ulaşılana kadar çözünmez. PH'ın sürekli izlendiğinden emin olun, çünkü BORULAR suda çözünmeye başladığında pH'ı daha da düşürecektir. Kloroformda çözünmüş aynı hacimde% 3 8-hidroksikinolin ile Casamino asidi ekstrakte edin. Karışmayan çözeltiyi yaklaşık 20 °C'de bırakın ve alt fazı bozmadan çözeltinin üst fazını dikkatlice toplayın.

2. Siderofor üretiminin kalitatif analizi

  1. 24 saat yetiştirilen P. aeruginosa kültürleri için OD600 nm'yi 0.2'ye ayarlayın.
  2. Steril bir tel halka kullanarak, bakteri kültürünü bir CAS agar plakası üzerinde çizin.
  3. 30 °C'de 24 saat inkübe edin.
    NOT: Bakteri kültürünü seyreltmek için pepton su ortamı veya% 0.8 normal salin kullanılabilir. 24 saatte bakteri üremesi gözlenmezse, CAS plakalarını 48 ila 72 saat inkübe edin.

3. Toplam sideroforların kantitatif tahmini

  1. OD600 nm'yi 0.25'e ayarladıktan sonra 24 saatte yetiştirilen P. aeruginosa kültürlerini Pepton su ortamında yeniden aşılayın ve 30 ° C'de 48 saat inkübe edin.
  2. 48 saat sonra, bakteri kültürünü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4650 x g'de santrifüjleyin.
  3. Santrifüjlemeden sonra, 96 oyuklu bir mikrotitre plakasına 100 μL hücresiz süpernatan ekleyin ve buna 100 μL CAS boyası ekleyin.
  4. Plakayı alüminyum folyo ile örtün ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
  5. İnkübasyondan sonra, 630 nm'de spektrofotometrik okumalar yapın.
  6. Toplam sideroforların nicelleştirilmesi için elde edilen sonuçları Yüzde Siderofor Birimi (PSU) olarak hesaplayın.
    NOT: PSU şu şekilde hesaplanabilir: [(Ar - As)/Ar] x 100
    burada, Ar = 630 nm'de referansın emilimi, As = numunenin hücresiz süpernatantının emilimi. Referans için, aşılanmamış pepton su ortamına CAS boyası eklenmelidir. Test tüpleri, mataralar vb. gibi tüm cam eşyaları 2 saat boyunca 6 M HCl ile doldurun ve üzerlerindeki demir kalıntılarını gidermek için damıtılmış suyla iki kez durulayın.

4. Pioverdinin kantitatif tahmini

  1. OD600 nm'yi 0.25'e ayarladıktan sonra 24 saatte yetiştirilen P. aeruginosa kültürlerini Pepton su ortamında yeniden aşılayın ve 30 ° C'de 48 saat inkübe edin.
  2. 48 saat sonra, devam etmeden önce bakteri üremesinin OD600 nm'sini ölçün.
  3. Bakteri kültürünü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4650 x g'da santrifüjleyin.
  4. Santrifüjlemeden sonra, 96 oyuklu bir mikrotitre plakasına 100 μL hücresiz süpernatan ekleyin ve buna 100 μL 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) ekleyin.
  5. OD405 nm'de spektrofotometrik okumalar yapın.

5. Piyochelin ekstraksiyonu ve spektrofotometri

  1. OD600 nm'yi 0.25'e ayarladıktan sonra 24 saatte yetiştirilen P. aeruginosa kültürlerini King's B ortamında (Ek Dosya 1) yeniden aşılayın ve 30 ° C'de 24 saat inkübe edin.
  2. 24 saat sonra, 100 mL kültür alın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 4650 x g'da santrifüjleyin.
  3. Santrifüjlemeden sonra, süpernatanıma 5 mL 1 M sitrik asit ekleyin. 50 mL Etil asetat ile iki kez ekstrakte edin.
  4. Organik fazı bir şırınga filtresinden magnezyum sülfat ile süzün. Filtrelenmiş organik fazı -20 °C'de saklayın.
  5. 320 nm'de spektrofotometrik okumalar yapın.
    NOT: Piyochelin, oda sıcaklığında oldukça kararsız bir bileşik olduğundan, ekstraksiyon işlemini buz üzerinde gerçekleştirin. Filtre ayırma için 50 mL steril şırınga kullanın. Şırınganın ucuna pamuk yerleştirin ve üzerine 1 gr magnezyum sülfat ekleyin. Şırınganın ucuna steril bir şırınga filtresi sabitleyin ve süzüntüyü steril bir tüpte toplayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Klinik izolatlardan sideroforların miktar tayini yapılmadan önce, siderofor üretimini sağlamak için siderofor üretimi için kalitatif bir tarama yapıldı. Klinik izolatlardan sideroforların kalitatif tespiti, CAS agar plakaları üzerinde çizgi oluşturan bakterilerle gözlenmiştir. Çalışma için MR1, TL7, J3 ve PAO1 (referans suş) olmak üzere üç klinik izolat seçildi. Her üç klinik izolat ve PAO1, mavi agar yüzeyindeki bakteri üremesinin etrafındaki berrak turuncu bir halenin pozitif siderofor ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu protokol, araştırmacıların toplam sideroforları ve P. aeruginosa'nın iki farklı sideroforunu, yani pyoverdine ve pyochelin'i, bakteriyel hücresiz süpernatanttan ölçmelerini sağlar. CAS agar plakaları tahlilinde, CAS boyası ve Fe3+ iyonları bir kompleks oluşturur. Bakteriler sideroforlar ürettiğinde, CAS-Fe3+ kompleksinden Fe3+ iyonlarını söndürürler ve bakteri büyümesi etrafında bir renk değişikliğine yol açarlar. Bu değişiklik, bakteri üremesi14,15

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Yazarlar, DBT - Biyoteknoloji Öğretim Programı, DBT - BUILDER Programı ve FIST'ten fon aldığını kabul eder. MR teşekkür bursu SHODH'dan alındı. HP, CSIR'den alınan burs sayesinde teşekkür etti.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Agar Agar, Tip IHIMEDIAGRM666
8-HidroksikinolinLoba Chemie4151
Kaamino AsitSRL Kimyasalları68806
Setiltrimetil Amonyum Bromür (CTAB)HIMEDIARM4867-100G
KloroformMerck1070242521
Krom azurol sülfonatHIMEDIARM336-10G
Sitrik asitMerck100241
Dekstroz monohidratMerck108342
DiklorometanMerck107020
Ferrik klorür hekzahidratHIMEDIAGRM6353
Cam ŞişelerBorosil5100021
Cam Test tüpleriBorosil9820U05
Hidroklorik asitSDFCL20125
King'in orta B tabanıHIMEDIAM1544-500G
M9 Minimal Orta TuzlarHIMEDIAG013-500G
Magnezyum Sülfat Qualigens10034
MultiskanGO UV SpektrofotometreThermo Scientific51119200
Pepton Tip I, BakteriyolojikHIMEDIARM667-500G
BORULAR serbest asitMP Biyomedikal190257
Potasyum dihidrojen fosfatMerck1048731000
Proteoz peptonHIMEDIARM005-500G
Shimadzu UV-Vis SpektrofotometreShimadzu2072310058
Sigma LaborzentrifugeSigma-Aldrich3-18K
Sodyum klorürQualigens15915

Kaynaklar

  1. Wang, J., Pontopolous, K. Regulation of iron cellulatar metabolism. Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).
  2. Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
  3. Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. Biology. 11 (12), 1711(2022).
  4. Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
  5. Dingemans, P., Cornelis, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
  6. Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
  7. Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
  8. Dao, K. -H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
  9. Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
  10. Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
  11. Geum-Jae-Jeong,, et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
  12. Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055(2013).
  13. Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
  14. Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
  15. Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
  16. Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
  17. Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
  18. Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
  19. Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
  20. Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
  21. Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. Pseudomonas methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).
  22. Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
  23. Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135(2019).
  24. Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
  25. Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
  26. Il, J. M. R., Lin, Y. -M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Pyoverdin KantifikasyonuPyochelin EkstraksiyonuCAS Agar DeneyiSpektrofotometrik AnalizHücreden Arındırılmış SüpernatanVirülans FaktörleriDemir SüpürmeMikrotitre Plakası
Pseudomonas aeruginosa'dan Siderofor Üretiminin Kalitatif ve Kantitatif Analizi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.