Method Article

Etiollenmiş Mısır Yaprağı Protoplastları için Otomatik Sıvı İşleme Kullanarak Yüksek Verimli Transgen Ekspresyon Çalışmalarının Etkinleştirilmesi

DOI:

10.3791/65989

⸱

February 16th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Syngenta Crop Protection, LLC

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, otomatik bir sıvı işleyici, etiollenmiş mısır yaprağı için bir protoplast izolasyon protokolü ve bir sıvı işleyici kullanılarak 96 oyuklu bir transfeksiyon prosedürü kullanılarak randomize bir transfeksiyon düzeninin oluşturulmasını açıklar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitki biyoteknolojisi alanı, son yıllarda bitkileri çeşitli amaçlar için manipüle etme ve mühendislik yapma yeteneğinde devrim yaratan kayda değer gelişmelere tanık olmuştur. Bununla birlikte, bu alandaki araştırmaların çeşitliliği arttıkça ve giderek daha karmaşık hale geldikçe, istikrarlı dönüşüme ilerleyen stratejileri daraltmak için erken, verimli, güvenilir ve yüksek verimli geçici tarama çözümlerine olan ihtiyaç daha belirgindir. Son yıllarda yeniden ortaya çıkan bir yöntem, çok sayıda tür, doku ve gelişim aşamasında izolasyon ve transfeksiyon yöntemlerinin mevcut olduğu bitki protoplastının kullanılmasıdır. Bu çalışma, 96 oyuklu bir plaka içinde plazmitin randomize olarak hazırlanması için basit bir otomatik protokolü, etiollenmiş mısır yaprağı protoplastının izolasyonu için bir yöntemi ve otomatik bir transfeksiyon prosedürünü açıklamaktadır. Bitki biyoteknolojisinde, bitki protoplast transfeksiyonu için bu yeni sıvı işleme protokolleri ile örneklenen otomatik çözümlerin benimsenmesi, manuel yöntemlere göre önemli bir ilerlemeyi temsil etmektedir. Araştırmacılar, otomasyondan yararlanarak geleneksel yöntemlerin sınırlamalarının üstesinden kolayca gelebilir, verimliliği artırabilir ve bilimsel ilerlemeyi hızlandırabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bitki protoplast transfeksiyonu, yani hücre duvarlarından yoksun bitki hücrelerine yabancı genetik materyalin sokulması, çok önemli bir tekniktir ve son yarım yüzyılda, bitki biyoteknolojisi araştırmalarını desteklemek için çok sayıda türü kapsar. Bununla birlikte, bu yöntemlerin kullanımı, izolasyon başına üretilen milyonlarca protoplast ile bile ağrılı ve kapsamı sınırlı olabilir. Geleneksel bitki protoplast transfeksiyon yöntemleri genellikle zahmetli, zaman alıcı, değişkenliğe eğilimli ve teknik olarak talepkardır, bu da düşük tekrarlanabilirliğe sahip niş sistemlere yol açar1. Bununla birlikte, son yıllarda otomatik çözümlerin ortaya çıkardığı potansiyel, bu 60 yıllık genç tekniğeyeni bir soluk getirme olasılığını aydınlatıyor 2,3. Araştırmacılar, malzeme hazırlama, poli-etilen glikol (PEG) inkübasyonu ve müteakip transfeksiyon reaktif dağıtımı gibi önemli ancak tekrarlayan adımları otomatikleştirme potansiyeli ile fiziksel taşıma gereksinimlerini ve diğer potansiyel insan hatası kaynaklarını önemli ölçüde azaltabilir4. Ayrıca, otomatik sıvı işleme sistemleri tarafından sunulan hassas kontrol ve homojenlik, tutarlı ve tekrarlanabilir transfeksiyon sonuçları sağlar.

Protoplast izolasyonu, doğrama, sindirim, inkübasyon, filtrasyon ve santrifüjlemeyi içeren titiz bir süreç olsa da, bu protokollerin transfeksiyon kısmı otomatik sıvı işleyicileri için özel olarak üretilmiştir. Çoğu protoplast transfeksiyon protokolü için prosedür PEG aracılıdır ve izole edilmiş protoplastın PEG ve saflaştırılmış plazmit DNA varlığında belirli bir süre boyunca kesin bir konsantrasyonda (türe ve dokuya bağlı olarak) karıştırılması, bu hücrelerin plazmit DNA'sını almasına izin verir5. Bu transfeksiyonu, bir gece boyunca inkübasyon6 ile sonuçlanan bir dizi yıkama aşaması takip eder. Kuluçka döneminden sonra, her şey uygun şekilde tasarlanmış ve sunulmuşsa, deney, ilgilenilen bileşenin ve/veya farklı düzenleyici bileşenlerin değerlendirilme potansiyelinin ifadesi ile sonuçlanır7. Bu prosedürle ilişkili tüm aspirasyon, dağıtma ve çalkalama/karıştırma adımları normalde manuel bir pipet ile ele alınacaktır. Böyle bir protokolü, her seferinde bir bireysel reaksiyon olmak üzere elle yürütmek zahmetlidir ve numuneler arasında gereksiz varyasyonlara neden olurken, aynı zamanda herhangi bir zamanda değerlendirilebilecek kapasiteyi de sınırlar. İlaç endüstrisinde memeli veya böcek hücrelerinin manipülasyonu ve kimyasal sentez için otomatik protokoller birkaç yıldır uygulanmaktadır 4,8,9. Protoplast kullanımı ve bitki materyallerinin otomatik sıvı işlemesini içeren protokoller artıyor 10,11,12,13.

Bitki protoplast transfeksiyonu için otomatik sıvı işleme protokollerinin benimsenmesi, araştırma uygulamaları için büyük umut vaat etmektedir. Araştırmacılar daha büyük genetik kütüphaneleri keşfedebilir, belirli gen fonksiyonlarını daha hızlı bir şekilde tarayabilir ve bitki stresi ile ilgili karmaşık genetik etkileşimleri daha kapsamlı bir şekilde araştırabilir14. Floresan tarama ile birlikte 96 kuyulu kapsülleri kullanan otomatik yaklaşımların ölçeklenebilirliği, yüksek verimli deneylere olanak tanır ve bilim adamlarının bitki biyoteknolojisindeki ilerlemeleri hızlandırabilecek veri ve içgörüleri hızla üretmesine olanak tanır11. Bununla birlikte, binlerce olmasa da yüzlerce veri noktasının oluşturulmasına yol açan verimdeki bu artışla birlikte, sonuçları karıştırabilecek herhangi bir hata kaynağını hesaba katan ek kalite kontrolü olmalıdır15. Çok sayıda bilimsel disiplinde katkıda bulunan bir faktör olarak tanımlanan bir unsur, kenar etkisidir. Bazı hafifletici stratejiler, bu fenomenle mücadele etmek için kuyular arası boşluğu veya en dıştaki kuyuları kullanmak veya doldurmak için en iyi plakayı önerecektir16,17. Bununla birlikte, bu stratejiler zaman ekler ve belirli bir tek kullanımlık mevcut değilse, tek seçenek daha azına razı olmak veya ertelemektir. Alternatif olarak, bir engelleme şeması aracılığıyla bu etkiyi açıklayan stratejilere bakmak, verimden ödün vermez veya yürütmeyi geciktirmez.

Bu etiollenmiş mısır yaprağı protoplast protokolü ve Şekil 1'de gösterilen iki otomatik yöntemi, kanonik protoplast yönteminin birden fazla bölümünü, plazmit materyalinin transfeksiyon için kullanılan kaba tahsisini ve transfeksiyonun kendisini otomatikleştirerek protoplast deneylerinin doğasında bulunan değişkenliği ele almayı amaçlamaktadır. Bu yöntemler, iyi karakterize edilmiş, basit ve verimli bir protoplast platformu olduğu için etiollenmiş mısır yaprağı protoplast platformu için gösterilmiştir. İçinde ayrıntılı olarak açıklanan tüm adımlara, benzer veya aynı tampon çözeltilerini kullanan protoplast transfeksiyon protokolleri için hemen erişilebilir. Bununla birlikte, bu tekniklerin benimsenmesinden önce protoplast kaynak dokusunun ve türlerinin benzersiz özelliklerine özel dikkat gösterilmelidir. Otomasyon yoluyla yapılan bu iyileştirmeler, bireysel deneyler için materyal hazırlanmasını basitleştirir ve tek tek sıralı transfeksiyondan aynı anda işlenen 96 transfeksiyona kadar verimi önemli ölçüde artırır. Bu çalışma aynı zamanda plaka konumsal yanlılığını hesaba katmak için randomize tamamlanmamış blokların kullanılması için gerekçe gösterecektir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Transfeksiyon plakası oluşturma

  1. Güverte düzeni oluşturma: Bir DNA plakası randomizasyon yöntemi oluşturmak için sıvı işleyici yazılımını açın. Yeni bir yöntem oluşturmak için menü çubuğundan Yeni Yöntem düğmesine tıklayın. Sol paneldeki Instrument Setup (Enstrüman Kurulumu ) düğmesine basarak Start (Başlangıç) ve Finish (Bitiş çizgileri) arasına Instrument Setup (Enstrüman Kurulumu ) satırını ekleyin.
    NOT: Bu otomatik protokolle birlikte gelen ilgili ekran görüntüleri Ek Şekil 1, Ek Şekil 2 ve Ek Şekil 3'te bulunabilir.
  2. Enstrüman Kurulum satırına tıklayın, Labware kategori menüsünden doğru laboratuvar yazılımını bulun ve bunları Ek Şekil 1'de gösterildiği gibi güverte düzenine sürükleyin.
    NOT: Laboratuvar yazılımı daha önce tanımlanmamışsa, üreticinin spesifikasyonuna göre sıvı işleyiciye programlanması gerekecektir, ancak bu tür talimatlar bu protokolün kapsamı dışındadır.
  3. Dosyadan aktarım kurulumu: Adım paletlerindeki Dosyadan Aktar düğmesine basın ve Dosyadan Aktar satırını Enstrüman kurulum satırının altına yerleştirin. Uç seçiminin ve değiştirilmesinin Ek Şekil 3'te gösterildiği gibi olduğundan emin olun.
  4. Dosyanın bir başlık satırı var seçeneğini işaretleyin ve sütun bilgilerinin doğru olduğundan emin olun.
  5. Etkinleştirmek için Kaynak alanına basın ve güverte düzeninden Kaynak Plakasına tıklayın, hedef plakayı tanımlayın ve pipetlenecek DNA miktarını girin.
  6. Pipetleme tekniğini, duvara parmak ucu dokunuşları gibi ayrıntılı olarak tanımlamak için Özelleştir düğmesine basın.
  7. Aktarılacak plazmit DNA miktarını belirtin. Bu protokol, transfeksiyon (kuyucuk) başına 20 μL 1 μg/μL plazmit DNA kullanır.
    NOT: Protoplast transfeksiyonundan önce transfeksiyon plakasına aktarılan plazmit DNA miktarı, kullanılan protoplast platformuna bağlı olacaktır.
  8. Dosyadan Aktarım .csv belge oluşturun.
    1. Bu belge iki sütundan oluşmaktadır. İlk sütunu, yani stok plazmid DNA'sının tüp rafı içindeki konumunu gösteren From sütununu, yani numune 1 için hazırlayın; bu iyi A01 olurdu. Bu aktarım üç kez (üç tekrar) gerçekleştiğinden, üç satır Kimden sütununda A01'i göstermelidir.
    2. İkinci sütunu, yani 96 oyuklu plakanın plazmit yapı hedef kuyusunu belirtmek için kullanılan sütuna hazırlayın. Örneğin, numune 1 (A01) B02, D04 ve H07 olabilir. Bunu bir .csv dosyası olarak kaydedin sıvı işleyici yazılımıyla uyumlu olması için.
  9. Protokolü çalıştırmadan önce, güverte konumlarının yüklendiğini, laboratuvar gereçlerinin doğru tanımlandığını, randomizasyon belgesinin tüp rafındaki tüm numune DNA'sı için kuyu konumlarını içerdiğini ve tüplerde protokolü yürütmek için yeterli plazmit numunesi olduğunu kontrol edin.
  10. Dosyadan Aktar adımının Dosya Özellikleri menüsünü genişletin, oluşturulan .csv dosyasını seçin ve protokolü çalıştırın.
  11. Protokol başarıyla tamamlandığında transfeksiyon plakalarını bir alüminyum folyo conta ile örtün. Transfeksiyon plakalarını kullanıma hazır olana kadar -20 °C'de saklayın. İzole edilmiş etiollenmiş mısır yaprağı protoplastı, adım 3.3'te bu transfeksiyon plakasına eklenecektir.

2. Etiollenmiş mısır yaprağı protoplast izolasyonu

  1. Etiollenmiş mısır yaprağı protoplastının izolasyonuna başlamak için, burada kullanılan NP222 gibi protoplast uyumlu bir genetik arka plan elde edin18. Deney başlamadan önce Tablo 1'de listelenen MMg, W5 ve WI tamponları olmak üzere yalnızca 3 tampon hazırlayın ve 4 °C'de tutun. En iyi sonucu elde etmek için deney gününde sindirim solüsyonu ve PEG hazırlayın.
  2. 25 tohumu önce %25'lik bir ticari ağartma solüsyonuna batırarak ve oda sıcaklığında yaklaşık 15 ila 20 dakika boyunca döner platformlu bir çalkalayıcı üzerinde çalkalayarak yüzey sterilize edin.
  3. Çalkalamadan sonra, tohumları steril su (DI) kullanarak iyice durulayın. Durulama adımını 5x tekrarlayın. Tohumları gece boyunca oda sıcaklığında steril suda emdirin.
  4. Ertesi gün tohumu nemli, otoklavlanmış toprağa ekin. Mantar kontaminasyonunu önlemek için topraktaki fazla nemi emmek için kuru kil peletleri ekleyin.
  5. Mısır fidelerini 28 °C'de (Bağıl Nem (RH)%) 16 saatlik hafif bir büyüme odasında, koleoptil toprağın 1-2 cm üzerine çıkana kadar yaklaşık 3 gün büyütün ve ardından 5-7 gün daha aynı sıcaklık ve bağıl nem ile karanlık bir odaya aktarın.
  6. İlk gerçek yaprak dokusunu ilk bileziğin hemen üzerinden keserek hasat edin.
  7. Yaprak dokusunu %25 ticari ağartıcı ve 250 μL %20 Tween 20 solüsyonunda 1 dakika boyunca kısa bir süre sterilize edin. Yaprak malzemesini DI su ile 5 kez iyice durulayın.
  8. Mısır yaprağı dokusunu tüy bırakmayan dokularla kurulayın (nazikçe) ve keskin bir bıçak kullanarak her bir yaprak bıçağın hem ucundan hem de tabanından ~1.5 cm çıkarın.
  9. Kalan yaprak dokusunu dar (0,5 mm - 1 mm) enine şeritler halinde kesin ve 100 x 25 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin.
  10. 25 mL sindirim solüsyonunu 0.22 μm'lik bir şırınga filtresinden doğrudan dilimlenmiş dokuyu içeren Petri kabına filtreyle sterilize edin.
  11. Yaklaşık -75 mbar basınçta bir vakumlu desikatörde oda sıcaklığında 30 dakika vakum uygulayarak yaprak dokusuna sindirim solüsyonu ile vakumla sızın.
    NOT: Çok sayıda akademik ve özel laboratuvar için ev vakum basıncı bu adım için yeterli olmalıdır.
  12. Döner platformlu bir çalkalayıcıya yerleştirin ve karanlıkta 25 °C'de, 60 RPM'de 2,5 ila 3 saat sallayın. Sindirim süresinin bitimine 10 dakika kaldığında hızı 90 RPM'ye yükseltin.
  13. Sindirim solüsyonunu ve sindirilmemiş bitki materyalini 40 μm'lik bir elek filtresinin üstündeki bir huniden 50 mL'lik bir tüpe dökün.
  14. Protoplastı peletlemek için 50 mL'lik tüpün içindeki çözeltiyi 150 x g'da 4 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve peleti 10 - 15 mL MMg Tampon çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.
  15. Santrifüjlemeyi tekrarlayın ve süpernatanı çıkarın. 5 - 10 mL taze MMg tamponunda tekrar süspansiyon haline getirin.
  16. Bir hemositometre kullanarak, izole edilmiş protoplastın yoğunluğunu dikkatlice ölçün. mL başına yaklaşık 5 x 105 protoplastlık bir yoğunluğa yeniden süspanse edin.
  17. Transfeksiyondan önce izolatın ~ 30 dakika buz üzerinde dinlenmesine izin verin. Bu süre zarfında PEG çözeltisini hazırlayın. PEG'yi 37 ° C'lik bir su banyosu kullanarak bir çözelti içinde tamamen çözün ve transfeksiyona kadar orada bırakın.

3. Otomatik protoplast transfeksiyonu

NOT: 3.6'dan 3.15'e kadar olan adımlar, manuel santrifüjleme gerektiren adım 3.10 ve 3.13'teki iki kullanıcı duraklaması dışında, tamamen otomatik sıvı işleyici tarafından yönetilir. Bu otomatik protokolle birlikte gelen ilgili ekran görüntüleri ek, Ek Şekil 1, Ek Şekil 3, Ek Şekil 4 ve Ek Şekil 5'te bulunabilir.

  1. Sıvı işleyicinin güverte düzenini, aşağıdaki adımlarda açıklanan protoplast transfeksiyon yöntemine göre transfeksiyon için hazırlayın. Aşağıdaki malzemeleri bir araya getirin: Hedef plaka (bu durumda, floresan ölçümü için şeffaf bir alt mikro plakaya sahip 96 oyuklu bir siyah olacaktır), PEG aspirasyon adımı için bir kutu 25 - 250 μL geniş delikli otomasyon ucu, kalan sıvı işleme adımları için beş kutu 25 - 250 μL pipet otomasyon ucu, reaktif rezervuarı olarak üç plastik oluk, atık toplama için bir adet boş 96 oyuklu plaka, kalan transfeksiyon tamponu yıkama solüsyonları, W5 ve WI.
  2. Transfeksiyon prosedürü başlamadan hemen önce, PEG solüsyonunu 0,22 μm steril tek kullanımlık vakum filtre ünitesinden 50 mL'lik yeni bir tüpe filtreyle sterilize edin.
  3. MMg tamponunda yeniden süspanse edilen protoplasttan, önceden hazırlanmış, buzu çözülmüş transfeksiyon plakasının her bir oyuğuna 100 μL (yaklaşık 50.000 protoplast) ekleyin. Bunu yapmak için, protoplast içeren tampon çözeltisini 10 mL'lik steril bir oluğa dökün ve çok kanallı bir pipet kullanın. Bu manuel transfer adımı sırasında protoplastın çözeltiden dışarı çıkmasını önlemek için oluğun nazikçe çalkalanmasına devam edin.
  4. PEG çözeltisini uygun oluğa dökün ve şimdi protoplast ve plazmit DNA içeren transfeksiyon plakasını içeren, adım 1 kullanılarak hazırlanan, güverte düzenine göre belirtilen yere yerleştirin.
  5. Bir protoplast transfeksiyon yöntemi oluşturmak için, sıvı işleyici yazılımını açın ve aşağıda açıklanan adımları gerçekleştirin.
    1. Laboratuvar malzemelerini güverteler arasında taşıma: Uç yükleme güvertesindeki boş uç kutusunu, Laboratuvar Yazılımını Taşı komutunu kullanarak yenisiyle değiştirin. Configuration (Yapılandırma) görünümünden From (Kimden) ve To (Bitiş desteleri) öğesini seçin.
    2. 200 μL'den büyük hacimler için: Transferler arasında uçları değiştirmeyin. İlk transfer adımı için uçları yükleyin ve son transfer adımından sonra boşaltın, bu da Ek Şekil 3'teki gibi her transfer adımı için Yükleme/Boşaltma seçeneklerinin doğru şekilde belirtilmesini gerektirir.
  6. Güverte düzeni oluşturma: Transfeksiyon plakası oluşturma yöntemi gibi, bir DNA otomatik transfeksiyon yöntemi oluşturmak için sıvı işleyici yazılımını açın. Yeni bir yöntem oluşturmak için menü çubuğundan Yeni Yöntem düğmesine tıklayın. Sol paneldeki Instrument Setup (Enstrüman Kurulumu ) düğmesine basarak Start (Bitiş çizgileri) arasına Instrument Setup (Enstrüman Kurulumu ) satırı ekleyin. Ek Şekil 1'de gösterilen güverte düzenine göre bir güverte düzeni oluşturun.
  7. Hücre/DNA karıştırma: PEG eklemeden önce Cihaz Eylem düğmesini kullanarak ve cihazı ayarlayarak (otomatik laboratuvar yazılımı konumlandırıcıyı veya ALP'yi sallayarak), sallama hızını (1500 rpm) ve sallama süresini (10 sn) kullanarak protoplast ve DNA'yı karıştırmak için bir adım ekleyin.
  8. PEG ilavesi ve karıştırma: Transfeksiyonu başlatmak için, 96 bölmeli bir pipet kullanarak PEG rezervuarından 110 μL PEG eklemek için bir Transfer adımı ekleyin. Doğru kaynak ve hedef konumların belirtilen güverte düzenine göre programlandığından emin olun. Transfer adımını, rezervuarın tabanından 1 mm PEG aspire edecek şekilde programlayın ve PEG'yi protoplast / DNA karışımını içeren 96 oyuklu plakanın tabanından 3 mm biriktirin. Önceden programlanmış adımları kopyalayıp yapıştırarak PEG eklemesinden sonra başka bir sallama adımı ekleyin.
  9. PEG inkübasyonu: Duraklat düğmesini seçerek bir duraklatma adımı ekleyin, çalkalayıcıyı seçin ve PEG ilavesinden başlayan önceden belirlenmiş inkübasyon süresini girin.
    NOT: Duraklatma zamanlayıcısı, bir hata mesajıyla sonuçlanacak herhangi bir ışık perdesi kesintisi veya kesintisi olmadıkça devam edecektir. Destenin manipüle edilmesi gerekiyorsa, uzaklaşmadan önce bu mesajların temizlendiğinden emin olun.
  10. W5 tampon ekleme/karıştırma: PEG inkübasyon reaksiyonunu söndürmek için toplam 600 μL W5 tamponunu transfeksiyon plakasına aktarmak için 200 μL'lik üç hat Transfer ekleyin. Transfeksiyon plakasının santrifüjlenmesine izin vermek için sallayarak ve bir kullanıcı duraklaması ile W5 tampon ilavesini takip edin.
  11. Kullanıcı duraklaması 1: Protoplast transfeksiyon plakasını 100 x g'da 4 dakika santrifüjleyin. Şimdi peletlenmiş protoplast ile transfeksiyon plakasını uygun güverte konumuna geri getirin. Duraklat düğmesine tıklayarak kullanıcı duraklatması ekleyin, ancak şimdi Tüm sistemi duraklat ve mesajı görüntüle seçeneği seçili.
    NOT: Liquid işleyici protokolün geri kalanıyla devam etmeden önce duraklatma mesajı açılır penceresinin temizlenmesi gerekir.
  12. Süpernatantın çıkarılması: 400 μL süpernatanı çıkarmak için iki satır Transfer ekleyin ve atık plakaya aktarın. Süpernatantın çıkarılması sırasında hücre aspirasyonunu önlemek için, alttan olan mesafeyi 6 mm olarak ayarlayın.
  13. WI ekleme/karıştırma: 580 μL WI tamponunu transfeksiyon plakasına aktarmak için 3 satır Transfer ekleyin. Önceden programlanmış adımları kopyalayıp yapıştırarak WI eklemesinden sonra başka bir sallama adımı ekleyin. Bir sonraki kullanıcı duraklatmasına geçin.
  14. Kullanıcı duraklaması 2: Protoplast transfeksiyon plakasını 100 x g'de 4 dakika santrifüjleyin. Şimdi peletlenmiş protoplast ile transfeksiyon plakasını uygun güverte konumuna geri getirin.
  15. Süpernatantın çıkarılması: 680 μL süpernatanı çıkarmak için dört satır Transfer ekleyin ve atık plakaya aktarın. Süpernatantın çıkarılması sırasında hücre aspirasyonunu önlemek için, alttan olan mesafeyi 6 mm olarak ayarlayın.
  16. Protoplastların mikroplakaya aktarılması: Bu protokolün son transferi, iki adet 150 μL transfer adımından oluşur. Her bir adımdan önce, transfeksiyon plakasının altından 2 mm'de 50 μL/s'de protoplastları tekrar tekrar aspire edin ve 3 mm'de dağıtın. Ardından, aynı pipet uçlarını kullanarak hedef mikroplakaya aktarın.
    NOT: Mikroplakaya aktarmadan önce peletin üzerindeki tampon hacminin aspire edilmesi ve dağıtılması, numune kaybı olmamasını sağlamak için transfeksiyon plakasının altında kalan protoplastları bozacaktır. Transfeksiyon plakası oluşturma sırasında randomizasyon yapıldığından, bu otomatik protokolü sonlandırır.
  17. İlk floresan ölçümünden önce mikroplakayı oda sıcaklığında karanlıkta 24 ila 48 saat inkübe edin.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kenar etkilerinin yanıt ölçümlerini etkileyebileceğini destekleyen gözlemsel veriler elde etmek için; Bu şüpheleri doğrulamak için bir pilot çalışma yapıldı. Bu çalışma için, yukarıdaki yöntemler sadece tek bir tedavi seviyesi ile üç tekrar 96 oyuklu plakaya uygulandı; tüm protoplastlar, ZsGreen'i yapısal olarak eksprese eden bir plazmit olan pSYN1125019 kullanılarak, plakanın kenarındaki birimler için ikinci sıraya ve plakanın merkezi bölgelerine kıyasla yanıt seviyesinde sistematik farklılıklar olduğunu göstermek amacıyla transfekte edildi. Plakanın dış kenarındaki 36 kuyu blok 1, kenardan ikinci sıradaki 28 kuyu blok 2 ve merkezi 32 kuyu blok 3 olarak tanımlanır - bkz. Şekil 2A sağ alt panel. Bu düzenleme, randomize tam blok tasarımı (RCBD) olarak 28 tedavi seviyesini veya randomize inkomplet blok tasarımı (RIBD) olarak 32 tedavi seviyesini barındırabilir. Şekil 2A'da, her bir çoğaltma (tekrar) için, her bir kuyucuk için ham veri noktaları, ilgili plakadan gelen ortalama ile normalleştirildi. Deneyin her üç tekrarında da, plakanın kenarındaki tepkiler, ortalama olarak, minimumdan 1-1.5 kat daha büyüktür. Şekil 2B , her bir kopya için toplam plaka ortalamasının yüzdesi olarak blok ortalamalarını göstermektedir. Tablo 2 , sabit bir efekt olarak blokla doğrusal bir modelin uydurulmasından kaynaklanan tek yönlü ANOVA tablolarını göstermektedir. Blok tasarımlarında yer alan kısıtlı randomizasyonla ilgili nedenlerden dolayı, blokaj faktörü için hipotez testine dayalı çıkarım, en iyi ihtimalle yaklaşık ve en kötü ihtimalle geçersiz olarak kabul edilir. Bununla birlikte, sabit bir engelleme faktörüne sahip bir modelin takılması, bir engelleme şemasının faydalı olup olmadığını değerlendirmek için yararlıdır. Mn_Sq (blok), blok ortalamalarının genel ortalama ile ilgili ortalama kare sapmasını temsil eder. Mn_Sq (Hata), ilgili grup ortalamaları hakkındaki bireysel gözlemlerin ortalama kare sapmasını, bu durumda, modelde herhangi bir tedavi faktörü olmadığı için genel ortalamayı temsil eder. Mn Sq (blok), Mn Sq'den (Hata) daha büyük olduğunda, yani F-oranı birden büyük olduğunda, ortalama kare hatasının boyutu, tamamen randomize bir tasarıma (CRD) göre etkili bir şekilde azaltılmıştır, böylece ilgilenilen tedavileri karşılaştırmak için istatistiksel gücü arttırır ve tedavi kontrastlarını tahmin eden güven aralıklarının genişliğini azaltır. Şekil 2B

figure-results-1

figure-results-2

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu el yazması, transfeksiyon plakası oluşturmayı ve otomatik bir transfeksiyon ile etiollenmiş mısır yaprağı protoplast izolasyonunu otomatikleştirmek için bir protokolü açıklamaktadır. Protokolün transfeksiyon plakası oluşturma bölümünün başarılı bir şekilde tamamlanması için, 8 kanallı bir kapsül ile donatılmış otomatik bir sıvı işleme robotu gerektirir. Transfeksiyon protokolü için, tam ve düzgün 96 oyuklu plaka transfeksiyonu için 96 oyuklu bir kapsül önerilir. Transfeksiyon yöntemi, 8 kanallı bir kapsül kullanılarak tamamlanabilir, ancak aspirasyon ve dağıtma adımlarının aldığı sürenin yanı sıra sütunlar arasındaki uçların değiştirilmesine atfedilebilecek süreye özel dikkat gösterilmelidir. PEG inkübasyon süresindeki farklılıkların, transfeksiyon verimliliği ve ekspresyonu üzerinde önemli bir etkiye sahip olduğu iyi belgelenmiştir ve bu nedenle, numune işlemedeki eşitsizliği önlemek için bu katkıda bulunan faktörlere özel dikkat gösterilmelidir13. Liquid handler protokolüne başlamadan önce, protokolün adımlarını ve belirli faaliyetlerin aynı anda tamamlanıp tamamlanamayacağını göz önünde bulundurmak önemlidir. Bu protokol, güvertedeki 96 konumdan 1 kuyulu kapsüle uçlar yükleyen bir cihaz kullanır. Bu protokol için sıvı işleyici, robotun kuluçka dönemleri sırasında veya protokole ek süre eklemekten kaçınmak için kullanıcı duraklama adımları sırasında uç kutularını değiştirdiği bir işlev içerir. Bir sıvı işleyici satın almaya karar verirken, işlevselliği ve zaman kazandıran potansiyel kolaylıkları göz önünde bulundurun.

Bu protokol Beckman Coulter NXp ve Biomek FX cihazlarını kullanmak için geliştirilmiş olsa da, bu protokol karşılaştırılabilir herhangi bir sıvı işleme cihazına uyarlanabilir. Tüm sıvı işleyicileri, hacimlerin bir konumdan diğerine nasıl ve ne kadar aktarılacağını belirtmek için bazı araçlara sahiptir. Bu protokol için, bu cihazlar bir Dosya satırından Aktar komutu kullandı. Laboratuvar yazılımı doğru bir şekilde tanımlanmışsa, bir kullanıcı herhangi bir gemiden veya herhangi bir gemiye transfer yapabilir. Tüp raflarının veya adaptörlerin ticari olarak temin edilememesi gibi istisnai durumlarda, bu tür konektörlerin 3D yazdırılması kullanılabilir. Tipik protoplast transfeksiyon protokolleri için, 1 μg/μL transfeksiyon konsantrasyonunda 20 μg DNA, çok sayıda protoplast platformu için standart bir malzeme hacmidir13. Transfeksiyon plakası oluşturma sırasında, ek bir önlem olarak, transfer sırasında aerosol haline getirilmiş plazmid nedeniyle herhangi bir kontaminasyon riskini en aza indirmek için 0,2 - 20 μL filtre uçları kullanın. Hazırlığın insan bileşeninin kaldırılması, zaman içindeki varyasyonu azaltır ve bu yüksek verimli deneylerin tekrarlanabilirliğini artırır. Ayrıca, plakalar vaktinden çok önceden hazırlanabilir. Bu hazırlık, transfeksiyon bilim adamının deney günündeki stresini hafifletecektir. Bununla birlikte, numuneler buharlaşabileceğinden, bu plazmit DNA plakalarını uzun süre 4 °C'de saklamaktan kaçınmak önemlidir. Numuneler -20 °C'lik bir dondurucuda saklanmalı ve daha sonra transfeksiyondan önce 4 °C'lik buzdolabında çözülebilir. Bu transfeksiyon plakası oluşturma protokolü programlandıktan sonra, yeni bir Dosyadan Aktarım .csv sağlayarak ve numuneler, laboratuvar gereçleri ve reaktifler için aynı güverte konumlarını işgal ederek kolayca tekrarlanabilir olmalıdır.

Otomatik transfeksiyon prosedürü için (adım 3), viskoz sıvının oluktan eşit şekilde aspirasyonunu sağlamak için bir fazla PEG çözeltisi hazırlanır, tipik olarak ölü hacmi hesaba katmak için 40 mL'lik bir fazlalık. Transfeksiyon için tam olarak gereken miktarın kullanılması, pipetlere hava çekilmesine ve 96 kanallı kafa boyunca eşit olmayan hacimlerde PEG aspire edilmesine neden olabilir. Bu çözelti önceden de hazırlanabilirken, transfeksiyon gününde de hazırlanması tavsiye edilir. PEG çözeltisinin sterilizasyonu bir şırınga filtresi kullanılarak yapılabilir, ancak viskozite nedeniyle zor olabilir. Bir vakum filtre ünitesi kullanmak daha hızlıdır ve bu aktiviteyle ilişkili herhangi bir hayal kırıklığını veya acıyı hafifletebilir. PEG çözeltisinde olduğu gibi, 96 kanallı kafa boyunca eşit pipetleme sağlamak için diğer transfeksiyon tampon çözeltilerinden (W5, WI) fazla miktarda da sağlanır. Tampon çözeltileri (W5 ve WI), gelecekteki sıvı işleyici çalışmaları için kullanılmak üzere önceden toplu olarak hazırlanabilir. Reaktifler maliyetli olmasa da, tampon çözeltisinden iyi miktarda fedakarlık yapılır. Günde artan çalışma sayısıyla birlikte, çalışma sonunda atılan fazlalığı azaltacak rezervuara alternatifler kullanmak daha iyi olabilir. Sıvı işleyici protokolünün çalışması sırasında, W5 ve WI, protokol başlatılmadan önce, 15 dakikalık inkübasyon sırasında veya protokoldeki kullanıcı duraklatma adımları sırasında ilgili çukurlarına eklenebilir. Işık perdesi gibi güvenlik özellikleri nedeniyle kuluçka süresi boyunca tampon eklerken dikkatli olun. Protokolün istenmeyen bir şekilde kesintiye uğramasını önlemek için yazılımdan gelen tüm uyarı mesajlarını sildiğinizden emin olun.

Bu protokol, protoplast12,13'ün işlenmesi için daha önce belgelenmiş otomatik protokoller üzerinde güvenilir, tekrarlanabilir ve yaygın olarak uygulanabilir bir gelişmeyi yansıtır. Bu yöntem, birçoğu aynı tampon manipülasyon adımları serisine bağlı olduğundan, protoplast protokollerinin görünüşte sonsuz repertuarına uyarlanabilir. Otomatik transfeksiyon plakası oluşturma sırasında RICBD aracılığıyla kenar etkisinin azaltılması, kenar efektinin istatistiksel olarak anlamlı bir düzeltmesini uygularken aynı anda çaba miktarını ve değişkenliği azaltır. Protoplastın 96 oyuklu bir kapsül transfeksiyonu, PEG inkübasyon süresi ile ilişkili herhangi bir varyasyon olasılığını ortadan kaldırır ve reaksiyonu aynı anda 96 oyuğun tamamında gerçekleştirir. Protokol, transfeksiyon adımlarının tam otomasyonunu gerçekleştirmeyi amaçlamış olsa da, kullanıcı duraklamaları, transfeksiyon bilimcisinin fiziksel müdahalesini gerektirecektir. Son yıllarda, dengesizliğe dayanıklı, otomasyona uyumlu santrifüjlerde birçok ilerleme kaydedilmiştir. Bu ekipmanla, kullanıcı müdahalesi olmadan tüm yöntemi otomatikleştirmek mümkün olacaktır. Alternatif olarak, diğer protokoller, transfeksiyon 12,13'ü takiben protoplastın kuyunun dibine çökmesine izin vererek santrifüjlemeden kaçınmıştır. Bununla birlikte, bu, transfeksiyon prosedürüne ek süre ekleyecek ve WI'da gece boyunca inkübasyondan önce W5 tamponunda inkübe etme süresi fazla olacaktır.

Transfeksiyon yönteminin birçok yerinde, sıvı işlemenin birden fazla transfer kullanılarak yapılması gereken 200 μL'yi aşan hacimlerin işlenmesini tanımlar. Sıvı işleyicinin yaşına ve modeline bağlı olarak, bu adım tek bir hacim olarak yapılabilir ve yapılmalıdır. Burada açıklanan model gibi daha eski sıvı işleyiciler için, 96 oyuklu bir kafa kullanılarak aspire edilebilecek en fazla 200 μL'dir. Yöntemde hem verimlilik hem de doğruluk açısından bariz bir iyileştirme, olası dökülme, damlama veya kontaminasyon riskini en aza indirmek için transfer sayısını azaltmak olacaktır. Sıvı işleme protokollerinin iyileştirilmesine yönelik diğer hususlar, bu teknolojilerin gözden geçirilmesinde ve bunların biyoteknoloji alanındaki kullanımlarında ana hatlarıyla belirtilmiştir23.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm yazarlar, transgenik (GM) özellikli ürünlerin üretilmesi için rutin olarak dönüşüm teknolojisi kullanan uluslararası bir tarımsal biyoteknoloji şirketi olan Syngenta tarafından istihdam edilmektedir.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, bu çalışmayı destekleyen Syngenta'daki birçok bilim insanına ve ekibimize her gün teşekkür eder. Geçici Test Ekibinin devam eden başarısı için çoğu zaman görünmeyen destekleri çok önemli olan aile ve arkadaşlara özel bir takdir gösterilmelidir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(2)β-merkaptoetanol SigmaM6250
2- (N-Morfolino) etansülfonik asit (MES) monohidratSigma69892
düz kapaklı 50mL santrifüj tüpleri sterilFisher22-010-064
96 Kuyu Optik Btm Plt PolymerBase Siyah w / Kapaklı Hücre Kültürü Steril PS .4mL KuyuFisher12-566-70
Axygen Biomek FX / NX Robotik Uçlar, steril olmayan, GenişDelikli Fisher14-222-096
Axygen Robotik Uçlar 30uL filtre, steril, raflıFisher14-222-103
Bel-Art SP Scienceware Lab Companion Yuvarlak Stil Vakumlu KurutucularFisher08-648-10
Bemis 2 IN. X 250 Ft. Rulo Laboratuvar Parafilmi Fisher13-374-16
Biomek FXPBeckman Coulter902508
Kalsiyum klorür dihidratSigmaC5080
Chemglass Yaşam Bilimleri Tek Kullanımlık Hemositometre Fisher50-131-1352
Clorox Antiseptik Çamaşır Suyu, KonsantreFisherNC1871274
Corning Mikroplaka Alüminyum Sızdırmazlık Bandı Fisher07-200-684
Corning 96 Kuyulu Test Blokları, 2mL, 96 kuyulu standartFisher07-200-701
DL-Dithiothreitol (DTT)Sigma10197777001
D-Mannitol SigmaM9546
Fisherbrand 60mL Plastik ŞırıngaFisher14-955-461
Fisherbrand Steril Hücreli Süzgeç 40um Fisher22-363-547
Fisherbrand Şeffaf Kapaklı Petri Kapları, İstiflenebilir, 100 mm x 25 mm, 325FisherFB0875711
Kutusu Magnezyum klorür hekzahidratSigmaM2670
Millex Şırınga Tahrikli Filtre Ünitesi Steril 33mm PES .22umFisherSLGPR33RS
Millex Şırınga Tahrikli Filtre Ünitesi Steril 33mm PVDF.45umFisherSLHAR33SS
MillliporeSigma Steriflip Steril Tek Kullanımlık Vakum Filtre Üniteleri 50mL PESFisherSCGP00525
Poli (etilen glikol) 4000  Sigma81240
Redi-Topraklama Fiş ve Fide Karışımı Wyatt QuarlesGP92747
Düzenli Hizmet Tek Kenarlı Tıraş Bıçağı çelik sırt .009RDFisher12-640
Araştırma Ürünleri International Corp Selülaz RSFisher50-213-232
Araştırma Ürünleri International Corp Makrozozim R-10Fisher50-213-444
Sodyum klorürSigmaS7653
Tepsi Eki - 36 Hücreli - 6x6 İç İçe Hummert11635000
Ara-20 SigmaP1379
VACUUBRAND ME1 Vakum Pompası, 100-120V, 50/60 Hz, ABD fişiVWR97058-164

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baltes, N. J., Gil-Humanes, J., Voytas, D. F. Genome engineering and agriculture: Opportunities and challenges. Prog Mol Biol Transl Sci. 149, 1-26 (2017).
  2. Torres-Acosta, M. A., Lye, G. J., Dikicioglu, D. Automated liquid-handling operations for robust, resilient, and efficient bio-based laboratory practices. Biochem Eng J. 188, 108713(2022).
  3. Cocking, E. C. A method for the isolation of plant protoplasts and vacuoles. Nature. 187, 962-963 (1960).
  4. Genzen, J. R., et al. Challenges and opportunities in implementing total laboratory automation. Clin. Chem. 64 (2), 259-264 (2018).
  5. Reed, K. M., Bargmann, B. O. R. Protoplast regeneration and its use in new plant breeding technologies. Front Genome Ed. 3, 734951(2021).
  6. Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  7. Yang, Y., et al. Synthetic promoter screening using Poplar mesophyll protoplast transformation. Bio Protoc. 13 (8), e4660(2023).
  8. Estes, S., Melville, M. Mammalian cell line developments in speed and efficiency. AdvBiochem Eng Biotechnol. 139, 11-33 (2014).
  9. Possee, R. D., et al. Generation of baculovirus vectors for the high-throughput production of proteins in insect cells. Biotechnol Bioeng. 101 (6), 1115-1122 (2008).
  10. Xu, Y., et al. Protoplasts: small cells with big roles in plant biology. Trends Plant Sci. 27 (8), 828-829 (2022).
  11. Rigoulot, S. B., et al. Automated, high-throughput protoplast transfection for gene editing and transgene expression studies. Methods Mol Biol. 2653, 129-149 (2023).
  12. Occhialini, A., et al. High-throughput transfection and analysis of Soybean (Glycine max) protoplasts. Methods Mol Biol. 2464, 245-259 (2022).
  13. Lenaghan, S. C., Stewart, C. N. Jr An automated protoplast transformation system. Methods Mol Biol. 1917, 355-363 (2018).
  14. Gilliard, G., et al. Protoplast: A valuable toolbox to investigate plant stress perception and response. Front Plant Sci. 12, 749581(2021).
  15. Marx, V. Plants: A toolbox of cell-asbed assays. Nat. Methods. 13, 551-554 (2016).
  16. Mansoury, M., et al. The edge effect: A global problem. The trouble with culturing cells in 96-well plates. Biochem Biophys Rep. 26, 100987(2021).
  17. Maxwell, C. B., et al. The edge effect in high-throughput proteomics: A cautionary tale. J Am Soc Mass Spectrom. 34 (6), 1065-1072 (2023).
  18. Zhong, H., et al. Advances in Agrobacterium-mediated maize transformation. Methods Mol Biol. 1676, 41-59 (2018).
  19. Wenck, A., et al. Reef-coral proteins as visual, non-destructive reporters for plant transformation. Plant Cell Rep. 22 (4), 244-251 (2003).
  20. Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jian, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physiol Plant. 36, 1271-1281 (2014).
  21. Bargmann, B. O., Birnbaum, K. D. Positive fluorescent selection permits precise, rapid, and in-depth overexpression analysis in plant protoplasts. Plant Physiol. 149 (3), 1231-1239 (2009).
  22. Coy, M. R., Abbitt, S. E., Frank, M. J. Protoplast isolation and transfection in Maize. Methods Mol Biol. 2464, 91-104 (2022).
  23. Jessop-Fabre, M. M., Sonnenschein, N. Improving Reproducibility in Synthetic Biology. Front Bioeng Biotechnol. 7 (18), (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Maize Leaf ProtoplastsAutomated Liquid HandlingTransgene ExpressionHigh Throughput ScreeningProtoplast IsolationProtoplast TransfectionPlant Biotechnology96 Well PlateTransient ExpressionPlasmid Preparation
Video Coming Soon

Related Articles