<ol><li> Videoda gösterildiği gibi bir akış odası oluşturun. Parafilm mühür sıkı olduğundan emin olun ve yıkanmış lamelleri kullanabilirsiniz. </li><li> 5-10 &#39;odasında inkübe aktin bağlayıcı ajan. </li><li> Engelleyici bir protein ile cam lamel non-spesifik bağlayıcı siteleri engellemek. </li><li> Odanın içinde tampon polimerize G-aktin akan polimerize aktin. </li><li> Solukluk fazla tampon akan unpolymerized aktin. </li></ol>

zaman atlamalı mikroskopi sökme aktin İzlenmesi

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Zaman atlamalı Mikroskopi Sökme Aktin İzlenmesi

Pekala, bugün sizlere dik mikroskopta görüntüleme yapmak için bir akış odası, yani bir füzyon odasının nasıl oluşturulacağını göstermek istiyorum. Ardından, film kullanarak iki boşluk oluşturuyorum. Bunun için parafilm alıp onu küçük şeritler halinde kesiyorum.Sıradaki adımda, temel olarak kanal duvarlarını oluşturacağım ve bunları eğik bir hava akımıyla kurutacağım. Lamelini parafinin üzerine yerleştiriyorum ve işte tamamlandı. Ardından, parafini eritmek ve temel olarak bir sızdırmazlık sağlamak için ısıtıcı blok üzerinde ısıtıyorum.Burada gördüğümüz şey lamine camdır ve lamine camın üzerinde, tam burada gördüğünüz gibi, iki katman film bulunmaktadır. Bunun üzerinde ise tekrar, 22 x 22 mm boyutlarında bir lamine cam vardır. Mühürlemeyi tamamlamak için filmin üzerine bastırdığım cam budur.Tamam, sıvı burada tek yönde ilerliyor ve ben onu buradaki filtre kağıdıyla bu yönde çekebiliyorum. Bunu nasıl yapacağınızı birazdan göstereceğim. Benim tercih ettiğim yöntem ise, bunu oldukça basit olan nemlendirilmiş bir hazneye yerleştirmektir.İki adet yükseltilmiş şerit alın ve altına bir filtre kağıdı yerleştirin. Akış odasını sızdırmaz tutmak için üzerine bir kapatma lamı yerleştiriyorum. Çembere bir solüsyon ekleme yöntemi, pipet ucunu odanın girişine yerleştirip solüsyonu eklemektir.Şimdi yapacağım işlem, hazneyi kapağı kapalı olarak 10 dakika boyunca inkübe etmektir. Sıvıyı diğer taraftan çekmek için genellikle kullandığım yöntem, bir filtre kağıdını alıp şu şekilde ince şeritler halinde kesmektir. Bu ince şeritlerden birini alıyorum ve bir yandan çözeltiyi giriş kısmına uygularken, diğer yandan filtre kağıdını çıkış kısmına yerleştirerek değişim çözeltisini çekiyorum.Böylece sıvının çözelti boyunca aktığını göreceksiniz. Ardından, orta kısmın kapanması için beş dakika bekliyorum. Şimdi yapmaya hazır olduğum şey, aktini yerleştirmek; aktini aslında polimerize etmem gerekiyor, polimerizasyonu akış odasının içinde gerçekleştiriyorum ve bu, önceki prosedürlerle aynıdır.Bu şekilde olduğu için ve artık aktin polimerize olduğu için, fazla polimerize olmamış aktini sadece tampon kullanarak büyük bir hacimle yıkayıp uzaklaştırıyorum. Burada yaklaşık 100 µL tamponum var ve bu, birkaç reaksiyon odası hacmine karşılık geliyor. Filtre kağıdı doyuma ulaştığında yönünü değiştirmem gerekiyor. Tamam mı?Böylece bununla görüntüleme yapmaya hazırım. Aktin'in tutturulduğu perfüzyon odası hazır. Şimdi lamı alıp mikroskobun altına yerleştiriyorum ve yağlı objektif ile görüntüleme yapacağım için lamın üst yüzeyine, içeriye aktin üzerine bir solüsyon, protein veya herhangi bir madde ekleyebilmek için imersiyon yağı damlatıyorum.Bu nedenle, zaman ayarlı görüntüleme yaparken aslında solüsyon tarafını değiştirebiliyorum.

Zaman atlamalı Mikroskopi Sökme Aktin İzlenmesi

Bu makalede

Protokol

Yeniden basım ve izinler

Etiketler