Method Article

Statik Bariyer Doku Modellerinin Dinamik Mikrofizyolojik Sistemlere Dönüştürülmesi

DOI:

10.3791/66090

⸱

February 16th, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Rochester Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, University of Rochester

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, açık kuyu formatını sıvı akış yetenekleriyle bütünleştiren yeniden yapılandırılabilir bir membran tabanlı hücre kültürü platformunu açıklar. Bu platform standart protokollerle uyumludur ve hem mühendislik hem de biyobilim laboratuvarlarının ihtiyaçlarını karşılayarak açık kuyu ve mikroakışkan kültür modları arasında tersine çevrilebilir geçişlere izin verir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrofizyolojik sistemler, laboratuvar ortamında insan dokularının yapısını ve işlevini taklit etmek için kullanılan minyatür hücre kültürü platformlarıdır. Bununla birlikte, bu platformlar, sıvı akış yeteneklerinden yoksun olmasına rağmen, açık kuyulu, membran tabanlı yaklaşımların doku bariyerlerini taklit etmek için altın standart olarak hizmet ettiği biyobilim laboratuvarlarında yaygın olarak benimsenmemiştir. Bu sorun öncelikle mevcut mikrofizyolojik sistemlerin açık kuyu sistemleri için geliştirilen standart protokoller ve araçlarla uyumsuzluğuna bağlanabilir.

Burada, açık kuyu yapısına, akış geliştirme kabiliyetine ve geleneksel protokollerle uyumluluğa sahip yeniden yapılandırılabilir membran tabanlı bir platform oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu sistem, açık kuyu ve mikroakışkan modlar arasında tersine çevrilebilir geçiş sağlayan bir manyetik montaj yaklaşımı kullanır. Bu yaklaşımla kullanıcılar, standart protokolleri kullanarak açık kuyu biçiminde bir deneye başlama ve gerektiğinde akış özellikleri ekleme veya kaldırma esnekliğine sahip olur. Bu sistemin pratik kullanımını ve standart tekniklerle uyumluluğunu göstermek için, açık kuyu formatında bir endotel hücre tek tabakası oluşturulmuştur. Sistem, sıvı akışını sağlamak için yeniden yapılandırıldı ve daha sonra immün boyama ve RNA ekstraksiyonu yapmak için açık kuyu formatına geçildi. Konvansiyonel açık kuyu protokolleri ile uyumluluğu ve akış geliştirme kabiliyeti nedeniyle, bu yeniden yapılandırılabilir tasarımın hem mühendislik hem de biyobilim laboratuvarları tarafından benimsenmesi beklenmektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vasküler bariyerler, kan bölmesini çevreleyen dokudan ayıran kritik bir arayüz görevi görür. Bağışıklık hücrelerini çekerek, moleküler geçirgenliği kontrol ederek ve patojenlerin dokuya girmesine karşı kalkan oluşturarak homeostazın korunmasında kritik bir rol oynarlar 1,2. İn vivo mikroçevreyi taklit etmek için in vitro kültür modelleri geliştirilmiştir ve hem sağlıklı hem de hastalıklı durumlarda bariyer özelliklerini etkileyen faktörlerin ve koşulların sistematik olarak araştırılmasını sağlar 3,4.

Bu tür kültür modelleri için en yaygın kullanılan yaklaşım, gözenekli, iz ile kazınmış bir kültür zarının ortamla dolu bölmeleri ayırdığı Transwell benzeri "açık kuyu" konfigürasyonu5'tir (Şekil 1A). Bu formatta, hücreler zarın her iki tarafına da ekilebilir ve çok çeşitli deneysel protokoller geliştirilmiştir. Bununla birlikte, bu sistemler, in vivo 5,6'da görülen bariyer olgunlaşmasını desteklemek ve bağışıklık hücresi dolaşımını taklit etmek için gerekli olan sıvı akışlarını sağlama yetenekleri bakımından sınırlıdır. Sonuç olarak, ilaç dozları, mekanik stimülasyon veya sıvı kaynaklı kesme gerilmeleri 6,7,8 uygulayan dinamik akışlar gerektiren çalışmalar için kullanılamazlar.

Açık kuyu sistemlerinin sınırlamalarının üstesinden gelmek için, gözenekli kültür membranlarını ayrı ayrı adreslenebilir akışkan kanallarla birleştiren mikroakışkan platformlar geliştirilmiştir9. Bu platformlar, sıvı yönlendirme, perfüzyon ve kimyasal bileşiklerin eklenmesi, kontrollü kesme stimülasyonu ve dinamik hücre ekleme yetenekleri üzerinde hassas kontrol sunar 7,10,11,12,13. Mikroakışkan platformlar tarafından sağlanan gelişmiş yeteneklere rağmen, karmaşık mikroakışkan protokoller ve yerleşik deneysel iş akışlarıyla uyumsuzlukları nedeniyle biyobilim laboratuvarlarında yaygın olarak benimsenmemişlerdir 4,10,14.

Bu teknolojiler arasındaki boşluğu doldurmak için, manyetik olarak yeniden yapılandırılabilir, modül tabanlı bir sistem kullanan bir protokol sunuyoruz. Bu sistem, deneyin özel ihtiyaçlarına göre açık kuyu ve mikroakışkan modları arasında kolayca değiştirilebilir. Platform, 100 nm kalınlığında bir kültür zarına (nanomembran) sahip m-μSiM (silikon membran tarafından etkinleştirilen modüler mikrofizyolojik sistem) olarak bilinen açık kuyulu bir cihaza sahiptir. Bu nanomembran, Şekil 1B'de gösterildiği gibi yüksek gözenekliliğe (% 15) ve cam benzeri şeffaflığa sahiptir. Üst bölmeyi bir alt kanaldan fiziksel olarak ayırır ve fizyolojik uzunluk ölçekleri15 boyunca moleküler taşımaya izin verir. Parlak alan görüntüleme ile canlı hücrelerin görüntülenmesinde bilinen zorluklara sahip olan geleneksel iz kazınmış membranların aksine, nanomembranın uygun optik ve fiziksel özellikleri, membran yüzeyinin her iki tarafındaki hücrelerin net bir şekilde görselleştirilmesini sağlar 15,16,17.

Mevcut protokol, özel tohumlama ve akış modüllerinin imalatını özetlemekte ve platformun manyetik olarak yeniden yapılandırılmasını açıklamaktadır. Platformun hem statik hem de dinamik koşullar altında endotel bariyerleri oluşturmak için nasıl kullanılabileceğini gösterir. Bu gösteri, endotel hücrelerinin, kayma stimülasyonu altında kaymaya duyarlı gen hedeflerinin yukarı regülasyonu ile akış yönü boyunca hizalandığını ortaya koymaktadır.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu tasarım, deneysel gereksinimlere ve son kullanıcının tercihlerine göre çeşitli modlarda kullanılabilir. Her deneyden önce, protokol için gerekli adımları ve modülleri belirlemek için Şekil 2'de sunulan karar akış şemasına bakın. Örneğin, kullanıcı bir deney boyunca Transwell tipi sistemle doğrudan karşılaştırmak için açık kuyu biçimini korumayı planlıyorsa, hücre tohumlama için desen şablonu gerekli değildir. Çekirdek modül ticari olarak temin edilebilir (Malzeme Tablosuna bakınız) ve ultra ince nanomembran, deneysel ihtiyaçlara uyacak şekilde farklı gözeneklilik ve gözenek boyutlarına sahip bir malzeme kütüphanesinden seçilebilir.

1. Desen şablonunun imalatı

NOT: Desen şablonu, hücreleri yalnızca membran çipinin gözenekli bölgesine yerleştirmeye yarar ve hücrelerin, akış modülü eklendikten sonra potansiyel olarak hasar görebilecekleri çevreleyen silikon katmana yerleşmesini önler16 (bkz. Şekil 3). Tek katmanın hasar görmesi, bariyer bütünlüğünü olumsuz etkileyebilir ve deneysel sonuçları tehlikeye atabilir. Açık, statik bir kültürde şablon gereksizdir, çünkü hasar riski yoktur.

  1. Ek Kodlama Dosyası 1'de (Şekil 4A) sağlanan tasarımı kullanarak bir kalıp satın alın, işleyin veya 3D yazdırın.
    NOT: Şablon duvarları, yüksek en-boy oranlı düz duvarlı özelliklere kıyasla ortam kapasitesini artırmak ve kabarcık sıkışmasını en aza indirmek için koniktir.
  2. Soğuk bir rulo kullanarak 130 μm basınca duyarlı yapışkan (PSA) filmi 3.2 mm'lik bir akrilik levhaya yapıştırın (Malzeme Tablosuna bakın).
  3. Bir dizi boşluk oluşturmak için akrilik levhayı Ek Kodlama Dosyası 2'de sağlanan tasarıma göre lazerle kesin (Şekil 4B).
  4. Koruyucu tabakayı PSA filminden soyun ve akrilik tabakayı kalıba yapıştırın.
    NOT: Kalıp özellikleri boşluk içinde ortalanacak şekilde lazerle kesilmiş tabakanın kalıpla hizalandığından emin olun (Şekil 4C). Zar üzerindeki hücre konumlandırmasının doğruluğu bu adıma bağlıdır.
  5. PDMS prepolimerini iyice karıştırın (10:1 baz-katalizör oranı kullanarak) ( Malzeme Tablosuna bakın) ve görünür kabarcık kalmayana kadar (5-15 dakika) bir vakum odasında gazını alın.
  6. PDMS'yi yavaşça kalıp boşluklarına dökün ve düz bir kenarla düzleştirin.
    NOT: Kabarcık sıkışmasını önlemek için PDMS'yi her boşluğa yavaşça dökün. Döküldükten sonra kabarcıklar varsa, kalıbı vakum odasına yerleştirin ve tekrar gazdan arındırın.
  7. PDMS'yi bir ocak gözü üzerinde 70 °C'de 1 saat kürleyin ve ardından oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
  8. Düz uçlu cımbız kullanarak kalıpları kalıp boşluklarından çıkarın.

2. Akış modülünün imalatı

NOT: Akış modülü, çekirdek modülün yonca şeklindeki kuyusu ile benzer bir ayak izini paylaşır ve kalıplanmış bir mikro kanal içerir (genişlik = 1.5 mm, yükseklik = 0.2 mm, uzunluk = 5 mm). Yonca şekli, kanalın gözenekli kültür bölgesi üzerinde hizalanmasına yardımcı olur (Şekil 5).

  1. Ek Kodlama Dosyası 3'te (Şekil 4D) sağlanan tasarım tarafından tanımlanan özelliklere sahip bir silikon kalıp oluşturmak için standart yumuşak litografi tekniklerini 18 kullanın.
  2. 3,2 mm kalınlığında bir akrilik levhaya 130 μm PSA filmi yapıştırın.
  3. Bir dizi yonca şeklindeki boşluk oluşturmak için Ek Kodlama Dosyası 4'te verilen tasarıma dayalı olarak akrilik levhayı lazerle kesin (Şekil 4E).
    NOT: Boşluğun yüksekliği, uygun sızdırmazlığı sağlamak için çekirdek modülün yüksekliğinden biraz daha uzun (0-0.1 mm) olması gereken akış modülünün yüksekliğini belirler.
  4. Koruyucu tabakayı PSA filminden çıkarın ve ardından silikon kalıp üzerindeki üçgen hizalama işaretlerini lazer kesim tabakadakilerle hizalayarak lazer kesim tabakayı silikon kalıba yapıştırın.
    NOT: Adım 1.4'e benzer şekilde, lazerle kesilmiş akrilik levhanın, kalıp özellikleri her boşlukta ortalanacak şekilde silikon kalıpla hizalandığından emin olun (Şekil 4F). Bu adım, mikrokanalın ayak izine göre konumunu belirler.
  5. Gazdan arındırılmış PDMS'yi kalıp boşluklarına yavaşça dökün ve düz bir kenarla düzleştirin.
    NOT: Döküldükten sonra kabarcıklar varsa, kabarcıklar çıkana kadar kalıbın gazını alın.
  6. Kalıbı bir ocak gözüne yerleştirin ve PDMS'yi 70 °C'de 1 saat pişirin, ardından kalıbın oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
  7. Düz uçlu cımbız kullanarak akış modüllerini kalıp boşluklarından dikkatlice çıkarın.
  8. Akış modülünü mikro kanal özellikleri yukarı bakacak şekilde yönlendirin ve bir biyopsi zımbası kullanarak çekirdek giriş ve çıkış portlarını kanalın sonuna yerleştirin (bkz.

3. Alt ve üst akrilik muhafazaların imalatı

NOT: Çekirdek modül alt muhafazaya sığar. Muhafazalardaki gömülü mıknatıslar arasındaki çekim, akış modülünü çekirdek modüle sıkıştırır ve sızdırmaz hale getirir (Şekil 6).

  1. Mıknatıs yerleştirme delikleri olan üst muhafazayı oluşturmak için Ek Kodlama Dosyası 5'te sağlanan tasarımı kullanarak 2 mm'lik bir akrilik levhayı lazerle kesin.
  2. 3,5 mm'lik bir akrilik levhaya 130 μm'lik bir PSA filmi yapıştırın.
  3. Mıknatıs yerleştirme delikleri olan alt muhafazayı oluşturmak için Ek Kodlama Dosyası 6'da verilen tasarıma göre akrilik levhayı lazerle kesin.
    NOT: Alt muhafazanın kalınlığı kritik bir parametredir ve akış sırasında sızıntıyı önlemek için çekirdek modülün toplam kalınlığına uygun olmalıdır.
  4. PSA koruyucu tabakayı çıkarın ve alt muhafazayı bir cam lamel üzerine takın.
  5. 4,75 mm nikel kaplı neodimyum mıknatısları ( Malzeme Tablosuna bakın) muhafazaların lazerle kesilmiş deliklerine bastırın.
    NOT: Manyetik çekimi sağlamak için alt ve üst muhafazalardaki mıknatısların zıt kutuplarla yerleştirildiğinden emin olun (Şekil 6).

4. Akış devresinin imalatı

NOT: Kapalı döngü akış devresi, rezervuar olarak iki numune toplama şişesi içerir (Şekil 7). Giriş rezervuarı, hücre ortamının inkübatördeki CO2 konsantrasyonu ile dengelenmesini sağlamak için bir poliviniliden diflorür (PVDF) filtresine sahiptir.

  1. Bir numune toplama şişesinin kapağında iki delik oluşturmak için 1 mm'lik bir biyopsi zımbası kullanın.
  2. Ayrı bir numune toplama şişesinin kapağında iki delik (1 mm ve 4 mm) oluşturmak için biyopsi zımbaları kullanın ve bu şişenin alt kısmında 1 mm'lik bir delik oluşturun.
  3. 20 mm'lik deliklerin her birine 1 G dağıtım ucu yerleştirin ve bunları sıcak tutkalla kapatın.
  4. 4 mm'lik deliğe 0,22 μm'lik bir PVDF filtresi ( Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin ve sıcak tutkalla kapatın.
  5. Bir numune tutma aşaması oluşturmak için Ek Kodlama Dosyası 7'de sağlanan tasarımı kullanarak 1,5 mm'lik bir akrilik levhayı lazerle kesin.
  6. Rezervuarları akrilik tabla üzerine yerleştirin.
  7. Mikro akış tüpleri kullanarak dağıtım uçlarını bağlayın (Malzeme Tablosuna bakın).
  8. 21 G dağıtım uçlarını kullanarak tüpleri akış modülünün giriş ve çıkışına bağlayın.
  9. Akış sirkülasyonu için peristaltik bir pompa ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanın.
    NOT: İstenirse akışı sağlamak için şırınga veya pnömatik pompalar da kullanılabilir. Akış hızı deneysel ihtiyaçlara göre belirlenmelidir. Deneysel olarak doğrulanmış bir COMSOL modelinden türetilen kapsamlı bir tablo, kullanıcıların hücre tek tabakası16'da istenen kesme gerilimini elde etmek için gerekli akış hızını seçmelerine yardımcı olmak için Ek Tablo 1'de verilmiştir.

5. Hücre tohumlama

NOT: Geleneksel membran eklerine benzer şekilde, nanomembran üzerinde farklı hücre tipleri kültürlenebilir. İkincil bir hücre tipi, alt kanal15'teki zarın diğer tarafında da birlikte kültürlenebilir.

  1. Hücre yapışmasını iyileştirmek için membranı 5 μg /cm2 fibronektin ile kaplayın (Malzeme Tablosuna bakınız) oda sıcaklığında 1 saat.
    NOT: Seçilen hücre tipi, gerekli kaplamayı ve hücre yoğunluğunu etkileyebilir. Burada açıklanan prosedür, İnsan umbilikal ven endotel hücreleri içindir (HUVEC'ler, bkz.
  2. Kaplama solüsyonunu bir P200 pipeti kullanarak aspire edin ve çekirdek modül kuyucuğuna bir desen şablonu yerleştirin.
  3. Cihazın kuyusuna ve alt kanalına hücre ortamı ekleyin.
  4. 40.000 hücre/cm2 yoğunlukta HUVEC'leri kuyuya tohumlayın.
    NOT: Bu yoğunluktaki HUVEC'ler tipik olarak 24 saatlik inkübasyondansonra birleşik bir tek tabaka oluşturur 16,19.
  5. Cihazı bir Petri kabına yerleştirin. Yerel nemi korumak için Petri kabına DI su içeren 15 mL'lik bir konik tüp kapağı ekleyin.
  6. Petri kabını inkübatöre aktarın.
    NOT: Cihazın üst kuyu ve alt kanalındaki hücre ortamı her 24 saatte bir değiştirilmelidir. Alt kanaldaki medyayı değiştirmek için, eski medyayı diğer porttan çıkarmak için portlardan birine yavaşça yeni medya enjekte edin.

6. Mikroakışkan moduna yeniden yapılandırma

  1. Üst muhafazayı, alt muhafazayı, akış modülünü, rezervuarları, tüpleri ve dağıtım uçlarını montajdan önce 30 dakika boyunca bir UV sterilizasyon odasına yerleştirerek sterilize edin. Akış devresinde% 70 etanol ve ardından steril PBS dolaştırın.
  2. Rezervuarları ve tüpleri Endotel Hücre Büyüme ortamı ile doldurun (Malzeme Tablosuna bakınız).
  3. Alt muhafazayı s'ye yerleştirinamptage. Açık kuyu çekirdek modülünü alt muhafazaya yerleştirin.
  4. Modülün kuyusundan hücre ortamını aspire edin. Akış modülünü kuyuya yerleştirin.
  5. Akış modülünü çekirdek modül kuyusuna sızdırmaz hale getirmek için üst muhafazayı yerleştirin. Giriş ve çıkış dağıtım uçlarını akış modülü bağlantı noktalarına bağlayın.
  6. Sisteme sıvı akışı sağlamak için peristaltik pompayı çalıştırın.

7. Akış girişinden sonra açık kuyu formatında aşağı akış analizinin yapılması

NOT: Buradaki kültür süresi deneysel hedeflere bağlıdır. Kullanıcılar, tercihlerine göre açık kuyu veya mikroakışkan formatlarda aşağı akış analizi (örneğin, İmmünositokimya, RNA ekstraksiyonu) yapabilirler. Örneğin, bir açık kuyu formatı tercih edilirse, sistem standart protokollere16,19 dayalı tahliller yapacak şekilde yeniden yapılandırılmalıdır.

  1. Kesme akışına maruz kalma için istenen süreye ulaşıldığında pompayı durdurun. Giriş ve çıkış dağıtım uçlarını çıkarın.
  2. Üst muhafazayı çıkarın. Akış modülünü cımbız kullanarak kuyudan yavaşça çıkarın.
  3. Kuyuya 100 μL hücre ortamı ekleyin. Standart protokollere dayalı olarak istenen tahlilleri gerçekleştirin.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açık kuyu çekirdek modülü, Şekil 6A'da gösterildiği gibi, başlangıçta bir alt mahfaza ve bir lamel tarafından oluşturulan belirli bir boşluk içine yerleştirilir. Daha sonra, bir mikrokanal ve erişim portları içeren akış modülü, çekirdek modülün kuyusuna yerleştirilir. Akış modülü, Şekil 6B'de gösterildiği gibi, alt ve üst yuvalara gömülü mıknatıslar arasındaki manyetik çekim kuvveti nedeniyle membranın silikon destek katmanına karşı güvenli bir şekilde kapatılmıştır. Bu manyetik kilitleme mekanizmasının etkinliğini değerlendirmek için, sistemin 38,8 ± 2,4 kPa'ya kadar çıkmaz basınçlara dayanabileceğini gösteren bir patlama basıncı testi yapıldı. Bu basınç toleransı, hücre kültürü uygulamalarında karşılaşılan tipik çalışma basınçlarını önemli ölçüde aşmaktadır. Ayrıca, 4000 μL/dk'ya kadar akış hızlarına maruz kaldığında sistem sızıntısız kalır, bu da kültür bölgesi16'da 74 din/cm2'lik bir kesme gerilimine eşdeğerdir.

Açık kuyu ve mikroakışkan modlar arasında geçiş yapabilen bir platform geliştirirken, geleneksel statik açık kuyu platformları için tipik olarak bir endişe kaynağı olmayan hücre tohumlama yaklaşımına dikkat edilmelidir16. Kanal sınırının etrafındaki tek tabakanın hasar görmesi, deneysel sonuçlardakomplikasyonlara neden olabilir 20. Bu sorunu çözmek için, çekirdek modülün açık kuyusuna uyan ve hücrelerin tercihen membran yüzeyine yerleşmesi için özel bir pencere sağlayan çıkarılabilir bir şablon tasarlanmıştır (Şekil 3). Hücre tek tabakası desenlendiğinde ve birleştiğinde, kullanıcı deneye açık kuyu formatında devam etme veya hücre tek tabakasını fizyolojik kesme stresine maruz bırakmak için platformu mikroakışkan modda yeniden yapılandırma esnekliğine sahiptir (Şekil 3). Manyetik kilitleme mekanizması, gerektiğinde açık kuyu ve mikroakışkan formatlar arasında kolayca geçiş yapma yeteneği sağlar. Örneğin, cihaz, bir akış stimülasyonundan sonra açık kuyu formatına geri döndürülebilir ve kullanıcılara standart deney protokollerini kullanarak çeşitli testler (immün boyama, RNA ekstraksiyonu ve moleküler geçirgenlik ölçümleri gibi) yapma esnekliği sunar15,16.

İnsan vücudunun fizyolojik ortamında, vasküler bariyer,bariyer 5,21,22'nin yapısını ve işlevini etkileyen önemli bir biyofiziksel ipucu görevi gören akış kaynaklı kayma stresine maruz kalır. Bu nedenle, mikrofizyolojik sistemlere sıvı akışının eklenmesi önemli bir gerekliliktir. Platformun çok yönlülüğünü göstermek için, standart protokoller kullanılarak açık kuyu formatında bir HUVEC tek katmanı kuruldu. 24 saatlik statik kültürden sonra, platform, hücre tek tabakasını 24 saat boyunca 10.7 din/cm2 kesme gerilimine maruz bırakmak için mikroakışkan moda yeniden yapılandırıldı. Sonuçlar, akış altında kültürlenen hücrelerin akış yönü boyunca hizalandığını, akışsız kültürlenen hücrelerin ise rastgele yönlendirildiğini göstermiştir (Şekil 8A,B). Kesme stimülasyonundan sonra platform, standart protokolleri kullanarak RNA'yı çıkarmak için açık kuyu formatına yeniden yapılandırıldı. Sonuçlar, hücrelerin kayma stresine maruz kalmasının, sağlıklı kan damarlarında anti-trombotik ve ateroprotektif işlevler gibi kritik rollere hizmet eden Kruppel benzeri faktör 2 (KLF2) ve endotelyal nitrik oksit sentazın (eNOS) yukarı regülasyonu ile sonuçlandığını göstermiştir23,24 (Şekil 8C).

figure-results-1
Şekil 1: İn vitro vasküler bariyer modellerinin karşılaştırılması. (A) konvansiyonel Transwell benzeri kesici uçların ve (B) açık kuyu m-μSiM'nin şematik gösterimi. Birleştirilmiş bir HUVEC tek katmanının parlak alan görüntüleri, rayla oyulmuş bir membran ile ultra ince bir nanomembran arasındaki parlak alan görüntüleme kalitesindeki farkı vurgular. Ölçek çubukları = 100 μm. Mansouri ve ark.16'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Karar verme akış şeması. Deneysel ihtiyaçlara ve aşağı akış analizi tercihlerine dayalı bir akış şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Platformun deneysel iş akışı. (A) Hücreleri doğrudan gözenekli membran üzerine yerleştirmek için, çekirdek modülün kuyucuğuna çıkarılabilir bir desen şablonu yerleştirilir (iç kısım desenli hücreleri gösterir, sarı çizgiler mikrokanal sınırlarını gösterir). (B) Şablon, statik hücre kültürü için cihazda tutulabilir veya çıkarılabilir. (C) Platformu mikroakışkan modda yeniden yapılandırmak için şablon, akış modülü ile değiştirilir. Manyetik sızdırmazlık mekanizması nedeniyle, konfigürasyon tersine çevrilebilir; Muhafazalar ve akış modülü, açık kuyu moduna geçmek için çıkarılabilir. Ölçek çubuğu = 200 μm. Mansouri ve ark.16'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Kalıpların şematik gösterimi. (A) Şablon kalıbı. (B) Lazerle kesilmiş akrilik levha. (C) şablon kalıbının birleştirilmiş görünümü. (D) Akış modülü kalıbı. (E) Lazerle kesilmiş akrilik levha. (F) Akış modülü kalıbının birleştirilmiş görünümü. Üçgen şeklindeki özellikler, akrilik levhaların kalıplara tutturulmasını kolaylaştırmak için hizalama işaretleridir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Yonca şeklindeki akış modülünün şeması. (A) Akış modülü ile membran çipi arasındaki temas arayüzü. Sıvı akışı için giriş ve çıkış portları pembe renkle gösterilmiştir. (B) PDMS akış modülünün 3D görüntüsü. Mansouri ve ark.16'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: Cihazın yeniden yapılandırılması için manyetik düzenek. (A) Cihazın mikroakışkan modda yeniden yapılandırılması için bileşenlerin şematik gösterimi. Zıt kutuplara sahip gömülü mıknatıslar, sızdırmazlık için çekim kuvveti oluşturur. (B) Vasküler kanalı pembe ve doku bölmesini yeşil renkte gösteren yeniden yapılandırılmış cihazın kesit görünümü. Mansouri ve ark.16'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: Akış devresinin birleştirilmiş görünümü. Devre, bir peristaltik pompa, hücre ortamı sağlamak ve dalgalanmaları sönümlemek için iki rezervuar, boru ve bileşenleri yerinde tutmak için bir akrilik aşamadan oluşur. Mansouri ve ark.16'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8: Açık kuyu ve mikroakışkan modlarında kültürlenen HUVEC'lerin karşılaştırılması. Hücreler, birleşik bir tek tabaka oluşturmak için 24 saat boyunca açık kuyuda tohumlandı ve kültürlendi. Sonraki 24 saatlik süre boyunca, bir cihaz seti mikroakışkan moda yeniden yapılandırıldı. (A) Akış yönü boyunca hizalanmış akış altında (10.7 dynes.cm-2 kesme gerilimi) kültürlenen hücreler (iç kısımda sırasıyla yeşil ve mavi renklerde hücrelerin aktin ve çekirdekleri gösterilir). (B) Açık kuyu formatında akış olmadan kültürlenen hücreler hizalama göstermedi. Radar grafiklerindeki çubukların uzunluğu, karşılık gelen yöndeki hücre sayısını gösterir. (C) Akış altında kültürlenen hücreler, akışsız duruma kıyasla KLF2 ve eNOS genlerinin daha yüksek yukarı regülasyonunu gösterdi (**p < 0.01, n = 3, ortalama ± SD). Ölçek çubukları = 100 μm. Mansouri ve ark.16'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 1: Farklı akış hızlarında nanomembran yüzeyindeki kayma gerilmesi. Bu tablo, çeşitli akış hızlarında nanomembran yüzeyindeki kayma gerilmesi değerleri hakkında bilgi sağlar. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 1: Şablon kalıbının CAD modeli. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 2: Şablon kalıbı için lazer kesim boşluklarının CAD modeli. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 3: Akış modülünün CAD modeli. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 4: Akış modülü kalıbı için lazer kesim boşluklarının CAD modeli. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 5: Üst gövdenin CAD modeli. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 6: Alt gövdenin CAD modeli. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 7: Akrilik aşamanın CAD modeli. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün amacı, akış yeteneklerini ultra ince bir nanomembran içeren bir açık kuyu platformuna dahil etmek için pratik bir yöntem geliştirmektir. Bu tasarımda, deneyler sırasında açık kuyu ve akışkan modları arasında geçişe izin veren ve her iki yaklaşımın avantajlarını birleştiren manyetik bir kilitleme yaklaşımı kullanılmıştır. Geleneksel kalıcı olarak bağlı platformların aksine, manyetik kilitleme, platformun deneysel iş akışı 16,25,26,27 sırasında uygun noktalarda sökülmesine izin verir. Bu platformda, hücreler tohumlanır ve bariyer tanıdık açık kuyu formatında kurulur ve daha sonra sistem, sadece bir akış modülü eklenerek ve manyetik olarak kapatılarak akışkan bir moda yeniden yapılandırılır. Bu yeniden yapılandırma iki temel fayda sunar: birincisi, hücre tek tabakasını sıvı kaynaklı kesme gerilimine maruz bırakarak fizyolojik koşulların simülasyonunu sağlar; ikincisi, akış koşulları altında bağışıklık hücreleri gibi ikincil bileşenlerin girişini kolaylaştırır16. Manyetik kilitleme özelliği, aletsiz bir montaj yöntemi sunarak açık kuyu ve mikroakışkan formatlar arasında isteğe bağlı geçiş sağlar. Sonuç olarak, immünositokimya ve RNA ekstraksiyonu gibi aşağı akış analizleri, standart teknikler kullanılarak veya istenildiği gibi mikroakışkan teknikler kullanılarak bilinen açık kuyu formatında gerçekleştirilebilir16.

Manyetik sızdırmazlık, platformun yeniden yapılandırılabilirliğini sağlayan tasarımın kritik bir parametresidir ve bu nedenle, doğru çalışması için birkaç husus gereklidir: (1) Alt muhafazanın yüksekliği, modülü düzgün bir şekilde kapatmak için çekirdek modülün yüksekliğine (tolerans: ±0,1 mm) uygun olmalıdır. (2) Akış modülünün yüksekliği, çekirdek modülün kuyusundan (0-0.1 mm) biraz daha uzun olmalıdır. (3) Bu tasarım, çok çeşitli malzemelere uyarlanabilir ve akış modülünün elastomerik malzemelerden yapılmasını zorunlu kılmaz. Önemli unsur, güvenilir bir sızdırmazlık sağlamak için akış modülü ile membran çipi arasındaki arayüze yumuşak, conta benzeri bir malzeme eklemektir. (4) Presleme mıknatısları için muhafazalardaki lazerle kesilmiş boşlukların çapı, kullanılan aletegöre optimize edilmelidir 28. Boşluk çapı çok büyükse mıknatıslar ayrılabilir ve akış sızıntısına neden olabilir veya boşluklar çok küçükse mıknatıs yerleştirme sırasında yuvalar çatlayabilir. Yukarıda belirtilen hususları izleyerek, burada tanıtılan manyetik montaj yaklaşımı, diğer açık kuyu sistemlerini mikroakışkan modda yeniden yapılandırmak için uygulanabilir.

Yeniden yapılandırma yeteneğine sahip olmak için, hücrelerin membran yüzeyine hassas bir şekilde konumlandırılmasını sağlayan bir desen şablonu kullanmak gerekir. Şablon, akış modülünün yerleştirilmesi üzerine zarar görebilecek gözenekli kültür bölgesinin dışında (yani silikon destek bölgesinde) hiçbir hücrenin olmamasını sağlar. Bu özellik, ko-kültür modellerinde özellikle önemli hale gelir, çünkü yanlışlıkla istenmeyen yerlere ekilen hücreler, bariyer dokusunun gelişimine aktif olarak katılamazlar. Bununla birlikte, bu yanlış yerleştirilmiş hücreler genellikle lizis işlemi sırasında alınır ve zar20 boyunca hücreler arasındaki etkileşimleri araştıran gen ekspresyonu çalışmalarında potansiyel olarak önyargıya neden olabilir. Şablon kullanılarak açık kuyulu hücre tohumlama, geleneksel mikroakışkan platformlarındoğasında bulunan akış yolu boyunca hücre kayıplarını azaltarak tohumlama verimliliğini artırır 4,16. Bu platform aynı zamanda birden fazla hücre tipini ve ECM malzemelerini 15,16,17 birleştirebilir. Örneğin, zarın üstünde bir endotel kurulurken, doku bölmesini taklit etmek için cihazın alt kanalına hücre yüklü bir hidrojel enjekte edilebilir.

Manyetik modüller ve bileşenler yeniden kullanılabilse de, muhafazadaki mıknatısların gevşemesi ve sızdırmazlık kuvvetinin azalması nedeniyle çeşitli kullanımlarda etkili sızdırmazlığın korunması bir sorun olabilir. Bu sorun, tasarımlar oluşturulduktan sonra her deney için yeni lamine modüller veya enjeksiyon kalıplama veya 3D baskı teknikleri kullanılarak seri üretim bileşenleri yapılarak azaltılabilir. Bu protokolde açıklanan yöntemde, akış modülü manuel olarak çekirdek modüle yerleştirilir ve sistemin çoğullama ve otomasyon yeteneği sınırlıdır. Deneysel verimi artırmak için, akış modülü ve üst muhafaza, dahili yönlendirme kanalları ve aynı anda birkaç modülü paralel olarak perfüze eden standartlaştırılmış boru bağlantıları içeren tek bir işlevsel modüle entegre edilebilir.

Açık kuyu çekirdek modülünün bileşenleri seri üretilir ve ticari olarak temin edilebilir. Akış modülü, muhafazalar ve desen şablonu gibi sistemin diğer bileşenleri de büyük ölçekte üretilebilir. Ayrıca, platformun yeniden yapılandırılabilirliği, gerçek zamanlı stimülasyon ve ölçümler için sensörlerin ve aktüatörlerin (örneğin, transendotelyal elektrik direnç modülü, elektroporasyon modülü) eklenmesine izin verir. Genel olarak, bu platform, mühendislik laboratuvarları dışında yaygın kullanımı desteklemeye yardımcı olmak için geleneksel ve mikroakışkan yaklaşımları birleştirir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.L.M., SiMPore, Inc.'in kurucu ortağıdır ve şirkette öz sermaye payına sahiptir. SiMPore, bu çalışmada kullanılan membranlar da dahil olmak üzere ultra ince silikon bazlı teknolojileri ticarileştiriyor.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 ve NSF hibe CBET 2150798 altında finanse edildi. Yazarlar, alüminyum kalıp imalatı için RIT Machine Shop'a teşekkür ediyor. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmeyebilir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,5 x 0,86 Mikro Akış tüpleriLanger InstrumentsWX10-14 & DG Serisi
1 mm Tek Kullanımlık Biyopsi Punchları, Integra MiltexVWR95039-090
1x PBS 7.4 pHThermoFisher Scientific10010023
20 GAUGE IT SERİSİ DAĞITIM İPUCUJensen GlobalJG20-1.5X
21 gauge NT PREMIUM SERİSİ AÇILI DAĞITIM İPUCUJensen GlobalJG21-1.0HPX-90
3M 467 MP Basınca duyarlı yapıştırıcı (PSA)DigiKey3M9726-ND
3M 468 MP Basınca duyarlı yapıştırıcı (PSA)DigiKey3M9720-ND
AlexaFluor 488 konjuge falloidinThermoFisher ScientificA12379 
Uygulamalı Biyosistemler  TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444556
Sığır Serumu Albümini (BSA), Fraksiyon V, %98, Reaktif sınıfı, Alfa Aesar, Boyut = 10 gVWRAAJ64100-09
Şeffaf Çizilmeye ve UV ışınlarına dayanıklı dökme akrilik levhaMcMaster-Carr8560K17112" x 12" x 1/16"
Şeffaf Çizilmeye ve UV ışınlarına dayanıklı dökme akrilik levhaMcMaster-Carr8589K3112" x 12" x 3/32"
Şeffaf Çizilmeye ve UV ışınlarına dayanıklı dökme akrilik levhaMcMaster-Carr8560K19112" x 12" x 7.64"
Corning Fibronektin, İnsan, 1 mgCorning47743-728
Kapak Camları, Globe Scientific, U x G = 24 x 60 mmVWR10118-677
DOW SYLGARD 184 SİLİKON ENKAPSÜLANT ŞEFFAF 0.5 KG KITEllsworth Yapıştırıcılar4019862
EGM-2 Endotel Hücre Büyüme Ortamı-2 BulletKitLonzaCC-3162
Fikstür A1 & A2SiMPore A.Ş.NA
Fikstür B1 & B2SiMPore A.Ş.RNase
Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon Kiti
Thermo Fisher ScientificH3570
Nikel kaplı mıknatıslar (4,75 mm çap, 0,34 kg çekme kuvveti)K& J MagneticsD313/16" çap  x 1/16" kalınlık
Paraformaldehit, %4 w/v aq. soln., metanol içermez, Alfa AesarFisher Scientificaa47392-9M
Peristaltik PompaLanger InstrumentsBQ50-1J-A
Photoresist SU-8 geliştirici çözümüFisher ScientificNC9901158
PVDF şırınga filtreleriPerkinElmer2542913
Silikon gofretÜniversite gofret, ABD1196
SU-8 3050Fisher ScientificNC0702369
Hedef gen: eNOS (Hs01574659_m1)ThermoFisher Scientific4331182
Hedef gen: GAPDH (Hs02786624_g1)ThermoFisher Scientific4331182
Hedef gen: KLF2 (Hs00360439_g1)ThermoFisher Scientific4331182
Termo Bilimsel  Pierce 20x PBS Tween 20Thermo Fisher Scientific28352
Taşıma Tüpü Numune Beyaz kapaklar, 5 mL, SterilVWR100500-422
TRI-reaktifThermoFisher ScientificAM9738
Ultra İnce Nano Gözenekli Membran ÇipSiMPore Inc.NPSN100-1LTasarım, tüm SiMPore membranları
uSiM bileşeni 1SiMPore Inc.NA
uSiM bileşeni 2SiMPore Inc.Na
İnhibitörü Thermo Fisher Scientific 4374966 ile NA İnsan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC)ThermoFisher Scientific C0035C CANLI/ÖLÜ Hücre Görüntüleme Kiti (488/570)Thermo Fisher Scientific R37601 Moleküler Problar Hoechst 33342, Trihidroklorür, Trihidrat ile uyumludur.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Claesson-Welsh, L., Dejana, E., McDonald, D. M. Permeability of the Endothelial Barrier: Identifying and Reconciling Controversies. Trends in Molecular Medicine. 27 (4), 314-331 (2021).
  2. Vera, D., et al. Engineering tissue barrier models on hydrogel microfluidic platforms. ACS Applied Materials & Interfaces. 13 (12), 13920-13933 (2021).
  3. Wang, Y. I., Abaci, H. E., Shuler, M. L. Microfluidic blood-brain barrier model provides in vivo-like barrier properties for drug permeability screening. Biotechnology and Bioengineering. 114 (1), 184-194 (2017).
  4. Sakolish, C. M., Esch, M. B., Hickman, J. J., Shuler, M. L., Mahler, G. J. Modeling barrier tissues in vitro: methods, achievements, and challenges. eBioMedicine. 5, 30-39 (2016).
  5. Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
  6. Tan, K., et al. A high-throughput microfluidic microphysiological system (PREDICT-96) to recapitulate hepatocyte function in dynamic, re-circulating flow conditions. Lab on a Chip. 19 (9), 1556-1566 (2019).
  7. Ayuso, J. M., Virumbrales-Muñoz, M., Lang, J. M., Beebe, D. J. A role for microfluidic systems in precision medicine. Nature Communications. 13 (1), 3086(2022).
  8. Katt, M. E., Shusta, E. V. In vitro models of the blood-brain barrier: building in physiological complexity. Current Opinion in Chemical Engineering. 30, 42-52 (2020).
  9. Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews Genetics. 23 (8), 467-491 (2022).
  10. Duncombe, T. A., Tentori, A. M., Herr, A. E. Microfluidics: reframing biological enquiry. Nature reviews. Molecular cell biology. 16 (9), 554-567 (2015).
  11. Williams, M. J., et al. A low-cost, rapidly integrated debubbler (rid) module for microfluidic cell culture applications. Micromachines. 10 (6), 360(2019).
  12. Ahmed, A., et al. Engineering fiber anisotropy within natural collagen hydrogels. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 320 (6), C1112-C1124 (2021).
  13. Ahmed, A., et al. Microengineered 3D collagen gels with independently tunable fiber anisotropy and directionality. Advanced Materials Technologies. 6 (4), 2001186(2021).
  14. Łach, A., Wnuk, A., Wójtowicz, A. K. Experimental models to study the functions of the blood-brain barrier. Bioengineering. 10 (5), 519(2023).
  15. McCloskey, M. C., et al. The Modular µSiM: A mass produced, rapidly assembled, and reconfigurable platform for the study of barrier tissue models in vitro. Advanced Healthcare Materials. 11 (18), 2200804(2022).
  16. Mansouri, M., et al. The modular µsim reconfigured: integration of microfluidic capabilities to study in vitro barrier tissue models under flow. Advanced Healthcare Materials. 11 (21), 2200802(2022).
  17. Hudecz, D., et al. Modelling a human blood-brain barrier co-culture using an ultrathin silicon nitride membrane-based microfluidic device. International Journal of Molecular Sciences. 24 (6), 5624(2023).
  18. Joshi, I. M., et al. Microengineering 3D Collagen Matrices with Tumor-Mimetic Gradients in Fiber Alignment. bioRxiv. , (2023).
  19. Hsu, M. C., et al. A miniaturized 3D printed pressure regulator (µPR) for microfluidic cell culture applications. Scientific Reports. 12 (1), 10769(2022).
  20. Rogers, M. T., et al. A high-throughput microfluidic bilayer co-culture platform to study endothelial-pericyte interactions. Scientific reports. 11 (1), 12225(2021).
  21. Wettschureck, N., Strilic, B., Offermanns, S. Passing the vascular barrier: endothelial signaling processes controlling extravasation. Physiological Reviews. 99 (3), 1467-1525 (2019).
  22. Wang, Y. I., Shuler, M. L. UniChip enables long-term recirculating unidirectional perfusion with gravity-driven flow for microphysiological systems. Lab on a Chip. 18 (17), 2563-2574 (2018).
  23. Nayak, L., Lin, Z., Jain, M. K. 34;Go with the flow": how Krüppel-like factor 2 regulates the vasoprotective effects of shear stress. Antioxidants & Redox Signaling. 15 (5), 1449-1461 (2011).
  24. Satoh, T., et al. A pneumatic pressure-driven multi-throughput microfluidic circulation culture system. Lab on a chip. 16 (12), 2339-2348 (2016).
  25. Abhyankar, V. V., Wu, M., Koh, C. Y., Hatch, A. V. A Reversibly sealed, easy access, modular (seam) microfluidic architecture to establish in vitro tissue interfaces. PLOS ONE. 11 (5), e0156341(2016).
  26. Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3D collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), 035019(2022).
  27. Hasan, M. R., et al. One-step fabrication of flexible nanotextured PDMS as a substrate for selective cell capture. Biomedical Physics & Engineering Express. 4 (2), 025015(2018).
  28. Ahmed, A., et al. Microengineering 3D collagen hydrogels with long-range fiber alignment. Journal of Visualized Experiments. 187, e64457(2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microphysiological SystemsBarrier Tissue ModelsOpen Well PlatformFlow EnhancementReconfigurable Cell CultureEndothelial Cell MonolayerMagnetic AssemblyMicrofluidic ModeShear Stress ExposureMembrane Based Culture

Related Articles