Yöntem makalesi

Drosophila Larva Beyin ve Hücre Hattından Poli A Kuyruk Uzunluğunun Ölçülmesi

1.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66116

⸱

12 Ocak 2024

 , 
1Department of Biology, University of Nevada, Reno

Bu makalede

Özet

Protokol, diğer türlerden dokulara veya hücre tiplerine kolayca uyarlanabilen, Drosophila sinir sisteminden ilgilenilen genin poli(A) uzunluğunu ölçmek için verimli ve güvenilir bir yöntemi açıklar.

Özet

Poliadenilasyon, mRNA moleküllerinin 3' ucuna poli(A) kuyrukları ekleyen çok önemli bir transkripsiyon sonrası modifikasyondur. Poli(A) kuyruğunun uzunluğu, hücresel süreçler tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir. mRNA poliadenilasyonunun düzensizliği, anormal gen ekspresyonu ve kanser, nörolojik bozukluklar ve gelişimsel anormallikler dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Bu nedenle, poliadenilasyonun dinamiklerini anlamak, mRNA işleme ve transkripsiyon sonrası gen regülasyonunun karmaşıklıklarını çözmek için hayati önem taşır.

Bu makale, Drosophila larva beyinlerinden ve Drosophila Schneider S2 hücrelerinden izole edilen RNA örneklerinde poli(A) kuyruk uzunluklarını ölçmek için bir yöntem sunmaktadır. Maya poli(A) polimeraz kullanılarak mRNA'nın 3' ucuna G/I kalıntılarının enzimatik eklenmesini içeren guanozin/inosin (G/I) kuyruk yaklaşımını kullandık. Bu modifikasyon, RNA'nın 3' ucunu enzimatik bozulmadan korur. Korunan tam uzunluktaki poli(A) kuyruklar daha sonra evrensel bir antisens astar kullanılarak ters kopyalanır. Daha sonra, PCR amplifikasyonu, ters transkripsiyon için kullanılan evrensel bir dizi oligo ile birlikte ilgilenilen geni hedefleyen gene özgü bir oligo kullanılarak gerçekleştirilir.

Bu, ilgilenilen genin poli(A) kuyruklarını kapsayan PCR ürünleri üretir. Poliadenilasyon tek tip bir modifikasyon olmadığından ve farklı uzunluklarda kuyruklarla sonuçlandığından, PCR ürünleri bir dizi boyut gösterir ve bu da agaroz jel üzerinde bir leke desenine yol açar. Son olarak, PCR ürünleri yüksek çözünürlüklü kapiler jel elektroforezine tabi tutulur, ardından poli(A) PCR ürünlerinin ve gene özgü PCR ürününün boyutları kullanılarak miktar tayini yapılır. Bu teknik, poli(A) kuyruk uzunluklarını analiz etmek için basit ve güvenilir bir araç sunarak, mRNA regülasyonunu yöneten karmaşık mekanizmalar hakkında daha derin bilgiler edinmemizi sağlar.

Giriş

Çoğu ökaryotik mRNA, kanonik poli(A) polimerazlar tarafından şablonlanmamış adenosinlerin eklenmesiyle çekirdekteki 3' terminallerinde transkripsiyon sonrası poliadenillenir. Bozulmamış bir poli(A) kuyruğu, mRNA'nın yaşam döngüsü boyunca çok önemlidir, çünkü mRNA nükleer ihracatı1 için gereklidir, translasyon verimliliğiniartırmak için poli(A) bağlayıcı proteinlerle etkileşimi kolaylaştırır 2 ve bozunmayakarşı direnç kazandırır 3. Bazı durumlarda, poli(A) kuyruğu, kanonik olmayan poli(A) polimerazlar4 tarafından kolaylaştırılan sitoplazmada da uzamaya uğrayabilir. Sitoplazmada, poli (A) kuyruk uzunluğu dinamik olarak değişir ve mRNA molekülünün ömrünü etkiler. Kuyruk uzunluğunu 5,6,7 modüle etmek için çok sayıda polimeraz ve deadenilaz bilinmektedir. Örneğin, poli(A) kuyruklarının kısalması translasyonel baskılama ile ilişkilidir, oysa poli(A) kuyruklarının uzatılması translasyonu artırır 8,9.

Biriken genomik çalışmalar, ökaryotik biyolojinin çeşitli yönlerinde poli(A) kuyruk uzunluğunun temel önemini göstermiştir. Bu, germ hücresi gelişimi, erken embriyonik gelişim, öğrenme ve hafıza için nöronal sinaptik plastisite ve inflamatuar yanıttaki rolleri içerir10. Poli(A) kuyruk uzunluklarını ölçmek için geliştirilmiş çok sayıda yöntem ve tahlil vardır. Örneğin, RNase H/oligo(dT) testi, poli(A) kuyruk uzunluğu 11,12'yi incelemek için oligo(dT) varlığında veya yokluğunda RNase H'den yararlanır. Poli(A) kuyruğunu incelemek için diğer yöntemler arasında, cDNA uçlarının hızlı amplifikasyonu poli(A) testi (RACE-PAT)12,13 ve ligaz aracılı poli(A) testi (LM-PAT)14 gibi 3' uçların PCR amplifikasyonu yer alır. PAT tahlilinin diğer modifikasyonları arasında ePAT15 ve sPAT16 bulunur. Enzimatik G-tailing17,18 veya 3' ucunun G/I-tailing'i, PAT testinin diğer varyasyonlarıdır. Bu tekniklerin daha fazla modifikasyonu, yüksek çözünürlüklü poli(A) testi (Hire-PAT)19 olarak adlandırılan yüksek çözünürlüklü analiz için kılcal jel elektroforezi ile birlikte floresan etiketli primerlerin kullanımını içerir. Bu PCR güdümlü tahliller, hızlı ve yüksek hassasiyetli poli(A) uzunluk kantitasyonuna izin verir.

Yeni nesil dizilemenin geliştirilmesiyle birlikte, PAL-seq20 ve TAIL-seq21 gibi yüksek verimli bir dizileme yöntemi, transkriptom çapında bir ölçekte poliadenilasyon analizlerine izin verir. Bununla birlikte, bu yöntemler yalnızca 36-51 nükleotidin kısa dizileme okumalarını sağlar. Bu nedenle, FLAM-Seq22 , tam uzunlukta mRNA'nın küresel kuyruk uzunluğu profillemesi için geliştirilmiştir ve uzun okumalar sağlar. Nanopor teknolojisi23 , poli(A) kuyruk uzunluğu tahminleri için PCR'den bağımsız, doğrudan RNA veya doğrudan cDNA dizilimi sağlar. Ancak, bu yüksek verimli yöntemler sınırsız değildir. Büyük miktarlarda başlangıç malzemesi gerektirirler, pahalıdırlar ve zaman alıcıdırlar. Ayrıca, nadir transkriptleri analiz etmek, yüksek verimli yöntemlerle son derece zor olabilir ve düşük verimli PCR tabanlı yöntemler, pilot deneyler ve diğer yöntemlerin doğrulanması için az sayıda transkriptin analiz edilmesi gerektiğinde hala bir avantaj sağlar.

Yakın zamanda, Dscam1 mRNA'larının Drosophila'da kısa poli(A) kuyrukları içerdiğini gösterdik, bu da sitoplazmik poli(A)-bağlayıcı proteinin Dscam1 3'UTR üzerinde G/I kuyruk yöntemi24 kullanılarak kanonik olmayan bir şekilde bağlanmasını gerektirir. Burada, Drosophila sinir sistemi ve Drosophila S2 hücrelerinden mRNA'ların poli(A) uzunluğunun doku hazırlığı ve ölçülmesi için kolaylaştırılmış bir prosedür sunuyoruz.

Protokol

1. Drosophila larvalarının yetiştirilmesi ve seçilmesi

  1. Nemlendirilmiş bir inkübatörde 25 ° C'de standart sinek yemi ortamında sinek suşunu (w1118, vahşi tip) koruyun / kültürleyin.
  2. Yumurtlamadan 72 saat sonra 10 dolaşan 3. instar larvasını seçin.
  3. Larvaları 35 mm'lik boş bir Petri kabına koyun ve larvaları forseps kullanarak musluk suyu içeren yeni kaba aktararak nazikçe yıkayın. Kalan yiyecekleri çıkarmak için bunu 2 kez yapın.

2. Drosophila larvalarından beyin izolasyonu (Şekil 1)

figure-protocol-1
Şekil 1: Drosophila larva beyninin 3. instar gezinme evresinden diseksiyonu. (A) Drosophila larvalarının şematik çizimleri. (B-G) Larva diseksiyonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Buz gibi soğuk PBS içeren bir diseksiyon kabına 10 larva yerleştirin.
  2. Larva dorsal tarafını yukarı yerleştirin (uzunluğu boyunca uzanan trakeal tüplerle tanımlanır) ve her bir ucunu tabağın dibine sabitleyin, ardından arka uçta vücut duvarında küçük bir kesi yapın.
  3. Mikrodiseksiyon makası kullanarak vücut duvarını dorsal orta hat boyunca ön uca doğru kesin.
  4. Beyni açığa çıkarmak için tabakta PBS'li bir Pasteur pipeti 3x kullanarak larvaların içini kısaca yıkayın.
  5. Forseps kullanarak beyni bulun ve kaldırın ve mikrodiseksiyon makası kullanarak dikkatlice izole edin.
  6. Diseke beyinleri buz üzerinde buz gibi soğuk PBS ile doldurulmuş 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın; Tüm larva beyinlerini toplayın. Bölüm 4'te açıklandığı gibi bir RNA mikro hazırlık kiti kullanarak RNA ekstraksiyonuna devam edin.
    NOT: Doku hasarını ve RNA bozulmasını önlemek için 15 dakika içinde 10 larva diseksiyonu yapın.

3. Drosophila S2 Schneider hücreleri

  1. Drosophila Schneider'in ortamındaki Drosophila S2 hücrelerini, nemlendirilmiş bir inkübatörde 25 ° C'de% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş olarak, minimum% 90 canlılık ile 8 × 106 ila 10 ×10 6 hücre / mL yoğunluğa kadar büyütün.
  2. 50 mL'lik steril konik bir tüpte, 25 ° C'ye önceden ısıtılmış FBS ile desteklenmiş Schneider'in Drosophila ortamı ile hücreleri 2,5 × 106 hücre / mL'ye seyreltin.
  3. 8 mL hücre süspansiyonunu (20 × 106 hücre) 100 mm'lik bir kültür plakasına aktarın ve 12 mL'ye (1. gün) getirmek için 4 mL ortam ekleyin.
  4. Kültürlenmiş hücreleri nemlendirilmiş bir inkübatörde 25 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Hücreler 12-16 saat sonra (2. gün) plakaya gevşek bir şekilde yapışır.
  5. Hücreleri uygun DNA plazmitleri ile transfekte edin24.
  6. Nemlendirilmiş bir inkübatörde 48 saat inkübe edin.
  7. İnkübasyondan sonra, hafif pipetleme ile 5 mL buz gibi PBS ekleyerek hücreleri toplayın (4. gün).
  8. Hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
  9. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüj ederek hücreleri peletleyin.
  10. Hücreleri buz gibi PBS ile nazikçe pipetleyerek 2 kez durulayın ve hücreleri 4 °C'de 5 dakika boyunca 1.000 × g'da santrifüjleyerek toplayın.
  11. Bir RNA miniprep kiti kullanarak RNA ekstraksiyonu gerçekleştirin.
    NOT: Steril bir laminer akış başlığı içinde aşağıdaki adımları gerçekleştirin.

4. Drosophila larvaları beyninden ve S2 hücrelerinden toplam RNA ekstraksiyonu

  1. Larva beyni: PBS'yi kısa santrifüjleme ile çıkarın (5.000 × g'da 8 sn kısa sıkma).
  2. 600 μL RNA lizis tamponu ekleyin ve plastik bir tokmak ile 10x homojenize edin. Tam lizizi sağlamak için tüpü stereo mikroskop altında görsel olarak inceleyin.
  3. Doku kalıntılarını gidermek için 1.000 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Temizlenmiş süpernatanı nükleaz içermeyen bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  4. Üreticinin talimatlarına göre bir RNA mikro hazırlık kiti kullanarak RNA'yı izole edin.
    NOT: Örneklerde az miktarda RNA bulunması nedeniyle larva beyin örnekleri için bir RNA mikro hazırlık kitinin kullanılması önemlidir.
  5. S2 hücreleri: PBS'yi çıkarın ve RNA'yı üreticinin talimatlarına göre izole edin.
  6. Spektrofotometri ve agaroz jel elektroforezi ile RNA verimini ve kalitesini ölçün.
    1. Ekstrakte edilen RNA'nın optik yoğunluğunu sırasıyla A260 nm ve A280 nm'de ölçerek ekstrakte edilen RNA'nın saflığını ve miktarını belirleyin. Aşağı akış uygulamaları için A260 nm/A280 nm oranının ≥2.0 ve RNA konsantrasyonunun >350 ng/μL olduğundan emin olun.
      NOT: 10 Drosophila larva beyninden tipik bir RNA verimi ~500-800 ng/μL veya 5 μL'de 2.5-4 μg'dir. S2 hücreleri için verim ~2-3 μg/μL'dir (15 μL'de 15-30 μg). İzole RNA, uzun süreli depolama için -80 °C'de saklanabilir.

5. RNA jelinin hazırlanması ve elektroforez

  1. % 1.5 Denatüre RNA jeli (100 mL)
    NOT: Formaldehit, ciltle teması ve buharların solunması yoluyla toksiktir; Kimyasal bir davlumbazda tutun.
    1. Üç agaroz tableti (1.5 g) 82 mL MOPS tamponunda (Ek Dosya 1) tabletler ince parçacıklar oluşturmak üzere tamamen parçalanana kadar çözün.
    2. Agaroz bulamacını, çözelti berraklaşana ve tüm parçacıklar tamamen çözülene kadar bir mikrodalgada ısıtın.
    3. Çözeltiyi ~60 °C'ye soğutun.
    4. 18 mL 7 formaldehit ekleyin, ardından hafifçe döndürerek karıştırın. Çözeltiyi döküm tepsisine dökün ve çeker ocakta katılaşmasına izin verin.
  2. RNA numunesi hazırlama ve elektroforez
    1. RNA örneğini 200 ng'ye (5 μL'de) seyreltin ve 5 μL 2x RNA yükleme boyası ekleyin.
    2. Numuneleri kuru bir banyoda 5 dakika boyunca 70 °C'de ısıtın.
    3. İlk şeride 2 μL RNA merdiveni ve bitişik şeride 10 μL numune yükleyin.
    4. 5 x 6 cm'lik bir jel için 60 dakika boyunca 100 V'ta MOPS tamponunda elektroforez gerçekleştirin.
      NOT: Amplikon boyutlarına bağlı olarak elektroforez koşullarını ayarlayın.
    5. Jeli bir UV aydınlatıcı üzerinde görselleştirin.
      NOT: Tek bir bant ~600 nükleotid boyutunun varlığı, bozulmamış RNA preparatını gösterir (bkz. Şekil 2A).

6. Poli (A) kuyruk uzunluğu ölçümü

figure-protocol-2
Şekil 2: RNA numunesi hazırlama ve poli(A)-kuyruk testi. (A) RNA jel görüntüleri, %1.5'lik bir formaldehit agaroz jeli üzerinde Drosophila larva beyninden (solda) ve S2 hücrelerinden (sağda) toplam RNA'yı gösterir. Tek sarmallı RNA merdiven boyutları, M şeridindeki nükleotidlerde gösterilir. rRNA'dan gelen ~600 nt'de büyük bir RNA bantlamasına dikkat edin. (B) Poli(A)-kuyruk tahlilinin şemaları. Kısaltma: G/I = guanozin/inosin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. GI kuyruğu (Şekil 2B)
    1. Reaktifleri buz üzerinde tutarak aşağıdaki karışımı (20 μL) hazırlayın: 14 μL'ye kadar toplam RNA örneği (1 μg), 4 μL 5x Kuyruk tampon karışımı ve 2 μL 10x Kuyruk enzim karışımı.
    2. Bir termocycler'da 37 °C'de 60 dakika inkübe edin.
    3. 1.5 μL kuyruk durdurma çözeltisi ekleyin; 2 dakika buz üzerinde tutun.
      NOT: Ters transkripsiyona devam edin veya GI kuyruklu RNA örneklerini ters transkripsiyona geçmeye hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.
  2. Ters transkripsiyon ve PCR amplifikasyonu
    1. Karışımı hazırlayarak ve Ek Dosya 1'de açıklanan koşullar altında inkübe ederek cDNA'yı sentezleyin.
    2. cDNA örneklerini seyreltin ve Ek Dosya 1'de belirtildiği gibi DNA'yı çoğaltmak için PCR gerçekleştirin.

7. Agaroz jel elektroforezi ile PCR ürün analizi

  1. Kalite kontrol için 45 dakika boyunca 100 V'ta elektroforez ile %2.5'lik bir agaroz jel üzerinde adım 6.2.2'deki PCR ürünlerinin küçük bir kısmını (2-5 μL) analiz edin.
  2. Jel ekstrakte edilen PCR bantlarını sıralayarak gene özgü ve kuyruğa özgü reaksiyonlar için PCR'nin özgüllüğünü doğrulayın.

8. Kılcal elektroforez

  1. Yüksek hassasiyetli bir DNA kitine sahip biyoanalizörü kullanarak gen spesifik ve poli(A) spesifik PCR'den 1 μL PCR ürünleri (0,5-5 ng/μL) üzerinde yüksek çözünürlüklü jel elektroforezi gerçekleştirin. Başarılı bir koşuyu gösteren iyi çözülmüş zirveleri arayın.

9. Veri analizi: poli(A) kuyruk uzunluğu ölçümü (Şekil 3)

figure-protocol-3
Şekil 3: Poli(A) kuyruk uzunluğu ve tepe değeri ölçümü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Verilere erişme
    1. Verilere erişmek için yazılımda xad dosyasını açın.
    2. Ağaç görünümü panelinde örnek adını veya merdiveni seçin.
      NOT: Bu, seçilen numuneler için sonucu elektroferogramlar veya jel benzeri görüntüler olarak gösterecektir. Alt işaretleyici 35 baz çifti (bp) ve üst işaretleyici 10.380 bp, merdiven verilerini (50-7.000 bp) numune kuyularından gelen verilerle hizalamak için kullanılan dahili standartlardır.
    3. Ayrıntıları görüntülemek için elektroferogramları ve jel benzeri görüntüleri yakınlaştırın ve uzaklaştırın.
  2. Tepe ve smear analizinin yapılması
    1. En yüksek boyutları elde etmek için, seçilen bir numunenin elektroferogramını açın.
    2. Elektroferograma sağ tıklayın ve yatay çizgiyi sürükleyerek tepe noktalarını manuel olarak seçmek için manuel entegrasyonu seçin.
    3. Tepe tablosundaki tepe değerlerine dikkat edin. En büyük Tepe Yüksekliğine sahip zirveyi belirleyin. Bu, tek bir numune için poli(A) kuyruk uzunluğunun bir tepe noktasıdır. Gösterilen örnekte 346 bp'dir.
    4. Üst menüdeki Ayar Noktalarını Göster/Gizle simgesini etkinleştirin ve sağ tarafta yeni bir panelin açılmasını bekleyin.
    5. Gelişmiş'i seçin, Smear Analizi Gerçekleştir'i bulmak için aşağı kaydırın ve onay kutusunu seçin. Bu, Bölge tablosunu elektroferogram sekmesine ekleyecektir.
    6. Bir örnekten bir elektroferogram seçin ve Kimden [bp] ve Kime [bp] menüsünü gösteren Bölge tablosuna gidin. Başlangıç ve bitişi [bp] ayarlamak için elektroferograma sağ tıklayın ve Bölge Ekle'yi eklemek için Bölge'yi seçin.
    7. Bölge tablosundaki herhangi bir hücreye sağ tıklayın ve özel bölgelerin ayarlanabileceği küçük yeni bir pencere açmak için Bölgeleri Değiştir'i seçin.
      NOT: Örneğin, GAPDH için 300 bp ile 550 bp arasında bir bölge kullandık. Gene özgü GAPDH PCR, 265 bp'de bir pik verdi. Üniversal primer (Tablo 1), G/I-kuyruklu RNA'lara tavlama yoluyla poli(A) PCR'nin uzunluğunu 35 bp uzatır. Böylece, GAPDH RNA'sındaki ilk adenin nükleotidi 300 bp'de (265 + 35) başlar. Maksimum poli(A) kuyruk uzunluğunu keyfi olarak 250 (300 + 250 = 550) ile sınırladık. Bölge tablosundan, program bölge içindeki ortalama boyutu 387 bp olarak döndürür.
    8. İlgilenilen mRNA'daki poli(A) kuyruk uzunluğunu hesaplamak için denklem (1)'i kullanın:
      Poli(A) kuyruk uzunluğu = (A - B - 35) (1)
      A, elektroferogramdan elde edilen poli(A)-spesifik PCR ürününün ortalama bp'sidir (yani, GAPDH için 387 bp), B, elektroferogramdan elde edilen gene özgü PCR ürününün pik bp'sidir (yani, GAPDH için 265 bp) ve "35", evrensel ters primer etiketinin uzunluğudur.
      NOT: Yukarıdaki hesaplamadan, GAPDH'nin ortalama poli(A) kuyruk uzunluğu 387 - 265 - 35= 87 bp'dir.

10. Poli(A) kuyruk uzunluğu dağılımının görselleştirilmesi

  1. Verileri Dosya | İhracat | Örnek verileri almak için Örnek Veriler.
    NOT: Dışa aktarılan csv dosyası, X ekseninde bp yerine çalışma zamanını görüntüler.
  2. Bir numunenin elektroferogramına gidin ve Bölge Tablosundaki bölge tablosunu otomatik olarak bp'den çalışma zamanına dönüştürmek için Elektroferogram sekmesindeki Boyutları Göster'i işaretleyin. Örnekte, 70,39 sn ila 86,28 sn, 300 bp ila 550 bp'ye karşılık gelir.
  3. csv dosyasını açın ve bir grafik oluşturmak için 70,39 sn ile 86,28 sn arasındaki çalışma süresi değerlerini seçin. bp boyutlarını grafikteki X eksenine göre görselleştirmek için, bp boyutlarına sahip elektroferogramı bir görüntü dosyası olarak dışa aktarın ve elektronik tabloda oluşturulan grafiğin üzerine yerleştirin. Bu, poli(A) kuyruk dağılımındaki bp boyutlarıyla uygun şekilde eşleşecektir.

Sonuçlar

Burada, Drosophila larva beyinlerinden Dscam1 ve GAPDH'nin poli(A) kuyruk uzunluğunu analiz ettik (Şekil 4). İzole edilen RNA'lar, kalite kontrol için bir agaroz jel üzerinde görselleştirildi. Yaklaşık 600 nükleotid boyutunda tek bir RNA bandı, bozulmamış RNA preparatını gösterir (Şekil 2A). RNA'lar, bir Agilent 2100 biyoanalizörü kullanılarak G/I kuyruğuna ve yüksek çözünürlüklü kapiler elektroforeze tabi tutuldu. Jel görüntüleri, Agilent 2100 Expert Yazılımı kullanılarak dışa aktarıldı ve buna göre birleştirildi. GAPDH ve Dscam1 genine özgü primer çiftlerinden elde edilen PCR ürünleri belirgin bir tek bant gösterirken, gene özgü/evrensel primer çiftlerinden gelenler farklı yayma paternleri gösterdi (Şekil 4A ve Tablo 1), bu da GAPDH ve Dscam1 mRNA'larının diferansiyel poli(A) uzunluğunu gösterir. Şekil 4B'de, GAPDH ve Dscam1'den ortalama poli(A) kuyruk uzunluklarını elde etmek için smear analizi kullanılmıştır. Elektroferogramlar dışa aktarıldı ve poli(A) kuyruk uzunluklarını temsil edecek şekilde modifiye edildi (Şekil 4C).

Benzer şekilde, S2 hücreleri üzerinde bir poli(A) kuyruk uzunluğu analizi gerçekleştirdik (Şekil 5). Dscam1 3'UTR'nin poli(A) kuyruklarının kısaltılmasındaki rolünü belirlemek için, S2 hücreleri, SV40 3'UTR veya Dscam1 3'UTR ile Dscam1 kodlama bölgesini içeren DNA plazmitleri ile transfekte edildi. SV40 3'UTR, rekombinant DNA plazmitleri için minimum transkripsiyon sonlandırma ve poliadenilasyon sinyali olarak yaygın olarak kullanıldığından, Dscam1 3'UTR'nin kontrolü için minimum SV40 3'UTR seçilmiştir. Total RNA ekstrakte edildi ve RT-PCR, G/I tailing ve yüksek çözünürlüklü kapiler elektroforezine tabi tutuldu (Şekil 5). Sonuç, SV40 3'UTR plazmidinden poli(A) kuyruk uzunluğu dağılımının endojen GAPDH ile benzer bir model izlediğini, Dscam1 3'UTR plazmidinden poli(A) kuyruk uzunluğu dağılımının ise larva beyinlerinden alınan endojen Dscam1 mRNA'nınkiyle benzer bir model izlediğini göstermektedir.

figure-results-1
Şekil 4: Larva beyinlerinden GAPDH ve Dscam1'in poli(A) kuyruk uzunluğu ölçümü. (A) Kılcal jel elektroforezi, gene özgü PCR ürününü GAPDH2 ve Dscam1 için ayrı bir bant (birinci ve ikinci şeritler) olarak çözer. Üniversal ters astar kullanan PCR ürünü bir yayma dağılımı gösterir (üçüncü ve dördüncü şerit). * Spesifik olmayan bant. (B) Ortalama poli(A)-kuyruk uzunlukları yayma analizi kullanılarak hesaplandı. (C) Poly(A) kuyruk uzunluğunun dağılımı, dışa aktarılan csv dosyasından yeniden oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 5: Transfekte edilmiş Dscam1 DNA plazmidinin poli(A) kuyruk uzunluğu ölçümü. Kültürlenmiş Drosophila S2 hücreleri, Dscam1'in kodlama bölgesini ve Dscam1 veya SV40'ın 3'UTR'sini içeren Dscam1 yapıları ile birlikte transfekte edildi. (A) Kapiler jel elektroforezi görüntüleri, gene özgü PCR ürünü için SV40 (Dscam1-SV40 3'UTR) ve Dscam1 (Dscam1-Dscam1 3'UTR) için ayrı bir bant (birinci ve ikinci şeritler) olarak gösterilir. Üniversal ters astar kullanan PCR ürünü bir smear paterni gösterir (üçüncü ve dördüncü şeritler). * Spesifik olmayan bant. (B) Ortalama poli(A)-kuyruk uzunlukları yayma analizi kullanılarak hesaplandı. (C) Poly(A) kuyruk uzunluğu dağılımı, dışa aktarılan csv dosyasından yeniden oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Dscam1
İleri Astar (5'-3') CGCAGCCACAACAATTGAATG
Ters Astar (5'-3') AAATAAAATCAAAATCATATATTTAGCAACTTATGAAC
SV40 Serisi
İleri Astar (5'-3') CCACAAAGGAAAAAGCTGCAC
Ters Astar (5'-3') TTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTG
GAPDH
İleri Astar (5'-3') CACTTCAGAAACGGCCTGAAAATGGC
Ters Astar (5'-3') AATATTTAAATGCTTATGAGTCGGCATTTTTAAAACTAC
Üniversal ters astar
Ters Astar (5'-3') GGTAATACGACTCACTATAGCGAGACCCCCCCCCCTT

Tablo 1: Bu protokolde kullanılan primerler.

Ek Dosya 1: Çözeltilerin bileşimi ve PCR kurulumu. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Bu protokolde, Drosophila larva beynini dolaşan 3. instar aşamasından diseksiyon tekniğini ve Drosophila S2 hücrelerinden örnek hazırlamayı açıklıyoruz. mRNA'ların kararsız doğası nedeniyle, numune toplama ekstra dikkat gerektirir. Larva beyin diseksiyonu için izolasyon sırasında beyinler zarar görmemeli ve uzun süre solüsyon içinde tutulmamalıdır. Bir diseksiyon turu için diseksiyon süresini 8-10 dakika olarak tutmak esastır. Diseksiyon solüsyonunun RNAaz inhibitörleri ile desteklenmesi de faydalı olabilir. S2 hücre kültürü ve transfeksiyonuna gelince, laminer akış başlığındaki tüm adımları gerçekleştirin.

RNA izolasyon adımı ek dikkat gerektirir. RNaz giderici solüsyonlarla ön işleme tabi tutulmuş laminer akış tipi temiz bir alan kullanmanızı öneririz. RNA veriminin yanı sıra, diseksiyon ve izolasyon adımları sırasında numunenin bozulmadığından emin olmak için RNA bütünlüğünün kontrol edilmesi esastır. RNA bütünlüğü, agaroz jel elektroforezinin denatüre edilmesiyle görselleştirilebilir. Drosophila'dan gelen toplam RNA, tek bir bantlama profili sergiler çünkü 28S rRNA, 18S rRNA25 ile birleşen eşit büyüklükte iki alt birime ayrışır. Bu, tek sarmallı bir RNA merdiveni kullanıldığında yaklaşık 600 nükleotidden oluşan tek bir bant olarak görülebilir (Şekil 2A).

İzole edilmiş RNA örnekleri G/I kuyruğuna tabi tutulur (Şekil 2B). Guanozin ve inosin kalıntıları, RNA'nın 3'-ucunu enzimatik bozunmadan koruyan maya poli(A) polimeraz (PAP)17 ile RNA'ların 3'-ucuna eklenir. Yeni sentezlenen G/I-tag korumalı tam uzunluktaki RNA'lar, evrensel ters primer (3' etiketli C10T2) kullanılarak cDNA örnekleri elde etmek için ters kopyalanır. Ardından, keskin bir bant gösteren bir PCR ürünü oluşturmak için poliadenilasyon bölgesinin hemen yukarısında gene özgü ileri/geri primerlere sahip bir PCR gelir. Bir gene özgü ileri ve evrensel ters primerlerden gelen PCR reaksiyonları, jel üzerinde bir yayma olarak tanımlanmamış uzunluklarda DNA molekülleri üretir ve bu da değişen uzunluklarda poli(A) kuyrukları yansıtır. PCR ürünleri daha sonra kapiler jel elektroforezi ile analiz edildi.

Primerleri tasarlarken, gene özgü ileri/geri primerlere sahip amplikon boyutunun 50-300 bp aralığında olması gerektiğine dikkat etmek önemlidir. Birden fazla ileri astarın test edilmesi, poli(A) kuyruk değerlendirmesi için işe yarayan en iyi astarı bulma fırsatı verir. Tahmin edilen poli(A) başlangıç bölgesinin hemen yukarısında gene özgü ürünler için bir ters astar tasarlamanızı öneririz çünkü bu, poli(A) kuyruk uzunluklarının doğrudan hesaplanması için bir fırsat sağlar. PCR reaksiyonlarını çalıştırırken, kontamine genomik DNA'dan amplifikasyonu ekarte etmek için "ters transkriptaz kontrolü yok" yapmak önemlidir. Tavlama sıcaklığı gradyanı ile PCR optimizasyonu şiddetle tavsiye edilir. Bu metodolojinin doğası göz önüne alındığında, alternatif olarak poliadenillenmiş mRNA türlerinin poli(A) kuyruk uzunluklarının analiz edilmesi ek değerlendirme gerektirir. Örneğin, birçok gen, farklı 3'UTR türleri üretmek için alternatif poliadenilasyona uğrar26. Bireysel 3'UTR türlerini incelemek için farklı PCR primer setleri kullanmanızı öneririz.

Her çalışmada birkaç nükleotidin potansiyel bir migrasyon farkı olduğundan, her çalışmada kılcal jel elektroforezine gene özgü PCR ürününün dahil edilmesini şiddetle tavsiye ederiz. Poli(A) kuyruk uzunluğu hesaplanırken teorik boyutlar yerine gene özgü PCR'nin gerçek baz çifti boyutunun kullanılması esastır.

Bazı RNA'lar, terminal üridilasyon27 dahil olmak üzere ek transkripsiyon sonrası modifikasyonlara uğrar. G/I kuyruk yöntemi, mRNA üridillendiğinde poli(A) kuyruk uzunluğunu ölçmek için uygun olmayabilir. Bunun nedeni, evrensel ters primerin, 3'-ucunda adenin olmayan nükleotidlere sahip mRNA türlerini verimli bir şekilde çoğaltamamasıdır. G/I kuyruğu, daha kısa parçaları daha verimli bir şekilde büyüterek potansiyel olarak istenmeyen önyargı yaratan PCR tabanlı bir yöntemdir. Bu nedenle, kullanıcılar sonucu yorumlarken dikkatli olmalıdır.

Burada sunulan yöntemi kullanarak, G/I kuyruğunun Drosophila sinir sistemi ve S2 hücrelerinden poli(A) kuyruk uzunluğunu ölçmek için verimli bir şekilde kullanılabileceğini gösterdik. Yöntem, kılcal elektroforez ile birleştirildiğinde oldukça niceldir. Yüksek verimli analizler küresel poli(A) kuyruk analizi sağlarken, düşük verimli PCR tabanlı yöntem G/I kuyruğu, tek transkript analizi, pilot deneyler ve diğer yöntemlerin doğrulanması için hala çok kullanışlıdır. Özetle, yöntem seçimi belirli araştırma sorularına ve hedeflerine bağlıdır. Araştırmacılar deneysel ihtiyaçlarına ve kaynaklarına en uygun yöntemi seçmelidir.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü tarafından JK'ye R01NS116463 ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibe P20GM103650 tarafından desteklenen ve bu çalışmada bildirilen araştırmalar için kullanılan Nevada Üniversitesi, Reno'daki Hücresel ve Moleküler Görüntüleme Çekirdeği tesisi tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3-(N-morfolino) propansülfonik asit (MOPS)Araştırma Ürünü Uluslararası (RPI)M92020
Agilent Yüksek Hassasiyetli DNA KitiAgilent Technologies  5067-4626
Agilent yazılımı 2100 uzman ücretsiz indirme demosuAgilent Technologieshttps://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259
Apex 100 bp-Düşük DNA MerdiveniGenesee Scientific19-109
BiyoanalizörAgilent 2100 Biyoanalizör G2938C
Dietil pirokarbonat (DEPC)Araştırma Ürünü Enternasyonu (RPI) D43060
DNA boyası (Jel Yükleme Boyası, Mor (6x)New England biolabs B7024S
Drosophila S2 hücre hattıDrosophila Genomics Kaynak Merkezi hisse senedi #181
Drosophila Schneider' s OrtaThermo Fisher Scientific21720024
Ehidium bromürGenesee scientific 20-276
Fetal sığır serumu (FBS)Sigma-AldrichF4135
Forseps Dumont 5    Güzel Bilimler araçları 11254-20
Nükleaz içermeyen suThermo Fisher Scientific AM9932
PBS 10xAraştırma Ürünü Uluslararası (RPI) P32200
Poli(A) Kuyruk Uzunluğu Test KitiThermo Fisher Scientific 764551KT
RiboRuler Düşük Menzilli RNA MerdiveniThermo Fisher Scientific SM1833
RNA Jel Yükleme Boyası (2x)Thermo Fisher Scientific R0641
RNA mikro hazırlık kitiZymoresearch R1050 
RNA mini hazırlık kitiZymoresearch R1055
Makas-Vannas Yaylı Makas - 2,5 mm Kesici Kenarİnce Bilim aletleri 15000-08
TopVision Agaroz TabletleriThermo Fisher ScientificR2802
Tris-Asetat-EDTA (TAE)Thermo Fisher ScientificB49

Kaynaklar

  1. Stewart, M. Polyadenylation and nuclear export of mRNAs. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 2977-2987 (2019).
  2. Machida, K., et al. Dynamic interaction of poly(A)-binding protein with the ribosome. Scientific Reports. 8 (1), 17435(2018).
  3. Eisen, T. J., et al. The dynamics of cytoplasmic mRNA metabolism. Molecular Cell. 77 (4), 786-799 (2020).
  4. Liudkovska, V., Dziembowski, A. Functions and mechanisms of RNA tailing by metazoan terminal nucleotidyltransferases. Wiley Interdisciplinary Reviews RNA. 12 (2), e1622(2021).
  5. Goldstrohm, A. C., Wickens, M. Multifunctional deadenylase complexes diversify mRNA control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (4), 337-344 (2008).
  6. Schmidt, M. J., Norbury, C. J. Polyadenylation and beyond: emerging roles for noncanonical poly(A) polymerases. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 1 (1), 142-151 (2010).
  7. Laishram, R. S. Poly(A) polymerase (PAP) diversity in gene expression - Star-PAP vs canonical PAP. FEBS Letters. 588 (14), 2185-2197 (2014).
  8. Salles, F. J., Lieberfarb, M. E., Wreden, C., Gergen, J. P., Strickland, S. Coordinate initiation of Drosophila development by regulated polyadenylation of maternal messenger RNAs. Science. 266 (5193), 1996-1999 (1994).
  9. Wreden, C., Verrotti, A. C., Schisa, J. A., Lieberfarb, M. E., Strickland, S. Nanos and pumilio establish embryonic polarity in Drosophila by promoting posterior deadenylation of hunchback mRNA. Development. 124 (15), 3015-3023 (1997).
  10. Passmore, L. A., Coller, J. Roles of mRNA poly(A) tails in regulation of eukaryotic gene expression. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (2), 93-106 (2021).
  11. Murray, E. L., Schoenberg, D. R. Assays for determining poly(a) tail length and the polarity of mRNA decay in mammalian cells. Methods in Enzymology. 448, 483-504 (2008).
  12. Salles, F. J., Strickland, S. Analysis of poly(a) tail lengths by PCR: The PAT assay. Methods in Molecular Biology. 118, 441-448 (1999).
  13. Salles, F. J., Darrow, A. L., O'Connell, M. L., Strickland, S. Isolation of novel murine maternal mRNAs regulated by cytoplasmic polyadenylation. Genes and Development. 6 (7), 1202-1212 (1992).
  14. Salles, F. J., Strickland, S. Rapid and sensitive analysis of mRNA polyadenylation states by PCR. Genome Research. 4 (6), 317-321 (1995).
  15. Janicke, A., Vancuylenberg, J., Boag, P. R., Traven, A., Beilharz, T. H. ePAT: A simple method to tag adenylated RNA to measure poly(a)-tail length and other 3' RACE applications. RNA. 18 (6), 1289-1295 (2012).
  16. Minasaki, R., Rudel, D., Eckmann, C. R. Increased sensitivity and accuracy of a single-stranded DNA splint-mediated ligation assay (sPAT) reveals poly(a) tail length dynamics of developmentally regulated mRNAs. RNA Biology. 11 (2), 111-123 (2014).
  17. Martin, G., Keller, W. Tailing and 3'-end labeling of RNA with yeast poly(A) polymerase and various nucleotides. RNA. 4 (2), 226-230 (1998).
  18. Kusov, Y. Y., Shatirishvili, G., Dzagurov, G., Verena, G. M. A new G-tailing method for the determination of the poly(a) tail length applied to hepatitis a virus RNA. Nucleic Acids Research. 29 (12), 57(2001).
  19. Bazzini, A. A., Lee, M. T., Giraldez, A. J. Ribosome profiling shows that miR-430 reduces translation before causing mRNA decay in zebrafish. Science. 336 (6078), 233-237 (2012).
  20. Subtelny, A. O., Eichhorn, S. W., Chen, G. R., Sive, H., Bartel, D. P. Poly(a)-tail profiling reveals an embryonic switch in translational control. Nature. 508 (1), 66-71 (2014).
  21. Chang, H., Lim, J., Ha, M., Kim, V. N. TAIL-seq: Genome-wide determination of poly(a) tail length and 3' end modifications. Molecular Cell. 53 (6), 1044-1052 (2014).
  22. Legnini, I., Alles, J., Karaiskos, N., Ayoub, S., Rajewsky, N. FLAM-seq: Full-length mRNA sequencing reveals principles of poly(A) tail length control. Nature Methods. 16 (9), 879-886 (2019).
  23. Garalde, D. R., et al. Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores. Nature Methods. 15 (3), 201-206 (2018).
  24. Singh, M., Ye, B., Kim, J. H. Dual leucine zipper kinase regulates Dscam expression through a noncanonical function of the cytoplasmic poly(A)-binding protein. Journal of Neuroscience. 42 (31), 6007-6019 (2022).
  25. Macharia, R. W., Ombura, F. L., Aroko, E. O. Insects' RNA profiling reveals absence of "hidden break" in 28S ribosomal RNA molecule of onion thrips, Thrips tabaci. Journal of Nucleic Acids. 2015, 965294(2015).
  26. Miura, P., Sanfilippo, P., Shenker, S., Lai, E. C. Alternative polyadenylation in the nervous system: to what lengths will 3' UTR extensions take us. Bioessays. 36 (8), 766-777 (2014).
  27. Sement, F. M., et al. et al Uridylation prevents 3' trimming of oligoadenylated mRNAs. Nucleic Acids Research. 41 (14), 7115-7127 (2013).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Poliyadenilasyon AnaliziDrosophila BeyniDrosophila S2 H creleriGI KuyruklamamRNA Reg lasyonuKapiler Jel ElektroforeziPCR AmplifikasyonuTers TranskripsiyonGen Ekspresyonu
Drosophila Larva Beyin ve Hücre Hattından Poli A Kuyruk Uzunluğunun Ölçülmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.