Enterik Sinir Sistemi Soylarının İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Farklılaşması

Özet

İnsan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC) enterik sinir sistemi (ENS) soylarının türetilmesi, ENS gelişimini ve hastalığını incelemek ve rejeneratif tıpta kullanmak için ölçeklenebilir bir hücre kaynağı sağlar. Burada, kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak hPSC'lerden enterik nöronlar türetmek için ayrıntılı bir in vitro protokol sunulmaktadır.

Özet

İnsan enterik sinir sistemi, ENS, dikkate değer nörotransmitter çeşitliliğine sahip geniş bir glial ve nöronal hücre tipleri ağıdır. ENS bağırsak hareketliliğini, enzim sekresyonunu ve besin emilimini kontrol eder ve bağışıklık sistemi ve bağırsak mikrobiyomu ile etkileşime girer. Sonuç olarak, ENS'nin gelişimsel ve edinilmiş kusurları birçok insan hastalığından sorumludur ve Parkinson hastalığının semptomlarına katkıda bulunabilir. Hayvan model sistemlerindeki sınırlamalar ve birincil dokuya erişim, insan ENS çalışmalarında önemli deneysel zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Burada, tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC) ENS soylarının etkili in vitro türetilmesi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Protokolümüz, 15 gün içinde hPSC'lerin enterik nöral krest hücrelerine yönlendirilmiş farklılaşması ile başlar ve 30 gün içinde fonksiyonel enterik nöronların çeşitli alt tiplerini verir. Bu platform, gelişimsel çalışmalar, hastalık modellemesi, ilaç keşfi ve rejeneratif uygulamalar için ölçeklenebilir bir kaynak sağlar.

Giriş

Enterik sinir sistemi (ENS), periferik sinir sisteminin en büyük bileşenidir. ENS, gastrointestinal sistem içinde yer alan ve bağırsağın neredeyse tüm fonksiyonlarını kontrol eden 400 milyondan fazla nöron içerir¹. ENS gelişimi ve fonksiyonu ile enterik nöropatilerdeki kusurlarının moleküler olarak anlaşılması, güvenilir ve otantik bir enterik nöron kaynağına erişim gerektirir. İnsan primer dokusuna erişim sınırlıdır ve hayvan modelleri birçok enterik nöropatide anahtar hastalık fenotiplerini özetlemekte başarısız olmaktadır. İnsan pluripotent kök hücre (hPSC) teknolojisinin, özellikle birincil kaynaklardan^izole edilmesi zor olanlar olmak üzere, istenen hücre tiplerinin sınırsız bir kaynağını sağlamada son derece faydalı olduğu kanıtlanmıştır 2,3,4,5,6,7. Burada, hPSC'lerden ENS kültürleri elde etmek için aşamalı ve sağlam bir in vitro yöntemin ayrıntılarını sunuyoruz. Bu ölçeklenebilir hPSC'den türetilmiş kültürler, gelişimsel çalışmalar, hastalık modellemesi ve yüksek verimli ilaç taraması için yollar açar ve rejeneratif tıp için nakledilebilir hücreler sağlayabilir.

Enterik nöron soyları, embriyogenez sırasında ENS gelişim yolunu izleyen nöral krest (NC) hücrelerinden türetilir. Embriyolarda, NC hücreleri katlanan nöral plakanın kenarları boyunca ortaya çıkar. Çoğalırlar, göç ederler ve duyusal nöronlar, Schwann hücreleri, melanositler, kraniyofasiyal iskelet ve enterik nöronlar ve glia ^8,9,10 dahil olmak üzere birçok farklı hücre tipine yol açarlar. Hücre kaderi kararı, NC hücrelerinin çıktığı ön-arka eksen boyunca farklı bölgeye, yani kraniyal NC, vagal NC, gövde NC ve sakral NC'ye bağlıdır. ENS, vagal ve sakral NC hücrelerinden gelişir ve birincisi, bağırsağın uzunluğu boyunca geniş göç ve bağırsağı kolonize etmesi nedeniyle enterik nöronların popülasyonuna hakimdir¹¹.

NC hücrelerinin PSC'lerden türetilmesi genellikle ikili SMAD inhibisyonu ve WNT yolu aktivasyonunun bir kombinasyonunu içerir^12,13. Yakın zamana kadar, tüm NC indüksiyon protokolleri, kültür koşullarında serum ve diğer hayvansal ürün katkı maddelerini içeriyordu. Kimyasal olarak tanımlanmamış ortamlar sadece NC indüksiyonunun tekrarlanabilirliğini azaltmakla kalmaz, aynı zamanda mekanik gelişimsel çalışmalara da meydan okur. Bu zorlukların üstesinden gelmek için, Barber ve ark.¹⁴, kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşullarını kullanarak bir NC indüksiyon protokolü geliştirdi ve bu nedenle serum replasman faktörlerine (örneğin, KSR) dayanan alternatif yöntemlere göre avantajlıydı13,14. Bu, bazal medya replasmanları ve orijinal olarak Fattahi ve arkadaşları tarafından hPSC'lerden enterik NC hücreleri türetmek için sunulan bir protokolün optimize edilmesiyle elde edildi. Bu geliştirilmiş sistem, burada sunulan hPSC farklılaşma protokolünün temelidir. Retinoik aside (RA) ek olarak BMP, FGF, WNT ve TGFβ sinyallerinin hassas modülasyonu ile 15 günlük bir süre içinde enterik nöral krest (ENC) hücrelerinin indüksiyonu ile başlar. Daha sonra, hücreleri glial hücre hattından türetilmiş nörotrofik faktör (GDNF) ile tedavi ederek ENS soylarını türetiriz. Tüm besiyeri bileşimleri kimyasal olarak tanımlanır ve 30-40 gün içinde sağlam enterik nöronal kültürler verir.

Burada tarif edilen tek katmanlı hücre kültürü sistemine ek olarak, serbest yüzen embriyoid cisimciklerini kullanan alternatif NC indüksiyon yaklaşımları geliştirilmiştir ^15,16. Bu kültürlerdeki göçmen hücrelerin, vagal NC'yi temsil eden bir alt küme ile NC belirteçlerini eksprese ettiği gösterilmiştir. Primer barsak dokusu ile ko-kültürler, bu kültürlerde enterik NC öncüllerini zenginleştirmek için kullanılmıştır. Bu çalışmalardaki medya kompozisyonları, sinir büyüme faktörü, NT3 ve beyin kaynaklı nörotrofik faktör gibi farklı faktörlerin bir kombinasyonunu içerir. Bu aşamada, bu faktörlerin enterik nöron öncü bağlılık kimliklerini nasıl etkileyebileceği tam olarak açık değildir. Tek tabakalı enterik NC indüksiyonunun ve embriyoid-vücut bazlı kültürlerin etkili bir şekilde karşılaştırılması için daha fazla veri gereklidir. Bu stratejilerdeki farklı kültür düzenleri göz önüne alındığında, her bir yöntemin kullanımı göz önünde bulundurularak belirli bir uygulamaya göre dikkate alınmalı ve optimize edilmelidir.

Burada sunulan protokol tekrarlanabilir ve biz ve diğerleri tarafından farklı hPSC (indüklenmiş ve embriyonik) hatları kullanılarak başarıyla test edilmiştir ^8,14,16.

Protokol

1. Medya hazırlığı

NOT: Protokol boyunca belirtilen konsantrasyonlar, medya bileşenlerinin nihai konsantrasyonlarıdır. Tüm ortamları steril koşullar altında laminer akış başlığında hazırlayın ve karanlıkta 4 °C'de saklayın. 2 hafta içinde kullanın.

1. hPSC bakım ortamı: Besleyici içermeyen hPSC bakım ortamı takviyesini (20 μL/mL) temel ortamıyla karıştırın.
2. Orta A: Farklılaşma baz ortamına kemik morfogenetik protein 4 (BMP4; 1 ng / mL), SB431542 (10 μM) ve CHIR99021 (600 nM) ekleyin.
3. Orta B: Farklılaşma temel ortamına SB431542 (10 μM) ve CHIR99021 (1,5 μM) ekleyin.
4. Orta C: Farklılaşma temel ortamına SB431542 (10 μM), CHIR99021 (1.5 μM) ve RA (1 μM) ekleyin.
5. Nöral kret tam (NCC) Orta: FGF2 (10 ng/mL), CHIR99021 (3 μM), N2 takviyesi (10 μL/mL), B27 takviyesi (20 μL/mL), L-glutamin takviyesi (10 μL/mL) ve MEM NEAA'lar (10 μL/mL) nörobazal ortama ekleyin.
6. ENC Ortamı: GDNF (10 ng/mL), askorbik asit (100 μM), N2 takviyesi (10 μL/mL), B27 takviyesi (20 μL/mL), L-glutamin takviyesi (10 μL/mL) ve MEM NEAA'lar (10 μL/mL) nörobazal ortama ekleyin.
7. Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) 1x: 500 mM EDTA'yı (1000x) PBS'de 500 μM'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin.
   NOT: Aksi belirtilmedikçe bu protokol boyunca Ca²⁺ ve Mg²⁺ serbest PBS kullanın.

2. Kültür plakalarının kaplanması

1. Bodrum membran matrisi kaplı plakalar: 50 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak kuvvetlice pipetleyerek 500 μL'lik donmuş bazal membran matrisi alikotunu 50 mL soğutulmuş DMEM:F12'de hızla çözün ve seyreltin. Kuyuları seyreltilmiş bazal membran matris çözeltisi (kuyu yüzey alanının^cm2'si başına 100 μL) ile kaplayın ve gece boyunca 37 °C'de inkübe edin. Kullanmadan önce kaplama ortamını aspire edin. Bazal membran matrisinin jelatinleşmesini önlemek için, bu adımı mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirin ve donmuş alikotu çözmek için soğuk DMEM: F12 kullanın.
   NOT: Pıhtılaşmayı önlemek için bazal membran matris sıcaklığı, çözülme (buz üzerinde) ve alikotlama (buz üzerindeki tüpler) sırasında soğuk tutulmalıdır.
2. PO / FN / laminin kaplı plakalar: 1000x stoğu seyrelterek PBS'de 15 μg / mL polinitin (PO) çözeltisi hazırlayın. Kuyucukları 2 cm^yüzey alanı başına 100 μL PO / PBS çözeltisi ile kaplayın ve plakaları gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Ertesi gün, PO / PBS'yi aspire edin ve kuyucukları 2 μg / mL fibronektin (FN) ve 2 μg / mL laminin içeren yeni yapılmış FN / laminin / PBS çözeltisi ile cm² kuyu yüzey alanı başına 100 μL'de kaplayın. Plakalar 37 °C'de en az 2 saat inkübasyondan sonra kullanılabilir. Kullanmadan önce FN / laminin / PBS'yi aspire edin.

3. hPSC kültürünün bakımı

NOT: Tüm hücre inkübasyon adımları, nemlendirilmiş bir inkübatörde %5_CO2 ve 37 °C'dedir.

1. hPSC kültüründen hPSC besiyerini aspire edin ve koloniler ~%80 birleşene kadar her gün taze besiyeri (kuyu yüzey alanının^cm2'si başına 200 μL) ekleyin.
2. Geçiş için, hPSC ortamını aspire edin ve hücreleri^cm2 kuyu yüzey alanı başına 100 μL PBS ile yıkayın.
   NOT: Hücreleri yıkamak için Ca²⁺ ve Mg²⁺ içermeyen PBS kullanmak önemlidir.
3. 500 μM EDTA (^cm2 kuyu yüzey alanı başına 100 μL) ekleyin. Plakanın kapağını yerine takın. Ters çevrilmiş bir mikroskopla izleyin ve hücreleri koloni kenarlarının ayrılması açısından izleyin (2-4 dakika).
4. Aynı hacimde hPSC ortamını her bir oyuğa aktarmak için 5 veya 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanın ve hücreleri birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek mekanik olarak hasat edin.
   NOT: Optimum EDTA inkübasyon süresi iPSC hattına bağlıdır. Aşırı koloni ayrışmasına ve hücre ölümüne yol açabileceğinden, kolonileri ayırmak için kuvvetli pipetlemeden kaçının. Bir farklılaşma plakasını başlatmak için geçerken, hücreleri EDTA ile 1-2 dakika daha inkübe edin.
5. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri döndürün (2 dk, 290 x g, 20-25 °C) ve süpernatanı dikkatlice atın.
6. Hücreleri uygun bir hacimde hPSC ortamında yeniden süspanse edin ve yeni bir bazal membran matris kaplı plakanın kuyularına aktarın.
   NOT: Düzenli hPSC bakımı için 1:18 - 1:24 geçiş oranı kullanın (1:18, 6 oyuklu bir plakanın tek bir oyuğundan ayrılan hücrelerin üçte birinin tamamen yeni bir plakaya aktarılması anlamına gelir). Bir farklılaştırma plakasını başlatmak için 5:6'lık bir geçiş oranı izleyin.
7. % 5 CO₂ ve 37 ° C'de inkübe edin.

4. Nöral kret indüksiyonu

NOT: Bu adım, Şekil 1A'da şematik olarak gösterilmiştir. Hücreler yaklaşık% 80 birleşim olduğunda NC farklılaşmasına başlayın. Bu, hücreler 5:6 oranında geçtiğinde 1-2 gün içinde elde edilecektir (yukarıya bakın). Pluripotent ve tamamen farklılaşmamış hPSC hücreleri ile 0. günde NC farklılaşmasına başlayın. Yüksek bir verimlilik için, koloni sınırları minimum farklılaşan hücrelere sahip olmalıdır. Koloniler büyük olduğunda veya ters mikroskop kullanılarak izlendiğinde koloninin merkezi kalınlaşmaya/kararmaya başladığında farklılaşma için geçiş ve plaka hPSC. Birleşme ve morfolojiye dikkat etmek, hücre hattına bağlı olarak değişebileceğinden ve^cm2 başına 50.000-200.000 arasında değişebileceğinden, kaplanmış hücre sayısından daha güvenilir olma eğilimindedir.

1. 0. günde, hPSC bakım ortamını 1 ng/mL BMP4, 10 μM SB431542, 600 nM CHIR99021 (^cm2 kuyu yüzey alanı başına 200 μL ortam) içeren Ortam A ile değiştirin.
2. 2. günde, hücreler% 100 birleşik olmalıdır. Harcanan Ortam A'yı nazikçe aspire edin ve 10 μM SB431542, 1.5 μM CHIR99021 (^cm2 kuyu yüzey alanı başına 200 μL ortam) içeren Orta B ile hücreleri besleyin.
   NOT: NC indüksiyonu sırasında kültürler büyüdükçe, hücreler alttaki tek tabakadan ayrılabilir. Eski ortamı nazikçe çıkararak ve kuyu tarafına taze ortam ekleyerek fazla hücre kaybını önleyin.
3. 4. günde, hücreleri tekrar Ortam B (^cm2 kuyu yüzey alanı başına 200 μL ortam) ile besleyin.
4. 6. günde, orta B'yi 10 μM SB431542, 1.5 μM CHIR99021 ve 1 μM retinoik asit (^cm2 kuyu yüzey alanı başına 400 μL ortam) içeren Orta C ile değiştirin.
5. 8. ve 10. günlerde 6. gün olarak besleyin.

5. ENC küresel oluşumu

NOT: Bu adım, Şekil 1B'de şematik olarak gösterilmiştir.

1. 12. günde, Orta C'yi nazikçe aspire edin ve hücreleri^cm2 kuyu yüzey alanı başına 100 μL PBS ile yıkayın. Aynı hacimde hücre ayırma solüsyonu ekleyin ve% 5 CO₂ ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
2. 10 ng/mL FGF2, 3 μM CHIR99021, 10 μL/mL N2 takviyesi, 20 μL/mL B27 takviyesi, 10 μL/mL L-glutamin takviyesi ve 10 μL/mL MEM NEAA içeren aynı hacimde NCC ortamı ekleyerek hücre ayırma solüsyonunu seyreltin. Serolojik bir pipet kullanarak, tek hücreli süspansiyonu hasat edin ve 15 mL'lik konik bir tüpe ekleyin.
3. Hücreleri döndürün (2 dk, 290 x g, 20-25 °C) ve süpernatanı dikkatlice atın.
4. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, 12 mL (tam 6 oyuklu bir plaka için) NCC ortamı ekleyin ve 1-2 kez mekanik olarak yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri tamamen yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu ultra düşük bir bağlantı plakasına aktarın.
   NOT: Yaklaşık 10^cm2 ENC tek katmanlı hücreler, 2 mL NCC ortamında yeniden süspanse edilir ve ultra düşük bir bağlantı plakasının bir kuyucuğuna aktarılır. Bu, tam 6 oyuklu ultra düşük bağlantı plakasına aktarılan tam 6 oyuklu bir NC indüksiyon plakasına eşittir.
5. 14. günde, her bir oyuğun ortasında küçük küreler toplanana kadar plakaları hafifçe döndürün. Bir P1000 mikropipet kullanarak ve yavaş dairesel hareketlerle, harcanan NCC ortamını her bir oyuğun çevresi boyunca aspire edin. Serbest yüzen sferoidleri çıkarmaktan kaçının.
6. Hücreleri orijinal NCC ortamı hacmiyle besleyin.

6. EN indüksiyonu

NOT: Bu adım, Şekil 1B'de şematik olarak gösterilmiştir.

1. 15. günde, ortamı nazikçe çıkarmak ve sferoidleri PBS ile yıkamak için 14. günde kullanılan tekniğin aynısını uygulayın. Sferoidlerden kaçınarak mümkün olduğunca fazla PBS'yi çıkarın.
2. Hücre ayırma çözeltisi ekleyin (kuyu yüzey alanının^cm2'si başına 100 μL) ve sferoidleri% 5 CO₂ ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe ederek tek hücrelere ayırın.
3. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, eşit hacimde ENC ortamı ekleyin (10 ng/mL GDNF, 100 μM askorbik asit, 10 μL/mL N2 takviyesi, 20 μL/mL B27 takviyesi, 10 μL/mL L-glutamin takviyesi ve nörobazal ortamda 10 μL/mL MEM NEAA içerir) her bir oyuğa ve kalan sferoidleri 2-3 tur mekanik pipetleme ile kırın. Hücreleri 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın.
   NOT: Zorla pipetleme veya daha küçük uç açıklığına sahip pipetlerin kullanılmasından kaynaklanabilecek aşırı stres ve hücre ölümünden kaçının.
4. Hücreleri döndürün (2 dk, 290 x g, 20-25 °C) ve süpernatanı dikkatlice atın. 10 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, ~ 5-10 mL ENC ortamı ekleyin ve 1-2 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri tamamen yeniden süspanse edin.
5. Tripan mavisi ve hemositometre gibi bir hücre sayma yöntemi kullanarak canlı hücrelerin konsantrasyonunu sayın.
   DİKKAT: Tripan mavisi şüpheli bir kanserojendir. Dikkatli tutun, uygun şekilde atın.
6. mL başına yaklaşık ~ 1.000.000 hücre yoğunluğunda cm² yüzey alanı başına yaklaşık 300.000-400.000 canlı hücre kaplamayı hedefleyen yeterli miktarda ENC ortamı ekleyin. Plakanın kuyularından FN / laminin / PBS çözeltisini aspire edin.
   NOT: EN kültürleri için planlanan tahlillere göre plaka formatını seçin, çünkü bu aşama protokolün son yeniden kaplama adımını işaret eder. Enterik nöron progenitörleri 15. günde dondurulabilir. Küreleri hücre ayırma çözeltisi ile ayırdıktan sonra, progenitörleri %10 DMSO veya Kök hücre bankacısı gibi dondurucu ortamda yaklaşık 5 x^{10 6} hücre / mL'de yeniden süspanse edin. Gerektiğinde, 5 μM Y-27632 ROCK inhibitörü ile ılık ENC ortamında çözdürün. İstenilen plaka formatında plaka hücreleri. Ortamı birkaç saat sonra taze ENC ile değiştirin.
7. Hücreleri yavaşça PO / FN / laminin kaplı oyuklara ekleyin. Özellikle 384 oyuklu plakalar gibi daha küçük kuyu boyutuna sahip plakalar kullanıldığında, hücrelerin PO / FN / laminin kaplamaya bağlanmasını önleyen hücre süspansiyonunun altında kabarcıkların sıkışmasını önleyin. Bu hücre ölümüne yol açabilir.
8. Hücreleri 30-40. güne kadar ENC ortamı^(cm2 kuyu yüzey alanı başına 200 μL) ile her gün besleyin, ardından besleme sıklığını azaltın (haftada bir veya iki kez), ancak besleme hacmini iki katına çıkarın (kuyu yüzey alanının^cm2'si başına 400 μL ortam).
   NOT: Bu, ortamın aşırı çıkarılması ve eklenmesi, nöronal kültürün kuyucukların yüzeyinden ayrılmasını kolaylaştırabileceğinden önemlidir. Özellikle uzun süreli kültürler için dekolmanı prospektif olarak önlemek için, ENC'yi haftada bir kez FN (2 μg / mL) ve laminin (2 μg / mL) ile destekleyin.

Sonuçlar

Bu protokol, kimyasal olarak tanımlanmış kültür koşulları kullanılarak hPSC'lerden enterik nöral krest ve enterik nöronlar türetmek için bir yöntem sağlar (Şekil 1A-B). Yüksek kaliteli nöronların üretilmesi, verimli bir enterik nöral krest indüksiyon adımına bağlıdır. Bu, Şekil 1C'de görüldüğü gibi yaklaşık 0,1 - 0,4 mm boyutunda pürüzsüz yüzeylerle yuvarlak görünmesi gereken serbest yüzen kürelerin morfolojisi kontrol edilerek görsel olarak değerlendirilebilir. Bu sferoidler, Şekil 1D'de görülebileceği gibi, nöral krest işaretleyici SRY-Box transkripsiyon faktörü 10 (SOX10)17,18'i de ifade etmelidir. Enterik nöron indüksiyon fazı sırasında, nöritler 25-30. gün gibi erken bir sürede görünür hale gelebilir (Şekil 1E). Bununla birlikte, istenmeyen mezenkimal hücre kontaminasyonlarını içeren daha düşük verimliliğe sahip farklılaşmalarda bu gecikebilir. İnsan enterik sinir sistemi, farklı nörotransmiterleri ifade eden çeşitli nöronların bir koleksiyonudur. Bu heterojenlik, sağlanan in vitro protokolde özetlenir ve anahtar belirteçlerin ekspresyonu, daha önce açıklanan protokoller^{13,14,19,20,21'e} göre immünofloresan görüntüleme ve akış sitometrisi gibi hücre boyama yöntemleri ile değerlendirilebilir (Şekil 1F,G).

Şekil 1: İnsan ENC hücrelerinin ve enterik nöron alt tiplerinin hPSC'lerden türetilmesi. (A) hPSC'den enterik nöral krest (ENC) indüksiyonu. hPSC'lerden ENC hücreleri türetmek için ortam bileşimlerini gösteren protokol (0-12. günler). (B) ENC sferoid oluşumu ve ENC'den enterik nöron indüksiyonu. ENC sferoid oluşumu için ortam bileşimini gösteren protokol (12-15. günler). Daha sonra enterik nöronlar, GDNF ve AA içeren bir besiyeri ile muamele edilerek üretilir ve olgunlaştırılır. (C) Protokolün farklı zaman noktalarında farklılaşan hPSC'lerin temsili faz kontrast görüntüleri. Ölçek çubuğu: 1000 μM. (D) SOX10::14. günde H9 iPSC'den türetilmiş ENC sferoidlerini eksprese eden GFP. Ölçek çubuğu: 1000 μm. (E) 33. gün nöronlarının faz sözleşmesi görüntüsü. Ölçek çubuğu: 400 μm. (F-G) 40. gün nöronlarında nörotransmitter belirteçlerinin immünofloresan görüntüleme (F) ve akış sitometrisi (G). Ölçek çubuğu: 50 μm. Kısaltmalar: BMP4 = rekombinant insan BMP4 proteini; RA = retinoik asit; FGF2 = rekombinant insan FGF temel; GDNF = rekombinant insan glial hücre hattından türetilmiş nörotrofik faktör; AA = askorbik asit. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Burada tarif edilen farklılaşma protokolü, 30-40 gün içinde hPSC'lerden enterik nöronlar elde etmek için sağlam bir in vitro yöntem sağlar (Şekil 1E) ve daha eski kültürlerde glial fibriler asidik protein, GFAP ve SOX10 eksprese eden enterik glia (> gün 55)13,14,19,22. Bu nöronlar ve glia, hPSC'lerin vagal ve enterik nöral krest hücrelerine kademeli olarak farklılaşması ve ardından enterik nöron ve glia progenitörleri^13,14 ile indüklenir. Nöral krest hücreleri, nöral krest belirteçlerini, transkripsiyon faktörü AP-2 alfa ve beta, TFAP2A ve TFAP2B'yi sırasıyla²¹ eksprese eder. Daha önce CD49'un hPSC'den türetilmiş nöral krest hücrelerinin¹⁴ verimliliğini belirtmek için bir belirteç olarak kullanılabileceğini göstermiştik. Bu yöntemin verimliliği ve başarısı, faktörlerin bir kombinasyonuna bağlıdır. İlk olarak, tüm adımların steril koşullar altında gerçekleştirilmesi çok önemlidir. hPSC kültürlerinin mikoplazma kontaminasyonu açısından test edilmesi, kök hücre büyümesini olumsuz etkileyebileceği ve görsel olarak tespit edilemediği için önemlidir. İkincisi, eşit ve düzgün bir şekilde kaplanmış plakaların kullanılması, yamalı hPSC kültürünün büyümesi ve NC kültürlerinin ve daha eski nöronların kuyucukların yüzeyinden ayrılması olasılığını azaltır. Üçüncüsü, farklılaşmada yüksek verimlilik için pluripotent ve tamamen farklılaşmamış hPSC hücreleri ile başlamak esastır. hPSC kolonileri, koloni sınırlarında minimal farklılaşan hücrelere sahip olmalıdır. hPSC'ler, koloniler büyük olduğunda veya bir faz kontrast mikroskobu ile gözlemlendiği gibi koloninin merkezi rengi kalınlaşmaya/koyulaşmaya başladığında farklılaşma için geçilmeli veya kaplanmalıdır. İstenmeyen farklılaşmış hücreler (genellikle mezenkimal hücreler), sadece genel farklılaşma verimliliğini düşürmekle kalmaz, aynı zamanda kültürler yaşlandıkça nöronların kuyu yüzeyinden ayrılmasına neden olabilir. Bu nedenle ENC kültürlerinin ilk 15 gün dikkatli bir şekilde izlenmesi önerilir. Verimli farklılaşma koşulları altında, kültürün ~ 6. gününde yüzeyinde koyu renkli diskler belirir, bu da 12-15. günlerde verimli sferoid oluşumunu gösterir. Ek olarak, küresel fazda (12-15. gün) serbest yüzen küreler pürüzsüz yüzeylere sahip olmalıdır (Şekil 1D). 3D küresel fazın 12-15. günlerde sürdürülmesi, kültürlerin ENS soylarına aşağı akış farklılaşması için ENC'lerin saflığını iyileştirmek için genellikle yeterlidir. Bununla birlikte, erken ve saf ENC progenitör hücre popülasyonları gerektiren çalışmalar için, CD49D kullanılarak FACS önerilir. CD49D, SOX10:hPSC'den türetilmiş NC soyları için spesifik bir yüzey işaretleyicidir ve^{hücre hatları 13,14} boyunca başarıyla kullanılmıştır. FACS kullanarak CD49D + hücrelerinin izole edilmesi hakkında daha fazla bilgi ve geçit stratejisi okuyucuları hakkında öneriler için Barber ve ark, Şekil 2D, Kutu 1 ve Ek Şekil 6¹⁴ tarafından hazırlanan makaleye başvurulur. Dördüncüsü, verimliliği en üst düzeye çıkarmak için, farklılaşma, hPSC kültürleri tek katmanlı ve ~%80 birleşik olduğunda başlamalıdır. Bu, 2. günde tamamen uyumlu bir kültüre sahip olmak anlamına gelir. Daha düşük birleşme, verimliliği olumsuz etkiler ve çok yoğun kültürler daha yüksek hücre ölümü oranına sahip olma eğilimindedir ve potansiyel olarak istenmeyen farklılaşmış hücrelerin ortaya çıkmasına neden olabilir.

Hücrelerin 15. günde yeniden kaplanması bu protokolde önemli bir adımdır. Bu, tek katmanlı bir nöronal kültür için son hücre transfer adımıdır ve bu nedenle plaka düzeni planlanan tahlillere göre seçilmelidir. Her bir oyuğa aktarılan hücre sayısı, nöronal çeşitliliği ve kuyucukların yüzeyine bağlı kalan eski nöronları önemli ölçüde etkileyebilir. Genel olarak,^cm2 başına 250.000-350.000 hücre aralığında bir hücre yoğunluğu (96 oyuklu bir plakanın oyuğu başına yaklaşık 75.000-100.000 hücre veya 24 oyuklu bir plakanın oyuğu başına 500.000-700.000) arzu edilir. 30-40. günden başlayarak, özellikle daha uzun nöron kültürleri için planlanan hücreler için nöronların ayrılmasını prospektif olarak önlemek için besleme ortamına (haftada bir defadan fazla olmamak üzere) fibronektin ve laminin eklenmesi düşünülebilir. Bu noktada, besleme sıklığının her 5-7 günde bire düşürülmesi ve ekstra taze ortam eklemeden önce her kuyucukta bir miktar orta bırakılması önerilir. Bu, nöronal projeksiyonlara gereksiz fiziksel stres uygulama şansını azaltır. Ortamın buharlaşması göz önüne alındığında (özellikle plakanın sınırındaki kuyucuklar için) 75 μL çıkarılabilir ve her oyuğa 100 μL taze ortam eklenebilir. Tecrübelere dayanarak, polimer lamel tabanlı görüntüleme plakaları üzerinde yetiştirilen kültürler, kuyu yüzeyine daha uzun süre yaşama ve bağlı kalma eğilimindedir. Bu nedenle, diğer hücre tipleri ile ko-kültürler gibi çok eski nöronal kültürler gerektiren deneyler için polimer lamel alt görüntüleme plakalarının dikkate alınması önerilir. Havayla kurutulmuş PO / FN / laminin kaplı plakalar hala verimli bir farklılaşma sağlayabilse de, bu, bu protokolün amacı için sistematik olarak test edilmemiştir. Bu nedenle, yeni kaplanmış plakaların kullanılması tavsiye edilir.

Burada açıklanan protokol, Barber ve ark.¹⁴ tarafından daha önce yayınlanmış bir protokole dayanmaktadır. Serum replasman faktörleri (örneğin, KSR)^13,14 içeren besiyerlerini kullanan eski ENC indüksiyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, mevcut protokol besiyeri koşulları kimyasal olarak tanımlanmıştır. Bu, daha tutarlı farklılaşmalara karşı avantajlıdır ve kültür koşullarını manipüle ederek daha kesin gelişimsel çalışmalara izin verir. Bu sağlam protokol, H9, UCSF4 ve WTC11 gibi test edilmiş bağımsız indüklenmiş ve embriyonik kök hücre hatlarından tekrarlanabilir bir şekilde enterik nöron kültürleri üretir. Sunulan protokolün güçlü bir yönü, insan ENS'sinde bulunanlara benzeyen çeşitli ENS nöronal alt tipleri üretme kapasitesidir. Örneğin, farklı ENS nörokimyasal kimlikleri için spesifik belirteçlerin ekspresyonu, akış sitometrisi ve floresan görüntüleme ile kontrol edilebilir (Şekil 1F,G). Nitrik oksit sentaz 1 (NOS1) için pozitif olan hPSC'den türetilmiş enterik nöronal popülasyonların tipik aralığı %5-20'dir; kolin O-asetiltransferaz (CHAT)% 40 -% 60'tır; gama-aminobütirik asit (GABA) %15-%30 ve serotonin (5-HT) %15-%30'dur. Bununla birlikte, bu alt tipler arasındaki in vitro yapısal ve işlevsel bağlantının in vivo hücresel ağları ne ölçüde doğru bir şekilde modellediği daha fazla çalışma gerektirmektedir. Ek olarak, bireysel alt tiplerin transkripsiyonel profilini genişletmek için yapılan tek hücre analizleri, yalnızca in vivo ve in vitro hücresel kimliklerin daha iyi karşılaştırılmasına yardımcı olmakla kalmayacak, aynı zamanda ilaç keşfi ve rejeneratif tıp için spesifik alt tipleri zenginleştirmeye yönelik gelişimsel ve moleküler çalışmaların yanı sıra gelecekteki protokol optimizasyonlarına da fayda sağlayacaktır.

Farklı nöronal ve daha eski kültürlerde glial hücreler içeren kültürlere rağmen, bu protokol kas hücreleri, epitel hücreleri ve bağışıklık hücreleri gibi ENS'nin in vivo nişinde doğal olarak bulunan diğer hücre tiplerini üretmez. ENS'nin bu hücre tipleri ile sağlık ve hastalık bağlamında etkileşimini incelemek, ko-kültür ve bağırsak organoid sistemlerini optimize etmeye yatırım yapmayı gerektirir. Genel olarak, in vitro olarak hPSC'lerden ENS'nin farklı alt tiplerini oluşturmak için güçlü bir yöntem burada açıklanmaktadır. Ölçeklenebilir kültürler, insan ENS'sinin gelişimsel çalışmaları, ilaç tedavileri geliştirmeyi ve enterik nöropatileri tedavi etmek için nakledilebilir hücreler sağlamayı amaçlayan toksikoloji testleri ve hastalık modelleme deneyleri için uygundur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Askorbik asit	Sigma-Aldrich	A5960
B27 takviyesi (serum içermez, eksi A vitamini)	Gibco	12587-010
Bodrum membran matrisi, Geltrex	Gibco	A14133-2
BMP4	R& D sistemleri	314-BP
Hücre kültürü santrifüjü	Eppendorf, model no. 5810R	02262501
Hücre ayırma çözümü, Accutase	Stemcell Technologies	07920
CHIR99021	Tocris	4423
Konik tüpler	ABD bilimsel	1475-0511, 1500-1211
Farklılaşma temel ortamı, Temel 6	Yaşam Teknolojiler	A1516401
DMEM/F-12 glutamin içermez	Yaşam Teknolojileri	21331020
EDTA	Corning	MT-46034CI
Besleyicisiz hPSC bakım ortamı, Essential 8 Flex Medium Kit	Life Technologies	A2858501
FGF2	R& D sistemleri	233-FB / CF
Fibronektin	Corning	356008
GDNF	Peprotech	450-10
Hemositometre	Hausser Scientific	1475
İnsan pluripotent kök hücreleri, H9 ESC	WiCell	RRID: Kontrollü
İnkübatör	Thermo Fisher Scientific	Herralcell 150i
Ters mikroskop	Thermo Fisher Scientific	EVOS FL
Laminer akış başlığı	Thermo Fisher Scientific	1300 serisi sınıf II, tip A2
Laminin	Cultrex	3400-010
L-glutamin takviyesi, Glutagro	Corning	25-015-CI
MEM NEAAs	Corning	25-025-CI
Çok kuyulu plakalar, Falcon	BD	353934, 353075
N-2 Takviyesi	CTS	A1370701
Nörobazal Orta Yaşam	Teknolojileri	21103049
PBS (Ca ve Mg içermez)	Yaşam Teknolojileri	10010023
Pipet dolgusu	Eppendorf	Z768715-1EA
Pipet uçları	ABD bilimsel	1111-2830
Pipetler	Fisherbrand	13-678-11E, 13-678-11F
PO	Sigma-Aldrich	P3655
polimer lamel alt görüntüleme plakaları, ibidi	ibidi	81156
RA	Sigma-Aldrich	R2625
SB431542	R& D sistemleri	1614
Tripan mavisi leke, %0,4	Thermo Fisher Scientific	15250-061
Ultra düşük bağlantı plakaları	Fisher Scientific	07-200-601
Y-27632 dihidroklorür	R& D sistemleri	1254