Epon Post Gömme Korbağıntılı Işık ve Elektron Mikroskobu

Shuyuan Wang; Haiyan Xiong; Qiyuan Chang; Xudong Zhuang; Yaochen Wu; Xinrui Wang; Congxian Wu; Zhifei Fu

doi:10.3791/66141

Method Article

Epon Post Gömme Korbağıntılı Işık ve Elektron Mikroskobu

DOI:

10.3791/66141

⸱

January 12th, 2024

Shuyuan Wang^*¹ , Haiyan Xiong^*¹^,² , Qiyuan Chang^*¹^,³ , Xudong Zhuang^*⁴^,⁵^,⁶ , Yaochen Wu¹^,³ , Xinrui Wang⁴^,⁵^,⁶ , Congxian Wu¹ , Zhifei Fu¹^,⁷^,⁸

¹Public Technology Service Center, Fujian Medical University, ²The School of Pharmacy, Fujian Medical University, ³The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, ⁴College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics, Fujian Medical University, ⁵Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital, ⁶NHC Key Laboratory of Technical Evaluation of Fertility Regulation for Non-human Primate, Fujian Maternity and Child Health Hospital, ⁷Institute of Neuroscience, Fujian Medical University, ⁸Fujian Key Laboratory of Molecular Neurology, Fujian Medical University

^* These authors contributed equally

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mScarlet adı verilen bir floresan proteini kullanarak Epon gömme sonrası bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, floresan ve üst yapıyı aynı anda koruyabilir. Bu teknik, çok çeşitli biyolojik uygulamalara uygundur.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu (CLEM), floresan mikroskobu (FM) tarafından sağlanan lokalizasyon bilgilerini ve elektron mikroskobu (EM) tarafından elde edilen hücresel üst yapı bağlamını birleştiren kapsamlı bir mikroskopidir. CLEM, floresan ve üst yapı arasında bir değiş tokuştur ve genellikle üst yapı floresansı tehlikeye atar. Glisidil metakrilat, HM20 veya K4M gibi diğer hidrofilik gömme reçineleri ile karşılaştırıldığında, Epon, üst yapı koruma ve kesit alma özelliklerinde üstündür. Daha önce, mEosEM'nin osmiyum tetroksit fiksasyonuna ve Epon gömülmesine dayanabileceğini göstermiştik. mEosEM'i kullanarak, ilk kez, floresan ve üst yapıyı aynı anda koruyan Epon post gömme CLEM'i elde ettik. Burada, EM numune hazırlama, FM görüntüleme, EM görüntüleme ve görüntü hizalama hakkında adım adım ayrıntılar sunuyoruz. Ayrıca, EM görüntüleme sırasında FM görüntüleme ile görüntülenen aynı hücreyi tanımlama prosedürlerini iyileştiriyoruz ve FM ve EM görüntüleri arasındaki kaydı detaylandırıyoruz. Geleneksel EM tesislerinde bu yeni protokolü takiben Epon post gömülü bağıntılı ışık ve elektron mikroskobunun kolayca elde edilebileceğine inanıyoruz.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Floresan mikroskobu (FM), hedef proteinin lokalizasyonunu ve dağılımını elde etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, hedef proteini çevreleyen bağlam kaybolur, bu da hedef proteini iyice araştırmak için çok önemlidir. Elektron mikroskobu (EM), birkaç hücre altı ayrıntı sağlayan en yüksek görüntüleme çözünürlüğüne sahiptir. Bununla birlikte, EM hedef etiketlemeden yoksundur. FM tarafından alınan floresan görüntüsünü EM tarafından elde edilen gri görüntü ile doğru bir şekilde birleştirerek, bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu (CLEM), bu iki görüntüleme modu 1,2,3,4 tarafından elde edilen bilgileri birleştirebilir.

CLEM, floresan ve üst yapı¹ arasında bir değiş tokuştur. Mevcut floresan proteinlerin sınırlamaları ve geleneksel EM numune hazırlama prosedürleri, özellikle osmik asit (OsO₄) ve Epon gibi hidrofobik reçinelerin kullanımı nedeniyle, üst yapı her zaman floresan^5'i tehlikeye atar. OsO₄ , EM görüntülerinin kontrastını iyileştirmek için kullanılan EM numune hazırlamada vazgeçilmez bir reaktiftir. Diğer gömme reçineleri ile karşılaştırıldığında, Epon ultrastrüktür koruma ve kesit alma özelliklerinde üstündür⁵. Bununla birlikte, hiçbir floresan proteini,_OSo4 ve Epon gömme^6'nın tedavisinden sonra floresan sinyalini tutamaz. Floresan proteinlerin sınırlamalarının üstesinden gelmek için, EM numune hazırlamadan önce FM görüntülemenin yapıldığı önceden gömülü CLEM geliştirilmiştir⁶. Bununla birlikte, CLEM'i önceden gömmenin dezavantajı, FM ve EM görüntüleri arasındaki kesin olmayan kayıttır⁵.

Aksine, gömme sonrası CLEM yöntemi, kayıt doğruluğu 6-7 nm ^5,6'ya ulaşabilen EM numune hazırlığından sonra FM görüntülemeyi gerçekleştirir. Floresan proteinlerin floresansını korumak için, çok düşük konsantrasyonlarda OsO₄ (% 0.001)³ veya yüksek basınçlı dondurulmuş (HPF) ve dondurarak ikame (FS) EM hazırlama yöntemleri ^4,7, bozulmuş üst yapı veya EM görüntüsünün kontrastı pahasına kullanılmıştır. Gömme reçinesi⁵ olarak glisidil metakrilat kullanılmasına rağmen, mEos4b'nin geliştirilmesi, gömme sonrası CLEM'in ilerlemesini büyük ölçüde destekler. OsO₄ boyama ve Epon gömme hayatta kalabilen mEosEM'in geliştirilmesiyle, floresan ve üst yapıyı aynı anda koruyarak ilk kez Epon gömme sonrası süper çözünürlüklü CLEM elde edildi⁶. mEosEM'den sonra,_OsO4boyamaya ve Epon gömmeye dayanabilen birkaç floresan proteini geliştirildi 8,9,10,11. Bu, CLEM'in gelişimini büyük ölçüde teşvik eder.

Epon gömme sonrası CLEM'in üç temel yönü vardır. Birincisi, EM numune hazırlığından sonra floresan sinyalini koruması gereken floresan proteindir. Deneyimlerimize göre, mScarlet bildirilen diğer floresan proteinlerden üstündür. İkincisi, EM görüntülemede FM görüntüleme ile görüntülenen aynı hücrenin nasıl bulunacağıdır. Bu sorunu çözmek için, hedeflenen hücreyi kolayca bulabilmeniz için bu adımın prosedürünü iyileştiriyoruz. Sonuncusu, FM görüntüsünü EM görüntüsüyle hizalama yöntemidir. Burada, FM ve EM görüntüleri arasındaki kaydı detaylandırıyoruz. Bu protokolde, VGLUT2 nöronlarında mScarlet'i eksprese ediyoruz ve mScarlet'in Epon post-embedding CLEM kullanarak ikincil lizozomları hedefleyebileceğini gösteriyoruz. Floresan ve üst yapıdan ödün vermeden Epon gömme sonrası CLEM için adım adım ayrıntılar sunuyoruz.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvancılık ve deneyler, Fujian Tıp Üniversitesi Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Geçerli protokolün adım adım iş akışı Şekil 1'de gösterilmektedir.

1. Numune hazırlama

Fare beyni
1. Bu fareleri genotiplemek için transgenik fareler (Malzeme Tablosuna bakınız) ve oligonükleotid primerleri (Malzeme Tablosuna bakınız) satın alın.
2. Daha önce yayınlanmış protokol ^12,13'ü izleyerek sağlam beyni kraniyal tonozdan perfüze edin ve çıkarın.
3. Fare beynini gece boyunca 4 °C'de 10 mL fiksatif solüsyon ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak sabitleyin.
4. Fiksatif çözeltiyi 0,1 M fosfat tamponu (PB) ile 3 x 10 dakika durulayın.
5. Fare beynini salınımlı bir mikrotom kullanarak 500 μm kalınlığında bölümlere ayırın (bkz.
6. Floresan bölgeleri bir stereomikroskop kullanarak bir neşter ile küçük bloklar halinde kesin (bkz.
  NOT: Küçük blokların hacmi 1 mm'den büyük olmamalıdır³.
Kültürlenmiş hücreler
1. HeLa hücrelerini 6 cm'lik hücre kültürü kaplarına tohumlayın ve bunları büyüme ortamında tutun (Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı [DMEM] düşük glikozu,% 10 fetal sığır serumu [FBS] ile desteklenmiştir).
2. Ertesi gün, mScarlet içeren plazmitleri, transfeksiyon kitinin talimat kitabını izleyerek DNA transfeksiyon reaktifi (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak hücrelere aktarın.
3. Transfeksiyondan kırk sekiz saat sonra, transfekte edilmiş hücreleri tripsinize edin ve 1.000 × g'da hücre peletleri elde etmek için santrifüjleyin. Hücre peletlerine numune blokları denir.

2. EM numune hazırlama

Fiksasyon
1. Numune bloklarını sabitleyici bir çözelti kullanarak sabitleyin (Malzeme Tablosuna bakın) gece boyunca 4 °C'de.
2. Fiksatif solüsyonu çıkarın ve fiksatif solüsyonu numune bloklarından 0,1 M PB ile 3 x 10 dakika durulayın.
Osmiyum tetroksit (_OsO4) boyama
1. Numune bloklarını OsO₄ çözeltisi ile sabitleyin (Malzeme Tablosuna bakın) 4 °C'de 1 saat.
2. OsO₄ çözeltisini çıkarın ve OsO₄ çözeltisini 3 x 10 dakika ddH₂O ile durulayın.ampbloklar.
Uranil asetat (UA) boyama
1. Numune bloklarını %2 UA çözeltisi kullanarak boyayın ( Malzeme Tablosuna bakın) 4 °C'de 1 saat.
2. UA çözeltisini çıkarın ve numune bloklarını ddH₂O ile 3 x 10 dakika durulayın.
Gradyan dehidrasyonu
1. Numune bloklarını gradyan etanol ile şu şekilde kurutun: 10 dakika boyunca %50, 10 dakika boyunca %70, 10 dakika boyunca %80, 10 dakika boyunca %90 ve %100 etanol içinde 2 x 10 dakika.
2. Numune bloklarını susuz asetonla 3 x 10 dakika kurutun.
Reçine infiltrasyonu
1. Numune bloklarına gradyan reçine ile sızın (Malzeme Tablosuna bakın): asetondan reçineye 3 saat boyunca 1:1, asetondan reçineye 1:1 2 saat, asetondan reçineye 1:3 3 saat.
2. Saf reçine ile 3 x 12 saat değiştirin.
Reçine gömme
1. Numune bloklarını bir kürdan kullanarak kapsüllere aktarın (Malzeme Tablosuna bakın).
2. Numune bloğunu içeren kapsüle saf reçine ekleyin ve reçineyi fırında 60 °C'de 14-16 saat polimerize edin.

3. Kapak camının altın nanopartiküllerle kaplanması

Kapak camı temizliği
1. Koruyucu gözlükleri temizleme tamponu ile (Malzeme Tablosuna bakın) 142 °C'de 2 saat yıkayın.
2. Temizleme tamponunu ddH₂O ile 3 x 10 dakika durulayın.
3. Kapak bardaklarını dikkatlice susuz etil alkol içeren bir behere aktarın ve gece boyunca inkübe edin.
4. Kapakları temiz bir tezgahta birkaç dakika havayla kurutun.
Kapak gözlüklerini altın nanopartiküllerle kaplayın.
1. Cam çimento kullanarak bir masaüstü santrifüjün dönüşünün ortasına bir cam sürgü sabitleyin (Malzeme Tablosuna bakın).
2. Yapışkan notlar kullanarak cam sürgünün ortasına bir kapak camı monte edin.
3. Kapak camına 75 μL% 1 pioloform ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın).
  NOT: Formvar'ı da test ettik (Malzeme Tablosuna bakın) ve iyi çalışıyor.
4. Kapak camının yüzeyinde ince bir pioloform tabakası oluşturmak için 1.360 × g'da (Şekil 2A) 3 dakika döndürün.
5. Kapak camı yüzeyini 250 μL% 0.1 poli-L-lizin ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin (Malzeme Tablosuna bakın) (Şekil 2B).
6. ddH₂O ile durulayın ve kapak camını birkaç dakika havayla kurutun.
7. 80 nm altın nanopartikülleri (Malzeme Tablosuna bakınız) ddH₂O ile% 25 (v / v, OD₆₀₀ = 0.07) (Malzeme Tablosuna bakınız) ile seyreltin ve 15 dakika boyunca sonikat yapın.
8. Kapak camı yüzeyini seyreltilmiş altın nanopartikülleri ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin (Şekil 2C).
9. ddH₂O ile durulayın ve kapak camını birkaç dakika havayla kurutun.
  NOT: Pioloform ve altın nanopartiküller ile kaplandıktan 2 hafta sonra iyi çalışır. Ancak kaplandıktan hemen sonra kullanmanızı öneririz.

4. Ultra ince kesit alma

Numune bloğunun yüzeyini dik açılı bir yamuk şeklinde kesin. Elmas bıçak kullanarak 100 nm kalınlığında kesitler kesin (bkz . Malzeme Tablosu) ve ultramikrotom (bkz. Malzeme Tablosu). Tek bir bölümü kesit bandından ayırın ve tek bölümü su banyosunda yüzdürün.
Altın nanopartikül kaplı kapak camının ortasına bir damla ddH₂O ekleyin. Bir numune döngüsü kullanarak bir kesit alın ve numune döngüsünü su damlasının yüzeyine ters çevirin. Numune halkasını çıkarın, bölümü su damlasının yüzeyinde bırakın.
Kapak camını birkaç dakika havayla kurutun. Bir keçeli kalem kullanarak kapak camının karşı tarafındaki bölümün etrafına bir halka çizin.

5. Işık mikroskobu görüntüleme

Floresan geri kazanımı
NOT: İş akışı Şekil 3A'da gösterilmiştir.
1. Kapak camındaki ultra ince bölüme 10 μL montaj tamponu ( Malzeme Tablosuna bakın) ekleyin. Montaj tamponuna yeni, temiz bir kapak camı yerleştirin.
  NOT: Montaj tamponunun temel bileşeni, floresan proteinlerin floresansını geri kazanmak için kullanılan DABCO'dur. Bu, floresan geri kazanımı için çok önemlidir.
2. Bu iki kapak camını ultra ince bölümle birlikte bir görüntüleme odasına koyun (bkz. Çizilmiş halkalı kapak camının üstte olduğundan emin olun.
Navigasyon haritasını toplayın.
1. Ters çevrilmiş bir floresan mikroskobunun parlak alan görüntüleme modunda bir işaretleyici olarak çizilen halkayı kullanan kesiti bulun (bkz. Bölümün bir köşesine gitme. Beyaz ışığı açın ve parlak alan görüntüsünü alın.
2. Beyaz ışığı kapatın. Lazeri (561 nm) açın ve aynı görüş alanının (FOV) floresan görüntülerini çekin.
3. Lazeri kapatın. Bu iki FOV'un %10 örtüştüğünden emin olarak bitişik FOV'a gidin. İkinci FOV'un parlak alan görüntüsünü ve floresan görüntüsünü alın.
4. Tüm bölüm kaplanana kadar bu işlemi tekrarlayın. FOV'u dikmek için kullanılabilecek görüntüleme yolunu kaydedin.
  NOT: Görüntünün daha yüksek kalitesi için konfokal mikroskobu kullanmanızı öneririz.
İlgilenilen görüntü hücreleri.
1. İlgilendiğiniz hücreleri kolayca hedeflemek için navigasyon haritasını kullanın. Lazeri (561 nm) açın ve ilgilendiğiniz hücrenin 300 kare floresan görüntüsünü alın. Lazeri kapatın.
2. Beyaz ışığı açın ve ardışık parlak alan görüntüleri (~100 kare) çekin.
3. İlgilendiğiniz başka bir hücreye gidin.

6. EM görüntüleme için hazırlık

NOT: İş akışı Şekil 3B'de gösterilmiştir.

Ultra ince bölümü yuva ızgarasına aktarın.
1. Bir cam kavanozu ddH₂O ile doldurun.
2. Kapak camlarını hazneden çıkarın ve iki kapak camını cımbızla ayırın. Bölümün bulunduğu kapak camını sıkıştırın, montaj tamponunu yıkayın ve havayla kurutun.
3. Tek taraflı bir bıçak kullanarak ultra ince bölümün etrafına bir # puan verin ve #'nin her köşesine 10 μL %12 hidroflorik asit (Malzeme Tablosuna bakın) damlatın. Kapak camını yavaşça suya koyun.
  NOT: Hidroflorik asit camla reaksiyona girerek pioloform filmin kapak camından çıkarılmasını kolaylaştırır. Hidroflorik asit toksiktir. Eldivenli kimyasal bir başlıkta kullanın. Cilt ile temas acil tıbbi müdahale gerektirir.
4. Pioloform filmi ve ultra ince bölümü su yüzeyinde birlikte yüzdürün. Izgaranın ortasındaki bölümü yakalamak için bölüme kaplanmamış bir yuva ızgarası yerleştirin.
5. Bir cam slaytı parafilm ile kaplayın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve ızgarayı pioloform filmle alın. Izgarayı oda sıcaklığında havayla kurutun.
Bölüm boyama
1. Bölümü% 2 UA ve Sato'nun üçlü kurşunu ile boyayın. Daha fazla ayrıntı için, daha önce yayınlanan protokol^2'ye bakın.

7. Görüntü analizi

Navigasyon haritasını birleştirin.
1. Ham verilerin konumunu bulun. Navigasyon haritasını dikmek için ImageJ yazılımını açın ( Malzeme Tablosuna bakın).
2. Eklentiler'e tıklayın | Dikiş | Izgara/Koleksiyon birleştirme | (Türü) Izgara: sütuna göre yılan | (Sipariş) Yukarı ve Sol (çekim sırasına göre) | Dilim boyutunu ayarlama | Veri yolunu seç | Dosya adını ayarla | Ekran füzyonunu kontrol edin. Farklı FOV'ların birkaç parlak alan görüntüsünden oluşan bir navigasyon haritası olan sonucu gözlemleyin.
3. Bir floresan navigasyon haritasını birleştirmek için aynı yöntemi kullanın.
Parlak alan görüntülerini floresan görüntülerle birleştirin.
1. ImageJ yazılımında, Dosya | İthalat | İlgilenilen hücrenin sıralı parlak alan görüntülerini içe aktarmak için Görüntü Sırası.
2. Resmin üzerine tıklayın | Yığınlar | Z Projeksiyon | Sıralı parlak alan görüntülerinin toplam yoğunluk projeksiyonu (SIP) görüntüsünü elde etmek için Dilimleri Topla.
3. Düzenle | Altın nanoparçacıkların sinyallerinin parlak beyaz noktalar haline gelmesi için parlak alanın SIP görüntüsünü ters çevirmek için ters çevirin.
4. ImageJ'de Dosya | İthalat | Sıralı FM görüntülerini içe aktarmak için Görüntü Sırası.
5. Resmin üzerine tıklayın | Yığınlar | Z Projeksiyon | Sıralı FM görüntülerinin SIP görüntüsünü elde etmek için Dilimleri Topla.
6. Resmin üzerine tıklayın | Renk | SIP parlak alan görüntüsünü SIP FM görüntüsüyle bileşik görüntü olarak birleştirmek için Kanalları Birleştir'i seçin.
7. Altın nanopartiküller yeşildir ve floresan proteini kırmızıdır. Resmin üzerine tıklayın | Türü | RGB Rengi , bileşik görüntünün formatını RGB'ye dönüştürmek için kullanılır.

8. EM görüntüleme

Izgaranın kesit tarafını yukarı doğru tutarak ızgarayı numune tutucusuna yerleştirin.
Ultra ince kesitin sağ yamuğunun dört farklı köşesine dört bağıl mesafe boyunca bir elektron mikroskobu altında karşılık gelen hücrelerin konumunu kabaca belirlemek için navigasyon haritasını kullanın.
Altın nanopartikülleri kullanarak hücreleri onaylayın.
Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile farklı büyütmelerde (4,200x, 6,000x veya 8,200x) EM görüntüleri çekin (Malzeme Tablosuna bakın).

9. FM görüntüsünün EM görüntüsü ile kaydedilmesi

Kayıt yazılımını açın (Malzeme Tablosuna bakın). Arama penceresine easyCLEMv0¹⁴yazın. easyCLEMv0'ı açmak için easyCLEMv0'a tıklayın. Resim/Sekans üzerine tıklayın | EM görüntüsünü ve bileşik görüntüyü yazılım paneline aktarmak için açın.
EasyCLEMv0 penceresinde, hizalama modu olarak rijit olmayan (2D veya 3D) seçmek için 2D'ye (x,y,[T]) tıklayın.
EasyCLEMv0 penceresinde, Kompozit (RGB)color.tif'yi seçmek için dönüştürülecek ve yeniden boyutlandırılacak görüntüyü seçin (muhtemelen FM) seçeneğinin sağındaki açılır kutuya tıklayın. Ardından, EMimage. tif seçmek için Değiştirilmeyecek (muhtemelen EM) görüntü seçin'in sağındaki açılır kutuya tıklayın.
Kaydı başlatmak için Başlat'a tıklayın.
EMimage. tif adlı EM görüntü penceresinde, Nokta 1'i altın nanoparçacığın üzerine koymak için bir altın nanoparçacığa tıklayın. Kompozit (RGB)color.tif adlı FM görüntü penceresinde, Nokta 1'i altın nanopartikülün üzerine koymak için karşılık gelen altın nanopartiküle tıklayın.
LM sinyalini altın nanopartiküllerin EM sinyaliyle onaylamak için Dönüşümü Güncelle'ye tıklayın.
Yukarıdaki işlemi EMimage. tif adlı EM görüntü penceresinde tekrarlayın ve LM sinyalini aynı altın nanoparçacığın EM sinyaliyle tek tek eşleştirin.
Kaydı tamamlamak için Durdur'a tıklayın.
Görüntü hizalamasından sonra, Üst üste bindirilmiş görüntü'ye tıklayın ve Görüntü/Sekans | Dört kanallı görüntüler (kırmızı, yeşil, mavi, gri) içeren bir görüntü yığınını dışa aktarmak için Farklı kaydet.
ImageJ'yi açın ve Dosya | Bindirmeli görüntüyü içe aktarmak için açın. Resmin üzerine tıklayın | Yığınlar | Katmanlara Yığ Görüntüsü dört kanallı görüntülere ayırmak için.
Resmin üzerine tıklayın | Renk | Üç kanaldaki (kırmızı, yeşil ve gri) görüntüleri bileşik bir görüntüde birleştirmek için Kanalları Birleştir.
Resmin üzerine tıklayın | Türü | RGB Rengi, bileşik görüntüyü bir CLEM görüntüsüne dönüştürmek için kullanılır.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Önceki raporlar, mScarlet'in lizozom^15'i hedefleyebileceğini gösterdi. Bu protokolde AAV eksprese eden mScarlet (rAAV-hSyn-DIO-mScarlet-WPRE-pA) stereotaksik aletler kullanılarak Vglut2-ires-cre fare beyninin M1 (ML: ±1.2 AP: +1.3 DV: -1.5) içine enjekte edildi. Yukarıda açıklanan protokolü takiben, nihai ilişkili görüntü Şekil 4A'da gösterilmektedir. FM görüntüsü, referans belirteçleri olarak altın nanopartiküller (yeşil noktalar) kullanılarak EM görüntüsüyle doğru bir şekilde hizalanabilir. EM görüntüsünde gösterildiği gibi (Şekil 4C, F), mScarlet lizozomu hedef aldı ve lizozomların içindeki içerikler heterojendir, bunlar ikincil lizozomun tipik özellikleridir.

figure-results-1
Şekil 1: Bağıntılı ışık ve elektron mikroskobuna şematik genel bakış. (A) Fare beyni hazırlığı. Adeno ile ilişkili virüsler fare beynine enjekte edildi. 30 gün sonra, fare beyin dilimlerinin floresan bölgeleri, EM numune hazırlığı için küçük bloklar halinde kesildi. (B) EM numune hazırlama. (C) Elmas bıçak kullanarak ultra ince kesit ve kapak camının şematik diyagramı. (D) FM görüntüleme ve TEM görüntüleme. Kısaltmalar: EM = elektron mikroskobu; FM = floresan mikroskobu; TEM = transmisyon elektron mikroskobu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Kapak camlarının altın nanopartiküllerle kaplanması. (A) Kapak camını santrifüjleme ile pioloform ile örtün. (B) Kapak camı yüzeyini poli-L-lizin ile inkübe edin. (C) Kapak camı yüzeyini seyreltilmiş altın nanopartikülleri ile inkübe edin. (D) Kaplanmış kapak camının şematik diyagramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: FM görüntüleme ve EM görüntüleme için hazırlık programı. (A) FM görüntüleme hazırlıklarının iş akışı beş adımdan oluşur: (i) ultra ince bölümün kepçelenmesi, (ii) Havayla kurutma, (iii) tampon eklendikten sonra ikinci bir kapak camının yerleştirilmesi, (iv) her iki kapak camının hazneye sabitlenmesi ve FM görüntüleme. (B) EM görüntüleme hazırlıklarının iş akışı da beş adımdan oluşur: (i) iki kapak camının ayrılması, (ii) ultra ince bölümün kaydırılması, (iii) ultra ince bölümün alınması, (iv) ultra ince bölümün yuva ızgarasına taşınması ve (v) EM görüntüleme. Kısaltmalar: EM = elektron mikroskobu; FM = floresan mikroskobu; TEM = transmisyon elektron mikroskobu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: mScarlet'in temsili CLEM görüntüsü. (A) Tüm nöronun CLEM görüntüsü. (B,E) İç kısmın CLEM görüntüleri. (C,F) İç kısmın EM görüntüleri. (D,G) İç kısmın floresan görüntüleri. Yeşil noktalar altın nanopartikülleri gösterir. Ölçek çubuğu = 5 μm (A), 1 μm (ek görüntüler). Kısaltmalar: EM = elektron mikroskobu; FM = floresan mikroskobu; CLEM = bağıntılı ışık ve elektron mikroskobu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan protokol, ışık mikroskobundan (LM) hedef proteinin lokalizasyon bilgisini ve elektron mikroskobundan (EM) hedef proteini çevreleyen bağlamı birleştirebilen çok yönlü bir görüntüleme ^yöntemidir6. Mevcut floresan proteinlerin sınırlamaları ile yaygın olarak kullanılan yöntem, korelasyon ışığı ve elektron mikroskobunun (CLEM) önceden gömülmesidir, bu da LM görüntülemenin EM numune hazırlığından önce yapıldığı anlamına gelir. Hemen hemen tüm mevcut floresan proteinler CLEM'in önceden gömülmesinde incelenebilir. Bununla birlikte, kaçınılmaz bozulmalar ve büzülmeler nedeniyle, son görüntünün doğru hizalanması imkansızdır⁶. Bu nedenle, CLEM'in önceden gömülmesiyle sağlanan bilgiler, EM görüntülemede LM tarafından görüntülenen aynı hücrenin ultra yapılarını kontrol etmektir.

Bu çalışma tarafından sağlanan yöntem, EM örnek hazırlandıktan sonra LM görüntülemenin yapıldığı gömme sonrası CLEM'dir. EM numune hazırlamadaki kimyasal fiksasyonun neden olduğu büzülme, nihai görüntünün doğru hizalamasını etkilemez. Ayrıca, hem LM görüntüleme hem de EM görüntüleme aynı bölümde ve altın nanopartiküllerin yardımıyla yapıldığından, nihai görüntü hizalaması çok doğru olabilir. Gömme sonrası CLEM, floresan proteinlerin geleneksel EM numune hazırlığından sonra bir floresan sinyalini tutmasını gerektirir. Daha önce, gömme reçine⁸ olarak Epon kullanarak floresan sinyallerini tutabilen mEosEM adlı ilk floresan proteini bildirmiştik. Gömme reçineleri olarak diğer reçinelerle karşılaştırıldığında, Epon üstün üst yapı koruma ve kesit alma özelliklerine sahiptir. mEosEM'yi takiben, mKate2^11,16, mCherry2^10,17, mWasabi^10,18, CoGFPv0^10,19, mEosEM-E⁸, mScarlet ^8,20, mScarlet-I ^8,20, mScarlet-H ^8,20 ve HfYFP⁹ gibi diğer dirençli Epon gömücü floresan proteinler bildirilmiştir.

Deneyimlerimize göre, mScarlet diğer floresan proteinlerden daha üstündür. Fiksatif çözelti, floresan proteinlerin floresansını etkileyebilir. Genel olarak, paraformaldehitin (PFA) fiksasyon ilerleme hızı, glutaraldehitinkinden (GA) çok daha yavaştır; tersine, PFA numuneye daha büyük GA'dan daha hızlı nüfuz eder. PFA ve GA'nın bir karışımı, numunenin kalitesini koruyacak kadar hızlı, ancak oksidasyon gibi numune hasarının meydana gelmeyeceği kadar yavaş sabitlenmesi arasında bir denge sağlar. Daha yüksek GA konsantrasyonu daha yüksek otofloresan üretecektir. Deneyimlerimize göre, reçine bloğundaki mScarlet'in floresansı polimerizasyondan 6 ay sonra tespit edilebilir. Ancak polimerizasyondan hemen sonra CLEM görüntüleme yapılmasını öneriyoruz.

CLEM gömme sonrası bir diğer önemli faktör, LM görüntüsünün EM görüntüsüyle doğru bir şekilde nasıl kaydedileceğidir. Daha önce bildirilen yöntemlere ^6,21 dayanarak, protokolde bazı değişiklikler yaptık. Birincisi, EM görüntülemede LM tarafından görüntülenen aynı hücrenin nasıl bulunacağıdır. DIC ve floresan görüntüleme modunu kullanarak tüm ultra ince bölümün navigasyon haritasını dikmek için farklı FOV'lar aldık. Navigasyon haritası kullanılarak, ilgilenilen hücreler kolayca tanımlanabilir. Diğer bir gelişme, doğru görüntü hizalamasıdır. Önceden, floresan görüntüleme modunda floresan sinyalini ve altın nanopartiküllerin EM görüntüleme modunda yüksek elektron kontrast sinyalini referans hizalama belirteçleri⁶ olarak kullandık. Bununla birlikte, mScarlet kullanıldığında, mScarlet'in floresan sinyali, altın nanopartiküllerin floresan sinyalinden çok daha yüksekti ve altın nanopartiküllerin floresan sinyalini tespit etmek zordu. Bu sorunu çözmek için, floresan sinyali yerine kayıt için altın nanopartiküllerin parlak alan sinyalini kullandık. Bu değiştirilmiş protokolü takiben, gömme sonrası CLEM'i gerçekleştirmek kolaydı.

Ancak, mevcut protokolün kullanılmadan önce dikkate alınması gereken bazı sınırlamaları vardır. Aşırı ekspresyon sisteminde iyi çalışmasına rağmen, hedef proteinler doğal promotörleri^22'nin altındaysa floresan oldukça zayıftır. Diğer bir sınırlama, mScarlet'in EM numune hazırlığından sonra yeterli floresan sinyallerini tutabilen ve memeli hücrelerinde iyi çalışan en iyi floresan protein (deneyimlerimize göre) olmasına rağmen, mScarlet'i nöronlarda floresan etiketi olarak kullanırken bir sorun olacaktır, bu da hedef proteinlerin yanlış konumuna yol açabilir¹⁵. Bu durumlarda, nöronlarda iyi çalışan mScarlet'in bir mutasyonu olan oScarlet^15'i kullanmanızı öneririz.

Bu değiştirilmiş protokolün potansiyel uygulamaları iki kategoriye ayrılabilir. Birincisi, hücre altı seviyeye yakınlaştırmaktır, bu da hedef proteini hücre altı bağlamda incelemek anlamına gelir. Daha önce yayınlanan raporlarımızda, bir γ-herpes virüsü²³ enfeksiyonu sırasında sitoplazmik virion montaj kompartmanlarının (cVAC'ler) oluşumunu incelemek için gömme sonrası CLEM kullandık. Gelecekteki uygulamalarda, gömme sonrası CLEM, hedef proteinlerin 3D dağılımını elde etmek ve 3D yapıyı doğal olarak çözmek için elektron tomografisi ile birleştirilebilir²⁴. İkinci tür potansiyel uygulama, nöral devreleri çizmek ve analiz etmek için kullanılabilen hücresel seviyeye uzaklaşmaktır. Yüksek çözünürlük kabiliyeti nedeniyle EM, ince beyin bağlantılarını haritalamanın etkili bir yolu haline geldi. Bununla birlikte, EM, nöronların kimliklerini doğru bir şekilde sağlayamaz, bu da nöronal devrenin derinlemesine analizini sınırlar. Epon post-embedding CLEM, üst yapılardan ödün vermeden nöronların kimliklerini nöronal devreye getirme potansiyeline sahiptir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların beyan edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu proje, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Zhifei Fu'ya 32201235), Çin'in Fujian Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (2022J01287'den Zhifei Fu'ya), Fujian Tıp Üniversitesi'ndeki İleri Yetenekler Araştırma Vakfı, Çin (XRCZX2021013'den Zhifei Fu'ya), Çin'in Fujian Eyaleti Finans Özel Bilim Vakfı (22SCZZX002'den Zhifei Fu'ya), NHC İnsan Olmayan Primat için Doğurganlık Düzenlemesinin Teknik Değerlendirmesi Anahtar Laboratuvarı ve Fujian Doğum ve Çocuk Sağlığı Hastanesi'nin kurulması (2022-NHP-04'ten Zhifei Fu'ya). Fujian Tıp Üniversitesi Kamu Teknoloji Hizmet Merkezi'nden Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin ve Yan Hu'ya EM numune hazırlama ve EM görüntüleme konusundaki destekleri için teşekkür ederiz.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
0,2 M Fosfat Tamponu (PB)			NaH2PO < alt >4 < / alt> ve orta nokta; 2H2O + Na < alt >2 < / alt >HPO< alt >4 < / alt > ve orta nokta 12H < alt > 2 < / alt >O
0,2 M Tris-Cl (pH 8.5)	Şanghay yuanye Biyo-Teknoloji	R26284
%25 Glutaraldehit (GA)	Alfa Aesar	A17876	Tehlikeli kimyasal
Abbelight 3D	Amonyum
hidroksit	10000418		SCR
	K Scientific	335213
BioPhotometer D30	eppendorf
Kapak camlarının			50 mL Amonyum hidroksit, 50 mL Hidrojen peroksit, 250 mL H₂O
Coverglass	Warner	64-0715
DABCO	Sigma	290734	Tehlikeli kimyasal
DDSA	SPI şirketi	GS02827	Tehlikeli kimyasal
Masaüstü santrifüj	WIGGENS	MINICEN 10E
Elmas bıçak	DiATOME	MX6353
DMP-30	SPI şirketi	GS02823	Tehlikeli kimyasal
DNA transfeksiyon reaktifi	Thermo Fisher	2696953	Lipofectamine 3000 Transfeksiyon
Kiti Epon 812	SPI şirketi	GS02659	Fiji
10009218		Etanol	SCR
image J	Ulusal Sağlık
Enstitüleri Fiksatif çözüm			% 4 PFA+% 0.25 GA + 0.02 M PB
Formvar	Sigma	9823
Gliserol	SCR	10010618
Altın nanopartiküller	Korpüsküler	790120-010
Gradyan reçine			Aseton reçineye 3: 1, 1: 1, 1: 3
Hidroflorik asit	SCR	10011118
Hidrojen peroksit	SCR	10011218
ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/)			Easy CLEMv0 Eklentisi
Görüntüleme odası	Thermo Fisher	A7816
Büyük jelatin kapsüller	Elektron Mikroskobu Bilimleri	70117
Montaj tamponu			Mowiol 4-88, Gliserol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO
Mowiol 4-88	Sigma	9002-89-5
Na2HPO₄ ž12H2O	SCR	10020318
NaH2PO₄ ž2H2O	SCR	20040718
	NMA SPI şirketi	GS02828	Tehlikeli kimyasal
Oligonükleotid primerleri	Takara Biyomedikal Teknolojisi (Pekin)		Vglut2-ires-Cre ve vahşi tipi aynı anda tespit etmek için üç oligonükleotid primeri kullanıldı. 5^{, < / sup>-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3^{, < / sup> ve 5^{, < / sup>-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3^{, < / sup> primerleri Vglut2-ires-Cre'yi tespit etmeyi amaçladı. Astarlar 5^,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3^, ve 5^,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3^, vahşi türü tespit etmeyi amaçladı.}}}}
Salınımlı mikrotom	Leica	VT1000S
Osmiyum tetroksit	SCR	L01210302	Tehlikeli kimyasal
OsO₄ çözeltisi			% 1 Osmiyum tetroksit +% 1.5 K_{4< / sub>Fe (CN)_{6< sub> ve orta nokta; 3H₂O}}
Parafilm	Amcor	PM-996
Paraformaldehit (PFA)	SCR	80096618	Tehlikeli kimyasal
Perfüzyon tamponu			%4 PFA+0.1 M PB
Pioloform	Sigma	63148-65-2	Tehlikeli kimyasal
Poli-L-lizin	Sigma	25986-63-0
Potasyum ferrosiyanür (K_{4< / sub>Fe (CN)_{6< / sub> ve orta nokta; 3H2O)}}	SCR	10016818
Neşter bıçakları	Merck	S2771
Neşter sapları	Merck	S2896-1EA
Stereomikroskop	OLYMPUS	MVX10
Transgenik fareler	Jackson Laboratuvarı		Vglut2-ires-Cre fareleri (suş: 129S6/SvEvTac) standart koşullarda (25 &°; C, 12 saatlik bir aydınlık/karanlık döngüsü, ad libitum verilen su ve yiyecekle. Erkek ve Dişi fareler 2&ndash'ta kullanıldı; 3 aylık, kilo aralığı 20-30 g.
Transmisyon elektron mikroskobu (TEM)	FEI		TECNAL G2
UA çözeltisi (%2 UA)			Sulu çözelti
Ultramikrotom	Leica LEICA	EM UC6
Uranil asetat (UA)	TED PELLA	19481	Tehlikeli kimyasal

J& Aseton temizleme tamponu tehlikeli kimyasal

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples. Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).
Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat Methods. 8 (1), 80-84 (2011).
Johnson, E., et al. Correlative in-resin super-resolution and electron microscopy using standard fluorescent proteins. Sci Rep. 5 (1), 9583(2015).
Paez-Segala, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
Fu, Z., et al. mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
Peng, D., et al. Improved fluorescent proteins for dual-colour post-embedding CLEM. Cells. 11 (7), 1077(2022).
Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
Tanida, I., et al. Two-color in-resin CLEM of Epon-embedded cells using osmium resistant green and red fluorescent proteins. Sci Rep. 10 (1), 21871(2020).
Tanida, I., Kakuta, S., Oliva Trejo, J. A., Uchiyama, Y. Visualization of cytoplasmic organelles via in-resin CLEM using an osmium-resistant far-red protein. Sci Rep. 10 (1), 11314(2020).
MacManus, D. B. Excision of whole intact mouse brain. MethodsX. 10, 102246(2023).
Lu, X., et al. Preserving extracellular space for high-quality optical and ultrastructural studies of whole mammalian brains. Cell Rep Methods. 3 (7), 24(2023).
Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nat Methods. 14 (2), 102-103 (2017).
Fenno, L. E., et al. Comprehensive dual- and triple-feature intersectional single-vector delivery of diverse functional payloads to cells of behaving mammals. Neuron. 107 (5), 836-853 (2020).
Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).
Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PLoS One. 12 (2), e0171257(2017).
Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6 (13), 1741(2008).
Ogoh, K., et al. Dual-color-emitting green fluorescent protein from the sea cactus Cavernularia obesa and its use as a pH indicator for fluorescence microscopy. Luminescence. 28 (4), 582-591 (2013).
Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
Xu, P., Xu, T., Zhang, M., Fu, Z., He, W. A protocol for Epon-embedding-based correlative super-resolution light and electron microscopy. Research Square. , (2019).
Johnson, E., Kaufmann, R. Preserving the photoswitching ability of standard fluorescent proteins for correlative in-resin super-resolution and electron microscopy. Methods Cell Biol. 140, 49-67 (2017).
Zhou, S., et al. Liquid-liquid phase separation mediates the formation of herpesvirus assembly compartments. J Cell Biol. 222 (1), 17(2023).
Tao, C. L., et al. Differentiation and characterization of excitatory and inhibitory synapses by cryo-electron tomography and correlative microscopy. J Neurosci. 38 (6), 1493-1510 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Epon Post Gömme Korbağıntılı Işık ve Elektron Mikroskobu

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles