Yöntem makalesi

Jiawei Shengjiang San'ın Diyabetik Nefropatinin Sıçan Modeli Üzerindeki Antagonistik Etkisi: EGFR / MAPK3 / 1 Sinyal Yolu ile İlgili

1.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66179

⸱

10 Mayıs 2024

 ,  ,  ,  , 
1Graduate School, Hebei University of Chinese Medicine, 2School of Basic Medical Sciences, Hebei University of Chinese Medicine, 3Department of Endocrinology and Nephrology, Renal Research Institute of Beijing University of Chinese Medicine, Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, 4Hebei Province Academy of Chinese Medicine Sciences, 5Department of Nephrology, First Affiliated Hospital, Hebei University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Burada, diyabetik nefropati tedavisinde Jiawei Shengjiang San'ın (JWSJS) etki mekanizmasını keşfetmek için ağ farmakolojisi ve moleküler yerleştirme tekniklerini tanımlayan bir protokol sunuyoruz.

Özet

Jiawei Shengjiang San'ın (JWSJS) diyabetik nefropati tedavisinde ve ağ farmakolojisini dağıtma eylemini destekleyen mekanizmaları araştırmayı amaçladık. Ağ farmakolojisi ve moleküler yerleştirme tekniklerini kullanarak, JWSJS'nin aktif bileşenlerini ve hedeflerini tahmin ettik ve titiz bir "ilaç-bileşen-hedef" ağı oluşturduk. JWSJS'nin terapötik yolaklarını ve hedeflerini ayırt etmek için gen ontolojisi (GO) ve Kyoto genler ve genomlar ansiklopedisi (KEGG) zenginleştirme analizleri kullanıldı. Moleküler yerleştirme doğrulaması için Autodock Vina 1.2.0 konuşlandırıldı ve yerleştirme sonuçlarını doğrulamak için 100 ns'lik bir moleküler dinamik simülasyonu gerçekleştirildi, ardından in vivo hayvan doğrulaması yapıldı. Bulgular, JWSJS'nin diyabetik nefropati ile kesişen 227 hedefi paylaştığını ve bir protein-protein etkileşim ağı topolojisi oluşturduğunu ortaya koydu. KEGG zenginleştirme analizi, JWSJS'nin lipidleri ve aterosklerozu, PI3K-Akt sinyal yolağını, apoptozu ve HIF-1 sinyal yolunu modüle ederek diyabetik nefropatiyi hafiflettiğini, mitojenle aktive olan protein kinaz 1 (MAPK1), MAPK3, epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) ve serin / treonin-protein kinaz 1 (AKT1) ile çoklu yolların toplu hedefleri olarak tanımlandı. Moleküler yerleştirme, JWSJS'nin temel bileşenlerinin (quercetin, palmitoleik asit ve luteolin), hidrojen bağı yoluyla üç önemli hedefle (MAPK1, MAPK3 ve EGFR) konformasyonu stabilize edebileceğini iddia etti. İn vivo incelemeler, JWSJS'ye bağlı olarak vücut ağırlığında kayda değer bir artış ve glikasyonlu serum proteini (GSP), düşük yoğunluklu lipoprotein kolesterol (LDL-C), üridin trifosfat (UTP) ve açlık kan şekeri (FBG) seviyelerinde azalma olduğunu gösterdi. Hematoksilen ve eozin (HE) ve Periyodik asit-Schiff (PAS) boyama ile birleştirilmiş elektron mikroskobu, her tedavi grubunun böbrek hasarını çeşitli derecelerde hafifletme potansiyelini vurguladı, p-EGFR, p-MAPK3 / 1 ve BAX'ta çeşitli düşüşler sergiledi ve tedavi edilen sıçanların böbrek dokularında BCL-2 ekspresyonunda artışlar. Sonuç olarak, bu içgörüler, JWSJS'nin diyabetik nefropati üzerindeki koruyucu etkinliğinin, EGFR / MAPK3 / 1 sinyal yolunun aktivasyonunu baskılamak ve renal hücre apoptozunu hafifletmek ile ilişkili olabileceğini düşündürmektedir.

Giriş

Diabetes mellitus (DM), diyabetik nefropati (DN), retinopati ve nöropati gibi sürekli hiperglisemiye bağlı çeşitli komplikasyonlara neden olabilen ve birden fazla sistemi etkileyen kronik bir hastalıktır1. DN, DM'nin ciddi bir komplikasyonudur ve son dönem böbrek yetmezliğinin (SDBY) yaklaşık %30-50'sini oluşturur2. Klinik belirtisi, artmış glomerüler hacim, mezanjiyal stromal hiperplazi ve kalınlaşmış glomerüler bazal membran3 ile karakterize SDBY'ye ilerleyebilen mikroalbüminüridir. DN'nin patogenezi karmaşıktır ve tam olarak aydınlatılamamıştır. Kan şekerini düşürmek, kan basıncını düzenlemek, proteinüriyi azaltmak gibi klinik yöntemler çoğunlukla ilerlemesini geciktirmek için kullanılır ancak etkisi geneldir.

Şu anda, DN4'ü tedavi etmek için spesifik bir ilaç bulunamamıştır. Bununla birlikte, yüzyıllar boyunca, Çin bitkisel ilaçları DM ve komplikasyonlarınıntedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır 5 ve hastaların klinik semptomlarını iyileştirmiş ve hastalığın ilerlemesini geciktirmiştir. Çok bileşenli, çok hedefli ve çok yolaklı etkilerin avantajları nedeniyle, Çin bitkisel ilaçlarının DN6 tedavisi için yenilikçi bir ilaç kaynağı olması beklenmektedir.

"Shengjiang san", Ming Hanedanlığı tıp doktoru Gong Tingxian tarafından "Wanbing Huichun" dan gelmektedir. "Neifu Xianfang" kitabı, Bombyx Batryticatus, Cicadae Periostracum, Curcumaelongae Rhizoma ve Radix Rhei et Rhizome'un kullanımını açıklar. Buna dayanarak, Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba ve Smilacis Glabrae Rhixoma'yı ekledikten sonra, shengjiang san'ın berraklığı artırma, bulanıklığı azaltma, durgun "ısıyı" serbest bırakma ve "qi" ile kanı uyumlu hale getirme işlevini yerine getirir 7,8. Ayrıca dalağı güçlendirme ve böbrekleri tonlama etkisini arttırır. Etkinliği, DN'nin "qi" nin "hayati enerji" eksikliği, aşırı kuruluk ve "ısı" ve üçlü bir enerji vericinin neden olduğu "ısı" durgunluğu nedeniyle düzensiz yükselmesi ve düşmesi patogenezi ile tutarlıdır 7,8.

Önceki klinik çalışmalar, Çin bitkisel ilaçlarının DM ve komplikasyonlarını tedavi etmek için kullanıldığını göstermiştir ve jiawei shengjiang san'ın (JWSJS) kan şekerini ve lipitleri düzenlediği, proteinüriyi azalttığı ve erken DN7'li hastaların klinik etkinliğini önemli ölçüde iyileştirdiği gösterilmiştir. JWSJS'nin DN sıçanlarında idrar proteini ve kan şekeri düzeylerini düşürme yeteneği önceki çalışmalarla doğrulanmıştır. Bu muhtemelen TXNIP/NLRP3 ve RIP1/RIP3/MLKL sinyal yolaklarını inhibe ederek, podosit piroptozunu azaltarak ve DN sıçanlarının böbrek dokularında nekrotik apoptozu önleyerek ve böylece böbrek korumasısağlayarak gerçekleşir 9. JWSJS, DN sıçanlarında nefrin ve podosin protein ekspresyonunu yukarı regüle edebilir ve podosit hasarını azaltabilir, böylece JWSJS'nin podosit hasarı üzerinde inhibe edici bir etkiye sahip olduğunu düşündürür. JWSJS, iyi güvenlik profillerine sahip belirli bir anti-DN etkisine sahiptir, ancak bu konuda çok az araştırma vardır ve bu çalışma çoğunlukla piroptoz ve nekrotik apoptoz üzerine odaklanmaktadır. Literatür yeterince derin veya sistematik değildir10. Önceki bulgularımız, JWSJS'nin DN sıçanlarındaproteinüriyi azaltabileceğini ve böbrek hasarını hafifletebileceğini doğrulamıştır 7. Bununla birlikte, DN tedavisi için JWSJS'nin mekanizması hakkında sadece birkaç çalışma vardır ve bunlar derinlik ve sistematizasyondan yoksundur. Bu nedenle, bu çalışma, ağ farmakolojisi kullanarak DN tedavisi için JWSJS'nin moleküler maddelerini ve etki mekanizmalarını analiz etmeyi ve gelecekteki araştırmalar için sağlam bir temel sağlamayı amaçlamaktadır.

Ağ farmakolojisi, keminformatik, ağ biyolojisi, biyoinformatik ve farmakoloji dahil olmak üzere ilaç etki mekanizmasını incelemek için ortaya çıkan bir yöntemdir 11,12. Ağ farmakolojisi araştırma tasarımı, geleneksel Çin tıbbının bütünsel kavramınaoldukça benzer 13,14 ve Çin bitkisel ilaçlarının mekanizmasını incelemek için önemli bir yöntemdir. Moleküler kenetlenme, moleküller arasındaki etkileşimleri inceleyebilir ve bağlanma modellerini ve afinitelerini tahmin edebilir. Moleküler yerleştirme, bilgisayar destekli ilaç araştırmaları alanında kritik bir teknik olarak ortaya çıkmıştır15. Bu nedenle, bu çalışma, JWSJS ile DN tedavisinin daha fazla araştırılması için güvenilir ve teorik bir temel sunan ağ farmakolojisi ve moleküler yerleştirme yöntemleri aracılığıyla bir JWSJS-DN-hedef etkileşim ağı oluşturmuştur.

Protokol

Tüm hayvanlar, ABD Ulusal Araştırma Konseyi Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu, 8. Baskı'ya uygun olarak korunmuş ve kullanılmış ve ARRIVE kılavuzlarında16,17 önerildiği şekilde rapor edilmiştir. Çalışma, Çin Ulusal Araştırma Konseyi Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak yürütüldü ve Hebei Çin Tıbbı Üniversitesi (DWLL2019030) Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı.

1. JWSJS aktif bileşenleri ve hedef toplama

  1. Tüm kimyasal bileşenleri almak için geleneksel Çin tıbbı sistemleri farmakoloji veritabanı ve analiz platformu (TCMSP) veritabanına18 tıbbi bileşim JWSJS'yi (Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba, Smilacis Glabrae Rhixoma, Radix Rhei et Rhizome ve Curcumaelongae Rhizoma) girin.   Absorpsiyon, dağılım, metabolizma ve boşaltım (ADME) ekranına göre oral biyoyararlanım (OB≥) %30 ve ilaç benzeri özelliklere (DL) göre ≥ 0.18 kimyasal bileşen19,20.
  2. Kimyasal bileşenlerin karşılık gelen hedeflerini almak için TCMSP veritabanını (https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php, Sürüm 2.3) kullanın.
  3. Geleneksel Çin Tıbbı ve Kimyasal Bileşim veritabanlarında arama yaparak Bombyx Batryticatus ve Cicadae Periostracum'un aktif bileşenlerini elde edin21.
  4. Deneysel güvenilirlik için, bu çalışma için kimyasal özet servisi (CAS) numaralarına sahip bileşikleri seçin. Ardından PubChem'den (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/, 2021'de güncellendi)22 aktif bileşenlerin 2B yapı diyagramlarını (.sdf formatı) indirin.
  5. İlaç benzerliği olarak gastrointestinal (GI) absorpsiyonu yüksek olan bileşenleri (Lipinski, Ghose, Veber, Egan, Muegge) taramak için SwissADME (www.swissadme.ch, 2021'de güncellendi)23kullanın ve ≥ 2 maddesi 'Evet' idi. Bu, Bombyx Batryticatus ve Cicadae Periostracum'un aktif bileşenlerine yol açtı.
  6. Hedef protein tahmini için bunları TCMSP veritabanına aktarın (https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php, Sürüm 2.3)18.
  7. UniProt veritabanındaki (https://www.uniprot.org, 2021'de güncellendi) hedefleri, durumu İncelendi ve türler İnsan24 olarak ayarlanarak standartlaştırın.

2. DN'ye karşılık gelen hedef koleksiyon

  1. GeneCards (https://www.genecards.org/, Sürüm. 5.1)25, OMIM (https://omim.org/, 2021'de güncellendi)26, TTD (http://db.idrblab.net/ttd/, 2021'de güncellendi)27, PharmGKB (https://www.pharmgkb.org/, 2021'de güncellendi)28 ve DrugBank veritabanları (https://www.drugbank.ca/, 2021'de güncellendi)29. Birleştirdikten ve tekilleştirdikten sonra DN hedeflerini elde edin.
  2. JWSJS ve DN'nin ortak hedeflerinin taranması ve ağ inşası
    1. R 4.2.0 yazılımını kullanarak JWSJS ve DN'nin ortak hedeflerini tarayın ve Venn diyagramları çizin. İlaçlar, bileşenler, hedefler ve hastalıklar arasındaki bağlantıyı görselleştiren bir İlaç-Bileşen-Hedef ağ diyagramı oluşturmak için JWSJS'nin aktif bileşenlerini ve potansiyel hedeflerini Cytoscape 3.8.0 yazılımına30 aktarın.
    2. Düğümün boyutunun derece değerinin boyutunu yansıtmasına izin verin, burada daha yüksek bir derece değeri düğümün ağda daha önemli olduğunu gösterir.
  3. PPI protein-protein etkileşim ağının oluşturulması ve temel hedeflerin taranması
    1. Bir protein-protein etkileşimi (PPI) ağı oluşturmak için çevrimiçi platform STRING'i (Sürüm:11.5) kullanarak kesişen genleri analiz edin31. Çoklu Protein analiz modunu kullanarak ağı oluşturun, türü Homo sapiens olarak ayarlayın ve gereken minimum etkileşim puanını >0.930 olarak ayarlayın.
    2. Cytoscape 3.8.0'ı kullanarak ağı topolojik olarak analiz edin, aradaki merkezilik (BC), yakınlık merkeziliği (CC), derece merkeziliği (DC), Özvektör merkeziliği (EC), yerel ortalama bağlantı tabanlı yöntem (LAC) ve her düğüm için ağ merkeziliği (NC) değerlerini hesaplayın ve tüm değerleri medyan32'den büyük olan altı düğümü süzün. DN tedavisi için JWSJS'nin temel hedeflerini belirlemek için bu işlemi birkaç kez tekrarlayın.
  4. GO fonksiyonel analizleri ve KEGG yolu zenginleştirme analizi
    1. JWSJS ve DN'nin ortak hedefleriyle ilişkili biyolojik süreçleri, moleküler fonksiyonları, hücresel bileşenleri ve yolları belirlemek için GO ve KEGG zenginleştirme analizleri gerçekleştirin.
    2. Kuruluşu kullanın . Kesişim hedeflerinin kimliklerini almak için Hs.eg.db paketi açın ve clusterProfiler, org'u kullanın. Zenginleştirme analizleri için Hs.eg.db, Enrichplot ve Ggplot2 paketleri33.
    3. Düzeltilmiş P

3. Moleküler yerleştirme

  1. JWSJS çekirdek bileşenleri ile DN tedavisi34 için temel hedefler arasında moleküler yerleştirme gerçekleştirmek için AutoDock Vina yazılımını kullanın.
  2. JWSJS çekirdek bileşenlerinin 2B yapısının sdf dosyasını elde etmek için PubChem veritabanında arama yapın. 3D yapısını oluşturmak ve optimize etmek için ChemBio 3D Ultra14.0 yazılımını kullanın, mol2 formatında kaydedin ve bir ligand dosyası olarak kullanın.
  3. Yapısal Biyoinformatik Araştırma İşbirliği (RCSB) Protein Veri Bankası (PDB) veritabanından çekirdek hedeflerin 3B yapısının pdb formatını bulun ve indirin. Protein yapısından su moleküllerini ve ligandları çıkarmak, pdb formatında kaydetmek ve bir reseptör dosyası olarak kullanmak için Pymol 2.4.0 yazılımını kullanın.
  4. Reseptör pdb dosyasını hidrojenasyon için AutoDockTools 1.5.7 yazılımına aktarın, hem reseptör proteinini hem de küçük moleküllü ligandı pdbqt formatına dönüştürün, Aralık katsayısı 1'e ayarlanmış reseptör proteini için aktif cebi ayarlayın.
  5. Moleküler yerleştirme için Autodock vina 1.2.0'ı kullanın ve bağlanma enerjisini hesaplayın; Afinite < 0 ise, molekülün protein ile kendiliğinden bağlandığını düşünün, Afinitenin daha büyük mutlak değeri, aralarında daha kararlı bir bağlanma olduğunu gösterir. Son olarak, Pymol 2.3.0 ve LigPlot 2.2.5 yazılımını kullanarak yerleştirme sonuçlarını görselleştirin.

4. Moleküler dinamik simülasyon

  1. Desmond yazılımını kullanarak MD simülasyonları gerçekleştirmek için şu adımları izleyin:
    1. Protein-ligand etkileşimlerinin kararlılığını ve esnekliğini değerlendirmek için Desmond yazılımının 2019-1 akademik sürümünü kullanın.
    2. Kenetlenme çalışmalarından elde edilen en umut verici ligand komplekslerinin üçlüsü üzerinde moleküler dinamik (MD) araştırmalar yapın. Fizyolojik iyonik koşulları çoğaltarak 0,15 M NaCl içeren bir SPC sulu ortamda simülasyonlar gerçekleştirin. Simülasyon kutusu, çözünen maddenin sınırlarından en az 10 şuzakta kalmasını sağlamak için tasarlanmıştır. Sistemin elektrik yükünü nötralize etmek için karşı iyonlar tanıtılır. Ek olarak, OPLS 2005 kuvvet alanının parametreleri tarafından yönetilen periyodik sınır koşulları uygulanır.
    3. Desmond varsayılan parametrelerini kullanarak 100 ps için bir enerji minimizasyonu aşaması başlatın.
    4. Tüm üretim MD sistemlerinde Nosé-Hoover zinciri ve Martyna-Tobias-Klein metodolojileri aracılığıyla 26,85 °C (300 K) ve 1,01325 bar'da sıcaklık ve basınç stabilizasyonu sağlayın. Moleküler dinamik simülasyonu, toplam 100 ns'lik bir süre boyunca 2 fs'lik bir zaman adımı ile yürütülür ve atomik koordinatlar her 100 ps'de bir kaydedilir.
    5. Simülasyon etkileşimleri diyagramı (SID) modülünü açın. Simülasyon sonuç veri dosyalarını modüle yükleyin.
    6. Modülde bulunan seçeneklerden istediğiniz analiz türünü seçin (örneğin, kök-ortalama-kare sapması [RMSD], kök ortalama kare dalgalanması [RMSF], hidrojen bağı analizi, vb.). Seçilen analiz türü için gereken ek parametreleri belirtin.
    7. Analiz Et veya Başlat düğmesine tıklayarak analizi çalıştırın.
    8. Analiz tamamlandıktan sonra, sonuçları SID modülü arayüzünde görüntüleyin ve yorumlayın. Gerekirse daha fazla kullanım veya sunum için sonuçları dışa aktarın.

5. Hayvan deneyi doğrulaması

  1. Hayvanlar ve deney tasarımı
    NOT: Bu çalışma, SPF dereceli bir hayvan üretim tesisinden elde edilen ve vücut kütlesi 150 g ± 20 g olan 8 haftalık 75 erkek Sprague-Dawley sıçanını içermektedir (hayvansal üretim sertifikası numarası SCXK [Hebei] 2018-004).
    1. Sıçanları SPF düzeyinde bir hayvan laboratuvarında barındırın ve 1 haftalık adaptif beslenmeden sonra rastgele normal ve model gruplarına bölün. Normal gruba normal bir diyet, model gruba ise yüksek şekerli ve yüksek yağlı bir diyet sağlayın. 4 hafta sonra, fareleri oruç tutun, ancak 12 saat boyunca sudan mahrum etmeyin.
    2. Model grubuna intraperitoneal Streptozotosin enjeksiyonu (STZ; 35 mg · kg-1) enjekte edin. 72 saat sonra, kuyruk damarı kan örneklemesi ile kan şekeri seviyelerini test edin. Açlık kan şekeri seviyesi ≥16.7 mmol· L-1, başarılı bir diyabetik model olarak onaylayın.
    3. Sıçan böbreğindeki histopatolojik değişiklikleri gözlemleyerek başarılı DN modelini onaylayın.
    4. Başarılı bir şekilde çoğaltılan modelleri, 4.37 g / kg, 8.73 g / kg ve 17.46 g / kg (klinik eşdeğer dozun 3.2, 6.3 ve 12.6 katına eşdeğer) JWSJS alan model grubuna rastgele bölün ve ayrıca bir irbesartan grubu (0.014 g / kg). Her grup 10 sıçandan oluşuyordu. Tüm ilaçları günde bir kez oral gavaj yoluyla uygulayın. Bu doz rejimini 4 hafta boyunca tutarlı bir şekilde sürdürün.
    5. % 1 pentobarbital sodyum (50 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyon kullanarak sıçanları uyuşturun ve pedal çekme refleksi kaybıyla uygun anesteziyi doğrulayın. Ötenaziden önce abdominal aorttan kan örnekleri toplayın.
    6. 150 mg / kg'lık bir dozda intraperitoneal sodyum pentobarbital enjeksiyonu kullanarak sıçanları ötenazi yaptıktan sonra böbrekleri toplayın.
      NOT: Hayvanlar, ötenazi için en güncel Amerikan Veteriner Hekimler Birliği (AVMA) yönergelerine (https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals) uygun olarak insancıl bir şekilde ötenazi yapıldı.
  2. Renal histoloji analizleri
    NOT: Böbrek dokuları% 4 paraformaldehit içinde sabitlendi ve 48 saat sonra etanolde dehidre edildi; Bölümler parafine gömüldü. Kesitler hematoksilen ve eozin (HE) ve Periyodik asit-Schiff (PAS) boyaması için ince (4 μm) dilimler halinde kesildi ve böbrek histolojisindeki morfolojik değişiklikler ışık mikroskobu altında gözlendi.
    1. HE boyama:
      1. Mum alma ve hidrasyon: Doku bölümlerini Ksilen I ve II (her biri 10 dakika), mutlak alkol I ve II (her biri 3 dakika) ile tedavi edin. Ardından, doku bölümlerini %95, %90, %80 ve %70 etanole (her biri 2 dakika) daldırın ve ardından 5 dakika damıtılmış suyla yıkayın.
      2. Doku bölümlerini 5 dakika boyunca hematoksilen boyasına yerleştirin ve ardından bölümleri 5 saniye boyunca hidroklorik alkol ile ayırt edin.
      3. Bölümü 3 dakika boyunca eozin boyama solüsyonuna yerleştirin.
      4. Dehidrasyon, temizleme ve montaj: Bölümleri farklı etanollerde (%70, %80, %90, %95 ve mutlak etanoller) çeşitli zamanlarda kurutun, ardından ksilen I ve II'de temizleyin, ardından nötr sakız ile monte edin.
    2. PAS Boyama:
      1. Adım 5.2.1'de açıklanan mum alma adımlarını izleyin ve bölüme ~8 dakika boyunca periyodik asit boyama solüsyonu uygulayın.
      2. Bölümleri damıtılmış suda 2 dakika durulayın ve ardından karanlıkta 15 dakika boyunca Schiff Reaktifi ile boyayın.
      3. Bölümleri Schiff reaktifi ile işlemden geçirdikten sonra 10 dakika musluk suyunda yıkayın.
      4. Bölümleri hematoksilen kullanarak 1 dakika boyunca lekeleyin ve ardından 30 saniye boyunca HCl-alkol ile ayırt edin. Çekirdeği maviye boyamak için bölümleri tekrar musluk suyunda 5 dakika yıkayın.
    3. Elektron mikroskobu:
      1. Numuneleri 3 saat boyunca% 2.5 glutaraldehit içinde sabitleyin, ardından 3 saat boyunca PBS'de durulayın. Ayrıca, numuneleri 3 saat boyunca% 1 osmik asit içinde muamele edin ve ardından 3 saat boyunca PBS'de tekrar durulayın.
      2. Aseton ile biten kademeli bir dizi alkol banyosu ile kurutun (her adım toplamda yaklaşık 2 saat sürer).
      3. Numuneleri epoksi propan ve epoksi reçine karışımı (1:1) ile oda sıcaklığında (RT) 2 saat, ardından 37 °C'de 2 saat daha saf epoksi reçine ile sızdırın.
      4. Bundan sonra, kesitlere ayırmadan önce 36 saatlik bir süre boyunca numuneleri giderek artan yüksek sıcaklıklarda sertleştirin ve sertleştirin. Bu işlem, dokunun reçine ile iyice sızmasını sağlar, bu daha sonra elektron mikroskobu için ince dilimlemeye izin verecek şekilde sertleştirilir.
      5. % 3 uranil asetat ve kurşun asit ile çift boyayın ve numuneleri 15 dakika içinde elektron mikroskobu ile gözlemleyin ve fotoğraflayın.
        NOT: Transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ayarları aşağıdaki gibidir: yüksek kontrast modunda (Zoom-7000 HC-1) 1x büyütme, bir TEM sisteminde 80.0 kV'luk bir hızlanma gerilimi ile.
  3. İmmünohistokimya
    1. Mum alma: Doku bölümlerini her biri 10 dakika boyunca ksilen I ve II'ye yerleştirin.
    2. Rehidrasyon: Mumdan arındırılmış doku bölümlerini, her biri 3 dakika boyunca art arda mutlak etanol I ve II'ye, ardından her biri 2 dakika boyunca %95, %90, %80 ve %70 etanole yerleştirerek rehidre edin.
    3. Antijen alımı: Doku bölümlerini yaklaşık 5 dakika boyunca yüksek basınç altında 0.1 M sitrat-sitrik asit tampon çözeltisine daldırın ve ardından RT'ye soğutun.
    4. Bloklama: Antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için, doku bölümlerini %5 normal keçi serumu ile yaklaşık 37 ° C'de 30 dakika inkübe ederek bloke edin.
    5. Birincil antikor inkübasyonu: Birincil antikorlar p-EGFR (1:200 seyreltilmiş) ve p-MAPK3/1 (1:200 seyreltilmiş) doku kesitlerine ekleyin ve nemlendirilmiş bir oda içinde gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
    6. İkincil antikor inkübasyonu: Bölümleri PBS ile üç kez yıkayın, ardından bölümlere biyotin etiketli ikincil antikorlar (üreticinin talimatlarına göre PBS'de seyreltilmiş) ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
    7. Yaban turpu peroksidaz ile konjuge streptavidin çalışma solüsyonunu 37 ° C'de doku bölümlerine uygulayın ve ardından fosfat tamponlu salin (PBS) kullanarak üç kez yıkayın.
    8. DAB gelişimi için, bölümleri DAB geliştirme solüsyonu ile inkübe edin (RT'de karanlıkta 3 dakika), ardından damıtılmış su ile durulayın. DAB, oksidasyon üzerine kahverengiye dönüşen yaban turpu peroksidaz (HRP) enzimi için bir kromojen substrat görevi görür.
    9. Yaklaşık 2 dakika boyunca karşı boyama için hematoksilen kullanın, bölümleri 5 saniye boyunca% 1 hidroklorik alkol ile ayırt edin, ardından maviye dönene kadar akan su altında yıkayın.
    10. Bölümleri art arda düşükten yüksek konsantrasyona bir dizi etanol içine yerleştirerek dehidre edin, ksilen I ve II'de berrak olun ve bölümleri nötr sakız ile monte edin.
      NOT: Bu prosedür, gece boyunca primer antikor inkübasyonu dahil olmak üzere yaklaşık 18-24 saat sürer.
    11. Her bölüm için rastgele üç görsel alan (200x) seçin ve görüntü analiz yazılımı kullanarak bölümlerin boyama sonuçlarını analiz edin. Aşağıdaki adımlar izlenerek Image Pro Plus 6.0 yazılımı kullanıldı.
    12. İlk olarak, bölümün bir görüntüsünü yazılıma aktarın.
    13. Yoğunluk düzeltmesi: Doğru sonuçlar elde etmek için bir yoğunluk düzeltmesi yapın.
      1. Yeni > Std. İsteğe Bağlı Yoğunluk > Seçenekler > Görüntüyü > Ölçümü > Kalibrasyonu > Yoğunluğu Seçin. Ardından, arka plan değerini kaydetmek için görüntünün boş bir alanına tıklayın ve Tamam'a tıklayarak onaylayın.
    14. Ölçüm parametrelerinin ayarlanması: Alanı ve entegre optik yoğunluğu (IOD) hesaplamak için ölçüm parametrelerini ayarlayın.
      1. Ölçü > Sayı/Boyut > Ölçü'ye tıklayın > Ölçümler'i seçin. Alan(100) ve IOD'yi seçin, ardından Tamam'a tıklayın.
      2. Seçenekler'e gidin, Örnekte Koyu Arka Plan, 4-Connect Ön Filtre'yi işaretleyin ve Tamam'a tıklayın.
    15. Renk seçimi: Pozitifliği doğru bir şekilde belirlemek için, lekeli alanları ve lekesiz alanları algılamak için renkleri seçin.
      1. HSI > Histogram Tabanlı > Renk Seç'e tıklayın. S değişmeden ve I'yi sıfır ile arka plan değeri arasında tutarken H değerini resme göre ayarlayın. Ardından, Kapat'a tıklayarak onaylayın.
      2. Veri toplama ve hesaplama: Ad, Alan (Toplam) ve IOD (Toplam) seçiliyken Veri Toplayıcı > Düzen > Ölç'e tıklayarak veri toplama ve hesaplama gerçekleştirin. Ardından, verileri daha fazla analiz > depolama için dışa aktarmak için Şimdi Topla > Veri Listesi'ne tıklayın.
        NOT: Bu, analiz edilen toplam alana göre ne kadar protein bulunduğunu gösteren IOD/Alan cinsinden her bölümde protein ekspresyonunun yarı kantitatif bir ölçümü ile sonuçlanmıştır.
  4. Batı lekeleme
    1. Böbrek dokusunu elde edin ve parçalara ayırın. Bu parçaları 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin, önceden soğutulmuş protein lizis çözeltisini (50 mM Tris [pH 7.4],150 mM NaCl, %1 Triton X-100, %1 sodyum deoksikolat, %0.1 sodyum dodesil sülfat [SDS]) ekleyin ve homojenize edin.
    2. 30 dakika buz üzerinde bırakın, ardından 13400 x g'da 20 °C'de 4 dakika santrifüjleyin. Elde edilen numuneyi -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
    3. Proteinleri ölçmek için Bradford yöntemini kullanın.
      1. Reaktif ve damıtılmış suyu 1:4 oranında karıştırarak Coomassie Brilliant Blue çalışma solüsyonunu hazırlayın.
      2. Üç grup oluşturun - boş, standart protein grubu ve örnek protein grubu. Her gruba 3 mL Coomassie Brilliant Blue çalışma solüsyonu, boş grup için fizyolojik salin, standart grup için standart protein ve numune grubu için ekstrakte edilmiş süpernatan protein ekleyin.
      3. Karışımları 5 dakika beklettikten sonra, bir ultraviyole spektrofotometre kullanarak absorbans değerlerini ölçün.
      4. Şu formülü kullanarak numune konsantrasyonunu hesaplayın: Protein konsantrasyonu (mg/mL) = (Numune absorbans değeri/Standart tüp absorbans değeri) x Standart protein konsantrasyonu x 5.
    4. Her protein örneğine eşit hacimde 6x yükleme tamponu ekleyin. 100 °C'de 5 dakika kaynattıktan sonra tekrar kullanın ve tekrar kullanana kadar -20 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
    5. Standart elektroforez, lekeleme ve engelleme gerçekleştirin.
      1. %12 çözünen jel kullanarak standart SDS-poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) gerçekleştirin. İstifleme jeli için 100 V ve çözme jeli için 120 V'luk sabit bir voltaj uygulayın, boya cephesi jelin dibine ulaşana kadar.
      2. Proteinleri, ıslak bir transfer sistemi kullanarak 4 ° C'de soğuk bir odada 2 saat boyunca 100 V'ta poliviniliden diflorür (PVDF) membranlarına aktarın.
      3. Protein transferinden sonra, RT'de 1 saat boyunca TBST'de% 5 yağsız süt ile zarları bloke edin.
    6. Primer antikorları EGFR (1: 2.000), p-EGFR (1: 2.000), MAPK3 / 1 (1: 2.000), p-MAPK3 / 1 (1: 2.000), Bcl-2 (1: 2.000), BAX (1: 2.000) ve CAPDH (1: 5.000) % 5 BSA ile TBST'de. Bu seyreltilmiş primer antikorları ekleyin ve zarları gece boyunca 4 ° C'de hafif çalkalama ile inkübe edin.
    7. Membranı TBST ile üç kez yıkadıktan sonra, seyreltilmiş ikincil antikorlar (1: 5.000) ekleyin, ardından 1 saat inkübe edin. Renk geliştirme sonrası, ImageJ yazılımını kullanarak hedef bantların nicel analizini yapın.
  5. qPCR analizi
    1. Gruplama: Gruplara örnek atayın - Control, DN, Irbesartan, JWSJS-L, JWSJS-M, JWSJS-H.
    2. RNA ekstraksiyonu: Doku homojenizasyonu ve RNA ekstraksiyonu, ardından üreticinin talimatlarına göre kloroform ilavesi, santrifüjleme ve RNA çökeltme işlemlerini gerçekleştirin.
    3. RNA çökeltme ve yıkama: RNA'yı izopropanol ile çökeltin ve etanol ile yıkayın.
    4. RNA Çözündürme: RNA peletini kurutun ve DEPC ile arıtılmış suda çözün.
    5. cDNA Sentezi: Üreticinin talimatlarına göre belirli reaksiyon karışımlarını kullanarak ters transkripsiyon gerçekleştirin.
    6. qPCR Amplifikasyonu: qPCR için GAPDH, MAPK3, MAPK1 ve EGFR için özel primerler kullanın ve üreticinin talimatlarına göre amplifikasyon gerçekleştirin.
      Primer dizileri aşağıdaki gibidir:
      GAPDH: F-5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3', R-5'-CTCGCTCCTGGAAGATGG-3';
      MAPK3: F-5'-AGATCTGTGATTTTGGCCT-3', R-5'-TCAATGGATTTGGTGTAGC-3';
      MAPK1: F-5'-CCTCAAGCCTTCCAACCTC-3', R-5'-GCCCACAGACCAAATCA-3';
      EGFR: F-5'-GGGGATGTGATTATTTCTG-3, R-5'-ATTTTGGTCTTTTGATTGG-3'.

6. İstatistiksel yöntemler

  1. Analizi uygun yazılım (örneğin, SPSS) kullanarak gerçekleştirin ve ölçülen verileri ortalama ± standart sapma(lar) olarak gösterin. Veriler normal dağılım ve varyans homojenliği kriterlerini karşılıyorsa, tek yönlü ANOVA kullanarak gruplar arasında karşılaştırma yapın ve Bonferroni yöntemi ile çoklu karşılaştırmalar yapın.
  2. Varyans homojen değilse çoklu karşılaştırmalar için T2 testini kullanın. P < 0.05'i istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edin.

Sonuçlar

Protokolün ardından, JWSJS'nin 90 aktif bileşeni, belirlenen OB ve DL standartlarına göre tarama ve tekilleştirmeden sonra analizden nihayet elde edildi. Bunlar arasında 20 çeşit Hedysarum Multijugum Maxim, 23 çeşit Epimrdii Herba, 15 çeşit Smilacis Glabrae Rhixoma, 16 çeşit Radix Rhei et Rhizome, dört çeşit Curcumaelongae Rhizoma, 15 çeşit Cicadae Periostracum ve altı çeşit Bombyx Batryticatus bileşeni vardı. JWSJS'de birçok aktif bileşen bulunduğundan, sadece 20 tanesi listelenmiştir (bakınız Tablo 1). Tekilleştirmeden sonra, JWSJS'nin aktif bileşenlerine karşılık gelen 396 hedef nihayet elde edildi.

Hastalıkla ilişkili genler araştırıldıktan sonra, birleştirme ve tekilleştirme işleminden sonra 3035 DN ile ilişkili hedef gen elde edildi. DN'nin karşılık gelen hedefleri, ilaçların aktif bileşenlerinin hedefleri ile karşılaştırıldı ve analiz edildi. Kesişim belirlendi ve bu da JWSJS ve DN'nin 227 kesişme hedefiyle sonuçlandı. Daha sonra bir Wayne diyagramı çizildi (bkz. Şekil 1A). "İlaç-içerik-hedef" ağ diyagramı Cytoscape 3.8.0 yazılımı kullanılarak oluşturuldu (bkz. Şekil 1B) ve topolojik analiz yapıldı. Her düğüm, derece değerine göre yüksekten düşüğe doğru sıralandı. İlk beş ilaç bileşeni kuersetin, palmitoleik asit, luteolin, kaempferol ve naringenin idi ve ilk beş hedef PTGS2, PTGS1, NCoA2, AR ve ESR1 idi.

Daha sonra, JWSJS ve DN kesişme hedefleri için bir PPI ağı geliştirildi (ortalama derece değeri 17.4 olan 196 düğüm ve 1714 kenar). Ayrıca, DN tedavisi için JWSJS'nin anahtar hedefleri olabilecek yedi anahtar hedef, üç taramadan sonra elde edildi: MAPK14, TP53, MAPK3, MYC, HIF1A, ESR1 ve MAPK1 (bkz. Şekil 1C).

Daha sonra, DN tedavisinde JWSJS hedefinin biyolojik özellikleri hakkında spekülasyon yapmak için GO zenginleştirme analizi yapıldı. BP, CC ve MF arasında, ilk on zenginleştirilmiş giriş Şekil 1D'de çizilmiştir. Sonuçlar, JWSJS'nin membran sallarında ve membran mikro alanlarında transkripsiyon faktörleri ve protein kinazlarla bağlanarak hücre proliferasyonunu, farklılaşmasını ve apoptozu düzenleyebileceğini ve böylece DN üzerinde terapötik bir etki yaratabileceğini göstermektedir. DN'deki JWSJS'nin potansiyel etki yollarını keşfetmek için katılımcı hedefler üzerinde KEGG yolu zenginleştirme analizi yapıldı. En üstteki otuz zenginleştirilmiş yol Şekil 1E'de çizilmiştir. Sonuçlar, DN'nin JWSJS tedavisinin, esas olarak lipid ve ateroskleroz, PI3K-Akt sinyal yolu, kimyasal karsinogenez, hepatit, prostat kanseri, apoptoz, HIF-1 sinyal yolu ve TNF sinyal yolunu içeren 181 sinyal yolu üzerinde etkili olabileceğini göstermektedir.

KEGG ile zenginleştirilmiş ilk 30 yolun hedeflerini daha fazla araştırmak için, JWSJS ile tedavi edilen DN için bir KEGG sinyal yolu ilişki ağı haritası oluşturmak için Cytoscape 3.8.0 yazılımını kullandık. MAPK1, MAPK3, EGFR ve AKT1'in birlikte hareket eden çoklu yolların hedefleri olduğu bulundu (bkz. Şekil 1F), bu proteinlerin JWSJS'nin DN üzerindeki etkilerine aracılık etmede merkezi bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir.

DN'yi tedavi etmede JWSJS'nin potansiyel hedeflerini daha da doğrulamak için, daha sonra PPI ağında ve KEGG sinyal yolu ağında yüksek dereceli değerlere sahip MAPK1, MAPK3 ve EGFR olmak üzere üç temel hedefi taradık. Bunlar, DN tedavisi için JWSJS'nin ilk üç çekirdeğinin bileşenleri olan quercetin, palmitoleik asit ve luteolin ile moleküler olarak kenetlendi. PDB kimliğinin taranması için koşullar aşağıdaki gibidir: (1) İnsanlardan türetilmiş olmak; (2) Konformasyonel çözünürlük ≤ 2.5Å, yani mümkün olduğunca küçük; (3) Konformasyonel dizinin mümkün olduğu kadar eksiksiz olması, yani yapısal kompleksin küçük molekül ligand bilgisine sahip olması gerekir; ve (4) Kristal pH değeri, insan vücudunun normal fizyolojik aralığına mümkün olduğunca yakın olmalıdır35. Son olarak, MAPK1, MAPK3 ve EGFR'nin PDB kimlikleri 4QTA, 4QTB ve 7JXQ idi.

Bu çalışmada36 AutoDock yazılımının yerleştirme sistemine güvenilirliğini doğrulamak için, önce MAPK1, Mapk3 ve EGFR'nin üç proteinini yeniden yerleştirdik. Üç hedef proteinin orijinal kristal yapısındaki ligand konformasyonu, kenetlenmeden sonra ligandlarla üst üste bindirildi (Şekil 2A). Kenetlenme sonrası ligand konformasyonu ile orijinal kristal yapı arasındaki kök-ortalama-kare sapması (RMSD) değerleri daha sonra hesaplandı. RMSD değerleri sırasıyla 1.129, 1.201 ve 1.877 şidi ve tümü 2ş≤. Bu, yerleştirme yönteminin güvenilir olduğunu ve bir sonraki moleküler yerleştirme doğrulaması için kullanılabileceğini gösterdi. Çekirdek bileşenlerin inhibitör potansiyelini karşılaştırmak ve beyan etmek için, MAPK1, MAPK3 ve EGFR'nin orijinal ligandları daha sonra kontrol olarak kullanıldı. Kenetlenme analizi, luteolin, palmitoleik asit ve quercetin ile üç çekirdek hedef arasındaki bağlanma enerjisini başarılı bir şekilde tahmin etti. Bunların hepsi negatifti ve -637'den azdı; Tablo 2'ye bakınız. Dikkat çekici bir şekilde, luteolin ve MAPK1 arasındaki moleküler kenetlenme, en yüksek boşluk boyutuna ve en düşük bağlanma enerjisine sahiptir. Genel olarak, moleküler yerleştirme sonuçları, luteolin, palmitoleik asit ve kuersetinin üç temel hedefle iyi bağlanma aktivitesine sahip olduğunu gösterdi (Şekil 2B, C).

RMSD, bir referans çerçevesine göre seçilen bir atom grubunun ortalama yer değiştirme değişikliklerini ölçmek için kullanılır. Bu arada, RMSF, protein zinciri boyunca lokalize değişiklikleri etkili bir şekilde karakterize eder. RMSD grafiği (Şekil 2D), luteolin-MAPK1 kompleksi ve quercetin-MAPK3 kompleksi bileşiğinin RMSD değerlerinin 5 ns içinde stabilize olduğunu göstermektedir. Luteolin-EGFR kompleksi, 0-35 ns arasında değişen dalgalı bir RMSD gösterdi; bu değer, 100 ns MD simülasyonunun sonuna kadar 35 ns'de stabilize edildi. Tüm kompleksler, 100 ns MD simülasyonunun sonunda kararlı bir şekilde etkileşime girdi. RMSF değeri, MD simülasyon yörüngesinden değerlendirildi: Aktif bölgedeki atomlar ve minimum düzeyde dalgalanan ana zincir, minimal bir konformasyonel değişiklik anlamına geliyordu, bu da bahsedilen kurşun bileşiğinin, hedef proteinin bağlanma cebinin boşluğu içinde güvenli bir şekilde sabitlendiğini düşündürüyor. RMSF sonuçları, karmaşık yapılarda sınırlı dalgalanmalar olduğunu gösterdi.

Son olarak, yukarıdaki sonuçları in vivo olarak doğruluyoruz. İlk olarak model grubundaki sıçanların ağırlığının anlamlı olarak azaldığını ve GSP, LDL-C, UTP ve FBG'nin anlamlı olarak arttığını gözlemledik (P < 0.05). Sıçanların vücut ağırlığı, irbesartan grubunda ve her JWSJS grubunda model grubuna göre önemli ölçüde artmıştır. GSP, LDL-C, UTP ve FBG farklı derecelerde azalmıştır (P < 0.05; bakınız Tablo 3).

Daha sonra, HE boyaması normal gruptaki glomerüllerin normal bir boyuta sahip olduğunu gösterdi. Düzenli ve berrak bir yapıya sahiplerdi ve pürüzsüz bir bazal zara, düzgün bir şekilde düzenlenmiş böbrek tübüllerine sahiptiler ve enflamatuar hücre infiltrasyonu yoktu. Model grubunda glomerüller hipertrofik, bazal membran kalınlaşmış ve mezanjiyal matriks artmıştır. İnterstisyum inflamatuar hücrelerle infiltre edildi. Her uygulama grubunun patolojik belirtileri, model grubuna kıyasla farklı derecelerde hafifletilmiştir (bkz. Şekil 3A).

PAS boyama, model grubunun normal gruba göre artmış glomerüler hacimlere, kalınlaşmış bazal membrana ve artmış mezanjiyal matrikse sahip olduğunu gösterdi. Bu patolojik belirtiler her bir uygulama grubu tarafından önemli ölçüde hafifletilmiştir (bkz. Şekil 3B). Transmisyon elektron mikroskobu kullanarak, model grubundaki glomerüler bazal membranın normal gruba göre kalınlaştığını bulduk. Mezanjiyal matris büyüdü ve podosit ayak süreçleri yoğun bir şekilde kaynaştı. Her bir uygulama grubundaki sıçanların mikroskobik belirtileri, model grubuna göre değişen derecelerde rahatladı (bkz. Şekil 3C).

Son olarak, JWSJS ile tedavi edilen DN sıçanlarında değişip değişmediklerini görmek için toplam EGFR, p-EGFR, MAPK3 / 1 ve p-MAPK3 / 1 ekspresyonları tespit edildi. Model gruplarında toplam EGFR ve MAPK3/1 ekspresyonunda normal gruba göre anlamlı bir değişiklik yoktu. p-EGFR, p-MAPK3/1 ve BAX ekspresyonu anlamlı olarak arttı ve BCL-2 ekspresyonu önemli ölçüde azaldı. Model grubuna kıyasla, p-EGFR, p-MAPK3 / 1 ve BAX ekspresyonu önemli ölçüde azaldı ve BCL-2 ekspresyonu, her doz grubundaki sıçan böbrek dokularında değişen derecelerde önemli ölçüde arttı (Şekil 3D, E). Bu sonuç immünohistokimya ile doğrulandı (Şekil 3F,G). Bu çalışma, JWSJS'nin p-EGFR, p-MAPK3 / 1, BAX ve BCL-2 proteinlerinin ekspresyonunu düzenleyerek ve hücre apoptozunu azaltarak DN sıçanlarında böbrekleri koruyabileceğini gösterdi. Ek olarak, çeşitli gruplarda MAPK3, MAPK1 ve EGFR mRNA'nın ekspresyon seviyelerini değerlendirmek için qPCR kullanıldı. Sonuçlar, DN grubundaki nispi ekspresyonun kontrol grubunun yanı sıra Irbesartan, JWSJS-L, JWSJS-M ve JWSJS-H gruplarına kıyasla anlamlı derecede yüksek olduğunu ortaya koydu. Bu bulgu, ilk sonuçları daha da doğrulamaktadır (Şekil 3H).

figure-results-1
Şekil 1: Ağ Farmakolojisi, diyabetik nefropatide JWSJS potansiyel hedeflerini ve sinyal yolaklarını açıklığa kavuşturdu. (A) JWSJS ve diyabetik nefropatinin kesişen hedeflerinin Venn diyagramı. Yeşil, JWSJS bileşenlerinin terapötik hedeflerinin sayısını temsil eder ve mor, DN'nin ilgili hedeflerinin sayısını temsil eder. Kesişen kısım, kesişen hedeflerin sayısını temsil eder (yani, DN için JWSJS'nin hedef sayısı). (B) DN tedavisinde JWSJS'nin "ilaç-bileşen-hedef" ağ diyagramı. Açık mavi, DN tedavisi için JWSJS'nin ilgili hedeflerini temsil eder. Fuşya, Bombyx Batryticatus'un aktif bileşenini temsil eder. Yeşil, Hedysarum Multijugum Maxim'in aktif bileşenlerini temsil eder. Koyu mavi, Radix Rhei et Rhizome'un aktif bileşenlerini temsil eder. Kırmızı, Cicadae Periostracum'un aktif bileşenlerini temsil eder. Mor, Epimrdii Herba'nın aktif bileşenlerini temsil eder. Sarı, Smilacis Glabrae Rhixoma'nın aktif bileşenlerini temsil eder. Gök mavisi, Curcumaelongae Rhizoma'nın aktif bileşenlerini temsil eder. (C) JWSJS ve DN kesişme hedeflerinin PPI ağı. (D) DN'nin JWSJS tedavisinde yer alan tedavi hedef genlerinin ontolojik analizi yoluyla tanımlanan en önemli 10 gen. (E) DN'nin JWSJS tedavisinde yer alan tedavi hedef genlerinin yol analizi yoluyla tanımlanan en önemli 30 gen. (F) JWSJS tarafından DN tedavisinde KEGG sinyal yolunun ilişki ağı. Sarı simgeler sinyal yollarını temsil eder. Mavi simgeler eylem hedeflerini temsil eder. Daha büyük bir grafik, ona daha fazla yolun bağlı olduğunu ima eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Diyabetik nefropati tedavisinde JWSJS'nin moleküler yerleştirme ve moleküler dinamik yörüngelerinin görselleştirilmesi. (A) Üç hedef protein kompleksi 7JXQ (a), 4QTA (b) ve 4QTB (c)'nin orijinal kristal yapısındaki ligandın konformasyonları, kenetlenmeden sonra ligandın konformasyonları ile karşılaştırılır. Yeşil, turuncu ve pembe sırasıyla EGFR, MAPK1 ve MAPK3 hedef proteinleridir. Altın, orijinal ligand molekülüdür ve mavi, kenetlenmeden sonraki ligand molekülüdür. (B) Diyabetik nefropati tedavisinde JWSJS'nin 3D moleküler yerleştirme görselleştirmesi. Yeşil, turuncu ve pembe, sırasıyla 7JXQ, 4QTA ve 4QTB hedef proteinleridir. 1a-3a, 7JXQ, 4QTA ve 4QTB'nin orijinal inhibitör (mavi) ile etkileşim diyagramını temsil eder. 1b-3b, 7JXQ, 4QTA, 4QTB ve luteolinin (sarı) etkileşim diyagramını temsil eder. 1c-3c, 7JXQ, 4QTA, 4QTB ve palmitoleik asidin (fuşya) etkileşim diyagramını temsil eder. 1D-3D, 7JXQ, 4QTA, 4QTB ve quercetin (mor) etkileşim diyagramını temsil eder. (C) Diyabetik nefropati tedavisinde JWSJS'nin 2D moleküler yerleştirme görselleştirmesi. 1a-3a, 7JXQ, 4QTA ve 4QTB'nin orijinal inhibitör ile etkileşim diyagramını temsil eder. 1b-3b, 7JXQ, 4QTA, 4QTB ve luteolinin etkileşim diyagramını temsil eder. 1c-3c, 7JXQ, 4QTA, 4QTB ve palmitoleik asidin etkileşim diyagramını temsil eder. 1D-3D, 7JXQ, 4QTA, 4QTB ve quercetin'in etkileşim diyagramını temsil eder. (D) (a) luteolin ve hedef protein 7JXQ, (b) luteolin ve hedef protein 4QTA ve (c) kuersetin ve hedef protein 4QTB komplekslerinin moleküler dinamik yörüngelerinin RMSD ve RMSF analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: JWSJS, böbrek hasarını hafifletir ve in vivo deneylerde EGFR/MAPK3/1 sinyal yolu aktivasyonunu baskılar. (A) HE boyaması ve (B) farklı gruplardaki sıçan böbrek dokularının periyodik asit-Schiff (PAS) boyaması (Büyütme, 200x; n = 10). (C) Farklı sıçan gruplarında böbrek dokusunun transmisyon elektron mikroskobu (Büyütme, 5000x; n = 3). (D) EGFR, p-EGFR, MAPK3 / 1, p-MAPK3 / 1, BAX ve BCL-2, diyabetik sıçan böbrek dokusunda western blotting yoluyla (n = 3). (E) p-EGFR, p-MAPK3/1, BAX ve BCL-2 ekspresyonunun istatistiksel analizi. (F) Altı grupta p-EGFR VE p-MAPK3/1 ekspresyonunun immünohistokimyasal analizi (n = 6). (G) p-EGFR VE p-MAPK3/1 ifadesinin istatistiksel analizi. (H) Altı grupta MAPK3, MAPK1 ve EGFR mRNA ekspresyonunun qPCR analizi. *P < 0.05'e karşı kontrol. **P < 0,01'e karşı kontrol. ▲P < 0,05'e karşı DN. ▲▲P < 0,01'e karşı DN. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: JWSJS'nin bazı aktif bileşenlerinin bilgileri. Her bir bileşen ve bunların özellikleri veya özellikleri hakkında ayrıntılar verir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 2: JWSJS'nin temel hedeflerinin ve ana aktif bileşenlerinin yerleştirme sonuçları tablosu. Tablo, JWSJS'nin temel hedeflerinin ve ana aktif bileşenlerinin yerleştirme çalışmalarından elde edilen sonuçları sunmaktadır. Bu tablo, bu bileşenlerin kendi hedefleriyle nasıl etkileşime girdiğini gösterir ve bu da JWSJS'nin etki mekanizması hakkında fikir verebilir. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 3: Diyabetik nefropatili sıçanlarda JWSJS'nin vücut ağırlığı ve biyokimyasal indeksler üzerindeki etkisi (ortalama ± standart sapma olarak ifade edilir, n = 10). Normal grupla karşılaştırıldığında: * P < 0.05. Model grubuyla karşılaştırıldığında: # P < 0.05. Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Çalışmamızda ağ farmakolojisi, moleküler yerleştirme ve in vivo hayvan modellerinin bir kombinasyonu kullanılmıştır. Kritik bir adım, özellikle EGFR / MAPK3 / 1 sinyal yolu ile etkileşimine odaklanarak, DN tedavisinde JWSJS'nin potansiyel mekanizmalarını belirlemek için çok önemli olan "ilaç-bileşen-hedef" ağının kurulmasıydı.

Bu çalışma sırasında, tahminlerimizin doğruluğunu artırmak için özellikle moleküler yerleştirme sürecinde çeşitli değişiklikler yaptık. Sorun giderme, esas olarak, insan DN'si ile alaka düzeyini sağlamak için in vivo hayvan modelinin koşullarını optimize etmeye odaklandı. Bu çalışma, JWSJS'nin temel aktif bileşenlerini ve hedeflerini belirleyerek, DN tedavisi için potansiyel bir ilaç adayı olarak JWSJS'nin daha fazla araştırılması ve geliştirilmesi için teorik bir temel sağlar.

Çalışma, DN'de renal apoptozu azaltmada JWSJS'nin potansiyel etki mekanizmasını araştırdı. Moleküler yerleştirme sonuçları, quercetin, palmitoleik asit ve luteolin'in MAPK1, MAPK3 ve EGFR dahil olmak üzere anahtar hedeflere düzenli bağlanma aktivitelerine sahip olduğunu gösterdi. Bu hedefleri, birden fazla yoldaki ortak eylemleri nedeniyle daha fazla çalışma için seçtik. DN sıçanlarında, JWSJS tedavisi, FBG ve GSP seviyelerinde önemli bir azalma, UTP ve LDL-C'de iyileşme, kilo alımı ve böbrek dokusu mikroskobik belirtilerinde iyileşme ile sonuçlandı, bu da JWSJS'nin DN tedavisinde potansiyel etkinliğini gösterir.

Apoptoz, hücre ölümünün kritik bir şeklidir ve düzensizlik, çeşitli hastalıkların riskini artırabilir38. Önceki çalışmalar, DN sıçanlarının apoptozla ilişkili proteinler BAX ve kaspaz-3'ün ekspresyonunun arttığını ve böbrek dokusundaki apoptotik hücrelerin sayısında önemli bir artış olduğunu göstermiştir39,40. Sonuçlar, JWSJS tedavisinin bu değişiklikleri tersine çevirdiğini ve diyabetik koşullar altında podosit apoptozunu azaltabileceğini düşündürdü.

JWSJS'nin potansiyel etki mekanizmasına ilişkin daha fazla araştırma, DN üzerinde çok hedefli ve çok bir etkiye sahip olduğunu gösterdi. En fazla zenginleştirme yoluna sahip oldukları için MAPK1, MAPK3 ve EGFR'yi incelemeye odaklandık. Hücre büyümesi, proliferasyon, farklılaşma, apoptoz ve anormal steroid sekresyonu gibi çeşitli fizyolojik ve patolojik süreçlerde yer alan ERK yolu, MAPK sinyal iletim yolu 13,41,42,43'te önemli bir yoldur. JWSJS'nin EGFR / MAPK3 / 1 sinyal yolunu inhibe ederek podosit apoptozunu kurtardığı sonucuna varıldı.

Ayrıca, JWSJS'nin p-EGFR ve p-MAPK3 / 1'in ekspresyonunu düzenleyebildiğini, bunun da Bcl-2'nin belirgin şekilde yukarı regüle edilmesine, ancak Bax'ın gözle görülür bir aşağı regülasyonuna neden olduğunu bulduk. Bu da renal hücre apoptozunun azalmasına neden oldu. Daha önceki çalışmalarda da benzer sonuçlar bulunmuştur. Örneğin, Chen, podositlerdeki EGFR delesyonunun diyabetik nefropatiyizayıflattığını bildirdi 44. Bazı araştırmacılar, EGFR / ERK yolunun domuz bağırsak epitel hücrelerinin9 çoğalmasını ve farklılaşmasını desteklediğini buldular. EGFR'nin inhibisyonu, TGF-β ve BAX ekspresyonunu aşağı regüle edebilir, böylece renal fibroz ve apoptozu iyileştirir45. Bu bulgular, JWSJS'nin EGFR / MAPK3 / 1 sinyal yolunu inhibe ederek DN'nin adjuvan tedavisinde önemli bir role sahip geleneksel bir Çin tıbbı reçetesi olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, DN tedavisinde JWSJS'nin potansiyel etki mekanizmasını tam olarak anlamak için daha fazla çalışmaya ihtiyaç vardır.

Bu çalışmanın çeşitli sınırlılıkları vardı. İlk olarak, hayvan modellerine güvenmek, JWSJS'ye insan tepkisini tam olarak kopyalayamayabilir. Ek olarak, ağ farmakolojisi tahminleri, anlayışlı olsa da, deneysel veriler yoluyla daha fazla doğrulama gerektirir. Bulguları doğrulamak için insan denekler üzerinde daha ileri klinik çalışmalar gereklidir. İkincisi, ağ farmakolojisi ilaç-hastalık ilişkilerini analiz etmek için yararlı bir araç olmasına rağmen, sonuçlar deneysel verilerden ziyade tahminlere dayandığı için dikkatle yorumlanmalıdır. Üçüncüsü, DN'yi tedavi etmek için JWSJS'nin etki mekanizması belirsizliğini korumaktadır ve çalışma yalnızca MAPK1, MAPK3 ve EGFR'nin potansiyel hedeflerine odaklanmıştır.

Bu çalışmada kullanılan yöntemler, diğer geleneksel Çin tıbbı formülasyonlarına uygulanabilir ve potansiyel olarak DN ve diğer karmaşık hastalıklar için yeni terapötik seçeneklerin keşfedilmesine yol açabilir. Ayrıca, bu yaklaşım, geleneksel ve modern tıbbın gelecekteki farmakolojik araştırmalara entegre edilmesi için zemin hazırlamaktadır. JWSJS'nin terapötik etkilerinin altında yatan moleküler mekanizmaları tam olarak aydınlatmak için daha ileri çalışmalara ihtiyaç vardır. Son olarak, çalışma, herhangi bir yeni ilacın geliştirilmesinde önemli hususlar olan JWSJS'nin potansiyel yan etkilerini veya toksisitesini araştırmamıştır. JWSJS'nin güvenliğini değerlendirmek ve klinik uygulamasını sağlamak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.

Özetle, bu çalışma öncelikle Jiawei Shengjiang San'ın ağ farmakolojisi, moleküler yerleştirme ve in vivo hayvan validasyonu kullanarak diyabetik nefropati için terapötik potansiyelini araştırmaktadır. JWSJS ile EGFR/MAPK3/1 sinyal yolu arasındaki etkileşimleri anlamak için kullanılan metodolojiye ve bu etkileşimlerin DN'deki renal hücre apoptozunu potansiyel olarak nasıl azalttığına odaklanarak prosedürel yönleri vurgular.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin'in Hebei Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı'nın (No. H2019423037) genel projesi tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
2 kez; SYBR Yeşil qPCR Master Karışımı Servicebio, Wuhan, ÇinG3320-05
24 saatlik idrar proteini miktar tayini (UTP)Nanjing Jiancheng Biyoloji Mühendisliği EnstitüsüN/A
3,3'-DiaminobenzidinŞangay Huzheng Biotech, Çin91-95-2
Otomatik biyokimyasal analiz cihazıHitachi, Japonya7170A
Susuz EtanolBiosharp, Tianjin, ÇinN/A
BAX Primer antikorları Afinite, ABDAF0120Sıçan
BCL-2 Birincil antikorlar Affinity, ABDAF6139Sıçan
BX53 mikroskobuOlympus, JaponyaBX53
Kloroform İkamesiECOTOP, Guangzhou, ÇinES-8522
Desmond yazılımı New York, NY, ABDSürüm 2019-1
Dijital Sabit Sıcaklık Su BanyosuChangzhou Jintan Liangyou Enstrüman, ÇinDK-8D
EGFR Birincil antikorlar Affinity, ABDAF6043Sıçan
Gömme-812 REÇİNEKabuk Kimyasal, ABD14900
Açlık kan şekeri (FBG)Nanjing Jiancheng Biyoloji Mühendisliği EnstitüsüN/A
FC tipi tam dalga boylu enzim etiket analizörüMultiskan; Termo, ABDN/A
GAPDH  Primer antikorlar Affinity, ABDAF7021
Sıçan Glikasyonlu serum proteini (GSP)Nanjing Jiancheng Biyoloji Mühendisliği EnstitüsüN/A
Transmisyon elektron mikroskobuHitachi, JaponyaH-7650
Hematoksilen/eozin (HE) boyama solüsyonuServicebio, ABDG1003
Image-Pro PlusMEDYA SİBERNETİĞİ, ABDYOK
Gerçek Zamanlı PCR Amplifikasyon AletiUygulamalı Biyosistemler, ABDiQ5 
Irbesartan tabletlerHangzhou Sanofi İlaçN/A
İzopropanolBiosharp, Tianjin, ÇinN/
A  JWSJS granülleriGuangdong Yifang İlaçN/A
Kodak Image Station 2000 MM görüntüleme sistemiKodak, ABDIS2000
Düşük yoğunluklu kolesterol (LDL-C)Nanjing Jiancheng Biyoloji Mühendisliği EnstitüsüN/A
MAPK3/1Birincil antikorlar Affinity, ABDAF0155Sıçan
Tıbbi SantrifüjHunan Xiangyi Laboratuvar Enstrüman Geliştirme, Çin TGL-16K
Mini trans-blot transfer sistemiBio-Rad, ABDN/A
Mini-PROTEAN elektroforez sistemiBio-Rad, ABDN/A
NanoVue Plus SpektrofotometreHealthcare Bio-Sciences AB, İsveç111765
p-EGFR Primer antikorlar Afinity, ABDAF3044Sıçan
Periyodik asit-Schiff (PAS) boyama çözeltisiServicebio, ABDG1008
p-MAPK3 / 1 Birincil antikorlar Afinite, ABDAF1015Sıçan
İkincil antikorları  Santa Cruz, ABDsc-2357Tavşan
StreptozotosinSigma, ABDS0130
SureScript Birinci İplikli cDNA Sentez KitiGeneCopeia, ABDQP056T
TriQuick ReaktifSolarbio, Pekin, ÇinR1100
Ultra Temiz TezgahSuzhou Arıtma Ekipmanı, ÇinSW-CJ-1F 

Kaynaklar

  1. Viigimaa, M., Sachinidis, A., Toumpourleka, M., Koutsampasopoulos, K., Alliksoo, S., Titma, T. Macrovascular complications of Type 2 diabetes mellitus. Curr Vasc Pharmacol. 18 (2), 110-116 (2020).
  2. Umanath, K., Lewis, J. B. Update on diabetic nephropathy: Core Curriculum 2018. Am J Kidney Dis. 71 (6), 884-895 (2018).
  3. Han, W., et al. Huangkui capsule alleviates renal tubular epithelial-mesenchymal transition in diabetic nephropathy via inhibiting NLRP3 inflammasome activation and TLR4/NF-kappaB signaling. Phytomedicine. 57, 203-214 (2019).
  4. Giralt-Lopez, A., et al. Revisiting experimental models of diabetic nephropathy. Int J Mol Sci. 21 (10), 3587(2020).
  5. Lu, Z., Zhong, Y., Liu, W., Xiang, L., Deng, Y. the efficacy and mechanism of Chinese herbal medicine on diabetic kidney disease. J Diabetes Res. 2019, 2697672(2019).
  6. Niu, H., et al. The therapeutic mechanism of PuRenDan for the treatment of diabetic nephropathy: Network pharmacology and experimental verification. J Ethnopharmacol. 293, 115283(2022).
  7. Gao, F., Wang, Z., Yang, B., Tan, J. Mechanism of Jiawei Shengjiang San in the treatment of membranous nephropathy based on network pharmacology. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 37 (5), 132-138 (2021).
  8. Li, W., Xie, M. Analysis of composing and application rule in the evolution of Shengjiang San. Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine. 44 (10), 894-898 (2021).
  9. Zhang, Y., et al. Mechanism of Jiawei Shengjiang powder in inhibiting renal inflammation and fibrosis in diabetic rats based on TLR4/NF-kappaB and Raf/MEK pathways. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 38 (5), 20-27 (2022).
  10. Zhao, L., et al. Pharmacodynamic mechanism of Yishen Tongluo Formula in treatment of diabetic kidney disease based on network pharmacology and verification of key regulation pathway. Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine. 45 (8), 824-834 (2022).
  11. Zhang, J., Liang, R., Wang, L., Yang, B. Effects and mechanisms of Danshen-Shanzha herb-pair for atherosclerosis treatment using network pharmacology and experimental pharmacology. J Ethnopharmacol. 229, 104-114 (2019).
  12. Chen, L., et al. Network pharmacology-based strategy for predicting active ingredients and potential targets of Yangxinshi tablet for treating heart failure. J Ethnopharmacol. 219, 359-368 (2018).
  13. Zhu, M., Qin, Y. C., Gao, C. Q., Yan, H. C., Wang, X. Q. l-Glutamate drives porcine intestinal epithelial renewal by increasing stem cell activity via upregulation of the EGFR-ERK-mTORC1 pathway. Food Funct. 11 (3), 2714-2724 (2020).
  14. Ding, Z., et al. Systems pharmacology reveals the mechanism of activity of Ge-Gen-Qin-Lian decoction against LPS-induced acute lung injury: A novel strategy for exploring active components and effective mechanism of TCM formulae. Pharmacol Res. 156, 104759(2020).
  15. Pinzi, L., Rastelli, G. Molecular docking: Shifting paradigms in drug discovery. Int J Mol Sci. 20 (18), 4331(2019).
  16. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8 (6), e1000412(2010).
  17. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guides for the Care and Use of Laboratory Animals. , National Academies Press (US). Washington (DC. (2011).
  18. Ru, J., et al. TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminform. 6, 13(2014).
  19. Xu, X., et al. A novel chemometric method for the prediction of human oral bioavailability. Int J Mol Sci. 13 (6), 6964-6982 (2012).
  20. Tao, W., et al. Network pharmacology-based prediction of the active ingredients and potential targets of Chinese herbal Radix Curcumae formula for application to cardiovascular disease. J Ethnopharmacol. 145 (1), 1-10 (2013).
  21. Traditional Chinese Medicine and Chemical Composition databases in Chemistry Database[DB/OL]. , Available from: http://www.organchem.csdb.cn (2021).
  22. Halladay, C. W., Trikalinos, T. A., Schmid, I. T., Schmid, C. H., Dahabreh, I. J. Using data sources beyond PubMed has a modest impact on the results of systematic reviews of therapeutic interventions. J Clin Epidemiol. 68 (9), 1076-1084 (2015).
  23. Daina, A., Michielin, O., Zoete, V. SwissADME: a free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules. Sci Rep. 7, 42717(2017).
  24. UniProt, C. Reorganizing the protein space at the Universal Protein Resource (UniProt). Nucleic Acids Res. 40 (D1), D71-D75 (2012).
  25. Stelzer, G., et al. The GeneCards Suite: From gene data mining to disease genome sequence analyses. Curr Protoc Bioinformatics. 54, 1-33 (2016).
  26. Amberger, J. S., Hamosh, A. Searching Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM): A knowledgebase of human genes and genetic phenotypes. Curr Protoc Bioinformatics. 58, 1-12 (2017).
  27. Zhou, Y., et al. Therapeutic target database update 2022: facilitating drug discovery with enriched comparative data of targeted agents. Nucleic Acids Res. 50 (D1), D1398-D1407 (2022).
  28. Whirl-Carrillo, M., et al. Pharmacogenomics knowledge for personalized medicine. Clin Pharmacol Ther. 92 (4), 414-417 (2012).
  29. Law, V., et al. DrugBank 4.0: shedding new light on drug metabolism. Nucleic Acids Res. 42 (D1), D1091-D1097 (2014).
  30. Shannon, P., et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  31. Xu, J., et al. Pharmacological mechanisms underlying the neuroprotective effects of Alpinia oxyphylla Miq. on Alzheimer's disease. Int J Mol Sci. 21 (6), 2071(2020).
  32. Tang, Y., Li, M., Wang, J., Pan, Y., Wu, F. X. CytoNCA: a cytoscape plugin for centrality analysis and evaluation of protein interaction networks. Biosystems. 127, 67-72 (2015).
  33. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. clusterProfiler: an R package for comparing biological themes among gene clusters. OMICS. 16 (5), 284-287 (2012).
  34. Trott, O., Olson, A. J. AutoDock Vina: improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. J Comput Chem. 31 (2), 455-461 (2010).
  35. Yang, X., et al. Rational selection of the 3D structure of biomacromolecules for molecular docking studies on the mechanism of endocrine disruptor action. Chem Res Toxicol. 29 (9), 1565-1570 (2016).
  36. Diller, D. J., Merz, K. M. throughput docking for library design and library prioritization. Proteins. 43 (2), 113-124 (2001).
  37. Hsin, K. Y., Ghosh, S., Kitano, H. Combining machine learning systems and multiple docking simulation packages to improve docking prediction reliability for network pharmacology. PLoS One. 8 (12), e83922(2013).
  38. Godse, N. R., et al. TMEM16A/ANO1 inhibits apoptosis via downregulation of Bim expression. Clin Cancer Res. 23 (23), 7324-7332 (2017).
  39. Ilhan, I., et al. Irbesartan decreased mitochondrial stress-related apoptosis in cisplatin-induced acute kidney injury via regulating BCL-2/BAX signaling. Mol Biol Rep. 49 (7), 6125-6133 (2022).
  40. Lee, M., et al. Protective effect of hydroxysafflor yellow a on nephropathy by attenuating oxidative stress and inhibiting apoptosis in induced Type 2 diabetes in rat. Oxid Med Cell Longev. 2020, 7805393(2020).
  41. Schlessinger, J. Ligand-induced, receptor-mediated dimerization and activation of EGF receptor. Cell. 110 (6), 669-672 (2002).
  42. Gu, X., Chu, L., Kang, Y. Angiogenic factor-based signature predicts prognosis and immunotherapy response in non-small-cell lung cancer. Front Genet. 13, 894024(2022).
  43. Chu, L., et al. Age-related changes in endogenous glucocorticoids, gonadal steroids, endocannabinoids and their ratios in plasma and hair from the male C57BL/6 mice. Gen Comp Endocrinol. 301, 113651(2021).
  44. Chen, J., Chen, J. K., Harris, R. C. EGF receptor deletion in podocytes attenuates diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 26 (5), 1115-1125 (2015).
  45. Skibba, M., et al. New EGFR inhibitor, 453, prevents renal fibrosis in angiotensin II-stimulated mice. Eur J Pharmacol. 789, 421-430 (2016).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

EGFR Sinyal YolağıMAPK3/1 YolağıAğ FarmakolojisiMoleküler KenetlemeProtein Etkileşim AğıApoptoz RegülasyonuBöbrek Histopatolojisi
Jiawei Shengjiang San'ın Diyabetik Nefropatinin Sıçan Modeli Üzerindeki Antagonistik Etkisi: EGFR / MAPK3 / 1 Sinyal Yolu ile İlgili
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.