İntrasitoplazmik Sperm Enjeksiyonu Sonrası Fare Yavrularında Kan Şekerinin İzlenmesi

Summary

Burada, intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI)-embriyo transferi (ET) fare modeli oluşturmak için bir protokol sunuyoruz, bu da ICSI'ye atfedilebilecek glikoz metabolizmasındaki yaşa bağlı değişiklikleri gözlemlememize olanak tanıyarak insan gelişimi üzerindeki potansiyel uzun vadeli etkileri hakkında bilgi veriyor.

Abstract

İnsan ömrü oldukça uzundur, fare modelleri ise tüm insan ömrünü nispeten kısa bir süre içinde simüle edebilir ve bir yıllık fare ömrü kabaca 40 insan yılına eşittir. İntrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI), klinik pratikte yaygın olarak kullanılan bir yardımcı üreme teknolojisidir. Bununla birlikte, yaklaşık 30 yıl önce nispeten yeni ortaya çıktığı göz önüne alındığında, bu tekniğin insani gelişme üzerindeki uzun vadeli etkileri belirsizliğini korumaktadır. Bu çalışmada, bir fare modeli kullanılarak embriyo transferi (ET) yöntemi ile kombine ICSI'yi kurduk. Sonuçlar, normal fare sperminin in vitro kültür ve ardından ICSI uygulandıktan sonra %89.57'lik bir döllenme oranı ve %87.38'lik bir iki hücreli oran sergilediğini gösterdi. ET'yi takiben, yavruların doğum oranı yaklaşık% 42.50 idi. Ayrıca, fareler yaşlandıkça, ICSI tekniğinin uygulanmasıyla ilişkili olabilecek glikoz metabolizması seviyelerinde dalgalanmalar gözlenmiştir. Bu bulgular, fare ICSI-ET tekniğinin, sperm anormalliklerinin embriyo gelişimi üzerindeki etkisini ve bunların özellikle glikoz metabolizması ile ilgili olarak yavru sağlığı üzerindeki uzun vadeli etkilerini değerlendirmek için değerli bir platform sağladığını göstermektedir. Bu çalışma, ICSI tekniğinin insani gelişme üzerindeki potansiyel etkileri hakkında daha fazla araştırma için önemli bilgiler sağlamakta ve bu teknolojinin uzun vadeli etkilerinin derinlemesine araştırılmasının gerekliliğini vurgulamaktadır.

Introduction

Doğurganlık sorunları, özellikle azalan doğurganlık oranlarının ve kısırlık prevalansının ve şiddetinin artan şiddetinin öne çıktığı modern toplumda, tıbbi ve sosyolojik kaygıların önemli bir odağı olarak ortaya çıkmıştır. Yardımcı Üreme Teknolojisi (ART), terapötik bir müdahale olarak yaygın olarak kullanılan İntrasitoplazmik Sperm Enjeksiyonu (ICSI) ile bu zorlukların üstesinden gelmek için çok çeşitli olanaklar sunar.

Palermo'nun 1992 yılında İntrasitoplazmik Sperm Enjeksiyonu (ICSI) ile elde edilen ilk başarılı gebeliği bildirmesinden bu yana, ICSI Yardımcı Üreme Teknolojilerinde (^{ART) çok} önemli bir teknik haline gelmiştir1. Bununla birlikte, ICSI'nin klinik ortamlarda sadece 30 yıldır, insan ömrüne kıyasla nispeten kısa bir süre boyunca kullanıldığı göz önüne alındığında, ICSI'nin özellikle yavru gelişimi üzerindeki uzun vadeli etkileri kapsamlı bir şekilde araştırılmamış ve aydınlatılmamıştır. Şu anda, tek tip genetik geçmişleri ve daha kısa ömürleri ile karakterize edilen fareler, tıbbi araştırmalarda yaygın olarak kullanılan alternatif bir model olarak ortaya çıkmıştır. Dahası, fare modeli, farelerde bir yılın insanlarda kabaca 40 yıla karşılık geldiği sıkıştırılmış bir zaman çerçevesi içinde tüm insan ömrünü özetleyebilir².

Son on yılda, birkaç küçük ölçekli çalışma, ICSI yoluyla gebe kalan bireylerin, daha sonraki yaşamlarında anormal kan şekeri seviyeleri gibi metabolik sendromlar geliştirme riskinin artabileceğini bildirmiştir ^3,4. Kanıtlar kesin olmasa da, bu bulgu yine de bilim camiasında ICSI'nin uzun vadeli sağlık etkileri konusunda ciddi endişelere yol açmıştır. Bu durum, ART'nin ve uzun vadeli sağlık sonuçlarının daha titiz bir şekilde değerlendirilmesine duyulan acil ihtiyacın altını çizmektedir. Özellikle insan çalışmalarının sınırlamaları ve etik hususları ışığında, ICSI'yi takiben insan yavrularının gelişimini tam olarak özetleyebilecek hayvan modellerinin geliştirilmesi giderek daha önemli hale gelmiştir. Bu bağlamda, fare ICSI-ET (İntrasitoplazmik Sperm Enjeksiyonu-Embriyo Transferi) modeli, insan ICSI'sini taklit etme ve yavru sağlık sonuçlarının uzun vadeli izlenmesini kolaylaştırma kapasitesi nedeniyle, ICSI teknolojisinin yavrulara yönelik potansiyel sağlık risklerini değerlendirmek için etkili bir araç haline gelmiştir⁵.

Bu çalışma, farelerin glikoz metabolik durumunu değerlendirmek için rastgele kan şekeri izleme, açlık kan şekeri testi ve glikoz tolerans testleri kullanarak ICSI-ET teknolojisinin yaygın bir metabolik fenotip, yani yavru glikoz metabolik sağlığı üzerindeki etkisini araştırmayı amaçlamaktadır. Normal fizyolojik aktiviteler sırasında glikoz metabolizmasındaki doğal dalgalanmaları yakalamak için rastgele kan şekeri izlemesi kullanılırken, potansiyel prediyabetik durumları değerlendirmek için açlık kan şekeri ve glikoz tolerans testleri kullanılır.

Protocol

Aşağıda açıklanan ICSI-ET protokolü, yönergeleri takip eder ve Şanghay Planlı Ebeveynlik Araştırmaları Enstitüsü'nün Hayvan Etik İncelemesi tarafından onaylanmıştır. Güvenlik Prosedürleri: Kimyasalları veya biyolojik malzemeleri kullanırken daima uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın. Davlumbaz Kullanımı: Sertifikalı bir çeker ocak veya biyogüvenlik kabini içinde uçucu kimyasallar veya aerosol oluşumunu içeren tüm prosedürleri gerçekleştirin. Süperovülasyon prosedürü için dişi fareler (6-8 haftalık B6D2F1 suşu) kullanın.

1. Farelerde ICSI

1. Farelerin süper yumurtlaması
   1. İlk gün saat 20: 00 civarında fare başına 7.5 IU'luk bir dozda intraperitoneal hamile kısrak serum gonadotropin (PMSG) enjeksiyonu uygulayın.
   2. Üçüncü gün saat 20: 00 civarında (PMSG enjeksiyonundan 48 saat sonra) fare başına 7.5 IU'luk bir dozda intraperitoneal insan koryonik gonadotropin (HCG) enjeksiyonu uygulayın.
2. HTF ortamını 1 mL'lik alikotlara hazırlayın ve dişi farelerde HCG enjeksiyonunun aynı gününde% 5 CO₂ inkübatörde 37 ° C'de gece boyunca dengeleme için açıkta bırakın.
3. ICSI gübreleme damlacıklarının hazırlanması
   1. Dişi farelerde HCG enjeksiyonunun aynı gününde, 50 x 9 mm'lik bir hücre kültürü kabı kapağını üst ve alt yarıya bölün. Sperm yerleştirme için %10 polivinilpirolidon (PVP) kullanarak her biri 5 μL'lik 4-6 damlacık oluşturmak için üst yarısını kullanın. ICSI prosedürü için M2 ortamını kullanarak her biri 5 μL'lik 8-10 damlacık oluşturmak için alt yarıyı kullanın.
   2. PVP ve M2 ortam damlacıklarını yaklaşık 3 mL mineral yağ ile örtün (Şekil 1).
4. Kültür yemeklerinin hazırlanması
   1. Dişi farelerde HCG enjeksiyonunun aynı gününde, 35 x 10 mm'lik bir hücre kültürü kabına 20 μL'lik 12 damla KSOM ortamı (MR-020P-D) eşit olarak dağıtın. Damlaları yaklaşık 3 mL mineral yağ ile örtün.
5. Sperm toplama:
   1. Dördüncü gün (HCG enjeksiyonundan 13 saat sonra) yaklaşık 9: 00'da servikal çıkık ile erkek farelere ötenazi yapın.
   2. Epididimal kaudayı izole edin ve steril gazlı bezle nazikçe lekeleyerek ve önceden ısıtılmış HTF ortamında durulayarak yağ dokusu ve kan kalıntılarını ortadan kaldırmak için iyice temizleyin.
   3. Spermin HTF ortamına serbestçe yüzmesine izin vermek için kauda epididimini kesin. Spermi serbest bırakmak için forseps kullanarak kaudayı hafifçe sıkın, bunları önceden dengelenmiş HTF tüplerinde toplayın ve daha fazla kullanım için sperm kapasitasyonu için 37 ° C,% 5 CO₂ inkübatörde açıkta tutun.
6. Oosit alımı
   1. Dördüncü gün saat 9:30 civarında servikal çıkık ile oosit alımı için uyarılan dişi farelere ötenazi yapın. Karın boşluğunu ortaya çıkarmak için karın derisinin ve kas tabakasının orta hattı boyunca dikkatlice bir kesi yapın.
   2. Yumurta kanallarının her iki tarafından, özellikle şişmiş ampulla bölgelerinden dokuyu nazikçe izole etmek için ince forseps kullanın ve sterilize edilmiş bir kültür kabında M2 ortamına aktarın. Belirtilen tüm farelerden yumurta kanalları toplanana kadar bu işlemi tekrarlayın.
   3. Diseksiyon mikroskobu altında, yumurta kanalının şişmiş ampullasının şeffaf bölümünü nazikçe delmek için 1 mL'lik bir şırınga iğnesi kullanın ve kümülüs-oosit komplekslerinin (COC'ler) ortama salınmasını kolaylaştırın.
   4. Aynı şırıngayı kullanarak, COC'leri dikkatlice seçin ve 100 μL taze M2 ortamı içeren yeni bir tabağa aktarın. Tüm COC'ler orijinal yumurta kanalı segmentlerinden başarıyla aktarılana kadar bu adımı tekrarlayın.
   5. Kan ve doku sıvılarını silin ve diseksiyon mikroskobu altında, 25 G'lik bir iğne kullanarak yumurta kanalının ampullasını yırtın, bu da çok sayıda COC'nin salınmasına neden olur.
   6. Yumurta kanalını ve doku parçalarını çıkarın, COC'leri hyaluronidaz (HY) içeren M2 ortamı damlacıklarına aktarın ve bunları 37 ° C'ye ısıtın.
   7. Yaklaşık 5 dakika inkübe edildikten sonra, kümülüs hücrelerinin ve oositlerin ayrılmasını kolaylaştırmak için nazik pipetleme yapın. Metafaz II (MII) oositlerini HY içeren çözeltiden taze M2 ortamına aktarın; daha sonra, M2 ortamının birden fazla damlacıklarına sıralı aktarımı gerçekleştirin.
   8. 2-3 tur yıkamadan sonra, oositleri KSOM kültür ortamı damlacıklarına aktarın ve daha sonra kullanmak üzere 37 °C,% 5 CO₂ inkübatörde saklayın.
7. Dördüncü gün saat 10:00 civarında, 50 watt'lık bir güç ayarı ile 46 kHz frekansında kafaları kuyruklardan ayırmak için 100 μL kapasiteli spermi 5 saniye boyunca sonike edin (bkz. adım 1.5.2).
   NOT: Kuyruğu kesmek için spermi sonikasyon yaparken, 5 saniyeyi geçmemesi gereken süreyi kontrol etmek için dikkatli olun. Sonikasyondan birkaç saniye sonra, sperm ters çevrilmiş bir mikroskop altında gözlemlenebilir; Spermin yaklaşık yarısı kesilmiş kuyruklar gösterdiğinde sonikasyonu durdurun.
8. ICSI prosedürü
   1. Enjeksiyon için düz uçlu ve 6 μm iç çapa sahip, 25 ° açıyla ayarlanmış, piyasada bulunan bir mikromanipülasyon iğnesi kullanın. İğneyi, iğnenin içinde 0,5 cm uzunluğunda doldurulmuş kısım ile çalışma sıvısı ile doldurun. Sıvı seviyesinin ~0,5 cm'ye ulaştığından emin olun.
      NOT: Döllenmiş oositlerin hayatta kalma oranını azaltabilecek yüksek sıcaklıklardan kaçınmak için enjeksiyon sırasında oda sıcaklığını 19 °C'de tutun. Sıvı seviyesinin 0,5 cm'ye ulaşmasını sağlamadaki hassasiyet, enjeksiyon işleminin bütünlüğünü korumak ve oositlerin canlılığını sağlamak için çok önemlidir.
   2. Enjeksiyon iğnesini mikromanipülatörün sağ koluna takın, tutma kapağını sıkarak güvenli bir şekilde sabitleyin. Mikromanipülatörün sol koluna fare oositleri için tasarlanmış, piyasada bulunan düz uçlu bir mikromanipülasyon tutma pipeti takın ve enjeksiyon iğnesini ve tutma pipetini mikroskobun görüş alanına yerleştirin.
   3. Bir pipet kullanarak bir damla PVP çözeltisine 1 μL sonikasyonlu sperm ekleyin.
   4. 20 MII oositi M2 ortamındaki bir damlacığa yerleştirin.
   5. PVP solüsyonunda 10-20 sperm kafasını aspire etmek için enjeksiyon iğnesini kullanın. Ardından, enjeksiyon iğnesini oositleri içeren damlacığın içine doğru hareket ettirin.
   6. İğ aparatının enjeksiyon tarafında olmadığından emin olmak için bir polarizasyon mikroskobu altında oosit içindeki metafaz milinin konumunu doğrudan belirleyin, polar gövde tipik olarak oositin yönüne göre saat 12 veya saat 6 konumunda bulunur.
   7. Oositi kültür kabının alt kısmı ile temas halinde tutun. Odak düzlemini, oositin zona pellucida'sı ve enjeksiyon iğnesi aynı düzlemde olacak şekilde ayarlayın.
   8. Enjeksiyon iğnesinin zona pellucida ile teması üzerine, zona pellucida'nın bir kısmını çizerek enjeksiyon iğnesine hafif bir negatif basınç uygulayın.
   9. Piezo darbelerini 5 yoğunluk ayarı ve 1 frekansla aynı anda etkinleştirin, zona pellucida'da etkili bir şekilde bir delik oluşturun ve enjeksiyon iğnesinin geçmesine izin verin.
   10. Enjeksiyon iğnesini perivitellin boşluğuna ilerletin ve sperm kafasını iğnenin ucuna itin. Enjeksiyon iğnesini, zona pellucida'nın karşı tarafına ulaşana kadar oositin içine sokun.
   11. Plazma zarında küçük bir gözenek oluşturmak için 1 yoğunluğa ve 1 frekansa ayarlanmış piezo darbeleri kullanın, böylece sperm kafasının minimum PVP girişi ve oosit bütünlüğünün en iyi şekilde korunması ile ooplazmaya enjekte edilmesini sağlayın.
   12. 20 oositin tümü enjekte edilene kadar 1.8.11 adımını tekrarlayın, ardından 19 ° C'de 15 dakikalık bir inkübasyon yapın.
   13. Hayatta kalan oositleri KSOM ortamına aktarın ve inkübatöre yerleştirin. 2 hücreli, 4 hücreli, morula ve blastosist oluşum oranlarını gözlemleyin.
       NOT: Oosit içine intrasitoplazmik tek sperm enjeksiyonu (ICSI) için zamanlama kontrol edilmeli ve HCG enjeksiyonundan sonraki 14-18 saat içinde prosedürün tamamlanması hedeflenmelidir.

2. Fare blastosistlerinin uterus nakli

1. Vasektomize erkek farelerin hazırlanması
   NOT: Çalışma için 6-8 haftalık ICR erkek fareleri kullanın.
   1. 0.2 mL / 10 g vücut ağırlığı dozunda% 1.25 2,2,2-tribromoetanol intraperitoneal enjeksiyonu ile anesteziyi indükleyin. Herhangi bir ağrı yanıtının olmaması anestezinin başarılı olduğunu gösterir.
      NOT: Mevcut protokol, anestezi uygulanmış hayvanların gözlerine veteriner merhemi uygulanmasını içermemekle birlikte, göz kuruluğunu önlemek ve prosedürler sırasında hayvanların sağlığını ve rahatını sağlamak için en iyi uygulama olarak önerilmektedir. Cerrahi ve iyileşme süreci boyunca tüm cerrahi aletler kullanılmadan önce sterilize edildi ve temiz bir ameliyat ortamı sağlamak için cerrahi alan antiseptik solüsyonlar kullanılarak hazırlandı.
   2. Potansiyel stres veya yaralanmalara karşı korunmak için, ilk iyileşme aşamasında ameliyat geçiren fareleri ayrı ayrı barındırın.
   3. Optimal ağrı kesici sağlamak için buprenorfini vücut ağırlığının 0.05 mg / kg'ı bir dozda uygulayın.
      NOT: Farelerin refahını sağlamak için, iyileşme döneminde fareleri yakından izleyin ve sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar onları gözetimsiz bırakmayın.
   4. Cerrahi bölgeyi, testislerin üstünde, alt karın bölgesinde hazırlayın. Kürkü çıkarın ve povidon-iyot ile dezenfekte edin. Steril makas kullanarak linea alba boyunca 1 cm uzunlamasına bir kesi yapın. Steril, tozsuz bir kağıtla kanı nazikçe alın ve karın kaslarını linea alba boyunca künt bir şekilde incelemeye ve karın boşluğuna erişmeye devam edin.
   5. Kavisli forseps kullanarak, sol testisi ve onunla ilişkili yağ pedini nazikçe kavrayın ve açığa çıkarın. Vas deferens'i tanımlayın ve sivri forseps kullanarak dikkatlice izole edin, manipülasyon için 10 mm'lik bir segment oluşturun.
   6. Kavisli forsepsleri birkaç saniye boyunca bir alkol lambasının dış alevinde tutarak sterilize edin. Vas deferens'i nazikçe kavrayın, koterizasyon nedeniyle düzleşmesine ve beyazlaşmasına neden olun. Birincinin 3-5 mm distalinde ikinci bir koterizasyon noktası oluşturun. Steril cerrahi makas kullanarak, iki koterizasyon noktası arasındaki vas deferens segmentini eksize edin.
   7. Vas deferens'in dağlanmış uçlarını dikkatlice inceleyin ve kısa, düzleştirilmiş, beyazlatılmış bir segment kaldığından emin olun. Kavisli forseps kullanarak, testisi ve ilişkili yağ pedini nazikçe karın boşluğuna geri koyun.
   8. Adım 2.1.6'da açıklanan prosedürü karşı taraflı (sağ) tarafta tekrarlayın.
   9. Ameliyat bölgesini dikişler kullanarak kapatın, tipik olarak kas tabakasına bir dikiş ve cilde üç dikiş yerleştirin. Cerrahi insizyonun uygun şekilde hizalandığından emin olun ve povidon-iyot ile dezenfekte edin. Hayvanı gözlem için bir ısıtma yastığına aktarın, hayvan bilincini geri kazanana kadar 10-15 dakika izleyin. İyileştikten sonra hayvanı barınak kafesine geri koyun.
      NOT: Vazektomi ameliyatını takiben, fareler 14 günlük bir iyileşme periyodu ve ardından 1 haftalık bir deneme çiftleşme deneyi gerektirir.
   10. Bu hafta boyunca, vazektomize olmuş erkekleri sürekli olarak dişilerle çiftleştirin ve çiftleşme tıkaçları olan tüm dişilerin gebelik durumunu gözlemleyin. Başarılı çiftleşme, dişi farenin vajinal ağzında sarımsı beyaz, bloklu bir vajinal tıkaç varlığı ile gösterilir.
       1. Fareleri ilk gün 16:00 ile 18:00 saatleri arasında eşleştirin ve ikinci gün 07:00 ile 09:00 saatleri arasında vajinal tıkaçları kontrol edin. Vajinal tıkaçları olan dişilerin 0.5 günde yalancı gebelik durumunda olduğunu düşünün ve bunları sonraki embriyo transfer deneyleri için kullanın. Vajinal tıkaçları olmayan dişileri alıcı gruba geri getirin.
          NOT: Vajinal tıkaçları olmayan bu dişiler, yalancı gebe dişileri hazırlamak için çiftleşme için kullanılmaya devam edilebilir. Tüm tıkalı dişilerin hamile kalmadığından emin olun; Ancak o zaman vazektomize edilmiş erkekler resmi deneyler için kullanılabilir.
       2. Vazektomize erkekler günlük olarak çiftleşebilirken, çiftleşme seansları arasında 1 gün dinlenmeye izin verin.
          NOT: Deneyimlerimize dayanarak, vazektomize erkekler bir yıldan fazla bir süre boyunca yüksek bir çiftleşme oranını koruyabilirler. Bununla birlikte, çiftleşen dişilerde art arda 4-6 deneme boyunca çiftleşme tıkaç üretemeyen vazektomize erkekler çalışmadan çıkarılmalıdır.
2. Yalancı gebe kadınların hazırlanması
   1. ICR dişi fareleri (7-10 haftalık, 25 g'ın üzerinde) vazektomize erkek farelerle (3-6 aylık) 1: 1 oranında çiftleştirerek yalancı gebe dişi fareler oluşturun.
      NOT: Vazektomize edilmiş erkekler, dişi farelerin uterus serviksini uyarmak için kullanıldı ve bu da corpora lutea'nın aktivasyonu ile sonuçlandı.
3. Blastosistlerin aktarılması için pipetin hazırlanması
   1. Nakledilecek embriyoları inkübatörden çıkarın ve 37 ° C sıcaklıkta bir M2 ortamı damlacığına aktarın.
   2. Küçük bir hacimde sıvıyı aspire etmek, az miktarda hava çekmek ve 6-10 embriyoyu aspire etmek için bir transfer pipeti kullanın. Son olarak, pipeti kapatmak için küçük bir hacim daha hava aspire edin.
      NOT: Transfer pipetindeki sıvının uzunluğu 0,5 cm'yi geçmemelidir.
4. Rahim nakli (blastokistler)
   1. Yalancı gebe dişi fareleri tartın (çiftleşmeden 2.5 gün sonra) ve 0.2 mL / 10 g vücut ağırlığı dozunda% 1.25% 2,2,2-tribromoetanol intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun. Kulağı forseps ile hafifçe bastırın.
   2. Farelere anestezi uyguladıktan ve alkol dezenfeksiyonu yoluyla asepsi sağladıktan sonra, ventral karın üzerinde orta hat uzunlamasına bir kesi yapın. Gevşek deri altı dokusundan yararlanarak, insizyonu nakil için gerektiği gibi sola veya sağa kaydırın. Periton boşluğuna erişmek için karın duvarı kas tabakasının lomber omurganın ~ 0.5 cm lateralinde künt diseksiyonunu yapmak için küçük makas kullanın.
   3. Atravmatik forseps kullanarak yumurtalıkları, yumurta kanallarını ve uterusu dikkatlice dışlayın.
   4. Bir şırınga iğnesinin ucunu kullanarak, kan damarlarından kaçınarak utero-tubal bileşkenin altındaki uterus duvarında küçük, yukarı açılı bir kesi yapın. Bu kesi rahim boşluğuna erişim sağlar; Yumurta kanalını küçük delikten 2-3 mm yavaşça yerleştirin.
   5. Embriyoların yavaş enjeksiyonu sırasında transfer pipetini dikkatli bir şekilde izlerken transfer pipetinin ucundaki küçük hava kabarcığını dikkatlice dışarı atın. Kültür ortamının merkezi kısmının dışarı atıldığı onaylandıktan sonra, prosedürü durdurun ve transfer pipetini yavaşça çıkarın.
   6. Yumurtalıkları, yumurta kanallarını ve uterusu karın boşluğuna geri yerleştirin. Kas tabakasını ve cildi ayrı ayrı dikin. Fareleri anesteziden kurtulana kadar bir ısıtma yastığına yerleştirin. Farelerin refahını sağlamak için, iyileşme döneminde fareleri yakından izleyin ve sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar onları gözetimsiz bırakmayın.
5. Hamileliğin gözlemlenmesi
   1. Ameliyattan sonra, doğan yavru sayısını izlemek için fareleri 18-21 gün boyunca gözlemleyin. Distosi (zor doğum) durumunda, sezaryen yapın. Yeni doğan farelerin aynı yaş grubundaki emziren barajlar tarafından beslenmesine izin verin.

3. Rastgele kan şekeri, açlık kan şekeri ve glikoz tolerans testi

1. Fare büyümesi sırasında rastgele kan şekeri seviyelerinin izlenmesi
   1. Farelerin doğumundan bu yana, iyi bir beslenme ve eğlence gecesinden sonra her 4 haftada bir sabah 9'da rastgele kan şekeri seviyesini izleyin.
      1. Kuyruk damarı kanı elde etmek için fare kuyruğu ucunu delin.
      2. İlk damla kan, beraberinde karışan doku sıvısının varlığı nedeniyle daha yüksek bir şeker ölçüm değerine sahiptir. Bu nedenle, temiz emici kağıt kullanarak ilk kan damlasını nazikçe silin.
      3. El tipi bir glukometre ile kuyruk damarından ikinci damladan (~ 4 μL) kan şekerini ölçün.
2. Fare gelişimi sırasında açlık kan şekeri ve glukoz toleransındaki değişikliklerin izlenmesi
   NOT: İlk kan örnekleme zaman noktasının 15 dakika olduğu göz önüne alındığında, tüm farelerin 15 dakika içinde enjekte edilmesi gerekir. Her fare enjeksiyonu 20-30 saniye sürdüğünden, enjeksiyonların bu zaman dilimi içinde tamamlanmasını sağlamak için her testte kullanılabilecek maksimum fare sayısı 30'u geçemez.
   1. Gece boyunca aç tutulan farelerde doğumdan sonra her 4 haftada bir açlık kan şekeri ve glikoz tolerans testlerini yapın.
      1. İlk gün taze ışınlanmış talaş, yatak takımları, temiz kafesler, kapaklar ve su şişeleri hazırlayın. Fareleri yiyeceksiz taze bir kafese aktarın. Kafeslere besleme etiketleri ekleyin.
      2. Yeterli% 10 glikoz enjeksiyonu (steril ve pirojen içermeyen) ve 1 mL şırınga hazırlayın.
      3. Her gruptaki farelerin 1. gün saat 17:00'den 2. gün saat 9:00'a kadar 16 saat oruç tuttuğundan emin olun, ancak suya serbest erişime izin verin. Bir glikoz ölçüm cihazı kullanarak 3.1.1.1-3.1.1.3 adımlarında açıklandığı gibi açlık kan şekeri seviyelerini ölçün.
   2. Hızlı tanımlamayı kolaylaştırmak için fareleri tartın ve kuyruklarını işaretleyin. 10 μL/g fare ağırlığına sahip glikoz şırıngaları hazırlayın.
   3. 30 s aralıklarla, farenin intraperitoneal boşluğuna 10 μL / g glikoz enjekte edin.
      NOT: Yanlış sıvı enjeksiyon hacmini önlemek için burada enjeksiyon tekniklerine özel dikkat gösterilmelidir. Operasyonun kilit noktaları aşağıdaki gibidir:
      1. Fareyi hareketsiz hale getirin ve kuyruğu bir elinizle tutun. Karın boşluğundaki organların başa doğru kayması ve yeterli enjeksiyon alanı bırakması için başı kalçalardan biraz daha aşağıda tutun.
      2. İğneyi orta hat ile kalça kemiği arasına yerleştirin, deriden 45 derecelik bir açıyla geçirin, ardından iğneyi cilt yüzeyine ~ 0,5 cm paralel olarak hizalarken karın boşluğunun daha derinlerine nazikçe yönlendirin.
         NOT: İç organların kazara delinip delinmediğini belirlemek için enjeksiyon sırasında herhangi bir dirence dikkat edin.
      3. Şırıngayı karın boşluğuna çıkarın.
      4. Enjeksiyonun başladığı zamanı kaydedin ve enjeksiyon hızını kontrol etmek için bir zamanlayıcı kullanın. Zamanlayıcıyı kullanırken zaman kaybetmemek için zamanlayıcıyı üç fare için 90 s'ye ayarlayın.
   4. Kan şekeri ölçümünü kuyruk damarından istenen aralıklarla alın (glikoz uygulamasından 0, glikoz uygulamasından 15, 30, 60, 90 ve 120 dakika sonra).
      NOT: Sonraki kan şekeri testi de her fare için 20-30 saniye sürmelidir.
   5. Deneyden sonra fareleri yiyecek ve su ile donatılmış ev kafeslerine geri koyun.

Discussion

Bu çalışma, insan destekli üreme teknolojisini (ART) kapsamlı bir şekilde özetlemek ve ICSI'nin ET ile birlikte yavru gelişimi üzerindeki etkisini incelemek için fare intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) ve embriyo transferi (ET) tekniklerini entegre etti. ICSI tekniğinin normal fare spermi ile uygulanmasında yüksek döllenme (%86.76) ve 2 hücre oranı (%88.48) elde edilmiştir. ET'yi takiben, yavru farelerin doğum oranı yaklaşık% 42.50 idi ve bu da teknik platformun sağlamlığını gösteriyor. Bu çalışmanın en dikkat çekici bulgusu, ICSI tekniğinin^{uygulanmasına} atfedilebilecek olan ICSI yavrularında glikoz metabolizma seviyelerinde yaşa bağlı dalgalanmaydı 6.

Glukoz metabolizması seviyelerinde gözlenen dalgalanmalar bu çalışmada dikkate değer bir bulgu oluşturmaktadır. Bu bulgu, ICSI tekniğinin, özellikle glikoz metabolizması⁷ ile ilgili olarak, yavruların sağlığı üzerindeki potansiyel uzun vadeli etkilerini ima etmektedir. Bu olgunun arkasındaki nedenleri açıklamak için, ICSI prosedüründe yer alan önemli teknik adımların kapsamlı bir incelemesini yaptık. Mikroenjeksiyon sıcaklığının (19 °C), ultrason kesme süresinin (5 saniye içinde) ve transfer sıvısı hacminin (<0.5 cm) kontrol edilmesinin, yüksek embriyo canlılığını ve implantasyon oranlarını korumak için önemli olduğunu bulduk. Transfer pipetinin sifonlama etkisinin kontrol edilmesi, hassas embriyo transferi için kritik bir adım olarak ortaya çıkmıştır. Transfer pipetini hazırlarken, tüpün çapında homojenlik sağlamak, sifonlama etkisini azaltmanın ve sıvının tüp içindeki hareketini daha iyi kontrol etmenin anahtarıdır. Bu ölçüm, embriyo transferinin başarı oranını ve doğruluğunu arttırmada etkilidir. Ayrıca, embriyo transferi sırasında uzun süreli in vitro kültürden ve aşırı kalabalıktan kaçınmak da gelişimsel yeterliliğin geliştirilmesine yardımcı oldu. Optimize edilmiş protokoller kullanarak, ET'yi takiben% 86.76'lık bir döllenme oranı ve% 42.50'lik bir doğum oranı elde ettik, bu da ICSI prosedürünün kendisinin doğal olarak canlılığı bozmadığını düşündürdü. Bu nedenle, glikoz metabolizmasındaki dalgalanmalar, açık embriyo hasarından ziyade ART işleminin neden olduğu ince hücre içi değişikliklerle daha makul bir şekilde ilişkilendirildi.

ART yaygın olarak güvenli olarak kabul edilse de, artan kanıtlar, görünüşte normal ART yavrularının bile, doğal olmayan üreme özellikleri ve gamet ve embriyo gelişimi sırasındaki kritik müdahale dönemleri nedeniyle yaşamın ilerleyen dönemlerinde çeşitli sağlık riskleri sergileyebileceğini göstermektedir 5,8,9,10,11,12,13 . Bulgularımız, ART'nin potansiyel metabolik etkileri hakkında yeni bilgiler sağlamakta ve ART'nin yavru sağlığı üzerindeki uzun vadeli etkileri hakkında daha fazla çalışmaya duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır¹⁴.

Bu çalışmada bir murin modeli kullanıldığını kabul etmek önemlidir; Sonuç olarak, sonuçlar doğrudan insan deneklere aktarılamayabilir. Bununla birlikte, fareler ve insanlar arasındaki önemli biyolojik paralellikler göz önüne alındığında, bu bulgular önemli ölçüde referans önemini korumaktadır¹⁵. Ayrıca, klinik uygulamada ICSI uygulanan hastaların sıklıkla sperm anormalliklerine sahip olduğunu kabul etmek önemlidir. Tersine, bu çalışmada ICSI prosedürleri için normal fareler kullanılmıştır, bu nedenle sperm anormallikleri olan farelerden ICSI yavruları hakkında veri yoktur. Bununla birlikte, sperm anormalliklerinin ICSI tekniğinin uzun vadeli etkileri üzerinde daha derin bir etkiye sahip olacağını tahmin etmek mantıklıdır. Bu nedenle, bu çalışmanın sonuçları dikkate değer bir referans değerini korumaktadır.

Çalışmamızın bir diğer sınırlılığı, fare modelimiz ile sperm immobilizasyonunda insan klinik uygulamaları arasındaki metodolojik tutarsızlıktır. ICSI'nin klinik uygulamasında, kuyruğu bir mikropipet ile fiziksel olarak parçalayarak insan spermini hareketsiz hale getirmek yaygın bir uygulamadır. Bununla birlikte, fare modeli deneylerimizde, fare embriyonik manipülasyonunda rutin olarak kullanılan bir yöntem olan spermi hazırlamak için ultrasonik kuyruk kırpma kullandık. Bu yaklaşımın, özellikle ultrasonun sperm bütünlüğüne ve işlevine neden olabileceği olası zararı göz önünde bulundurarak, modelde istemeden değişkenlik ve potansiyel yanlılık yaratabileceğini kabul ediyoruz. Bu metodolojik farklılık, bulgularımızın doğrudan tercüme edilebilirliğini sınırlayabilir. Gelecekteki çalışmalarımızda, fare sperminin kuyruklarını bozmak için mikropipetlerin kullanımını keşfetmeyi planlıyoruz. Bu ayarlama, sperm üzerindeki istenmeyen etkileri en aza indirmeyi ve insan ICSI prosedürlerinde gözlemlenen koşulları ve sonuçları daha iyi çoğaltmayı amaçlamaktadır. Bulgularımızın klinik uygunluğunu artırmak için araştırma uygulamalarımızı sürekli olarak geliştirmeye kararlıyız.

Yukarıda belirtilen teknolojik platforma dayanarak, gelecekteki araştırmalarda, ICSI tekniğinin kardiyovasküler sağlık ve bağışıklık sistemi gibi yavru sağlığının diğer yönleri üzerindeki etkisini daha fazla araştıracağız. Ayrıca, ICSI'nin uzun vadeli etkilerini kapsamlı bir şekilde anlamak için daha uzun vadeli takip çalışmaları da zorunludur.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anestezik için	% 1.25 avertin (2,2,2-tribromoetanol)	Nanjing Aibei	M2960
Bakteriyolojik Petri Kapları 35 x 10 mm stil, sıkı kapaklı, kristal dereceli saf polistiren, steril	BD	353001
Bakteriyolojik Petri Kapları 50 x 9 mm stil, sıkı kapaklı, kristal dereceli saf polistiren, steril	BD	351006
Biyogüvenlik Kabini	ESCO	class BSC	Aseptik işlemleri, kültür yemekleri yapımı, reaktiflerin alikotlanması vb.
CO2 İnkübatörü	Thermo	8000DH	Embriyo kültürü
Diseksiyon Mikroskobu	Olympus	SZX16	Fare embriyo transferinde kullanım
Fluorinert Fc-770	SIGMA	F3556	Fluorinert FC-770, çalışma sıvısı el tipi glukometre olarak kullanılan, yüksek dielektrik dayanımı ve direncine sahip, termal olarak kararlı, tamamen florlu bir sıvıdır.
			glukoz ölçümü
HTF	Merck	MR-070-D	Fare IVF ile kullanılmak üzere tasarlanmış sıvı olan EmbryoMax İnsan Tubal Sıvısı (HTF) (1x), 50 mL formatında mevcuttur ve Embriyo Kültürü için optimize edilmiş ve onaylanmıştır.
Hidrolik Mikroenjektör	Eppendorf	CellTram 4r Yağ, 5196000030	Sperm enjeksiyonu için
Ters Mikroskop	Nikon	TI2-U	Mikromanipülasyon gözlem ev sahibi
KSOM	Merck	MR-020P-D	(1x), Toz, Fenol Kırmızısı olmadan, 5 x 10 mL
M2	Merck	MR-015-D	EmbryoMax M2 Orta (1x), Sıvı, Fenol Kırmızı Mikromanipülatörlü
	NARISHIGE	NTX-N4	Mikromanipülasyon kolu
mineral yağı	SIGMA	M8410	Mineral yağ, çeşitli moleküler biyoloji uygulamalarında buharlaşmayı ve çapraz kontaminasyonu kontrol etmek için bir örtü tabakası olarak kullanıma uygundur.
İğne Kesici	Nanjing Aibei	Sutter MF-800	Mikromanipülasyon iğneleri imalatı için kullanın
İğne Çektirme	Nanjing Aibei	Sutter modeli p-100	Mikromanipülasyon iğneleri yapmak için kullanın
Piezo Matkap Gezisi Mouce ICSI	Eppendorf	5195000.087	ICSI enjeksiyon iğnesi uygulaması.
Piezoelektrik Mikromanipülatör (Membran Kesici)	Eppendorf	Eppendorf PiezoXpert	Oositin zona pellucida ve oolemmasını kırmak için mikro darbelerin kullanımı
Pnömatik Mikroenjektör	Eppendorf	CellTram 4r Hava, 5196000013	Oositi sabitlemek için
Kullanıma hazır İnsan Koryonik Gonadotropin (Hcg)	Nanjing Aibei	M2520	Sterilizasyon reaktifi, intraperitoneal enjeksiyon. 50 IU/mL
Kullanıma Hazır Hamile Kısrak Serumu Gonadotropin (PMSG)	Nanjing Aibei	M2620	Sterilizasyon reaktifi, intraperitoneal enjeksiyon. 50 IU/mL
Stereomikroskop	Olympus	SZX7	Oosit eldesi ve embriyo gelişiminin gözlemlenmesi