Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Karaciğer Organogenezini Modellemek, Assembloidler Oluşturmak ve İnsan Hücre Hatlarını Kullanarak Sentetik Dokular Tasarlamak için İn Vitro Yetiştirme Teknikleri

1.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/66229

⸱

18 Nisan 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University at Buffalo (State University of New York), 2Clinical and Translation Research Center (CTRC), University at Buffalo (State University of New York), 3Department of Chemical and Biological Engineering, University at Buffalo (State University of New York), 4Center for Cell, Gene and Tissue Engineering, University at Buffalo, State University of New York, 5Khufu Therapeutics, Inc.

Bu makalede

Özet

Organoidler, organ geliştirme, ilaç keşfi ve hastalık araştırmaları için kişiselleştirilmiş doku modellemesinde devrim yaratıyor. Organoid mühendisliği, karmaşık sentetik dokular oluşturmaya doğru ilerler. Amaç, doku mühendisliğini ilerletmek için morfogenez, assembloid teknolojisi ve biyomatrisleri entegre etmektir. Bu protokol, karaciğer organogenezinin modellenmesine ve sentetik doku yapımı için kılavuzların oluşturulmasına yardımcı olur.

Özet

Kronik karaciğer hastalığı, dünya çapında 800 milyondan fazla insanı etkileyen salgın boyutlara ulaştı. Mevcut tedavi olan ortotopik karaciğer transplantasyonunun çeşitli sınırlamaları vardır. Karaciğer rejeneratif tıbbı alanında, karaciğer organogenezinin önemli bir potansiyele sahip olduğu umut verici çözümler ortaya çıkmıştır. E8.5 ve 11.5 arasında meydana gelen erken karaciğer organogenezi, morfogenez, hepatik kord oluşumu ve toplu göçe yol açan epitelyal-mezenkimal etkileşimlerin oluşumunu içerir. Bununla birlikte, bu sürecin in vitro modellemesi için yöntem eksikliği vardır. Bu çalışmada, karaciğer organogenezinin çeşitli aşamalarının ve yönlerinin insan hücre dizileri ile modellenmesini sağlayan ayrıntılı bir dizi yöntem sunulmaktadır. Bir yöntem serisinde, karaciğer organogenezinde bulunan erken yapıları kopyalayan, erken morfogenezi modelleyen ve in vivo olarak görüldüğü gibi interstisyel hücre göçünü gösteren hepatik (HEP) ve mezenkimal (MES) sferoidli assembloid teknolojisi kullanılır. Bu yenilikçi asambloid sistemleri, asambloid oluşumunu ve göçünü etkileyen faktörlerin belirlenmesine yardımcı olur. Toplu göç ve dallanma morfogenezini modellemek için HEP küresel yetiştirme sistemleri de kullanıldı. Mezenkimal şartlandırılmış besiyeri (M-CM), doza bağlı dallanma göçünün başlatılmasında önemli bir rol oynar. Sunulan tüm yöntemlerin yüksek başarı oranı ile yüksek oranda tekrarlanabilir olduğu gösterilmiştir. Çalışmamız, bu olayları birbirine bağlayarak, in vitro ve in vivo organogenezi tersine çevirmek için sıralı, morfogenetik olayların yeniden oluşturulmasını sağlayacaktır.

Giriş

Karaciğer hücre göçü, karaciğer organogenezinde, hastalığında ve hücre tedavisinde önemli bir rol oynar. Karaciğer organogenezi sırasında (E8.5-9.0, fare), ventral ön bağırsak pre-hepatik epiteli, çevredeki mezenşim ve kalpten yayılan indüktif sinyaller nedeniyle karaciğer genlerini eksprese etmeye başlar. E9.0'da, hücreler bir küboidalden psödostratifiye kolumnar morfolojiye geçerken ön bağırsak epiteli kalınlaşır ve karaciğer divertikülünü oluşturur1,2. Bu kritik aşamada, karaciğer divertikülü sadece ~ 1.500 hücreden oluşur. Daha sonra, karaciğer divertikülünü kaplayan hepatik endoderm kalınlaşır, tabakalara ayrılır ve göç eden hepatoblastların (HB'ler) kordonlarını oluşturur. Bu HB'ler, endotel hücreleri ve mezenkimal hücrelerle birlikte göç eder, çevredeki mezenkimal dokuya dallanır ve karaciğer tomurcuğu3,4'ü oluşturmak için üç boyutlu kolektif hücre göçünü başlatır. Aslında, bu aşamada, hücreler toplu olarak (1) diğer hücre tipleriyle birlikte birlikte göç veya hareket, (2) dallanma morfogenezi veya dallanma tüpü benzeri yapıların oluşumu ve (3) interstisyel göç veya diğer hücrelerin üzerinde veya arasında göç. E11.5 ile göç durur ve ilkel karaciğer oluşur ve 103 kat genişler3. Karaciğer hücre göçü, karaciğer organogenezinin sonraki aşamalarında da gerekli olabilir, çünkü sıçan fetal HBs ekspresyonu, 3D kolektif hücre göçü, morfogenez ve hücre dışı matris yeniden şekillenmesi5 ile ilişkili yüksek derecede yukarı regüle genlerin kanıtlarını göstermiştir. Erken karaciğer organogenezindeki rolüne ek olarak, 3D toplu göç, ileri hepatoselüler karsinomun (HCC) lokal yayılımı ve metastazı ile karmaşık bir şekilde bağlantılıdır ve sonuçta prognozun kötüleşmesine ve tedavi direncinin artmasına yol açar6. Yetişkin ve fetal hepatositler, karaciğer yeniden popülasyonu sırasında dalaktan karaciğer içine geçerken de toplu göç kullanır. İn vivo görüntüleme çalışmaları, nakledilen hepatositlerin saatler içinde portal ven'e ve ardından kılcal damarlara girdiğini, karaciğer sinüzoidleri boyunca ve karaciğer dokusu boyunca göç ettiğini göstermiştir7,8,9. Son olarak, son çalışmalar, göç eden HB'lerin murin ve insan karaciğer rejenerasyonu sırasında ortaya çıktığını ve sheets10'da bazı hareket kanıtları olduğunu göstermektedir. Genel olarak, birden fazla morfogenez moduna sahip olan karaciğer kolektif göçü, organogenez, kanser, hepatosit hücre tedavisi ve karaciğer rejenerasyonunda önemli bir rol oynar.

Çok sayıda genetik çalışma, 3D karaciğer kollektif hücre göçünün altında yatan moleküler yolları araştırmıştır. Bu çalışmalar, karaciğer kordonlarının yokluğunun karaciğer oluşumunu engellediğini ortaya koyarak, karaciğer oluşumu için karaciğer oluşumunun gerekliliğini ve bunların destekleyici hücrelerle etkileşimlerini vurgulamaktadır1,11,12,13. Bu çalışmalar ayrıca karaciğer büyümesinin kardiyak mezodermden salgılanan FGF-2, çevre mezenşimden salgılanan BMP4, HGF ve endotel hücre etkileşimleri dahil olmak üzere çeşitli faktörler tarafından başlatıldığını göstermektedir. Ek olarak, HEX, PROX1 ve TBX3 dahil olmak üzere göçle ilişkili transkripsiyon faktörleri çok önemli roller oynar2,14. Sonuç olarak, genetik çalışmalar, transkripsiyon faktörü ekspresyonuna yol açan çözünür faktör sinyalizasyonunun, HB'ler ve çevresindeki mezenşim arasındaki göçü, sinyalleşmeyi ve moleküler etkileşimleri yönlendirdiğine dair kanıtlar sunmaktadır.

Erken karaciğer organogenezinde hücre göçü kapsamlı bir şekilde araştırılmış olsa da, karaciğer göçünün mevcut in vitro çalışmaları sıklıkla in vivo tümör modellerinin yanı sıra yüksek oranda göç eden HCC hücrelerini kullanan 2D testler kullanır15. Bu çalışmalar, TGFβ-116, c-Myc17, YAP18, goosecoid19, actopaxin20 ve miRNAs21,22,23. 3D hepatik hücre göçündeki moleküler mekanizmaların anlaşılmasında kayda değer bir ilerleme kaydedilmiş olsa da, 2D ve 3D hücresel göç arasındaki belirgin eşitsizlikler, 2D tahlillerin doğal sınırlamalara sahip olduğunu göstermektedir. Dahası, bu modeller genellikle hem göç hem de büyüme için gerekli olan mezenkimal hücre tiplerinin dahil edilmesinden yoksundur. Destekleyici mezenşimi entegre eden karaciğer göçü için 3D modellerin geliştirilmesinde ilerleme olmasına rağmen, bu modeller öncelikle çeşitli toplu göç modlarını keşfetmek yerine birlikte göçü vurgulamaktadır.

Çeşitli kendi kendine birleşme ve morfogenetik süreçler yoluyla sferoidlerden doku üretme yeteneği, sentetik dokuların bilimsel olarak araştırılmasını kolaylaştırır. Bu dokular ilaç geliştirme ve tarama, hastalık modelleme, tedavi ve diğer biyomedikal ve biyoteknolojik uygulamalarda geniş uygulamalara sahiptir. Farklı karaciğer 3D toplu göç modlarını sergilemek için tasarlanmış birkaç 3D in vitro yetiştirme sisteminin metodolojik ayrıntıları sağlanmaktadır. Bu sistemler (1) bir matris içinde HEP ve MES sferoidleri ile ko-sferoid kültürü, (2) M-CM ile kültürlenmiş HEP sferoid matris damlacığı, (3) HEP-MES karışık sferoidleri ve (4) yüksek yoğunluklu MES hücreleri ile kültürlenmiş HEP sferoid matriks içerir. Bu sistemler, karaciğer kolektif göçünün 3 boyutlu bir ortamda sağlam bir şekilde modellenmesini sağlar, böylece karaciğer organogenezi, kanser ve tedavinin altında yatan moleküler ve hücresel süreçler hakkındaki anlayışımızı geliştirir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Bu makalede kullanılan kısaltmalar Ek Dosya 1'de tanımlanmıştır.

1. %1 düşük elektroendozmoz (EEO) agaroz çözeltisinin hazırlanması

  1. 2.5 g düşük EEO agaroz tozunu tartın ve bir behere aktarın.
    NOT: Çözelti hazırlama sırasında kabarcıklanmayı önlemek için beherin istenen hacmin en az iki katı boyutunda olduğundan emin olun.
  2. 250 mL damıtılmış suyu ölçmek için dereceli bir silindir kullanın ve %1'lik bir nihai konsantrasyon (a/h) hedefleyerek behere dökün.
  3. Beherin ağzını plastik sargı ile kapatın ve havalandırma için küçük bir delik bırakın. Beheri mikrodalgada 30 saniye ısıtın.
  4. Beheri dikkatlice çıkarın ve içindekileri döndürün. Tamamen çözünene kadar bu işlemi her 30 saniyede bir tekrarlayın.
    DİKKAT: Mikrodalgada pişirilmiş cam eşyaları, uygun eldivenler kullanarak dikkatli bir şekilde kullanın. Aşırı ısınmayı veya kaynamayı önlemek için çözeltiyi yakından izleyin.
  5. Homojen bir çözelti elde edildiğinde, kabı mikrodalgadan çıkarın. Solüsyonu önceden sterilize edilmiş bir şişeye aktarmadan önce hafifçe döndürün. Solüsyonu otoklavlayın ve agaroz solüsyonunu kullanıma hazır olana kadar oda sıcaklığında (RT) saklayın.

2. 96 oyuklu plakanın kaplanması

NOT: Bu ve diğer deneylerde 384 kuyulu ultra düşük bağlı küresel mikroplakalar kullanılabilir.

  1. Steril% 1 agaroz çözeltisi içeren şişenin kapağını gevşetin. Çözeltiyi sıvı faza geçene kadar mikrodalgada 30 saniye aralıklarla ısıtın; Ardından kapağı sıkın.
    DİKKAT: Mikrodalgada pişirilmiş cam eşyaları, uygun eldivenler kullanarak dikkatli bir şekilde kullanın. Aşırı ısınmayı veya kaynamayı önlemek için çözeltiyi yakından izleyin.
    NOT: Bu adımları steril bir doku kültürü laminer akış başlığı altında gerçekleştirin.
  2. 96 oyuklu doku kültürlü plakayı kaplamak için oyuk başına 55-65 μL% 1 agaroz çözeltisi aktarın ve plakayı hemen döndürün.
  3. % 1'lik agaroz çözeltisi istenen sayıda oyuğa aktarıldıktan sonra, agarozun katılaşmasını sağlamak için plakaları 4 ° C'lik bir buzdolabında 20-30 dakika bekletin. Kullanmadan önce plakayı oda sıcaklığına getirin (Şekil 1A).

3. HEP sferoidlerinin hazırlanması

  1. % 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ve% 1 Penisilin-Streptomisin (Pen-Strep) ile desteklenmiş, Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamından (DMEM) oluşan tamamlanmış büyüme ortamı (cDMEM) kullanarak bir T-75 şişesinde HepG2-WT hücrelerini yetiştirin. Hücre kültürünü 37 ° C ve% 5 CO2'de tutun ve büyüme ortamını günlük olarak değiştirin.
  2. % 80 birleşmeye ulaştığında, hücreleri 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın ve durulamayı atın. Şişeye 5 mL %0.05 Tripsin-EDTA ekleyin ve 37 °C ve %5CO2'de 5-10 dakika inkübe edin.
  3. Eşit miktarda cDMEM ekleyin ve hücreleri şişeden yıkayın. Hücreler ayrıldıktan sonra, karışımı 15 mL'lik steril konik bir santrifüj tüpüne aktarın ve hücre süspansiyonunu RT.
    'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin NOT: Bu protokolde belirtilen tüm santrifüj adımları oda sıcaklığında (RT) gerçekleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu santrifüjleme prosedürleri alternatif olarak soğuk sıcaklıklarda gerçekleştirilebilir.
  4. Hücre süspansiyonunu taze cDMEM'de yeniden askıya alın ve hücreler / mL'deki nihai konsantrasyonu belirlemek için hücreleri sayın (Şekil 1B).
  5. Hücrelerin boya etiketlemesi
    NOT: Bu isteğe bağlı bir adımdır.
    1. İstenilen miktarda hücre süspansiyonunu 15 mL'lik steril konik santrifüj tüpüne aktarın ve hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
    2. 1.0 x 106 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için hücre peletini serum içermeyen bir büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Her mL hücre süspansiyonu için 5 μL floresan hücre etiketleme çözeltisi ekleyin ve hücre süspansiyonunu 20 dakika boyunca rotasyonda 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin< > NOT: Serumsuz büyüme ortamı DMEM'dir ve sadece %1 pen-strep ile desteklenir. Hücre süspansiyon yoğunluğuna bağlı olarak düzgün boyama için inkübasyon süresini ayarlayın.
    3. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 450 x g'da santrifüjleyin ve hücre peletini taze cDMEM'de yeniden süspanse edin. Bu yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın (Şekil 1C).
  6. Küresel oluşum
    1. Hücre sayısına bağlı olarak 5.0 x 104 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için hücreleri taze cDMEM'de askıya alın. Hücre süspansiyonunu iyice karıştırın ve oyuk başına 100 μL hücre süspansiyonunu agaroz kaplı 96 oyuklu plakaya aktarın.
      NOT: Hücre süspansiyon yoğunluğu, agaroz kaplı 96 oyuklu plakada oyuk başına 5.000 hücre elde edecek şekilde ayarlanmıştır. 384 oyuklu plakaların kullanımı için, hücreler 2.0 x 105 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyonda süspanse edilir ve oyuk başına 10.000 hücrelik bir konsantrasyon elde etmek için kuyu başına 50 μL hücre süspansiyonu aktarılır.
    2. Plakayı 10 dakika boyunca 340 x g'da santrifüjleyin ve 5-9 gün boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin ( Şekil 1D).
      NOT: Kaplamadan sonra büyüme ortamını her gün değiştirin, cDMEM'in% 50'sini nazikçe çıkarın ve değiştirin. HEP sferoidleri, HEP-MES montaj modeli veya M-CM modeli için uygundur.

4. MES sferoidlerinin hazırlanması

  1. %10 FBS ve %1 Pen-Strep ile desteklenmiş DMEM içeren cDMEM kullanarak bir T-175 şişesinde HFF/MRC-5 hücrelerini yetiştirin. Hücre kültürünü 37 ° C ve% 5 CO2'de tutun, ortamı her gün değiştirin.
  2. % 80 birleşmeye ulaştıktan sonra, hücreleri 1x PBS ile durulayın ve durulamayı atın. Şişeye 5 mL %0.25 Tripsin-EDTA ekleyin ve 37 °C ve %5CO2'de 5-10 dakika inkübe edin.
  3. Eşit miktarda cDMEM ekleyin ve hücreleri şişeden yıkayın. Hücreler ayrıldıktan sonra, karışımı 15 mL'lik steril konik santrifüj tüpüne aktarın ve hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
  4. Hücre süspansiyonunu taze cDMEM'de yeniden askıya alın ve hücreler / mL'deki nihai konsantrasyonu belirlemek için hücreleri sayın (Şekil 1B).
  5. Hücrelerin boya etiketlemesi
    NOT: Bu isteğe bağlı bir adımdır.
    1. İstenilen miktarda hücre süspansiyonunu 15 mL'lik steril konik santrifüj tüpüne aktarın ve hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
    2. 1.0 x 106 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için hücre peletini serum içermeyen bir büyüme ortamında yeniden süspanse edin. Her mL hücre süspansiyonu için 5 μL floresan hücre etiketleme çözeltisi ekleyin ve hücre süspansiyonunu 20 dakika boyunca rotasyonda 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin< > NOT: Serumsuz büyüme ortamı DMEM'dir ve sadece %1 pen-strep ile desteklenir. Hücre süspansiyon yoğunluğuna bağlı olarak düzgün boyama için inkübasyon süresini ayarlayın.
    3. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 450 x g'da santrifüjleyin ve hücre peletini taze cDMEM'de yeniden süspanse edin. Bu yıkama işlemini iki kez daha tekrarlayın (Şekil 1C).
  6. Küresel oluşum
    1. Hücre sayısına bağlı olarak 1.0 x 105 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için hücreleri taze cDMEM'de askıya alın. Hücre süspansiyonunu iyice karıştırın ve oyuk başına 100 μL hücre süspansiyonunu agaroz kaplı 96 oyuklu plakaya aktarın.
      NOT: Hücre süspansiyon yoğunluğu, agaroz kaplı 96 oyuklu plakada oyuk başına 10.000 hücre yoğunluğuna ulaşacak şekilde ayarlanmıştır.
    2. Plakayı 10 dakika boyunca 340 x g'da santrifüjleyin ve 5-9 gün boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin ( Şekil 1D).
      NOT: Kaplamadan sonra büyüme ortamını her gün değiştirin, cDMEM'in% 50'sini nazikçe çıkarın ve değiştirin. MES sferoidleri, HEP-MES montaj modeli için uygundur.

5. HEP-MES assembloid oluşumu

NOT: HEP (Şekil 2A) ve MES sferoidlerinin (Şekil 2B) oluşumu için adım 3 ve adım 4'e bakın.

  1. 96 oyuklu plakadan bir pipet kullanarak HFF/MRC-5 sferoidlerini ayrı ayrı toplayın. Bunları taze cDMEM içeren 15 mL'lik steril konik santrifüj tüpüne aktarın. Sferoidlerin tüpe 5 dakika oturmasına izin verin ve ardından ılık cDMEM.
    ile nazikçe durulayın NOT: Durulama işlemini nazikçe ve dikkatli bir şekilde gerçekleştirin.
  2. Tek bir HFF/MRC-5 sferoidini bir pipet kullanarak bir HepG2-WT sferoidi içeren bir kuyucuğa nazikçe aktarın. 1: 1 ve 1: 5 seyreltmede buz gibi soğuk büyüme faktörü azaltılmış (GFR) Matrigel (MG) veya sıçan kuyruğu Kollajeni (CG) ekleyin ve 3 saat boyunca% 5 CO2'de 37 ° C'de inkübe edin ( Şekil 2C).
    NOT: MG'yi gece boyunca 2 °C ila 8 °C buzdolabında buz üzerinde çözdürün. 10 °C'nin üzerinde bir jel oluşturduğu için MG ile çalışırken önceden soğutulmuş pipetlerin, uçların ve tüplerin kullanıldığından emin olun.
  3. İnkübasyondan sonra, her bir oyuğa 75 μL taze cDMEM ekleyin ve 2-3 gün boyunca% 5 CO2'de 37 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Kaplamadan sonra büyüme ortamını her gün değiştirin, cDMEM'in% 50'sini nazikçe çıkarın ve değiştirin. Assembloidler, 3-4 güne kadar ortam değişiklikleri olmadan oluşmaya devam edecektir. HEP-MES asambloid oluşumu matris kullanılmadan meydana gelebilir.

6. HEP küresel damlacık oluşumu

NOT: HEP sferoidlerinin oluşumu için adım 3'e bakın (Şekil 3A). HEP sferoidlerini damlacıklar halinde süspanse etmek için iki farklı malzeme kullanılabilir. İki yöntem aşağıda verilmiştir.

  1. GFR MG damlacıkları
    1. HepG2-WT sferoidlerini 96 oyuklu plakadan bir pipet kullanarak ayrı ayrı toplayın ve buz üzerinde 15 mL'lik steril konik bir santrifüje yerleşmelerine izin verin.
    2. Ayrı bir 15 mL steril konik santrifüj tüpünde, 1 mL buz gibi soğuk GFR MG ve buz gibi soğuk kontrol büyüme ortamını 1: 1 seyreltmede karıştırın. HepG2-WT sferoidlerini içeren 15 mL'lik tüpten bir pipet kullanarak ortamı aspire edin ve buzun üzerine yerleştirin.
      NOT: MG'yi gece boyunca 2 °C ila 8 °C buzdolabında buz üzerinde çözdürün. 10 °C'nin üzerinde bir jel oluşturduğu için MG ile çalışırken pipetlerin, uçların ve tüplerin önceden soğutulduğundan emin olun.
    3. MG çözeltisini HepG2-WT sferoidlerine ekleyin ve MG çözeltisi içinde eşit küresel dağılım sağlayın.
    4. 200 μL'lik bir pipet kullanarak, MG çözeltisinde 15 μL'lik tek bir sferoid hacmi toplayın ve yavaşça 60 mm'lik bir Petri kabına tohumlayın (Şekil 3B).
      NOT: Damlacık başına birden fazla sferoid tohumlanırsa, çıkarın ve uygun şekilde yeniden tohumlayın. Sferoidler, damlacığın merkezinde olduklarından emin olmak için gerekirse yeniden konumlandırılır. Optimum sferoid tohumlama için, hava kabarcığı oluşumunu en aza indirmek için ters pipetleme kullanmayı düşünün.
  2. Sıçan kuyruğu CG damlacıkları
    NOT: Tüm CG hazırlığı buz üzerinde yapılmalıdır.
    1. HepG2-WT sferoidlerini 96 oyuklu plakadan bir pipet kullanarak ayrı ayrı toplayın ve buz üzerinde 15 mL'lik steril konik santrifüj tüpüne yerleşmelerine izin verin (Şekil 3B).
    2. Bir mikrosantrifüj tüpünde, toplam 1 mL.
      hacim için 358.8 μL deiyonize su, 100 μL 10x PBS, 12.1 μL 1 N NaOH ve 529.1 μL stok sıçan kuyruğu CG ekleyin NOT: Stok sıçan kuyruğu CG'si her zaman sonuna eklenmelidir.
    3. CG çözeltisini HepG2-WT sferoidlerine ekleyin ve CG çözeltisi içinde eşit küresel dağılım sağlayın.
    4. 200 μL'lik bir pipet kullanarak, CG çözeltisinde 15 μL'lik tek bir sferoid hacmi toplayın ve yavaşça 60 mm'lik bir Petri kabına tohumlayın.
      NOT: Damlacık başına birden fazla sferoid tohumlanırsa, çıkarın ve uygun şekilde yeniden tohumlayın. Sferoidler, damlacığın merkezinde olduklarından emin olmak için yeniden konumlandırılır. Optimum sferoid tohumlama için, hava kabarcığı oluşumunu en aza indirmek için ters pipetleme kullanmayı düşünün.
  3. Büyüme ortamını eklemeden önce damlacıkları 37 °C ve% 5 CO2'de 60 dakika inkübe edin.
  4. Petri kabına istenen büyüme ortamından 5 mL'yi yavaşça ekleyin ve 37 °C'de inkübe edin ve her üç günde bir büyüme ortamı değişiklikleriyle% 5 CO2 ( Şekil 3C).
    NOT: HEP DAMLACIK OLUŞUMU TESTINDE M-CM kullanılmıştır.

7. M-CM'nin Hazırlanması

  1. HFF / MRC-5 hücrelerini hasat edin ve bunları 5.000 hücre /cm2 tohumlama yoğunluğunda T-75 doku kültürü ile muamele edilmiş bir şişeye tohumlayın ve şişeyi 15 mL cDMEM'de 72 saat boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
    NOT: Optimal hücre sağlığını sağlamak için bu süre zarfında şişeyi izleyin.
  2. 72 saatlik inkübasyondan sonra, M-CM'yi 15 mL'lik steril konik santrifüj tüpünde toplayın. M-CM'yi kalıntıların giderilmesi için 5 dakika boyunca 290 x g'da santrifüjleyin ve sterilizasyon için 0,2 μm'lik bir filtre kullanarak filtreleyin (Şekil 4A).
  3. M-CM'yi 1: 1 ila 1: 7 seyreltme oranında tam büyüme ortamı ile seyreltin ve istenen deneye ekleyin (Şekil 4B).
    NOT: HEP damlacık oluşumu testinde M-CM kullanın.

8. HEP-MES karışık küresel oluşumu

NOT: HepG2-WT hücre süspansiyonu hazırlığı için adım 3.1-3.5'e ve HFF/MRC-5 hücre süspansiyonu hazırlığı için adım 4.1-4.5'e bakın.

  1. Her hücre süspansiyonu için 1.0 x 105 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için HepG2-WT hücrelerini taze cDMEM'de askıya alın.
  2. Her hücre süspansiyonu için 1.0 x 105 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için HFF / MRC-5 hücrelerini taze cDMEM'de askıya alın.
  3. HepG2-WT ve HFF/MRC-5 hücre süspansiyonlarını, 2.0 x 105 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için 1: 1 oranında 15 mL'lik bir steril konik santrifüj tüpüne aktarın. Hücre süspansiyonunu iyice karıştırın ve oyuk başına 100 μL hücre süspansiyonunu agaroz kaplı 96 oyuklu plakaya aktarın.
    NOT: Hücre süspansiyon yoğunluğu, agaroz kaplı 96 oyuklu plakada oyuk başına 20.000 hücre elde edecek şekilde ayarlanmıştır.
  4. Plakayı 340 x g'da 10 dakika santrifüjleyin ve 37 °C ve %5 CO2'de 1-2 gün inkübe edin (Şekil 5C).
  5. Fibrin hidrojellerin eklenmesi
    NOT: Bu, HEP-MES karışık sferoidlerin kaplanmasından 72 saat sonra yapılan isteğe bağlı bir adımdır.
    1. 15 mL'lik steril konik santrifüj tüpünde, fibrin oluşumu için fibrinojen (3.25 mg / mL) ve trombin (12.5 birim / mL) 4: 1 oranında karıştırın ve tüpü buz üzerine koyun.
  6. Fibrini, kuyucuktaki mevcut cDMEM ile 1: 1 seyreltmede önceden var olan karışık bir sferoid ile her bir oyuğa aktarın. Plakayı 37 °C ve% 5 CO2'de 30 dakika inkübe edin.
  7. İnkübasyondan sonra, her bir oyuğa 75 μL taze cDMEM ekleyin ve 1-2 gün boyunca% 5 CO2'de 37 ° C'de inkübe edin.
    NOT: Kaplamadan sonra büyüme ortamını her gün değiştirin, cDMEM'in% 50'sini nazikçe çıkarın ve değiştirin.

9. Yüksek yoğunluklu MES göç modeli

NOT: HepG2-WT küresel hazırlığı için adım 3'e (Şekil 6A) ve HFF/MRC-5 hücre süspansiyonu hazırlığı için adım 4.1-4.5'e bakın (Şekil 6B).

  1. 6.0 x 105 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için HFF / MRC-5 hücrelerini taze cDMEM'de askıya alın ve buza koyun.
  2. HFF/MRC-5 hücre süspansiyonunu ve buz gibi MG/CG'yi 1:1 seyreltmede karıştırın (Şekil 6C).
    NOT: Hücre süspansiyon yoğunluğu, agaroz kaplı 96 oyuklu plakada oyuk başına 30.000 hücre elde edecek şekilde ayarlanmıştır. MG'yi gece boyunca 2 °C ila 8 °C buzdolabında buz üzerinde çözdürün. 10 °C'nin üzerinde bir jel oluşturduğu için MG ile çalışırken pipetlerin, uçların ve tüplerin önceden soğutulduğundan emin olun.
  3. Bir pipet kullanarak 100 μL HFF / MRC-5 ve MG çözeltisini bir HepG2-WT sferoidi içeren bir kuyuya aktarın. Plakayı 37 °C ve% 5 CO2'de 30 dakika inkübe edin.
  4. İnkübasyondan sonra, her bir oyuğa 75 μL taze cDMEM ekleyin ve 37 ° C'de% 5 CO2'de 12 güne kadar inkübe edin.

10. İstatistiksel analiz

  1. Microsoft Excel veya herhangi bir istatistik/grafik yazılımı kullanılarak toplanan verileri gözden geçirin ve analiz edin.
    NOT: İki grup arasındaki istatistiksel değerlendirme için Student t-testi (iki kuyruklu tip II) yapıldı ve 0.05'e eşit veya daha küçük p değerleri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi ve metin ve şekil/şekil açıklamaları içinde tanımlandı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Hastalık modelleme, ilaç keşfi ve doku mühendisliği (Şekil 7) gibi çeşitli biyomedikal uygulamalar için sentetik dokulara olan ilgi artmaktadır. Bu alan kapsamında, insan pluripotent kök hücre (hPSC) kaynaklı organoidler, sferoidler ve hücreler; daha sentetik, karmaşık ve büyük dokulara dönüştürülmektedir. Bu dönüşüm, morfojenez prensiplerinin uygulanmasını, mikrofabrikasyon gibi araçların kullanımını ve biyomatrislerin entegrasyonunu içererek sentetik dokuların hassas bir şekilde mühendisli...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mevcut protokol, hem basit hem de karmaşık toplulukların yetiştirilmesi için birden fazla yöntemin yanı sıra erken karaciğer organogenezinde24,25 3D toplu hücre göçünü indükleme tekniklerini kapsar. Ana hatlarıyla belirtilen protokoller, küresel oluşumun tüm metodolojilerde merkezi bir unsur olduğu birkaç kritik adımı vurgulamaktadır. Mikro kuyucuklar (96 veya 384 kuyucuklar), küresel oluşumu sağlamak için yapışmayan veya agaroz kaplı plakalarla birlikte kullanıl...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

NP, akut ve kronik karaciğer hastalığı için tedaviler geliştiren bir organoid mühendislik şirketi olan Khufu Therapeutics'in kurucusudur.

Teşekkürler

Yazarlar, bu yazıda kullanılan verilere paha biçilmez katkılarından dolayı Ogechi Ogoke ve Osama Yousef'e içten teşekkürlerini sunar. NP, UB CBE başlangıç fonları, Mark Diamond Bursu, New York Eyaleti Kök Hücre Bilim C024316, Rejeneratif Tıpta UB Kök Hücreler (ScIRM) merkezi, Buffalo Üniversitesi Hücre, Gen, Doku Mühendisliği Merkezi (CGTE) tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
384 kuyulu Siyah/Şeffaf Yuvarlak Alt Ultra Düşük Bağlantılı Küresel MikroplakaCorning3830
96-wl Hücre Kültürü Plakası Düz, TC, STRL, 1 / pk, 100 / CSLaboratuvar Ürünleri Satış701001
AgaroseSigma-AldrichA0576Düşük EEO
Axiovision YazılımıZEISSsürüm 4
Hücre Kültürü Kabı, 60mm, TC, STRL, 20/pk, 500/CSLaboratuvar Ürünleri Satışı705001
Hücre Kültürü Şişesi, 175cm², Vent, TC, STRL, 5 / pk, 40 / CSLaboratuvar Ürünleri Satışı709003
Hücre Kültürü Şişesi, 75cm², Vent, TC, STRL, 5 / pk, 100 / CSLaboratuvar Ürünleri Satış708003
Santrifüj Tüpleri, 15mL, PP, STRL, grad, 50 / bg, 500 / CSLaboratuvar Ürünleri SatışL226010
Kollajen I, Sıçan Kuyruğu, 100 mgCorning354236
DMEM, yüksek glikoz, GlutaMAX Takviyesi, piruvatThermoFisher Scientific10569010
EVOS Floresan, faz kontrast mikroskobuEVOSAMEFC4300R1.360 x 1.024 piksel yoğunluklu
Fetal Sığır Serumu, nitelikli, Amerika Birleşik DevletleriThermoFisher Scientific26140079
İnsan plazmasından fibrinojenSigma-AldrichF4883-500MG500 mg
Hep G2 [HEPG2]ATCCHB-8065
HERAcell vios 160iThermoFisher Scientific51033557
HFF-1ATCCSCRC-1041
ImageJIJ1.46r;
https://imagej.net/ij/ Matrigel Büyüme Faktörü Azaltılmış (GFR) Bazal Membran Matris, LDEV içermeyen, 10 mLCorning354230
MRC-5 ATCCCCL-171
MSCGMT İnsan Mezenkimal Kök Hücre Büyümesi BulletKitLonzaPT-3001
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
İnsan plazmasından trombinSigma-AldrichT6884-100UN100 birim
Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısıThermoFisher Scientific25300062
Tripsin-EDTA (% 0.25), fenol kırmızısıThermoFisher Scientific25200072
Vybrant DiD Hücre Etiketleme ÇözümüThermoFisher ScientificV22887
Vybrant DiI Hücre Etiketleme ÇözümüThermoFisher ScientificV22885
Vybrant DiO Hücre Etiketleme ÇözümThermoFisher ScientificV22886
Zeiss Axio floresan mikroskobuZEISSSE64, 1.344 &; 1.024 piksel yoğunluğu

Kaynaklar

  1. Bort, R., Signore, M., Tremblay, K., Martinez Barbera, J. P., Zaret, K. S. Hex homeobox gene controls the transition of the endoderm to a pseudostratified, cell emergent epithelium for liver bud development. Dev Biol. 290 (1), 44-56 (2006).
  2. Gualdi, R., et al. Hepatic specification of the gut endoderm in vitro: Cell signaling and transcriptional control. Genes Dev. 10 (13), 1670-1682 (1996).
  3. Ogoke, O., et al. Spatiotemporal imaging and analysis of mouse and human liver bud morphogenesis. Dev Dyn. 251 (4), 662-686 (2022).
  4. Ogoke, O., Oluwole, J., Parashurama, N. Bioengineering considerations in liver regenerative medicine. J Biol Eng. 11, 46(2017).
  5. Petkov, P. M., Kim, K., Sandhu, J., Shafritz, D. A., Dabeva, M. D. Identification of differentially expressed genes in epithelial stem/progenitor cells of fetal rat liver. Genomics. 68 (2), 197-209 (2000).
  6. Yang, M. H., et al. Comprehensive analysis of the independent effect of twist and snail in promoting metastasis of hepatocellular carcinoma. Hepatology. 50 (5), 1464-1474 (2009).
  7. Gupta, S., et al. Entry and integration of transplanted hepatocytes in rat liver plates occur by disruption of hepatic sinusoidal endothelium. Hepatology. 29 (2), 509-519 (1999).
  8. Koenig, S., Stoesser, C., Krause, P., Becker, H., Markus, P. M. Liver repopulation after hepatocellular transplantation: Integration and interaction of transplanted hepatocytes in the host. Cell Transplant. 14 (1), 31-40 (2005).
  9. Rajvanshi, P., Kerr, A., Bhargava, K. K., Burk, R. D., Gupta, S. Studies of liver repopulation using the dipeptidyl peptidase iv-deficient rat and other rodent recipients: Cell size and structure relationships regulate capacity for increased transplanted hepatocyte mass in the liver lobule. Hepatology. 23 (3), 482-496 (1996).
  10. Matchett, K., et al. Multimodal decoding of human liver regeneration. bioRxiv. , 10.1101/2023.02.24.529873 2023.2002.2024.529873 (2023).
  11. Matsumoto, K., Yoshitomi, H., Rossant, J., Zaret, K. S. Liver organogenesis promoted by endothelial cells prior to vascular function. Science. 294 (5542), 559-563 (2001).
  12. Sosa-Pineda, B., Wigle, J. T., Oliver, G. Hepatocyte migration during liver development requires prox1. Nat Genet. 25 (3), 254-255 (2000).
  13. Suzuki, A., Sekiya, S., Büscher, D., Izpisúa Belmonte, J. C., Taniguchi, H. Tbx3 controls the fate of hepatic progenitor cells in liver development by suppressing p19ARF expression. Development. 135 (9), 1589-1595 (2008).
  14. Rossi, J. M., Dunn, N. R., Hogan, B. L., Zaret, K. S. Distinct mesodermal signals, including BMPs from the septum transversum mesenchyme, are required in combination for hepatogenesis from the endoderm. Genes Dev. 15 (15), 1998-2009 (2001).
  15. Ng, L., et al. Suppression of actopaxin impairs hepatocellular carcinoma metastasis through modulation of cell migration and invasion. Hepatology. 58 (2), 667-679 (2013).
  16. Fransvea, E., Angelotti, U., Antonaci, S., Giannelli, G. Blocking transforming growth factor-beta up-regulates e-cadherin and reduces migration and invasion of hepatocellular carcinoma cells. Hepatology. 47 (5), 1557-1566 (2008).
  17. Zhao, Y., et al. RNAi silencing of c-myc inhibits cell migration, invasion, and proliferation in hepg2 human hepatocellular carcinoma cell line: C-myc silencing in hepatocellular carcinoma cell. Cancer Cell Int. 13 (1), 23(2013).
  18. Fitamant, J., et al. Yap inhibition restores hepatocyte differentiation in advanced HCC, leading to tumor regression. Cell Rep. 10 (10), 1692-1707 (2015).
  19. Xue, T. C., et al. Goosecoid promotes the metastasis of hepatocellular carcinoma by modulating the epithelial-mesenchymal transition. PLoS One. 9 (10), e109695(2014).
  20. Biname, F., Lassus, P., Hibner, U. Transforming growth factor beta controls the directional migration of hepatocyte cohorts by modulating their adhesion to fibronectin. Mol Biol Cell. 19 (3), 945-956 (2008).
  21. Chen, J. S., et al. MiR-338-3p inhibits epithelial-mesenchymal transition and metastasis in hepatocellular carcinoma cells. Oncotarget. 8 (42), 71418-71429 (2017).
  22. Yang, C., et al. MiR-1301 inhibits hepatocellular carcinoma cell migration, invasion, and angiogenesis by decreasing Wnt/beta-catenin signaling through targeting BCL9. Cell Death Dis. 8 (8), e2999(2017).
  23. Zeng, Y. B., et al. MiRNA-135a promotes hepatocellular carcinoma cell migration and invasion by targeting forkhead box o1. Cancer Cell Int. 16, 63(2016).
  24. Ogoke, O., et al. Dynamic changes in the niche and transcription trigger early murine and human pluripotent stem cell-derived liver organogenesis. bioRxiv. , 10.1101/2022.07.24.501313 (2023).
  25. Ogoke, O., et al. Modeling liver organogenesis by recreating three-dimensional collective cell migration: A role for TGF-beta pathway. Front Bioeng Biotechnol. 9, 621286(2021).
  26. Kanton, S., Pasca, S. P. Human assembloids. Development. 149 (20), dev201120 (2022).
  27. Bayley, H., Cazimoglu, I., Hoskin, C. E. G. Synthetic tissues. Emerg Top Life Sci. 3 (5), 615(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Karaci er AssembloidleriHepatik SferoidlerMezenkimal SferoidlerDallanma MorfogeneziKolektif MigrasyonMezenkimal Ko ulland r lm Besiyeri
Karaciğer Organogenezini Modellemek, Assembloidler Oluşturmak ve İnsan Hücre Hatlarını Kullanarak Sentetik Dokular Tasarlamak için İn Vitro Yetiştirme Teknikleri
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.