Yöntem makalesi

Hematopoetik Organlardan Stromal Hücre İzolasyonu

DOI:

10.3791/66231

⸱

26 Ocak 2024

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Harvard Stem Cell Institute, 3Department of Stem Cell and Regenerative Biology, Harvard University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, tek hücreli multiomik ile uyumlu murin kemiği, kemik iliği, timus ve insan timik dokusundan stromal hücrelerin izolasyonunu sağlayan protokoller sunulmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek hücre dizilemesi, hematopoietik organların stromasındaki heterojen hücre popülasyonlarının haritalanmasını sağlamıştır. Bu metodolojiler, kararlı durumda daha önce çözülmemiş heterojenliğin yanı sıra, dışsal stresler veya yaşlanma sırasında indüklenen hücre tipi temsilindeki değişiklikleri incelemek için bir mercek sağlar. Burada, murin ve insan timusundan yüksek kaliteli stromal hücre popülasyonlarının yanı sıra murin kemiği ve kemik iliğinden izolasyonu için adım adım protokoller sunuyoruz. Bu protokoller aracılığıyla izole edilen hücreler, yüksek kaliteli tek hücreli multiomik veri kümeleri oluşturmak için uygundur. Numune sindiriminin, hematopoietik soy tükenmesinin, FACS analizinin/sıralamasının etkileri ve bu faktörlerin tek hücreli dizileme ile uyumluluğu nasıl etkilediği burada tartışılmaktadır. Dizileme sonrası analizde başarılı ve verimsiz ayrışmayı ve aşağı akış stromal hücre verimlerini gösteren FACS profilleri örnekleri ile kullanıcılar için tanınabilir işaretçiler sağlanmaktadır. Stromal hücrelerin özel gereksinimlerini göz önünde bulundurmak, bu alandaki bilgiyi ilerletebilecek yüksek kaliteli ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için çok önemlidir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sağlıklı yetişkinde, de novo kan hücrelerinin üretimi kemik iliğinde ve timusta gerçekleşir. Bu bölgelerdeki stromal hücreler hematopoezin sürdürülmesi için gereklidir, ancak stroma dokunun %1'inden daha azını oluşturur 1,2,3,4. Bu nedenle, stroma'yı destekleyen saf hematopoez izolatlarının elde edilmesi, özellikle yüksek kalitede numuneler elde etmek için uygun işleme gerektiren tek hücreli multiomikler için önemli bir zorluk teşkil eder. Farklı sindirim kokteyllerinin bileşenleri, multiomik analizdeki belirli adımlara müdahale edebilir 5,6. Burada sunulan protokoller, kemik iliği ve timik dokulardan çok çeşitli stromal hücrelerin izolasyonunu detaylandırmaktadır.

Hem kemik iliği hem de timustaki stromal bileşenlerin bozulması, kan hücresi gelişiminde derin bozulmaya neden olur ve malignitelere neden olabilir 7,8,9. Stromayı destekleyen hematopoez, sitotoksik koşullandırma ve kemik iliği transplantasyonunu takiben hasar görür ve bu da hematopoietik kök ve progenitör hücreleri (HSPC'ler) sürdüren sitokinlerin ve büyüme faktörlerinin salgılanmasının azalmasına neden olur2,10,11. Ayrıca, yaşlanma kemik iliği ve timus stromal hücrelerini etkiler ve muhtemelen yaşlı hematopoietik fenotiplere katkıda bulunur. Timus, yaşa bağlı geniş evrim geçiren ilk organdır. Yağ ve fibrotik doku, ergenliğin başlangıcında T hücreli destekleyici stromanın yerini almaya başlar12,13. Kemik iliğinde adiposit içeriği yaşla birlikte artar ve vasküler ve endosteal nişler önemli ölçüde yeniden şekillenir 14,15,16.

Hematopoezi destekleyici stromanın çoklu stres durumlarında ve hem insan hem de murin dokusunun timus durumunda çalışmasını sağlamak için, daha önce yayınlanmış sindirim protokollerinioptimize ettik 1,2,8,17,18. Bu protokoller, hücrelerin verimli ve tekrarlanabilir izolasyonunu sağlar ve tek hücreli RNA dizilimi (scRNAseq) ve diğer multiomik türleri ile uyumludur.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan dokusu ile yapılan tüm çalışmalar, Massachusetts General Hospital Dahili İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylandıktan sonra gerçekleştirildi. Tüm hayvan prosedürleri, Massachusetts General Hospital Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) yönergelerine uygun olarak yürütüldü. Bu çalışma için 8-10 haftalık ve hem erkek hem de dişi C57Bl / 6 fareleri kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz.

1. Murin timik dokusunun hazırlanması

  1. Aşağıdaki tamponları ve çözeltileri hazırlayın.
    1. % 2 (h / h) fetal sığır serumu (FBS) ile orta 199 (M199) (bkz.
    2. Murin ayrışma kokteyli: M199 +% 2 FBS'de 0.5 WU / mL Liberaz TM ve 6.3 U / mL DNaz I (Malzeme Tablosuna bakınız).
    3. % 2 (a / h) Sığır serum albümini (BSA) ile M199.
      NOT: FBS içeren ortam, RNA kalitesini artırmak için BSA'ya geçirilebilir.
  2. Murin timus diseksiyonunu gerçekleştirin
    1. Fareyi CO2 boğulması ile ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek) ve sırt üstü yatırın. % 70 etanol püskürterek göğsün üzerindeki kürkü ıslatın ve göğüs boşluğunu açmaya devam edin.
    2. Önce cerrahi makasla göğüs kafesinin hemen altında enine bir kesi yaparak timusu dikkatlice inceleyin. Farenin her iki yanındaki kaburgaları köprücük kemiğine kadar kesin. Daha sonra diyaframı göğüs duvarının serbest bırakılabilmesi için kesin. Göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için kaburgaları bir çift forseps ile kaldırın.
      1. Timus, boşluğun tepesinde, kalbin hemen üzerinde oturan beyaz, bilobular bir organdır. Timusu forseps ile tutun ve timusu yerinde tutan bağ dokusunu nazikçe kesin. Diseke timik dokuyu buz üzerinde M199 +% 2 FBS ile 6 oyuklu bir plakanın kuyusuna koyun.
        NOT: Yaşlı veya radyasyonla şartlandırılmış fareler veya timik kusurları olan mutant suşlarla çalışırken, timus o kadar küçük olabilir ki, organı güvenilir bir şekilde çıkarmak için bir diseksiyon mikroskobu gerekir.
    3. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, künt uçlu forseps ve mikro yaylı makas kullanarak herhangi bir ekstratimik dokuyu çıkarın.
  3. Murin timik dokusunun enzimatik ayrışmasını gerçekleştirin (10 dakikalık artışlarla 30 dakika)
    1. Temizlenmiş timusu 15 mL'lik bir tüpün kapağına yerleştirin ve dokuyu steril cerrahi makasla ince ince kıyın.
      NOT: Sindirim için kullanılacak olan tüpün kapağındaki dokunun kıyılması, bir kaptan diğerine geçişe bağlı doku kaybını en aza indirir. Bu, yaşlı veya radyasyonla şartlandırılmış fareler veya timik kusurları olan mutant suşlarla çalışırken çok önemlidir. Bu ortamlardaki küçük timus boyutu, mümkün olan her yerde malzeme kaybını azaltma ihtiyacını gerektirir.
    2. 15 mL'lik tüpe 2 mL murin ayrışma kokteyli ekleyin, timus parçalarını içeren kapağı takın ve dokunun ayrışma kokteylinde yeniden süspanse edilmesini sağlamak için 5 kez ters çevirin.
    3. Sızıntıyı önlemek için, tüpün kapağını parafin filme sarın. Ardından tüpü 250 rpm çalkalama ile 37 ° C'lik bir su banyosuna yatay olarak yerleştirin. 10 dakika inkübe edin.
      NOT: Sindirim protokolünün başarısı, inkübasyonun 37 °C'de ve çalkalama ile yapılmasına bağlıdır. Açıklanan protokol, çalkalanan bir su banyosu kullanılarak optimize edilmiştir. Bu mevcut değilse, ısıtılmış bir ortamda ajitasyonu etkinleştiren diğer yaklaşımlar işe yarayabilir, ancak protokolün önce bu ayarlar için optimize edilmesini öneririz.
    4. 15 mL'lik tüpü bir rafa yerleştirin ve doku parçalarının oturmasına izin verin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve 70 μm'lik bir hücre süzgecinden buz gibi 50 ml'lik bir tüpe geçirin.
    5. Toplam 3 tur sindirim için 2-4 arasındaki adımları iki kez tekrarlayın. Doku, son inkübasyonun sonunda az ya da çok tamamen ayrışmalıdır.
    6. Toplanan hücre süspansiyonuna 20 mL M199 +% 2 FBS ekleyin. 500 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da döndürün.
    7. Süpernatanı çıkarın ve uygun bir M199 +% 2 FBS hacminde yeniden süspanse edin. Ardından hücre sayımına devam edin.
      NOT: M199 +% 2 FBS'nin yeniden süspanse edilmesi gereken hacim, timusun durumuna bağlı olacaktır. 6-10 haftalık fareler için, dokuyu 3-4 mL M199 +% 2 FBS içinde yeniden süspanse etmenizi öneririz. Bununla birlikte, yaşlı veya radyasyonla şartlandırılmış doku veya timik kusurlu mutant suşlar kullanan deneyler için, küçük timus boyutu 0.1-1 mL arasında değişen daha düşük hacimler gerektirecektir.
    8. Hücre süspansiyonunu %0,4 (a/h) tripan mavisi çözeltisinde 1:2 oranında seyrelterek hücreleri sayın. Hücreleri bir hemositometreye yükleyin ve parlak alan mikroskobu altında sayın. Mililitre başına canlı hücre sayısını belirlemek için boyanmamış hücreleri ve numune canlılığını değerlendirmek için mavi lekeli hücre sayısını sayın.
  4. Murin timik stromanın floresanla aktive edilmiş hücre sıralamasını gerçekleştirin
    1. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da döndürün. 25 U / mL Koruyucu RNaz inhibitörü ile desteklenmiş M199 +% 2 FBS'de 5 x 107 hücre / mL konsantrasyonda hücreleri yeniden süspanse edin (bkz. Malzeme Tablosu).
    2. 2 μg/mL konsantrasyonda murin Fc Bloğu (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve 4 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
    3. Hücreleri aşağıdaki antikorlarla boyayın: CD45-PE / Cy7 (4 μg / mL), Ter119-PE (4 μg / mL), CD31-BUV737 (2 μg / mL) ve EpCam-BV711 (2 μg / mL) (Malzeme Tablosuna bakınız) 4 ° C'de 30 dakika boyunca.
    4. Numuneleri M199 + %2 BSA'da yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da döndürün.
    5. DAPI (0.5 μg/mL) veya 7-AAD (1 μg/mL) gibi bir canlılık boyası içeren M199 + %2 BSA'daki süpernatanı çıkarın ve hücreleri yeniden süspanse edin (bkz. Belirlenen protokolleri takip ederek timik stromal hücrelerin FACS izolasyonuna geçin19.

2. İnsan timik dokusunun hazırlanması

  1. Aşağıdaki tamponları ve çözeltileri hazırlayın.
    1. Orta 199 (M199) ve %2 (h/h) FBS.
    2. %1,5 (a/h) BSA ile M199.
    3. İnsan ayrışma kokteyli: M199 +% 1.5 BSA'da 1 mg / ml Kollajenaz IV ve 2 mg / mL Dispas ve 6.3 U / mL DNaz I (Malzeme Tablosuna bakınız).
      NOT: İnsan timik dokusunun hazırlanmasındaki son sindirim adımı tripsin içerir. Bu nedenle, FBS tripsin aktivitesini inhibe edeceğinden, bu noktaya kadar olan tüm adımların BSA içeren tamponda gerçekleştirilmesi önemlidir.
  2. İnsan timik doku izolasyonu gerçekleştirin
    1. İnsan timusunu (daha önce yayınlanmış yöntem19'a göre toplanan) uygun bir hacimde M199 +% 1.5 BSA'ya yerleştirin ve işleme başlayana kadar buz üzerinde saklayın.
    2. İnsan timik dokusu ile çalışırken, işi bir doku kültürü başlığında gerçekleştirerek ve CDC yönergelerine göre standart önlemleri kullanarak potansiyel olarak bulaşıcıymış gibi ele alın20.
    3. Dokuyu 10 mL buz gibi M199 +% 1.5 BSA içeren 10 cm'lik bir Petri kabına koyun. Steril forseps ve makas kullanarak, organ çıkarılırken hasar gören ekstratimik yağ veya dokuyu dikkatlice temizleyin.
    4. Cerrahi makas ve bir çift forseps kullanarak, timusu 1 cm3 küp halinde kesin ve parçaları hafifçe aşağı itmek için 10 mL'lik bir şırınganın pistonunu kullanın. Bu, gelişmekte olan timositlerin bir kısmını serbest bırakacak ve böylece sindirilecek doku hacmini azaltacaktır.
      NOT: Timosit gelişim aşamalarının daha sonraki analizine ihtiyaç duyulursa, salınan hematopoietik fraksiyonu kaydedin. Bununla birlikte, bu fraksiyonu enzimatik sindirim sırasında üretilen stromal hücre fraksiyonu ile birleştirmeyin. İki fraksiyonun bir araya getirilmesinin, hücre süspansiyonunda tıkanma oluşma riskini önemli ölçüde artırdığı ve sonuçta stromal hücrelerin verimini azalttığı gözlendi. Dokunun nazikçe ezilmesi sırasında çok az stromal hücre kaybolur.
  3. İnsan timik dokusunun enzimatik ayrışmasını gerçekleştirin (30 dakikalık artışlarla 90 dakika)
    1. Hafifçe ezilmiş timik doku parçalarının yaklaşık 5 mg'ını 50 mL'lik konik bir tüpün kapağına aktarın. Daha sonra steril cerrahi makas kullanarak dokuyu ince bir şekilde kesin.
    2. 8 mL insan ayrışma kokteylini 50 mL'lik tüpe pipetleyin, kıyılmış insan timik dokusunu içeren kapağı takın ve ardından tüm dokunun enzim kokteyli ile karıştığından emin olmak için tüpü 5 kez hafifçe ters çevirin.
    3. Sızıntıyı önlemek için tüpün kapağını parafin film ile sabitleyin. Tüpü 37 ° C'de 30 dakika boyunca sallanan (250 rpm) bir su banyosunda yatay olarak inkübe edin.
    4. 50 mL'lik tüpü bir rafa yerleştirin ve süpernatanı çıkarmadan ve 70 μm'lik bir hücre süzgecinden buz üzerine yerleştirilmiş 50 ml'lik yeni bir tüpe geçirmeden önce insan timik doku parçalarının çökelmesine izin verin.
    5. İnsan ayrışma kokteyli ile toplam iki tur sindirim için 2.3.2-1.3.4 adımlarını tekrarlayın.
    6. İkinci sindirim turu yapıldıktan sonra, kalan dokuya 8 mL daha insan ayrışma kokteyli ekleyin. Daha sonra 2 mL% 0.25 tripsin pipetleyin doku ayrışma tüpüne. 37 °C'de 30 dakika daha inkübe edin, 250 rpm'de çalkalayın.
      NOT: İnsan dokusu için sindirim süresinin en az 90 dakika olması kesinlikle önemlidir, çünkü daha kısa inkübasyon süreleri stromal hücre verimlerinin büyük ölçüde azalmasına neden olur.
    7. Son inkübasyon adımı yapıldıktan sonra, hücre süspansiyonunu ve kalan doku parçalarını, 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirerek önceki adımlarda toplanan süpernatan ile birleştirin. Tripsin reaksiyonunu kırmak için numuneye 3 mL FBS ekleyin ve buzun üzerine yerleştirin.
    8. Adım 1.3'te açıklandığı gibi hücreleri saymaya devam edin.
  4. İnsan timik stromasının floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırmasını gerçekleştirin
    1. İnsan timusunun hücre süspansiyonunu aşağı çevirin ve 25 U / mL Koruyucu RNaz inhibitörü ile desteklenmiş M199 +% 2 FBS'de 5 x 107 hücre / mL konsantrasyonda yeniden süspansiyon haline getirin.
    2. İnsan Fc Bloğu (5 μg/mL) ile 4 °C'de 10 dakika inkübe edin.
    3. CD45-BV711 (2,5 μg/mL), CD235a-BV711 (2,5 μg/mL), Lineage-cocktail-FITC (3,76 μg/mL), CD66b-FITC (20 μL/100 μL numune), CD8-APC/Cy7 (5 μL/100 μL numune), CD4-BV605 (5 μL/100 μL numune), CD31-PE/Dazzle594 (10 μg/mL) ve EpCam-BV421 (2,5 μg/mL) ile 4 ° C'de 30 dakika boyayın (bkz.
    4. Numuneleri M199 + %1,5 BSA'da yıkayın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da döndürün.
    5. DAPI (0.5 μg/mL) veya 7-AAD (1 μg/mL) gibi bir canlılık boyası içeren M199 +% 1.5 BSA'daki süpernatanı çıkarın ve hücreleri yeniden süspanse edin. Belirlenen protokolleri takip ederek timik stromal hücrelerin FACS izolasyonuna geçin19.

3. Murin kemiği ve kemik iliği dokusunun hazırlanması

NOT: Kemik ve kemik iliği fraksiyonları, stromal hücrelerin maksimum saflığını ve dokuların optimal ayrışmasını elde etmek için iki ayrı sindirim reaksiyonunda hazırlanır. Numuneler, sindirim adımlarından sonra tek bir stromal bölme olarak sıralanmak üzere bir araya getirilebilir.

  1. Aşağıdaki tamponları ve çözeltileri hazırlayın.
    1. %2 (h/h) FBS ile M199.
    2. Murin B&M (kemik ve ilik) ayrışma kokteyli: M199 +%2 FBS'de Stemxyme 2 mg/mL, Dispase 1 mg/mL ve 10 U/mL DNaz I ( Malzeme Tablosuna bakınız).
      NOT: B&M ayrışma karışımını taze hazırlayın ve kullanana kadar karışımı buz üzerinde tutun.
    3. %0,5 (a/h) BSA ile M199.
    4. % 0,5 (a / h) BSA ile fosfat tamponlu salin (PBS).
    5. % 2 (a / h) Sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM EDTA ile M199.
      NOT: FBS içeren ortam, RNA kalitesini artırmak için BSA'ya geçirilebilir.
  2. Murin kemik iliği ayırma işlemi gerçekleştirin
    1. Fareyi CO2 boğulması ile ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek). Kürkü ıslatmak için% 70 etanol püskürtün.
    2. Femur, tibia, pelvis ve humerusu her iki taraftan dikkatlice çıkarın ve buz 21,22 üzerinde M199 +% 2 FBS içeren bir kuyuya yerleştirin.
    3. Kemiğe verilen zararı en aza indirmek ve periosteal tabakayı korumak için tüm kas, bağ ve kıkırdak dokusunu mendille çıkarın. Buz üzerinde M199 +% 2 FBS ile yeni bir kuyuya yerleştirin.
    4. Bir neşter kullanın ve epifizi çıkarmak için uzun kemiklerin büyüme plakalarını kesin ve buz üzerinde M199 +% 2 FBS içeren 10 cm'lik bir tabağa koyun.
    5. Kemik iliğini soluk beyaz olana kadar kemiklerden boşaltın. İliği buz üzerinde 15 mL'lik bir tüpe akıtmak için 28 G'lik bir iğne ve 10 mL M199 +% 2 FBS ile doldurulmuş 10 mL'lik bir şırınga kullanın. Kızarmış kemiği epifizle birlikte 10 cm'lik tabağa yerleştirin.
      NOT: Dokuların tamamen ayrılması için kemik iliğinin tamamen yıkanması, daha iyi numune hazırlanmasına neden olacaktır.
  3. Murin kemik iliği dokusunun enzimatik ayrışmasını gerçekleştirin (10 dakikalık artışlarla toplam 30 dakika)
    1. 15 mL'lik tüpü, ilik tüpün dibine batana kadar buz üzerinde dik olarak bırakın. 10 mL M199 +% 2 FBS'yi pipetleyerek yavaşça çıkarın.
    2. 15 mL'lik tüpe 4 mL B&M ayrışma kokteyli ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 ° C'lik bir su banyosuna (sallama yok) koyun.
    3. 5 dakika sonra tüpü üç kez ters çevirin ve tekrar su banyosuna yerleştirin.
    4. İlk 10 dakikadan sonra, peletin altta olduğundan emin olun ve 70 μm'lik bir hücre süzgecinden buz gibi 50 mL'lik bir tüpe süzerken süpernatanı toplayın. Kalan BM peletine 2 mL taze B&M ayrışma kokteyli ekleyin ve tekrar su banyosuna koyun.
    5. Kalan kemik iliği parçalarını 1 mL'lik bir pipet kullanarak kuvvetli pipetleme ile ayırın. Elde edilen tüm hücre süspansiyonunu önceki adımlarda olduğu gibi aynı tüpte toplayın. Toplanan hücre süspansiyonuna 20 mL M199 +% 0.5 BSA + 2 mM EDTA ekleyin.
      NOT: Adım 3.3.5'te, son sindirilen numuneden sonra eklenen tampon, daha fazla enzimatik aktiviteyi inhibe etmeye yardımcı olmak için EDTA içerir.
  4. Murin kemik iliği dokusunun hematopoietik hücre tükenmesini gerçekleştirin.
    1. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin. CD45, Ter119, CD11b, Gr1, B220 ve CD3'ü hedefleyen biyotin antikorları (5 mg / mL) ile 500 μL PBS +% 0.5 BSA'da yeniden süspansiyon yapın (bkz. Kapaklı yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.
    2. Karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
    3. Manyetik boncukları iyice vorteksleyin ve tüpe 25 μL manyetik boncuk ekleyin.
    4. Karanlıkta oda sıcaklığında 5 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
    5. Tüpü 2-3 dakika boyunca eşleşen mıknatısa yerleştirin ve süpernatanı yeni bir tüpte toplayın.
      NOT: Bu adımdan sonra kemik iliği bir havuzda toplanabilir veya kemik fraksiyonundan ayrı tutulabilir. Soy tükenmesi başarılı olursa, ortaya çıkan hücre süspansiyonu kırmızı hücrelerden yoksun olmalıdır.
  5. Murin kemik dokusunun enzimatik ayrışmasını gerçekleştirin.
    1. 50 mL'lik bir tüpün düz kapak ucu ile 10 cm'lik tabakta kemikleri daha küçük parçalara ayırın. Filtrenin içindeki kemik parçalarını izole etmek için süpernatanı 70 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
      NOT: Alternatif olarak, kemik parçalanması için bir havan ve havan tokmağı kullanılabilir. Bununla birlikte, bu seçenek, kemik kırılmak yerine topraklandığında daha fazla döküntü ve daha düşük stromal hücre canlılığı üretme eğilimindedir. Stroma hücreleri hala kemiğe ve kemiğe yapışıktır ve hematopoietik hücreleri içeren süpernatan atılmalıdır.
    2. Hücre süzgecindeki kemik parçalarını kesmek için makas kullanın. Bu, daha verimli bir enzimatik ayrışma için yüzey alanını artıracaktır. Kemiği 5 mL M199 +% 2 FBS ile yıkayın.
    3. Kemik fraksiyonunu 5 mL murin B&M ayrışmasına yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız) yeni bir 50 mL tüpte karıştırın.
    4. Sızıntıyı önlemek için, tüpün kapağını parafin filme sarın. Ardından tüpü yatay olarak 37 °C'lik bir su banyosuna 120 rpm ile 30 dakika çalkalayarak yerleştirin.
    5. Sindirimden sonra, 25 mL M199 +% 0.5 BSA + 2 mM EDTA ekleyin ve stromal hücreleri içeren süpernatanı 70 μm'lik bir hücre süzgecinden buz gibi 50 ml'lik bir tüpe süzün.
      NOT: Ortaya çıkan kemik parçalarının sindirim yoluyla gözle görülür şekilde azaldığını kontrol edin. Adım 3.5.5'te, son sindirilen numuneden sonra eklenen tampon, daha fazla enzimatik aktiviteyi inhibe etmeye yardımcı olmak için EDTA içerir.
  6. Murin kemiği ve kemik iliği stromasının floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırmasını gerçekleştirin.
    1. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da döndürün.
    2. PBS +% 0.5 BSA + 2 mM EDTA'da 10 μg / mL konsantrasyonda murin Fc Bloğunda yeniden süspansiyon yapın ve 4 ° C'de 10 dakika inkübe edin.
    3. Hücreleri (10 milyon hücre / 100 μL toplam boyama hacmine kadar) aşağıdaki antikorlarla boyayın: CD45-PE / Cy7 (1 μg / mL), Ter119-PE / Cy7 (1 μg / mL), CD31-BV421 (0.66 μg / mL), CD140a-APC (2 μg / mL), Sca1-AF700 (0.66 μg / mL), CD51-PE (2 μg / mL), CD105-PE / göz kamaştırıcı (2 μg / mL) (bkz.
    4. Calcein-'yi oda sıcaklığına dengelemeye bırakın ve 50 μL DMSO'da yeniden süspanse edin. Her kullanım için taze olarak hazırlayın. Yeniden süspansiyondan sonra oda sıcaklığında tutun. Antikor boyama kokteylinde zaten yeniden süspanse edilmiş olan numuneye (20 μg / mL) eklemeden önce kalseini PBS (0.1 mg / mL) içinde önceden seyreltin ve karanlıkta 4 ° C'de 20-30 dakika inkübe edin.
    5. Numuneleri PBS +% 0.5 BSA + 2 mM EDTA'da yıkayın ve 500 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
    6. Süpernatanı çıkarın ve PBS +% 0.5 BSA + 2 mM EDTA'daki hücreleri yeniden süspanse edin. Belirlenen protokolleri takip ederek kemik ve kemik iliği stromal hücrelerinin FACS izolasyonuna geçin19.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokoller, akış sitometrik analizi için uygun timus ve kemik iliğinden tekrarlanabilir stromal hücre çeşitlerinin yanı sıra scRNA dizilemesi gibi tek hücreli multiomikler verir. Murin timik dokusu, kemik iliği naklinden önce gelen sitotoksik koşullanma veya doğal yaşlanma süreci gibi stres faktörlerine yanıt olarak önemli bir yeniden şekillenme geçirir. Sonuç olarak, timik hücresellik bu ayarların her ikisinde de büyük ölçüde azalır (Şekil 1A). 8 haftalık vahşi tip bir fareden alınan bir timus yaklaşık 100 milyon hücre içerirken, 2 yaşındaki bir farenin hücreselliğinin bunun yarısı kadar olması beklenebilir ve ışınlama ve kemik iliği naklinden 4 gün sonra bir timus 5.000.000 hücre kadar düşük olabilir (Şekil 1A).

Sitotoksik koşullandırma tercihen hematopoietik hücreleri ablate eder, böylece stromal bölme orantılı olarak zenginleştirilir (Şekil 1B). Bununla birlikte, genel olarak düşük hücresellik, yeterli sayıda timik stromal hücrenin izole edilmesini zorlaştıracaktır. Bu nedenle, aşağı akış multiomik uygulamalarıyla uyumlu hücre sayıları elde etmek ve mümkün olan her yerde malzeme kaybını en aza indirmek için hayvanları bir araya getirmek gerekli olabilir. Timik stromal hücreler üzerinde multiomik yapmak için, canlı, tek, CD45-Ter119- hücrelerin floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) (Şekil 1C), çoğu stres koşulundan yeterli sayıda hücrenin sıralanabilmesini sağlayacaktır.

Stroma kompartmanının heterojenliğini korumak için, tipik olarak tek bir pozitif stroma markörü üzerinde sıralama yapmayız, ancak hematopoietik hücreleri dışarıda bırakırız. Uygun doku ayrışmasının sağlandığından emin olmak için analiz için pozitif stromal hücre belirteçlerinin dahil edilmesi hala önerilmektedir. Bununla birlikte, FACS izolasyonu kusurludur ve scRNAseq ile belirlendiği gibi, sıralanan hücrelerin 0-50'si hematopoietik kökenli olacaktır (Şekil 1D,E). Bu, FACS'tan önce CD45 + hücrelerinin manyetik olarak tükenmesiyle geliştirilebilir; bununla birlikte, bu, azaltılmış timik hücresellik koşulları için önerilmez (Şekil 1A), çünkü manyetik tükenmede yer alan ekstra işlemle birlikte gelen malzeme kaybı, aşağı akış uygulamaları için çok düşük stroma verimlerine neden olur.

İnsan timik stromasının izolasyonu için en kritik adım enzimatik sindirimdir. Ayrışma aşaması aceleye getirilirse, genel stromal hücre verimi ve stromal hücre alt tipi temsili ciddi şekilde azalacaktır (Şekil 2A). Ayrıca, doku sindiriminin optimal olduğundan emin olmak için her zaman timik endotel ve epitel belirteçlerinin dahil edilmesi önerilir, çünkü hematopoietik belirteçler için basitçe negatif geçitleme, gerçek stromal hücre salınımını ölçmek için yeterli olmayacaktır. Bu, hematopoietik belirteçler için negatif hücrelerin yüzdesinin, 90 dakika inkübe edilen örneğe kıyasla 30 dakika boyunca sindirilen örnekte daha yüksek olduğu Şekil 2A'da örneklenmiştir. Ancak ardışık kapıda görüldüğü gibi daha kısa olan sindirim protokolünde endotel ve epitel hücrelerinin verimi çok zayıftır (Şekil 2A).

Multiomik uygulamalar için insan timik stromal hücrelerinin FACS izolasyonu için, stromal hücre zenginleştirmesini iyileştirmek için pan-hematopoietik belirteç CD45 ve eritroid belirteç CD235a'ya ek olarak hematopoietik soy antikor kokteylinin yanı sıra CD4 ve CD8 antikorları ile boyama önerilmektedir (Şekil 2B). Bu nedenle, timik stroma, canlı, tek, CD45-CD235a-Lineage-CD4-CD8- hücrelerinin insan multiomik analizi için FACS sıralanmalıdır (Şekil 2B). Fare örneklerinin scRNAseq'i için görüldüğü gibi, bu hala 0-50 hematopoietik hücrelerin kontaminasyonu ile sonuçlanır, ancak bu yine de insan timus stromal kompartmanının kabul edilebilir çözünürlüğünü verir (Şekil 2C,D).

Kemik ve BM stroma için, timik doku ile aynı strateji kullanıldı; stromal hücreler, hematopoietik belirteçler için negatif hücreler üzerine geçit yapılarak izole edilir ve sindirim kontrolleri olarak başka stromal hücre belirteçleri dahil edilir (Şekil 3). Kemik gibi kalsifiye dokunun ayrışması, önemli bir döküntü birikimine neden olur. Kalseinin bir canlılık boyası olarak eklenmesi, aksi takdirde sıralanmış sayıları yanlış bir şekilde şişiren ve kapılı popülasyon frekanslarını azaltan bu döküntülerin çoğunun dışlanmasına izin verecektir (Şekil 3). Bu, tüm hücrelerde geçitlemeyi ve sadece Calcein+'da geçitlemeyi karşılaştıran FACS grafiklerinde örneklenmiştir (Şekil 3). İnsan timik stromal hücrelerinde görüldüğü gibi, hematopoietik belirteç-negatif hücrelerin yüzdesi, kemik ve BM doku ayrışma etkinliği için güvenilir bir okuma değildir (Şekil 3). CD45-Ter119-kapısı, sindirim basamağının başarısız olduğu bir örnekte bol miktarda hücre içerebilirken, tipik kemik ve BM stromal hücre belirteçleri CD31, CD140a ve CD51'in daha ileri analizi, zayıf stroma salınımını açıkça göstermektedir (Şekil 3 ve Şekil 4).

Murin kemiği ve BM stromal hücrelerinin FACS izolasyonu için, sadece CD45-Ter119-Calcein + 'yı sıraladığımız, ancak optimal sindirimi sağlamak için sıralanan popülasyonun ileri ve yan saçılma özelliklerini ve stromal hücre işaretleyici ekspresyonunu izlediğimiz Şekil 3'teki gibi geçit stratejisinin kullanılması önerilmektedir (Şekil 3A). FACS'den önce kemik iliğinin hematopoietik soy pozitif manyetik hücre tükenmesi ve gösterilen kapılarda sıralama kombinasyonu, %>90 stroma olan hücrelerin tek hücreli dizilimi ile sonuçlanır. Böyle bir scRNA dizilim çalışmasının bir örneği (Şekil 5A,B), analiz edilen hücrelerin transkriptom bazlı açıklamasından sonra bu düşük hematopoietik kontaminasyonu göstermektedir (hematopoietik belirteç genlerinin örnekleri Şekil 5C). Bu, nakil sonrası timik dokudaki sınırlı başlangıç materyali nedeniyle manyetik hücre tükenmesinin sıralama aşamasından önce gerçekleştirilmediği timik stromal preparatların tam tersidir (Şekil 1F).

figure-results-1
Şekil 1: Murin timik stromanın akış sitometrik ve tek hücreli RNA dizileme analizi. (A) 8 haftalık farelerde (Kontrol), 4 gün önce ölümcül şekilde ışınlanan ve nakledilen 8 haftalık farelerde (Nakil) ve 2 yaşındaki farelerde (Yaşlı) timosit sayılarının ölçülmesi. (B) Ölümcül ışınlama ve transplantasyondan 4 gün sonra stromal hücre alt tiplerinde zenginleşmeyi gösteren temsili akış sitometrisi grafikleri. (C) Tek hücreli multiomik analiz için murin timik stromayı sıralamak için akış sitometrisi geçit stratejisi. (D) Stroma (mavi) ve hematopoietik hücreleri (kırmızı) gösteren murin timusun UMAP'ı. (E) Timus örneklerinde murin hematopoietik belirteç genlerini gösteren UMAP'ler. (F) Timus scRNAseq örneklerinde murin stromal ve hematopoietik hücrelerin miktar tayini. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: İnsan timik stromasının akış sitometrik ve tek hücreli RNA dizileme analizi. (A) Farklı sindirim sürelerinin insan timik stromal hücre popülasyonlarının salınımı üzerindeki etkisinin temsili sonuçlarını gösteren FACS grafikleri. (B) Tek hücreli multiomik analiz için insan timik stromasını sıralamak için akış sitometrisi geçit stratejisi. (C) Stroma (mavi) ve hematopoietik hücreleri (kırmızı) gösteren insan timusunun UMAP'ı. (D) Timus örneklerinde insan hematopoietik belirteç genlerini gösteren UMAP'ler. (E) Timus scRNAseq örneklerinde insan stromal ve hematopoietik hücrelerinin miktar tayini. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Murin kemik iliği stromal belirteçleri ve Calcein, ayrışma verimliliğini tahmin etmeye yardımcı olur. (A) Tüm hücreler ve Calcein + hücreleri üzerinde kapılı CD45-Ter119-murin kemik iliği stromal hücrelerinin temsili akış sitometrisi analizi. Sonraki CD31-geçit ile, Calcein + hücreleri seçilirken daha yüksek oranda CD140a + CD51 + hücreleri gösteriyor. (B) Eksik CD140a + CD51 + hücreleri olan başarısız bir kemik sindirimini temsil eden akış sitometri analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Kemik iliği stroma geçit stratejisi. (A) Tek hücreli multiomik için murin kemik iliği stromasını sıralamak için akış sitometrisi geçit stratejisi. (B) Eksik CD140a + CD51 + hücreleri olan başarısız bir kemik iliği sindirimini temsil eden akış sitometrisi analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: Stromal ve hematopoietik hücre kompozisyonu ile kemik iliği tek hücreli RNA dizilimi. (A) Stroma (mavi) ve hematopoietik hücreleri (kırmızı) gösteren murin kemiği ve kemik iliğinin UMAP'ı. (B) Fare kemiği ve kemik iliği örneklerinde stromal ve hematopoietik hücrelerin miktarının belirlenmesi. (C) Murin kemik iliği örneklerinde hematopoietik belirteç genlerinin UMAP'ı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematopoetik organlardaki stromal hücreler normal kan üretimi için kritik öneme sahiptir ve hematopoietik stroma bozulmaları hematopoietik bakımda ve strese yanıtta ciddi bozulmalara neden olabilir 9,23,24. Hematopoietik stromal hücrelere ilişkin içgörü, hematolojik hastalıklarıanlamak 7,9,10,24 ve bunlarla savaşmak için terapötikler geliştirme yeteneği 25,26 için gereklidir. Bununla birlikte, hematopoietik stroma'yı parankimden tekrarlanabilir bir şekilde ayırmak, özellikle stromal hücre verimini ve çeşitliliğini en üst düzeye çıkarırken yüksek kaliteli numune preparatları gerektiren tek hücreli multiomiklerin ortaya çıkmasıyla birlikte bir zorluktur. Burada açıklanan protokoller, hematopoietik stromal hücreleri izole etmenin zorluklarını karşılarken çoğu aşağı akış multiomik uygulamasıyla uyumlu olacak şekilde optimize edilmiştir 1,2,19.

Hematopoetik stromal hücrelerin izolasyonu için ilk düşünülmesi gereken konu dissosiyasyon koşullarıdır. Optimal ayrışma, stroma bölmesinin 1,2 tam heterojenliğini yansıtmak için stroma hücrelerini dokudan serbest bırakmak için kritik öneme sahiptir. Doğru ayrışma karışımını seçmek, deneysel kapsama ve aşağı akış protokollerine bağlıdır. Ayrışma karışımlarını mümkün olduğunca taze hazırlamanızı ve kullanana kadar buz üzerinde tutmanızı öneririz. Dispas gibi bazı bileşenlerin çözülmesi zordur ve pipet karıştırma için daha fazla zaman gerekebilir. Vorteksleme önerilmez, çünkü bu, sindirim enzimlerinin doğal konformasyonunu bozabilir ve sonuçta inaktivasyonlarına yol açabilir. Daha da önemlisi, EDTA enzimatik aktiviteyi inhibe eder ve aktif sindirim adımları sırasında kaçınılmalıdır, ancak enzim içeren tampon derhal çıkarılamazsa reaksiyonu durdurmak için kullanılabilir. Enzim karışımının kendisine ek olarak, dokunun verimli bir şekilde ayrışması için iki nokta kritiktir, (1) yüzey alanını artırmak için tam kırma ve kesme ve (2) sindirim enzimleri ile yeterli inkübasyon süresi. Örneğin, insan timik dokusunun ayrışması, murin dokusundan önemli ölçüde daha zordur ve bu nedenle sindirim süreleri daha uzun olmalıdır. İnsan dokusu için ayarlama yapılmazsa, stromal verim ve hücre çeşitliliği azalacaktır (Şekil 2A). Ayrışma enzimleri, kaçınılmaz olarak gen ekspresyonunu27 etkileyen 37 °C'lik bir optimal sıcaklık gerektirir. Hücre durumlarını korumak için soğuk veya daha düşük sıcaklıkta ayrışma arzu edilse de, şu anda kemik ve kemik iliği için uygun ticari olarak temin edilebilen soğuk-aktif ayrışma enzim kombinasyonları yoktur. Sindirim gerektiren herhangi bir doku için, farklı hücre tiplerinden elde edilen heterojenlik ve yüzde katkı, sindirim süresi, enzim kokteyli bileşimi ve işleme ile her zaman değişecektir. Bu ilk adımların aşağı akışında, heterojenlik ve temsil, zorlu hücre tiplerinin (örneğin, stroma'dan adipositler) sınıflandırılması ve yakalanması sırasında nozul boyutları ve akışkan cihaz kanal çapları gibi filtrasyon adımlarıyla daha da sınırlandırılacaktır. Bu nedenle, veri kümelerini karşılaştırırken, protokollerdeki bu farklılıkların alt popülasyonların temsilini etkileyebileceğine dikkat etmeliyiz. Mantıksal olarak, stromal sistemlerdeki bozulmaların etkisini ölçerken işlem adımlarını eşit tutma konusunda uyanık olmamız gerektiği sonucu çıkar.

Dizilemenin maliyeti düşmüş ve azalmakta olsa da, tek hücreli teknolojiler genellikle analiz edilebilecek hücre sayısı ile sınırlıdır. Her bir reaktif kitinin kapasitesini optimize etmek için, mümkün olduğunda hematopoietik hücre manyetik tükenmesi kullanıldı. Bu, hem kemik iliği hem de timik numune fraksiyonlarında stromadan çok daha fazla sayıda kirletici hücreden kaçınılmasını sağlar. Bununla birlikte, nakil sonrası timik dokuda olduğu gibi başlangıç materyali sınırlıysa, manyetik tükenme stratejilerinin her zaman maruz kaldığı artmış, spesifik olmayan hücre kaybı bunu tavsiye edilemez hale getirebilir. Ek olarak, dokuların hazırlanması ve sindirimi sırasında, hücre dışı matris bileşenlerinin ezilmesi, kesilmesi ve enzimatik olarak salınması büyük miktarda döküntü oluşturur. Bu tür bir kirletici, analiz için numunede bırakılırsa, sonraki işlemlerde tıkanma sorunlarına neden olabilir, tek hücre indeksi sıralaması için negatif kuyulara neden olabilir ve analizde ana kapı yüzdelerini yüksek oranda şişirebilir. Kalsein boyama, hücreler / canlı hücreler için pozitif kapı oluşturmak için kullanıldı. Calcein farklı renklerde gelir, bu da onu boyama matrisinize son derece uyumlu hale getirir. Kalsein ile çalışırken, boyayı tekrarlanan donma-çözülme döngülerine maruz bırakmamaya dikkat edin (yani, her zaman taze hazırlayın ve çözündükten sonra oda sıcaklığında saklayın).

DNA oligos28 ile barkodlanmış antikorlara dayalı numuneleri çoğullama yeteneği, 10x Genomics gibi platformlarda tek hücre dizileme reaksiyonlarının daha fazla kullanılmasına izin verir. Örnek çoğullama için tasarlanan hashtag antikorları, hücre yüzeyi molekülleri veya nükleer zar için farklı hedefler ve hem fare hem de insan için özgüllük ile birlikte gelir. Hücre etiketleme sistemi birden fazla doku için başarılı bir şekilde kullanılmış olsa da, sindirim enzimi karışımlarını daha sonra hashtag kullanımıyla birleştiren deneyler, iyileşmenin büyük ölçüde azalmasına neden olabilir. Ayrışma sonrası ek yıkama adımlarını dahil etmeye çalıştık ve sindirim enzimlerinin aktivitesini inhibe etmek için EDTA ekledik. Bununla birlikte, bu adımlarla bile, hematopoietik hücrelerden daha düşük hashtag tanımlaması bekleyin. Enzimatik sindirim protokolleri ile hashtag yakalama oranlarının %30-%70 arasında olduğu bulunmuştur. Bu, aynı popülasyondaki stromal hücrelerin% >90'ını etiketleyen bir florokrom konjugatı ile aynı antikor klonunun olmasına rağmen meydana gelir. Dokunun enzimatik sindirimini hashtagleme ile eşleştiren herhangi bir deneysel tasarım pilot olarak uygulanmalı ve enzimatik inhibisyonu sağlamak için dikkatli olunmalıdır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.T.S., Agios Therapeutics ve Editas Medicines'ın yöneticisi ve hissedarıdır; Magenta Therapeutics ve LifeVault Bio'nun kurucusu, direktörü, hissedarı ve bilimsel danışma kurulu üyesi, Fate Therapeutics ve Garuda Therapeutics'in hissedarı ve kurucusu ve Clear Creek Bio'nun direktörü, kurucusu ve hissedarı, FOG Pharma, Inzen Therapeutics ve VCanBio'nun danışmanı ve Sumitomo Dianippon'dan sponsorlu araştırma fonu alıcısı. D.T.S ve K.G, patent US20220143099A1 mucitleridir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Massachusetts General Hospital'daki HSCI-CRM Akış Sitometrisi tesisi ve Harvard Üniversitesi'ndeki Bauer Core Tesisi tarafından uzman teknik yardımla desteklendik. T.K ve K. G, İsveç Araştırma Konseyi ve C.M. Alman Araştırma Vakfı tarafından desteklendi. Tek hücreli RNA dizileme verilerinin analizindeki yardımları için Sergey Isaev ve I-Hsiu Lee'ye teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.25 Tripsin-EDTAThermo Fisher Scientific25200-072
7AAD (7-aminoaktinomisin D)BD Biosciences559925
Anti-İnsan Soy Kokteyli 3-FITCBD Biosciences643510
Sığır Serumu AlbüminMillipore SigmaA9647
C57Bl / 6 farelerJackson664Erkek veya dişi, 8-12 haftalık
Calcein Fisher Scientific65-0853-78
Kollajenaz IVMillipore SigmaC5138
Corning Steril Hücre Süzgeçleri, Beyaz, Ağ Boyutu: 70 ve mikro; mFisher Scientific08-771-2
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Dnase I SolutionThermo Fisher Scientific90083  2500 U/mL
Easysep fare streptavidin RapidSpheres İzolasyon kitiKök Hücre Teknolojileri19860
Fetal Sığır SerumuGibcoA31605-01Nitelikli Tek Atış
İnsan Fc BloğuBD Biosciences564220
Liberaz TM Millipore Sigma5401127001Araştırma Sınıfı
Orta 199Gibco12350
Fare anti-insan CD235a-BV77BD Biosciences740785
Fare anti-insan CD31-PE / Dazzle594Biolegend303130
Fare anti-insan CD45-BV77Biolegend304050
Fare anti-insan CD4-BV605BD Biyolojik Bilimler562658
Fare anti-insan CD66b-FITCBD Biosciences555724
Fare anti-insan CD8-APC / Cy7BD Biosciences557760
Fare anti-insan EpCam-BV421Biolegend324220
Koruyucu RNase İnhibitörüMillipore Sigma3335402001
Sıçan anti-fare CD105-PE / dazzle594Biolegend120424
Sıçan anti-fare CD11b-BiotinBiolegend101204
Sıçan anti-fare CD140a-APCFisher Scientific17-1401-81
Sıçan Anti-Fare CD16 / CD32 (Fare BD Fc Blok)BD Biosciences553142
Sıçan anti-fare CD31-BUV737BD Biosciences612802
Sıçan anti-fare CD31-BV421Biolegend102424
Sıçan anti-fare CD3-BiotinBiolegend100244
Sıçan anti-fare CD45.2-BiotinBiolegend109804
Sıçan anti-fare CD45-PE / Cy7Biolegend103114
Sıçan anti-fare CD45-PE / Cy7Biolegend103114
Sıçan anti-fare CD45-PE / Cy7Biolegend103114
Sıçan anti-fare CD45R / B220-BiotinBiolegend103204
Sıçan anti-fare CD51-PEBiolegend104106
Sıçan anti-fare EpCam-BV711BD Biosciences563134
Sıçan anti-fare Ly-6A / E (Sca-1) -AF700Biolegend108142
Sıçan anti-fare Ly-6G / Ly-6C (Gr1) -BiotinBiolegend108404
Sıçan anti-fare Ter119-BiotinBiolegend116204
Sıçan anti-fare Ter119-PEBiolegend116208
Sıçan anti-fare Ter119-PE/Cy7Biolegend116222
Stemxyme Worthington BiyokimyasalLS004107

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baryawno, N., et al. A cellular taxonomy of the bone marrow stroma in homeostasis and leukemia. Cell. 177 (7), 1915-1932 (2019).
  2. Severe, N., et al. Stress-induced changes in bone marrow stromal cell populations revealed through single-cell protein expression mapping. Cell Stem Cell. 25 (4), 570-583 (2019).
  3. Han, J., Zuniga-Pflucker, J. C. A 2020 view of thymus stromal cells in t cell development. J Immunol. 206 (2), 249-256 (2021).
  4. Park, J. E., et al. A cell atlas of human thymic development defines t cell repertoire formation. Science. 367 (6480), (2020).
  5. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus rna-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  6. Lischetti, U., et al. Dynamic thresholding and tissue dissociation optimization for cite-seq identifies differential surface protein abundance in metastatic melanoma. Commun Biol. 6 (1), 830(2023).
  7. Ding, L., Saunders, T. L., Enikolopov, G., Morrison, S. J. Endothelial and perivascular cells maintain haematopoietic stem cells. Nature. 481 (7382), 457-462 (2012).
  8. Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
  9. Raaijmakers, M. H., et al. progenitor dysfunction induces myelodysplasia and secondary leukaemia. Nature. 464 (7290), 852-857 (2010).
  10. Himburg, H. A., et al. Distinct bone marrow sources of pleiotrophin control hematopoietic stem cell maintenance and regeneration. Cell Stem Cell. 23 (3), 370-381 (2018).
  11. Zhou, B. O., et al. marrow adipocytes promote the regeneration of stem cells and haematopoiesis by secreting scf. Nat Cell Biol. 19 (8), 891-903 (2017).
  12. Steinmann, G. G. Changes in the human thymus during aging. Curr Top Pathol. 75, 43-88 (1986).
  13. Steinmann, G. G., Klaus, B., Muller-Hermelink, H. K. The involution of the ageing human thymic epithelium is independent of puberty. A morphometric study. Scand J Immunol. 22 (5), 563-575 (1985).
  14. Ambrosi, T. H., et al. Adipocyte accumulation in the bone marrow during obesity and aging impairs stem cell-based hematopoietic and bone regeneration. Cell Stem Cell. 20 (6), 771-784 (2017).
  15. Ho, Y. H., et al. Remodeling of bone marrow hematopoietic stem cell niches promotes myeloid cell expansion during premature or physiological aging. Cell Stem Cell. 25 (3), 407-418 (2019).
  16. Kusumbe, A. P., et al. Age-dependent modulation of vascular niches for haematopoietic stem cells. Nature. 532 (7599), 380-384 (2016).
  17. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).
  18. Stoeckle, C., et al. Isolation of myeloid dendritic cells and epithelial cells from human thymus. J Vis Exp. (79), e50951(2013).
  19. Gustafsson, K., Scadden, D. T. Isolation of thymus stromal cells from human and murine tissue. Methods Mol Biol. 2567, 191-201 (2023).
  20. Centers for disease control prevenetion (cdc) infection control. , Available from: Https://Www.Cdc.Gov/Infectioncontrol/Basics/Standard-Precautions.Html (2023).
  21. Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. J Vis Exp. (110), e53936(2016).
  22. Zhu, H., et al. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone. Nat Protoc. 5 (3), 550-560 (2010).
  23. Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
  24. Kode, A., et al. Leukaemogenesis induced by an activating beta-catenin mutation in osteoblasts. Nature. 506 (7487), 240-244 (2014).
  25. Agarwal, P., et al. Mesenchymal niche-specific expression of cxcl12 controls quiescence of treatment-resistant leukemia stem cells. Cell Stem Cell. 24 (5), 769-784 (2019).
  26. Duarte, D., et al. Inhibition of endosteal vascular niche remodeling rescues hematopoietic stem cell loss in aml. Cell Stem Cell. 22 (1), 64-77 (2018).
  27. O'flanagan, C. H., et al. Dissociation of solid tumor tissues with cold active protease for single-cell rna-seq minimizes conserved collagenase-associated stress responses. Genome Biol. 20 (1), 210(2019).
  28. Stoeckius, M., et al. Cell hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biol. 19 (1), 224(2018).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tek H cre DizilemeTimus DisosiyasyonuKemik li i zolasyonuH cre S zgeci FiltrasyonuManyetik Boncuk Ayr t rmasFACS AnaliziMurin Stromal H crelerH cre Pop lasyonu Heterojenli i

İlgili makaleler