Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Akciğer İskemisi Reperfüzyon Hasarının Murin Sol Pulmoner Hiler Klemp Modeli

2.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66232

⸱

12 Nisan 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cardiothoracic Surgery, Washington University, St. Louis

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

Protokol, fare modellerinde akciğer iskemi-reperfüzyon hasarını incelemek için kullanılabilecek uygulanabilir, güvenilir ve tekrarlanabilir bir sol pulmoner hiler klempleme yöntemini özetlemektedir.

Özet

Akciğer nakli sırasında iskemi reperfüzyon hasarı (IRI), primer greft disfonksiyonu, akut ve kronik rejeksiyon ve mortalite dahil olmak üzere nakil sonrası komplikasyonlar için majör bir risk faktörüdür. IRI'nin temellerini inceleme çabaları, sol akciğer hiler klemplemesinin güvenilir ve tekrarlanabilir bir fare modelinin geliştirilmesine yol açmıştır. Bu model, anestezi uygulanmış ve entübe edilmiş bir farede gerçekleştirilen cerrahi bir prosedürü içerir. Sol torakotomi yapılır, ardından dikkatli akciğer mobilizasyonu ve sol pulmoner hilus diseksiyonu yapılır. Hiler klemp, sol ana gövde bronşundan arteriyel girişi, venöz çıkışı ve hava akışını durduran bir kayma ile pulmoner hilusun geri dönüşümlü sütür ligasyonunu içerir. Reperfüzyon, dikişin dikkatli bir şekilde çıkarılmasıyla başlatılır. Laboratuvarımız güncel incelemelerde deneysel model için 30 dk iskemi ve 1 saat reperfüzyon kullanmaktadır. Bununla birlikte, bu zaman dilimleri belirli deneysel soruya bağlı olarak değiştirilebilir. Kurban edilmeden hemen önce, elde edilen PaO2 değerlerinin sadece yaralı sol akciğere atfedildiğinden emin olmak için 4 dakikalık bir sağ hiler klempleme periyodundan sonra sol ventrikülden arteriyel kan gazı alınabilir. Ayrıca, kurban edilmeden önce incelenecek hücre(ler) için spesifik florokrom etiketli bir antikorun intravenöz enjeksiyonunu içeren akış sitometrisi ile hücre ekstravazasyonunu ölçmek için bir yöntem de tarif ediyoruz. Sol akciğer daha sonra akış sitometrisi, donmuş veya sabitlenmiş, parafine gömülü immünohistokimya ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu için hasat edilebilir. Bu hiler klemp tekniği, IRI'nin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaların ayrıntılı olarak incelenmesine olanak tanır. Temsili sonuçlar, sol akciğer oksijenasyonunun azaldığını ve hiler klempleme sonrası akciğer hasarının histolojik kanıtlarını ortaya koymaktadır. Bu teknik, mikrocerrahi deneyimi olan ve olmayan personel tarafından kolayca öğrenilebilir ve çoğaltılabilir, bu da güvenilir ve tutarlı sonuçlara yol açar ve akciğer IRI'sini incelemek için yaygın olarak benimsenen bir model olarak hizmet eder.

Giriş

Organ nakli sırasında IRI, primer greft disfonksiyonu ve daha sonraki greft reddi atakları için önemli bir risk faktörüdür 1,2. Transplantasyon sırasında sıcak iskemi süresi, donör aort kros klempinden soğuk perfüzyonun başlanmasına ve organın buzdan çıkarılmasından organ implantasyonuna kadar geçen süre olarak tanımlanır. Soğuk hava deposu süresi, soğuk perfüzyonun başlamasından organın buzdan çıkarılmasına kadar geçen süre olarak tanımlanır3. Sıcak iskemi, daha sonraki organ fonksiyonları için soğuk iskemi 4,5,6'dan daha zararlıdır ve altta yatan mekanizmaları, klinik öncesi modellerde daha fazla çalışmayı gerektirir. Ek olarak, kardiyak ölüm sonrası bağıştan (DCD) organ nakli, beyin ölümünden sonra geleneksel bağıştan (DBD) daha uzun sıcak iskemik sürelerle ilişkilidir7. DCD donörlerinin kullanımı donör havuzunu genişletebilir ve akciğer kullanımını artırabilirken, sıcak iskeminin nakil sonrası akciğer fonksiyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için daha fazla klinik öncesi çalışmaya ihtiyaç vardır. Aşağıda, farelerde sol pulmoner hiler klemp yoluyla bir sıcak IRI modelini açıklıyoruz.

Son birkaç yılda akciğer hiler klemplemesinin çeşitli hayvan modelleri geliştirilmiş ve uyarlanmıştır ve atravmatik mikrovasküler klemp 8,9,10,11,12,13, Rumel turnike14,15 veya sütür ligasyonu16 kullanımını içerebilir hilar kelepçe olarak. Hiler kelepçenin püf noktası, geri dönüşümlü olması ve reperfüzyonun elde edilebilmesi için hiler yapılarına minimum veya hiç zarar vermemesi gerektiğidir. Burada, farelerde sol pulmoner hilusun bir kayma düğümü ile geri dönüşümlü sütür ligasyonunu içeren hiler klemp tekniğimizi açıklıyoruz. Bu yöntem, pulmoner arteriyel girişi, venöz çıkışı ve ana gövde bronşunun içine ve dışına hava akışını tıkar. Vasküler bir klemp, klips veya turnike üzerindeki bir düğümün ana yararı, uzun süreli iskemi dönemlerinde göğsün kapatılabilmesi ve böylece farede duyarsız sıvı ve ısı kaybını en aza indirgemesidir. Güvenilir arteriyel kan gazı (ABG) ölçümleri elde etmek ve hiler klempleme sonrası hücre ekstravazasyonunu ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Bu hiler klemp tekniği, akciğer nakli ile ilgili daha geniş bir çalışmada önemli bir yer tutmaktadır. Ortotopik akciğer transplantasyonunun küçük hayvan modelleriyle karşılaştırıldığında, hiler klemp tekniği, cerrahi anastomoz travması veya allojenite eklenmeden IRI'nin etkilerini izole edebilir17. Ek olarak, hiler klemp tekniği, fare akciğer naklinden daha kolay ve hızlı bir şekilde ustalaşabilir. Aslında, hiler klemp teknikleri kullanılarak, son on yılda IRI patogenezinde TLR4, NADPH oksidaz ve adenozin A2A reseptörü 14,18,19,20 gibi birkaç önemli mekanizma tanımlanmıştır. Aşağıdaki protokolde, akciğer IRI'yi incelemek için bir araç olarak güvenilir, öğretilebilir ve tekrarlanabilir bir hiler klempleme yöntemi sunuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm çalışmalar Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Hayvanlar, Ulusal Bilimler Akademisi tarafından hazırlanan ve Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Kılavuz, 8. baskı 21 ve Ulusal Tıbbi Araştırma Derneği tarafından formüle edilen laboratuvar hayvanı bakımı ilkelerine uygun olarak insancıl bakım aldı.

1. Anestezi ve entübasyon

  1. En az 25 g ağırlığında bir fare seçin. Bu, ses telleri arasındaki daha büyük delik nedeniyle daha kolay entübasyonu kolaylaştıracaktır.
  2. Fareye intraperitoneal olarak bir ketamin (vücut ağırlığı dozu 100 mg/kg) ve ksilazin (vücut ağırlığı dozu 10 mg/kg doz) karışımı enjekte edin. Bu karışım 1/2 inç 29G iğne ile 1/2 cc'lik bir şırıngaya yüklenmelidir. Ketaminin etkili olması için yaklaşık 5 dakika bekleyin - fare kendiliğinden hareket göstermemeli ve yeterli anesteziyi doğrulayan bir ayak parmağı tutamına yanıt vermemelidir.
  3. Ek ağrı kontrolü için ameliyattan önce deri altına buprenorfin (vücut ağırlığının 0.05 mg / kg dozu) enjekte edin.
  4. Ameliyat sırasında kornea kurumasını önlemek için her iki gözünüze ilaçsız oftalmik merhem sürün.
  5. Fareyi sol göğsün ve sırtın üzerine bir saç kesme makinesi ile tıraş edin (bkz. Şekil 1A), laparotomi planlanıyorsa karın üzerine uzanın (bkz. adım 5.3).
  6. Fare anestezi uygulandıktan sonra, tercih edilen bir entübasyon kurulumunu kullanarak entübasyonu ve prosedürün geri kalanını ~ 37 ° C'de ısıtılmış bir mat üzerinde mikroskop altında gerçekleştirin (farede normotermiyi korumak için).
  7. Ses tellerinin yeterli bir görünümünü elde ettikten sonra, endotrakeal tüp (ETT) olarak kullanılan 1 inçlik 20G'lik bir anjiyokateterin içine ucunda bir eğri bulunan ev yapımı bir tanıtıcı (Ek Şekil 1'e bakınız) yerleştirin. Tanıtıcının ucunu ve ardından ETT'yi ses telleri arasında ve ötesinde yönlendirin.
    NOT: Yemek borusuna yanlış entübasyonu önlemek için ETT'nin ses tellerinden geçtiğini görselleştirmek önemlidir. Entübasyon sırasında ses tellerinin zarar görmemesi için özen gösterilmelidir (yani entübasyon girişim sayısı 5 ile sınırlandırılmalı ve direnç karşılanırsa ETT ilerletilmemelidir).
  8. ETT yerleştirildikten sonra, tanıtıcıyı çıkarın ve ETT'yi küçük bir hayvan ventilatörüne bağlayın. Doğru endotrakeal entübasyonu doğrulamak için simetrik göğüs yükselişini gözlemleyin. Ventilatör ayarları dakikada 100-105 nefes ve solunan oksijen oranı %100 olmalıdır. Tidal hacim 0.35 mL ve pozitif ekspirasyon sonu basıncı 1 cm H2O'dur.
    NOT: Kazara özofagus entübasyonu derhal düzeltilmezse ölüme yol açacağından, karın yerine göğsün yükseldiğinden emin olun.
  9. Yerinde olduğu onaylandıktan sonra, ETT'yi fare burnunun etrafına 5 cm'lik 1 inçlik bir ipek bant şeridi ile sabitleyin ve ETT'nin ağızdan dışarı kaymaması için ETT ve burun ile yeterli teması sağlayın (bkz. Şekil 1B-C).
  10. Ameliyat boyunca yeterli anesteziyi korumak için, oksijen akışına paralel olarak% 1 -% 1.5 izofluran uygulayın.

2. Torakotomi

  1. Fareyi, her iki ön pençe sol üst köşeye bantlı, sağ arka pençe sol alt köşeye bantlanmış ve sol arka pençe sağ alt köşeye bantlanmış olarak sağ yanal dekübit konumuna getirin (bantlama için Şekil 2G'ye bakın).
  2. En az 3 alternatif povidon iyot turu ve ardından% 70 alkol uygulaması ile sol göğsün üzerindeki cilt ile dezenfekte edin.
  3. Ön aksiller çizgiden arka aksiller çizgiye kadar 4. interkostal boşluk üzerinde, üstteki cildi açmak için makas kullanarak bir kesi yapın (bkz. Şekil 2A). 4. interkostal boşluk, orta aksiller çizgide aksillanın yaklaşık 1 cm altında yer alır.
  4. Kan kaybını en aza indirmek için, elde tutulan bir koter kalemi kullanarak deri altı ve kas katmanlarındaki görünür kan damarlarını pıhtılaştırın.
  5. Latissimus dorsi ve serratus anterior kaslarını makas kullanarak cilt kesisinin uzunluğu boyunca keskin bir şekilde bölün (bkz. Şekil 2B).
  6. İnce kavisli forseps kullanarak, 4. kaburgayı dikkatlice yükseltin (alttaki akciğere zarar vermemeye dikkat edin) ve 5. interkostal boşluğa girmek için 4. kaburganın hemen üzerinde ince bir makasla kesin bir keskin nişancı yapın (bkz. Şekil 2C). İnterkostal nörovasküler demetin yaralanmasını önlemek için torakotomiyi 5. kaburganın altında değil, 4. kaburganın üzerinde gerçekleştirin.
  7. Negatif plevral boşluk basıncı kaybolduğunda ve akciğer göğüs duvarından geri çekildiğinde, torakotomiyi 5. kaburganın hemen üzerindeki 4. interkostal boşlukta öne ve arkaya doğru uzatın (bkz. Şekil 2D-E). Kesinin tüm uzunluğu, genellikle ~ 1 cm olmak üzere tüm akciğeri açığa çıkaracak kadar uzun olmalıdır.
    NOT: Torakotomi öne doğru çok fazla uzatılırsa iç meme arteri kanaması meydana gelebilir - karşılaşılırsa, aşırı kan kaybını önlemek için bu koterize edilmelidir.
  8. Kaburga boşluğunu açmak için iki kaburga ekartörü uygulayın ve yeterli görselleştirme için en az 1cm2'lik bir çalışma penceresi sağlayın (bkz. Şekil 2F-G).

3. Hilar kelepçe uygulaması

  1. İki uçlu pamuk uçlu aplikatörler kullanarak, sol akciğeri sefalad yükselterek ve ardından yarı saydam inferior pulmoner ligamenti kör bir şekilde bölerek hareket ettirin (bkz. Şekil 3A-B).
    NOT: Bunu akciğeri yırtmadan gerçekleştirmek zorsa, alt pulmoner ligament de ince makas kullanılarak keskin bir şekilde bölünebilir.
  2. Akciğeri öne doğru yansıtın, böylece arka sol pulmoner hilus görselleştirilebilir. 6-0 ipek bağdan ~10 cm'ye kadar bir parça kesin ve bu bağın orta noktasını hilumun arkasına yerleştirin (bkz. Şekil 3C).
  3. Ardından, kravatın üzerine uzanmak için sol akciğeri arkaya doğru çevirin ve kravatın her iki ucunu öne doğru çekin (bkz. Şekil 3D).
  4. Kravatın iki serbest ucu (A ve B) ile, forseps ve kavisli bir sivrisinek kelepçesi ile ters çevrilebilir bir kayma düğümü aletle bağlayın. Adım 3.4.1 ve 3.4.2'deki ayrıntılı açıklamaya bakın. Sıcak iskemik zaman, slip düğümün bağlanmasıyla başlar. Düğüm bağlandıktan sonra sol akciğer artık her ventilatör nefesinde şişmemelidir. Perfüzyonun kesilmesi anlamına gelen soluk beyaz olmalıdır.
    NOT: Düğümün hilumun ortasına oturduğundan emin olmak için özen gösterilmelidir, yanlışlıkla sol atriyumu merkeze ve akciğer parankimini yanlara sıkıştırmaktan kaçınmalıdır (bkz. Şekil 3F).
    1. Kelepçe baskın elde, forseps baskın olmayan eldeyken, A'nın ucunu forseps ile tutun ve A'nın orta noktasını kapalı kelepçenin etrafına bir kez sarın (bkz. Şekil 3E).
    2. B'nin orta noktasını kelepçe ile kavrayın ve kaymayı sıkıştırmak için iki elinizle çekin. B'nin ucunun düğümü çekmesine izin vermeyin, bu düğümü geri döndürülemez hale getirir. Düğümü bağladıktan sonra, B'nin düğümden çıkan bir ilmek olmalı, A ise düz olmalıdır (bkz. Şekil 3F). Düğüm, B'nin ucunu çekerek serbest bırakılabilir.
  5. Sol akciğerin şişmemesine neden olması gereken ETT'den ventilatöre çıkış tüpünü manuel olarak tıkayarak bronşun yeterli tıkandığını onaylayın (bkz. Şekil 3G). Pulmoner arter ve venlerin kıkırdaklı bronşlara göre daha fazla katlanması nedeniyle bronşiyal tıkanıklık ile damar tıkanıklığı olduğu varsayılır.
  6. Hiler klemp uygulandıktan sonra, sıcak iskemi döneminde hissedilmeyen sıvı kayıplarını en aza indirmek için cilt kesisini 6-0 naylon sütür kullanarak basit bir kesintili dikişle kapatın.

4. Hilar kelepçesinin serbest bırakılması

  1. İstenilen sıcak iskemi döneminden sonra, ipek bağın kısa serbest ucunu nazikçe çekerek düğümü serbest bırakın ( Şekil 3F ve adım 3.4'ten B). Slipknot'un serbest bırakılmasının ardından reperfüzyon süresini başlatın.
    NOT: Bağın serbest bırakılmasını takiben, akciğer ventilasyonu, şimdi sol akciğerin genişlemesine neden olması gereken ETT çıkışının tekrar manuel olarak tıkanmasıyla doğrulanabilir. Yine, perfüzyon akciğerin şişmesi ile ima edilir, ancak akciğerin pembeleşmesi ile de doğrulanabilir (bkz. Şekil 4A).
  2. Reperfüzyon döneminde, duyarsız kayıpları en aza indirmek için göğsü üç kat halinde kapatın. İlk olarak, 4. kaburga boşluğunu 6-0 naylon dikişle tek bir dikişle, bir ısırık 4. kaburganın hemen üzerinde ve bir ısırık 6. kaburganın hemen üzerinde olacak şekilde kapatın (bkz. Şekil 4B-C). İyatrojenik pnömotoraks riskini en aza indirmek için bunu maksimum akciğer şişirme seviyesine bağlayın (bkz. Şekil 4D-E).
  3. Ardından, 6-0 naylon sütür ile basit bir koşu dikişi kullanarak kas tabakasını kapatın.
  4. Son olarak, cilt kesisini 6-0 naylon sütür ile basit bir kesikli dikişle kapatın (bkz. Şekil 4F). Uyanık hayvanların kesilerinde toplanma ve tam yara ayrışmasına yol açma riski nedeniyle cilde dikiş atmaktan kaçının.
  5. Bu noktadan itibaren istenilen reperfüzyon süresi sonunda akciğer direkt olarak çıkarılabilir. ABG değerlendirmesi isteniyorsa, adım 5'e bakın. Kurban edilmeden önce ek intravenöz enjeksiyon isteniyorsa, adım 6'ya bakın. Bu terminal bir ameliyattır.
  6. Reperfüzyon süresinin birkaç saatten fazla olması amaçlanıyorsa, farenin anesteziden uyanmasına ve ekstübe etmesine izin vermek için izofluranı kapatın. Ekstübasyon kriterleri arasında pençe sıkışması ile seğirme ve spontan solunum ve hareket yer alır. Bir fareyi ketamin ve izofluran anestezisinden uyandırmak tipik olarak 30-45 dakika sürer. Bu bir hayatta kalma ameliyatıdır.
    1. Hayatta kalma ameliyatı için, ameliyattan kaynaklanan sıvı kayıplarını hesaba katmak için deri altına 1 mL ılık salin enjekte edin. Ağrı kontrolü için ameliyattan önce deri altına buprenorfin (doz 0.05 - 0.1 mg / kg vücut ağırlığı) enjekte edin. Ameliyattan sonra en az 3 gün boyunca her 4-6 saatte bir anesteziyi tekrarlayın. Ek ağrı kontrolü için insizyon boyunca bir bupivakain bloğu düşünün.

5. ABG değerlendirmesi

NOT: ABG ölçümü isteniyorsa, bu en iyi sol ventrikülden arteriyel kan aspirasyonu ile elde edilir. ABG'nin sadece sol akciğer fonksiyonunu yansıttığını tespit etmek için, bu arteriyel kan, sağ hilusun klemplenmesinden yaklaşık 4 dakika sonra elde edilmelidir22,23, bu süre zarfında sadece sol akciğer oksijenasyon ve ventilasyon gerçekleştirir.

  1. Hiler klempten sonra fare anesteziden uyandırılmışsa, fareyi 1. adıma göre yeniden uyuşturun ve entübe edin.
  2. İstenen reperfüzyon süresinin bitiminden yaklaşık 15-20 dakika önce, fareyi sırtüstü yatırın ve dört uzvunu da bantla sabitleyin.
    NOT: Reperfüzyonun bitiminden önce aşağıdaki adımların gerçekleştirilmesi için yeterli zaman ayrılmalıdır. Karın ve göğsü açmak için özel zamanlama, cerraha ve deneyimlerine bağlı olarak değişecektir.
  3. Kasık kemiğinden ksifoide kadar orta hat laparotomisi yapın, cildi ve ardından karın duvarını linea alba boyunca makasla kesin (bkz. Şekil 5A-B).
  4. Ksifoidde, laparotomiyi en alt kaburganın eğrisini takip ederek ön aksiller çizgiye sola ve sağa uzatın (bkz. Şekil 5C).
  5. Karından itibaren, göğse girmek için orta hattaki ön diyaframı kesin ve kalbe zarar vermemek için çok derine inmemeye dikkat edin (bkz. Şekil 5D-E). Ardından, ön diyafram kesisini en alt kaburga boyunca ön aksiller çizgiye sola ve sağa uzatın (Şekil 5D'deki beyaz noktalı çizgiye bakın).
  6. Kapaklı bir torakotomi oluşturmak için bilateral kaburgaları ön aksiller çizgi boyunca, aksillaya doğru yukarı doğru uzanan şekilde bölün. Ardından, kalbin ve iki taraflı akciğerlerin tam olarak açığa çıkmasına izin veren ön göğüs duvarını (sternum ve iki taraflı ön kaburgalar) sefaladını yansıtın ( Şekil 5F'deki beyaz noktalı çizgilere bakın).
  7. Retraksiyonu kolaylaştırmak için sefalad çevrilmiş ön göğüs duvarına bir kelepçe uygulayın. Göğsün görselleştirilmesini iyileştirmek için diyaframı orta hatta kavisli bir sivrisinek kelepçesi ile aşağı doğru geri çekin (bkz. Şekil 5F).
  8. Sağ akciğeri (4 loblu) tam olarak harekete geçirmek için, orta hattı geçerek sol göğse uzanan aksesuar lobu tekrar sağ göğse geri koyun (bkz. Şekil 5G-H). Bu lobu sol göğse bağlayan ince bir bağ vardır - bunu pamuk uçlu aplikatörlerle kör bir şekilde veya makasla keskin bir şekilde bölün.
    NOT: Bu aksesuar lob, inferior vena kava (IVC) ile orta hattın posteriorunu geçer, bu nedenle bu manevra sırasında IVC'ye zarar vermemeye dikkat edilmelidir.
  9. Tüm loblar sağ göğse geri döndüğünde, sağ akciğerin tamamını öne doğru yansıtın ve sağ hilusun arkasına başka bir 6-0 ipek kravat (~ 10 cm'ye kadar kesilmiş) yerleştirin. Ardından, sağ akciğeri kravatın üzerinden göğsüne geri yerleştirin.
  10. Sağ akciğerin dört lobunu da çevrelemeye özen göstererek, adım 3.4'te anlatılan tekniğin aynısını kullanarak sağ hilumun etrafına başka bir düğüm atın. Bu sağ hiler klemp adımı, reperfüzyonun bitiminden yaklaşık 4 dakika önce olacak şekilde zamanlanmalıdır.
  11. 1 cc tüberkülin şırıngasına 1/2 inç 31G iğneyi yaklaşık 200 μL heparin 1000 birim / mL ile kaplayın. Bunu yapmak için, heparin hacmini artırın ve heparinin şırınganın tüm içini kaplamasını sağlamak için pistonu tekrar tekrar 3-4 kez ileri geri çekin. Bu, cerrahi istasyondan ABG makinesine taşıma sırasında aspire edilen kanın pıhtılaşma riskini en aza indirmek için yapılır.
  12. Sağ hiler klemplemeden 4 dakika sonra, sol ventrikülden gelen arteriyel kanı heparin kaplı şırıngaya aspire edin (bkz. Şekil 5I). Ventriküler septumu delmekten ve yanlışlıkla venöz sağ ventrikül kanını aspire etmekten kaçınmaya dikkat edin. Daha koyu sağ ventrikül ile daha parlak sol ventrikül arasında net bir renk farkı vardır (bkz. Şekil 5I ek). İğneyi sol boyna doğru eğin. Bir ABG'yi (~ 150 μL) çalıştırmak için yeterli kan elde etmek için birden fazla ponksiyon gerekebilir.
    NOT: Sağ hiler klempin 4 dakikası sırasında, fare yaklaşmakta olan ölümün habercisi olan agonal solunum sergilemeye başlayabilir. Böyle bir durumda, kalp durmasından önce arteriyel kan hızlı bir şekilde aspire edilmelidir. Atmayan bir kalpten kan aspire etmek mümkün değildir.
  13. Diğer ölçümlerin yanı sıra oksijen doygunluğu, kısmi oksijen basıncı, kısmi karbondioksit basıncı elde etmek için arteriyel kanı bir ABG makinesinde çalıştırın. ABG toplama ve/veya antikor tedavisinden sonra fareye ötenazi yapın (bkz. adım 6).

6. Hücre ekstravazasyonunun ölçümü için intravenöz antikor enjeksiyonu

NOT: Bu teknik, daha önce yayınlandığı gibi, fedakârlıktan önce IVC'ye intravenöz olarak florokrom etiketli antikorların enjeksiyonu ve ardından akış sitometrik analizi yoluyla hücre ekstravazasyonunu belirlemek için kullanılabilir18. Kısaca intravasküler nötrofiller, nötrofil spesifik anti-Ly6G antikorları kullanılarak interstisyel nötrofillerden ayırt edilebilir. Floresein izotiyosiyanat etiketli (FITC etiketli) anti-Ly6G (klon 1A8), kurban edilmeden 5 dakika önce intravenöz olarak enjekte edilir ve bu da dolaşımdaki intravasküler nötrofilleri etiketler. Kullanılan FITC-Ly6G antikorunun konsantrasyonu, 200 μL fosfat tamponlu salin içinde seyreltilmiş 100 ng'dir. Daha sonra, akış sitometrisi için sol akciğerden tek hücreli süspansiyon hazırlandıktan sonra, tüm nötrofiller allofikosiyanin etiketli (APC etiketli) anti-Ly6G (klon 1A8) ile etiketlenir. Bu nedenle, APC-Ly6G + FITC-Ly6G + nötrofiller intravasküler iken APC-Ly6G + FITC-Ly6G- ekstravasküler veya interstisyeldir. Bu teknik, örneğin anti-Ly6C antikorlarına sahip monositlere, anti-CD19 antikorlarına sahip B hücrelerine uyarlanabilir.

  1. İstenilen antikoru, şırınga içindeki hava kabarcıklarını en aza indirmeye dikkat ederek 5/16 inç 31G iğneli 3/10 cc'lik bir şırıngaya yükleyin. Adım 6.5'te IVC'ye intravenöz enjeksiyon için bunu kullanın.
  2. Adım 5.3-5.4'e göre laparotomi yapın.
  3. Laparotomi sonrasında, iki sivri uçlu pamuk uçlu aplikatör kullanarak sağ medial viseral rotasyonu künt bir şekilde gerçekleştirin. Bir farede bu, IVC'nin net bir şekilde görülmesini sağlayacak olan karnın soluna doğru tüm bağırsağın boşaltılmasıyla yapılır (bkz. Şekil 6A).
  4. IVC'nin üzerindeki yağı pamuk uçlu aplikatörlerle kör bir şekilde temizleyin.
  5. Antikor solüsyonunu damar delinmesi yoluyla IVC'ye enjekte edin (bkz. Şekil 6B). İğnenin çıkarılmasından sonra, hemostatik olana kadar (genellikle yaklaşık 2-3 dakika) damar delinme bölgesine hemen bir pamuklu çubukla hafif bir baskı uygulayın.
  6. IVC üzerine baskı uygulamaya devam etmek için içi boşaltılmış bağırsağı pamuklu çubuk üzerinde karın içine geri koyun (bkz. Şekil 6C).
  7. Sol akciğeri çıkarmak için 5.5-5.7 adımlarına göre kapaklı torakotomi yapın. Kurban ve hasattan önce antikorların sistemik olarak dolaşması için en az 5 dakika kalmasına izin verin. ABG toplama ve / veya antikor tedavisinden sonra fareye ötenazi yapın.

7. Histoloji (H & E) boyama

  1. Sol akciğerin formalin fiksasyonu ve parafin gömülmesini ve 5 μm kalınlığa kadar kesit alınmasını takiben, slaytı ksilen içinde deparafinize edin (iki 10 dakikalık yıkama).
  2. Sıralı etanol yıkamalarında dehidrat: %100 ile 2x 5 dk, %95 ile 1x 2 dk yıkama ve %70 etanol ile 1x 2 dk yıkama. Daha sonra deiyonize suda durulayın.
  3. Slaytı hematoksilen ile 2-4 dakika boyayın, ardından 5 dakika veya berraklaşana kadar deiyonize su ile yıkayın. Hematoksilen boyamanın kesin süresinin dokuya ve istenen nükleer boyama yoğunluğuna göre optimize edilmesi gerekecektir.
  4. Lekeleri ayırt etmek için tanımlayıcı solüsyonda 30 saniye yıkayın, ardından 2 dakika suda yıkayın. Mavi renk oluşturan solüsyonda 30 saniye yıkayın, ardından 2 dakika suda yıkayın.
  5. % 95 etanol 15x'e batırarak daha fazla kurutun. Eozin içinde 1 dakika boyayın.
  6. 2 dakika etanol yıkama (2x) ile dehidre edin, ardından 2 dakika ksilen yıkama (2x) yapın. Montaj ortamını ve kapak kızağını uygulayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Sol hiler klempleme sonrası, sol akciğere atfedilen arteriyel kandaki (PaO2) kısmi oksijenasyon basıncı ~100 mmHg olup, sahte torakotomi sonrası ~500 mmHg'ye kıyasla anlamlı derecede düşüktür (Şekil 7A, n=6-7). Dikkat çekici bir şekilde, sahte torakotomiler B6 farelerinde, yalnızca sol akciğere atfedilen değerleri temsil eden 4 dakikalık sağ hiler klemplemeden 4 dakika sonra ABG ölçümü ile gerçekleştirildi. Hiler klempli sol akciğerin H&E boyalanması, hava yollarını dolduran i...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada, pulmoner arter ve venler ile bronşları tıkayan sol hilusa bir slipknot uygulanarak sıcak iskemi ve ardından reperfüzyon yapılan bir hiler klemp tekniği tarif edilmiştir. Hiler klemplemeden sonra, sol akciğer histoloji, akış sitometrisi, toplu veya tek hücre dizilimi ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu gibi çeşitli deneysel teknikler için hasat edilebilir. Ek olarak, kan ve dalak sistemik etkileri incelemek için kullanılabilirken, iskemik olmayan sağ akciğer iç kontrol görevi görebilir. Bu protokolde, ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar konuyla ilgili herhangi bir açıklama bildirmemiştir.

Teşekkürler

Bu çalışma, kamu, ticari veya kar amacı gütmeyen sektörlerdeki herhangi bir finansman kuruluşundan özel bir hibe almadı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
İlaçlar< / güçlü>
% 10 povidon-iyot çözeltisiiçinAplicareNDC 52380-0126-2
Buprenorfin 1.3 mg / mLFidelis Hayvan SağlığıNDC 86084-100-30Ağrı
kontrolü içinCarprofenCronus PharmaNDC 69043-027-18
Heparin 1000 birim / mLSagentNDC 25021-404-01Arteriyel kan elde etmek için
İzofluran %1-%1.5Sigma Aldrich26675-46-7Anestezi için
Ketamin hidroklorür 100 mg/mLVedcoNDC 50989-996-06Anestezi için
Puralube Vet göz merhemiMedi-Vet.com11897Göz bozulmasını önlemek için
Ksilazin 20 mg / mLAkornNDC 59399-110-20Ağrı kontrolü için
Aletler ve Aletler< / güçlü>
Argent Yüksek Sıcaklık İnce Uçlu Kotery KalemMcKesson231Kan damarlarını pıhtılaştırmak için
Kavisli sivrisinek kelepçesiGüzel Bilim Araçları13009-12Cerrahi prosedür için
İnce kavisli forsepsGüzel Bilim Araçları11274-20Cerrahi için prosedür
İnce makasGüzel Bilim Araçları15040-11Cerrahi prosedür için
Entübasyon kelepçesi kurulumuGüzel Bilim Araçları18374-44, 18144-30Entübasyon sırasında fareyi dilinden dikey olarak tutmak için. Ek Şekil 1A'ya bakınız.
Manyetik kaburga ekartörleriGüzel Bilim Araçları18200-01, 18200-10Torakotominin geri çekilmesi için. Manyetik fiksatör ve ekartör aşağıdaki mikro lateks boru ile bağlanmalıdır.
Optik Sınıf Plastik Fiber Optik Ceketsiz, 500 & mu; mEdmund Optics02-532Endotrakeal tüp için introdüser yapmak için. Ek Şekil 1B'ye bakın. Bu optik fiberin 1,5 inç uzunluğunda, bir ucuna sabitlenmiş bir parça ipek bant bulunmalıdır. Daha sonra endotrakeal tüp için bir introdüser olarak kullanılabilir. Tanıtıcının ucu hafifçe eğri olmalıdır.
Power Pro Ultra kesmemakinesi Oster078400-020-001Saç kesmek için
Makasİnce Bilim Araçları14370-22Cerrahi prosedür için
Küçük hayvan ısıtma yastığıK & H Pet ÜrünleriTermo-Peep Isıtmalı PedNormotermiyi korumak için
Küçük hayvan ventilatörüHarvard Aparatı55-0000Havalandırma için (TV 0.35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105 / dak, FiO2 %100)
Spearit Mikro Lateks Kauçuk Boru (1/8 dış çap, 1/16 iç çap)Amazon.comhttps://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1Geri çekilmesi için torakotomi
İstatistik Profili Prime Critical Care Kan Gazı AnalizörüNova Biomedicalhttps://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx
ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33
2aM8WGPiUVhicPQZ
Wj2AaAqhDEALw_wcB   		Torakotominin retraksiyonu için
Düz kelepçeGüzel Bilim Araçları13008-12Cerrahi prosedür için
Düz forsepsGüzel Bilim Araçları91113-10Cerrahi prosedür için
Cerrahi mikroskopWild Heerbruggartık üretilmiyorEntübasyon ve cerrahi prosedür için; Leica cerrahi mikroskopları ile değiştirilmesini öneririz
Supplies
½ ½ ile CC şırınga; inç 29G iğneMcKesson942665Ketamin / ksilazin intraperitoneal
ve frac12 enjekte etmek için; 1 cc tüberkülin şırıngasında inç 31G iğneMcKesson16-SNT1C2705Sol ventrikülden arteriyel kan aspirasyonu için
1 inç 20G IV kateterTerumoSROX2025CAEndotrakeal tüp (ETT)
için1 inç ipek bantDurapore3M ID 7100057168ETT'yi buruna bantlamak ve uzuvları sabitlemek için
5/16 inç 31G iğneli 3/10 cc şırıngaMcKesson102-SN310C31516Pİnferior vena kavaya antikor enjeksiyonu için
P-10 iğnesi üzerinde 6-0 monofilament sütürMcKessonS697GXTorakotomi, kas tabakası ve cildin kapatılması için
6-0 ipek kravatCerrahi Uzmanlık Alanları LookSP102Hilar kelepçe için kayma yapmak için
Sivri uçlu pamuk uçlu aplikatörlerSolon56225Akciğeri manipüle etmek ve künt diseksiyon için
Dezenfektan

Kaynaklar

  1. Bharat, A., et al. Immunological link between primary graft dysfunction and chronic lung allograft rejection. Ann Thorac Surg. 86 (1), 189-195 (2008).
  2. Daud, S. A. Impact of immediate primary lung allograft dysfunction on bronchiolitis obliterans syndrome. Am J Respir Crit Care Med. 175 (5), 507-513 (2007).
  3. Halazun, K. J., Al-Mukhtar, A., Aldouri, A., Willis, S., Ahmad, N. Warm ischemia in transplantation: search for a consensus definition. Transplant Proc. 39 (5), 1329-1331 (2007).
  4. Warnecke, G., et al. Warm or cold ischemia in animal models of lung ischemia-reperfusion injury: is there a difference . Thorac Cardiovasc Surg. 52 (3), 174-179 (2004).
  5. Hasenauer, A., et al. Effects of cold or warm ischemia and ex-vivo lung perfusion on the release of damage associated molecular patterns and inflammatory cytokines in experimental lung transplantation. J Heart Lung Transplant. 40 (9), 905-916 (2021).
  6. Iskender, I., et al. Effects of warm versus cold ischemic donor lung preservation on the underlying mechanisms of injuries during ischemia and reperfusion. Transplantation. 102 (5), 760-768 (2018).
  7. Santos, P., Teixeira, P. J. Z., Moraes Neto, D. M., Cypel, M. Donation after circulatory death and lung transplantation. J Bras Pneumol. 48 (2), e20210369(2022).
  8. Moskowitzova, K., et al. Mitochondrial transplantation enhances murine lung viability and recovery after ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 318 (1), L78-L88 (2020).
  9. Nakata, K., et al. Functional blockage of S100A8/A9 ameliorates ischemia-reperfusion injury in the lung. Bioengineering (Basel). 9 (11), 673(2022).
  10. Nakata, K., et al. Protective effects of anti-HMGB1 monoclonal antibody on lung ischemia reperfusion injury in mice. Biochem Biophys Res Commun. 573, 164-170 (2021).
  11. Wang, Q., Li, Y., Wu, C., Wang, T., Wu, M. Aquaporin-1 inhibition exacerbates ischemia-reperfusion-induced lung injury in mouse. Am J Med Sci. 365 (1), 84-92 (2023).
  12. Gielis, J. F., et al. A murine model of lung ischemia and reperfusion injury: tricks of the trade. J Surg Res. 194 (2), 659-666 (2015).
  13. Zhang, X., et al. Mitogen-activated protein kinases regulate HO-1 gene transcription after ischemia-reperfusion lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (4), L815-L829 (2002).
  14. Sharma, A. K., et al. Adenosine A2A receptor activation on CD4+ T lymphocytes and neutrophils attenuates lung ischemia-reperfusion injury. J Thorac Cardiovasc Surg. 139 (2), 474-482 (2010).
  15. Yang, Z., Sharma, A. K., Linden, J., Kron, I. L., Laubach, V. E. CD4+ T lymphocytes mediate acute pulmonary ischemia-reperfusion injury. J Thorac Cardiovasc Surg. 137 (3), discussion 702 695-702 (2009).
  16. Sayah, D. M., et al. Neutrophil extracellular traps are pathogenic in primary graft dysfunction after lung transplantation. Am J Respir Crit Care Med. 191 (4), 455-463 (2015).
  17. Okazaki, M., et al. A mouse model of orthotopic vascularized aerated lung transplantation. Am J Transplant. 6 (7), 1672-1679 (2007).
  18. Hsiao, H. M. Spleen-derived classical monocytes mediate lung ischemia-reperfusion injury through IL-1beta. J Clin Invest. 128 (7), 2833-2847 (2018).
  19. Sharma, A. K., Mulloy, D. P., Le, L. T., Laubach, V. E. NADPH oxidase mediates synergistic effects of IL-17 and TNF-alpha on CXCL1 expression by epithelial cells after lung ischemia-reperfusion. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306 (1), L69-L79 (2014).
  20. Zanotti, G., et al. Novel critical role of Toll-like receptor 4 in lung ischemia-reperfusion injury and edema. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 297 (297), L52-L63 (2009).
  21. National Research Council. Guide for the care and use of laboratory animals. , The National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  22. Saito, M., et al. Pirfenidone alleviates lung ischemia-reperfusion injury in a rat model. J Thorac Cardiovasc Surg. 158 (1), 289-296 (2019).
  23. Tanaka, S., et al. Protective effects of Imatinib on ischemia/reperfusion injury in rat lung. Ann Thorac Surg. 102 (5), 1717-1724 (2016).
  24. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  25. Koletsis, E., et al. In situ cooling in a lung hilar clamping model of ischemia-reperfusion injury. Exp Biol Med (Maywood). 231 (8), 1410-1420 (2006).
  26. Hermsen, R., et al. Genomic landscape of rat strain and substrain variation. BMC Genomics. 16 (1), 357(2015).
  27. Beck, J. A., et al. Genealogies of mouse inbred strains. Nat Genet. 24 (1), 23-25 (2000).
  28. Liao, W. I., et al. A mouse model of orotracheal intubation and ventilated lung ischemia reperfusion surgery. J Vis Exp. (187), 64383(2022).
  29. Murata, T., Nakazawa, H., Mori, I., Ohta, Y., Yamabayashi, H. Reperfusion after a two-hour period of pulmonary artery occlusion causes pulmonary necrosis. Am Rev Respir Dis. 146 (4), 1048-1053 (1992).
  30. Ukita, R., et al. A large animal model for pulmonary hypertension and right ventricular failure: Left pulmonary artery ligation and progressive main pulmonary artery banding in sheep. J Vis Exp. (173), 62694(2021).
  31. Wang, Q., et al. Induction of right ventricular failure by pulmonary artery constriction and evaluation of right ventricular function in mice. J Vis Exp. (147), 59431(2019).
  32. Welbourn, C. R., et al. Pathophysiology of ischaemia reperfusion injury: central role of the neutrophil. Br J Surg. 78 (6), 651-655 (1991).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Düzeltme


Formal Correction: Erratum: Murine Left Pulmonary Hilar Clamp Model of Lung Ischemia Reperfusion Injury
Posted by JoVE Editors on 7/09/2024. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/66232

Daha fazla makale keşfet

Pulmoner Hilum KlemplemeFare Akciğer HasarıNötrofil EkstravazasyonuB Hücresi GöçüAkış SitometrisiTorakotomi ProsedürüArteriyel Kan GazıAkciğer Transplantasyonu Modeli
Akciğer İskemisi Reperfüzyon Hasarının Murin Sol Pulmoner Hiler Klemp Modeli
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.