Biyobankacılık ve su ürünleri yetiştiriciliğini desteklemek için mercan spermlerinin dondurularak saklanması için yarı otomatik bir iş akışı

Mercan resifleri küresel olarak, iklim değişikliğinin neden olduğu okyanus ısınması ve asitlenme nedeniyle mercan türleri, popülasyonları ve genetik çeşitlilik kaybı yaşıyor, bu kritik habitatların yaşayabilirliğini azaltıyor ve destekledikleri türleri etkiliyor ^1,2. Genetiği uzun vadede güvence altına almak için en etkili yaklaşım, canlı numunelerin kriyojenik sıcaklıklarda sıvı nitrojen içinde süresiz olarak dondurularak saklanmasına izin veren kriyoprezervasyon ve biyobankacılıktır³. 2012 yılında mercan sperminin⁴ dondurularak saklanması için yöntemlerin geliştirilmesi, ilk kez bu türlerden elde edilen genetiğin biyobankacılığını mümkün kıldı ve 2012 yılında mercan genetiği için ilk biyolojik deponun geliştirilmesine yol açtı⁵. O zamandan beri, bu kriyoprezervasyon protokolü daha da rafine edildi⁶ ve dünya çapında 50'den fazla mercan türünün genetiğini güvence altına almak için kullanıldı ve bu türlerin 30'u Avustralya'daki Büyük Set Resifi'nden^{geliyor 7}. Dondurularak saklanmış mercan spermi, normal olarak gelişen ve Avustralya⁸ ve Karayipler'de 9 yardımcı gen akışı deneylerini kolaylaştırmak için kullanılan sağlıklı mercanlar^üretebilir. Larvalar 10 ve yetişkin mercan dokuları^11,12 gibi karmaşık doku tiplerinin dondurularak saklanmasını sağlamak için teknolojiler şu anda geliştirilme aşamasındayken, mercan sperminin dondurularak saklanması şu anda mercan genetiğinin rutin biyobankacılığı için mevcut olan en yaygın araçtır.

Mercan popülasyonları üzerindeki etkiler arttıkça, birçok ülke resif restorasyonunu ve adaptasyonunu desteklemek (örneğin, Avustralya'daki Resif Restorasyon ve Adaptasyon Programı [RRAP]¹³) veya kalan tehlike altındaki mercan popülasyonlarını güvence altına almak (örneğin, ABD'deki Florida Coral Rescue¹⁴). Bu programlar bağlamında, kriyoprezervasyon, mevcut genetik çeşitliliği güvence altına almanın ve yok oluşları önlemenin yanı sıra araştırma ve büyük ölçekli mercan üretimini destekleyen bir teknoloji olarak düşünülebilir. Sperm kriyoprezervasyonu, fiziksel veya zamansal olarak ayrılmış popülasyonlar arasında üreme üzerinde daha fazla kontrol sağlayabilir ve anaçların genetik yönetiminin termal tolerans veya hastalık direnci gibi arzu edilen özellikleri seçmesine izin verebilir⁸. Bugüne kadar, mercan sperm biyobankacılığı, biyoçeşitlilik yönetimini desteklemek için nispeten küçük bir ölçekte gerçekleştirilmiştir⁷, bu nedenle, bu tür bir biyobankacılığın bu daha büyük resif restorasyon programları içindeki potansiyelini karşılaması için bir miktar yükseltme gerekecektir. Mercan üremesine dayalı tüm resif restorasyon çabalarında olduğu gibi, biyo-bankacılık çabalarının artmasının önündeki ana engel, mercan gametlerinin mevcut olduğu sınırlı dönemdir, çünkü resif oluşturan türlerin çoğunda yumurtlama, ilkbaharın sonlarında ve yazın başlarında dolunaya denk gelir¹⁵, yani gametlerin her yıl yalnızca birkaç gece kriyoprezervasyon ve biyobankacılık için mevcut olduğu anlamına gelir. Ayrıca, kitlesel yumurtlamanın meydana geldiği bölgelerde, örneğin Büyük Set Resifi'nde, tipik olarak aynı gece aynı anda veya birkaç saat içinde yumurtlayan birden fazla tür vardır¹⁵. Bu nedenle, numunelerin ve ilgili meta verilerin bütünlüğünü sağlarken, bu kısa yıllık yumurtlama pencereleri sırasında biyobankacılık kapasitesini en üst düzeye çıkarmak için işlemenin ölçeğini ve verimliliğini artırmak için sperm kriyoprezervasyon yolunda iyileştirmeler yapılması gerekmektedir.

Mercan sperminin dondurularak saklanması ve biyobankacılığı, yumurtlama sırasında gametlerin toplanmasından örneklerin biyodepoya ve veri tabanına katılmasına kadar birkaç önemli adımı içerir (Şekil 1). İşlem, spermin yumurtalardan ayrılması (hermafrodit türlerde) veya su kolonundan (gonokorik türlerde) spermin toplanması ile başlar, ardından sperm hareketliliği ve konsantrasyonunun değerlendirilmesi ile devam eder. Sperm daha sonra filtrelenmiş deniz suyunda (FSW) kriyoprotektan (% 10 v / v nihai konsantrasyon, dimetil sülfoksit, DMSO) ile birleştirilir ve özel olarak tasarlanmış bir soğutma cihazında -20 ° C / dk'da soğutulur⁴. Bu işlemin erken yinelemeleri, faz kontrast mikroskobu ve hemositometre sayımları yoluyla sperm hareketliliği ve konsantrasyonunun görsel değerlendirmesine, numuneler kriyoprezervasyon için işlenirken tüplerin yazdırılmasına ve etiketlenmesine, sperm örneklerinin kriyoviyallere elle pipetlenmesine ve özel olarak tasarlanmış bir yüzer rafta^{soğutulmasına dayanıyordu 16}. Bilgisayar destekli sperm analizinin (CASA) ^{uygulanması17} ve 3D baskılı bir soğutma cihazının⁶ geliştirilmesi, mercan sperm kriyoprezervasyonunun verimliliğini ve güvenilirliğini artırmıştır, ancak sperm örneği işleme yolu, başlangıcından bu yana büyük ölçüde aynı kalmıştır. Bu yaklaşım, bir yumurtlama gecesinde orta sayıda koloni ve türden alınan numunelerin işlenmesi için uygun olsa da, büyük hacimler ve sayıda koloniler için (örneğin, bir seferde >10 koloniden alınan bireysel numuneler), kriyoprezervasyon yolunda, numune doğurganlık potansiyelinde bozulma olmadan numunelerin zamanında (yani sperm salınımından sonraki 2 saat içinde) işlenmesini engelleyen darboğazlar vardır. Kriyoviyaller için büyük ölçekli sıvı taşıma sistemleri mevcut olmasına rağmen (örneğin, Thomas ve ^ark.18), bunlar tipik olarak büyük parti işleme (yani, birden fazla kriyovial rafı) için tasarlanmıştır ve sahada nakliye ve kullanım için uygun değildir, bu nedenle bu uygulama için uygun maliyetli değildirler. Bu nedenle, bu çalışma, bir yumurtlama gecesinde etkili bir şekilde kriyoprezerve edilebilecek numune sayısını en üst düzeye çıkarmak için işleme yolundaki kilit adımlarda taşınabilir, ucuz otomasyon ekipmanı ve yöntemleri sunarak mercan sperminin kriyoprezervasyonunun verimliliğini artırmayı amaçlamıştır.

Burada açıklanan yöntemler, hem hermafroditik hem de gonokorik mercan türlerinden spermleri işlemek ve kriyoprezervasyon yapmak için kullanılabilir. Her iki üreme modu için sperm kriyoprezervasyonu için mercan yumurtlaması ve gamet toplama hakkında genel bir giriş ve astar, Smithsonian Ulusal Hayvanat Bahçesi ve Koruma Biyolojisi Enstitüsü Mercan Kriyoprezervasyon Eğitim Kursu^19'da bulunabilir. Açıklanan yöntemler öncelikle Woppaburra Deniz Ülkesi'ndeki Keppel Adası grubundan ve Avustralya'daki Büyük Set Resifi'ndeki Bindal Deniz Ülkesi'ndeki Davies Resifi'nden toplanan Acropora millepora kolonilerinden elde edilen gametler kullanılarak geliştirilmiştir. Mercanların ve gametlerin tüm toplanması ve kullanımı, ilgili Deniz Ülkelerinin Geleneksel Koruyucularının önceden ve bilgilendirilmiş rızası ile gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma için kullanılan reaktifler ve ekipman Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Yumurtlama öncesi - sistem kontrolleri ve sperm aktivasyon çözeltisi ve kriyodilüslüentin hazırlanması

1. Barkod tarayıcının şarjlı, etkin olduğunu onaylayın ve elektronik tablo verilerini yatay hücre girişi olarak girecek şekilde ayarlayın. Bu ayarı özelleştirmek için barkod okuyucu kullanım kılavuzuna bakın.
2. CASA için mercan sperm aktivasyonu konsantre stok çözeltileri hazırlayın.
   NOT: Aktivasyon çözeltisinin hazırlanması için kimyasallarla çalışırken tek kullanımlık eldivenler giyilmelidir.
   1. 37 ° C'ye ayarlanmış bir tüp ısıtıcısı yardımıyla 4 mL steril saflaştırılmış doku kültürü suyunda 1.5 g BSA'yı çözerek veya tüpü kapalı ellerde tutarak, periyodik olarak hafifçe döndürerek (şişeyi sallamayın) % 30 sığır serum albümini (BSA) stok çözeltisi (5 mL) hazırlayın.
   2. Çözeltiye girdikten sonra, doku kültürü suyu kullanarak son hacme (5 mL) kadar yapın, tüpü tarihle etiketleyin ve "H₂O'da% 30 BSA" olarak işaretleyin.
   3. Buzdolabında (4 °C) 2 haftaya kadar saklayın.
   4. 0.2913 g kafeini 24 mL filtrelenmiş deniz suyunda (FSW) çözerek 60 mM kafein stok çözeltisi (25 mL) hazırlayın.
   5. Çözeltiye girdikten sonra, FSW kullanarak son hacme (25 mL) kadar tamamlayın, tüpü tarihle etiketleyin ve "FSW'de 60 mM kafein" olarak işaretleyin.
   6. Buzdolabında 1 aya kadar saklayın.
      NOT: FSW'de kafeinin maksimum çözünürlüğü yaklaşık 71 mM'dir.
3. ~ 10⁹ sperm / mL'de (FSW'de% 0.9 BSA + 12 mM kafein) sperm örnekleri için sperm aktivasyon çalışma solüsyonu hazırlayın.
   1. 10 mL çalışma çözeltisi için, 2.0 mL 60 mM kafein stok çözeltisi + 0.3 mL %30 BSA stok çözeltisi + 7.7 mL FSW'yi birleştirin.
   2. Tüpü tarih ve "sperm aktivasyon çalışma solüsyonu -% 0.9 BSA + 12 mM kafein" ile etiketleyin.
   3. Her kullanım gününde hazırlayın, oda sıcaklığında (19-30 °C) saklayın ve günün sonunda kullanılmayan solüsyonu atın.
4. Kriyoprotektan çözeltileri (kriyodilentler) hazırlayın. Kriyoprotektan DMSO'yu kullanırken tek kullanımlık eldivenlerin giyildiğinden emin olun.
   NOT: FSW, bir numune içindeki ilk sperm konsantrasyonuna ve kriyoprezerve alikotların istenen nihai sperm konsantrasyonuna bağlı olarak değişen kriyoprotektan konsantrasyonları ile hazırlanır. Kriyoseyrelticiyi hazırlarken, DMSO ilavesinden önce FSW'nin 50 mL'lik tüpe aktarıldığından emin olun.
   1. Yumurtlamadan önce mercanların tutulduğu tank sisteminden ham deniz suyunu toplayın (~ 35 ppt tuzluluk).
   2. Ham deniz suyunu, 0,2 μm pirojenik olmayan membran filtre takılı bir vakum pompasına bağlı bir şişe üstü filtreleme sistemi kullanarak filtreleyin.
   3. ≥2 × 10⁹ sperm / mL için, 50 mL'lik bir tüpte 10 mL DMSO + 40 mL FSW'yi birleştirerek FSW'de% 20 DMSO hazırlayın.
   4. Sperm konsantrasyonu <2 × 10⁹ sperm / mL için, 50 mL'lik bir tüpte 15 mL DMSO + 35 mL FSW'yi birleştirerek FSW'de% 30 DMSO hazırlayın.
   5. Tüpü tarih ve DMSO konsantrasyonu ile etiketleyin, yani %30 DMSO veya %20 DMSO.
   6. Her kullanım gününde hazırlanın, oda sıcaklığında (19-30 °C) saklayın ve her günün sonunda kullanılmayan solüsyonu atın.
      NOT: DMSO ve FSW'nin karıştırılması ekzotermik bir reaksiyon oluşturur ve oda sıcaklığına soğumaya izin vermek için kriyodilasyon kullanımdan çok önce yapılmalıdır. FSW, bu ısı oluşumunu dengelemek için kriyodiyülüentin hazırlanması için 4 °C'de saklanabilir.
5. Termokupl veri kaydediciyi hazırlayın.
   1. Her bir kriyoprezervasyon çalışmasının yaklaşık soğutma hızını ölçmek için, FSW'ye %10 DMSO içeren bir kriyoviyal yerleştirin ve kapaktan bir termokupl probu sokularak sperm numunelerinin yanında kriyoprezervasyon rafının bir numune yuvasına yerleştirin.
   2. Bir termokupl şişesi yapmak için, barkodlu kriyoviyalin kapağında küçük bir delik açın veya eritin ve açıklıktan K tipi veya T tipi bir termokupl yerleştirin. Termokupl prob ucunu, flakon doldurulduğunda numunenin ortasına oturacak şekilde bir seviyeye kadar aşağı itin ve iç flakon duvarı ile teması önlemek için prob ucunu flakonun ortasında tutun. Kapağı kapatın ve termokupl probunu sıcak tutkalla yerinde tutun.
   3. Tek kullanımlık eldivenler giyerek, barkodlu kriyoviali FSW'de kriyoprezervasyon yapılacak sperm örneğinin hacmine eşit% 10 DMSO'luk bir hacimle doldurun.
   4. FSW'de taze% 10 DMSO hazırlayın ve termokupl şişelerini günlük olarak doldurun.

2. Sperm hazırlama ve değerlendirme

1. Hermafrodit türler için (örneğin, Acropora türleri), 3 mL'lik bir transfer pipeti kullanarak su yüzeyinden gamet demetleri toplayın ve bunları 5 mL deniz suyu (10 mL toplam hacim) üzerinde 5 mL gamet demeti oranında etiketli 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
2. Gonokorik türler için, 3 mL'lik bir transfer pipeti kullanarak polip ağzına yakın bir yerden sperm toplayın ve numuneyi etiketli 50 mL'lik bir tüpe yerleştirin, ardından doğrudan adım 2.8'e geçin.
   NOT: Gamet örneklerinin toplanması ve işlenmesi için tek kullanımlık eldivenler gerekli değildir, ancak tercih edilirse giyilebilir. Çapraz kontaminasyonu önlemek için eller tatlı su ile iyice yıkanmalı veya her gamet örneği arasında eldivenler değiştirilmelidir.
3. Hermafrodit türler için, demetler parçalanana kadar numuneyi elinizle hafifçe döndürerek sperm-yumurta demetlerini çalkalayın.
   NOT: Bazı Montipora türlerinin yumurtalarında bir toksin vardır, bu nedenle spermlere zarar vermemek için minimum çalkalama ile yavaşça parçalanmalarına izin verilmelidir.
4. Yumurtaların yüzeye çıkmasına ve spermin yerleşmesine izin vermek için numuneyi bir tüp rafında 2 dakika bekletin (yumurtalar yüzeyde pembe/kahverengi bir tabaka oluşturacak ve tek tek yumurtalar görünecektir; bkz. Şekil 1i).
5. Spermi ayırmak ve kontamine yumurtaları çıkarmak için, 3 mL'lik temiz bir transfer pipeti kullanarak spermi tüpün altından nazikçe aspire edin.
6. Sperm örneğini, yeni bir steril 50 mL santrifüj tüpünün üzerine oturan 100 μm'lik bir hücre süzgecine aktarın. Numune filtreden kolayca akmalıdır. Numune akışını teşvik etmek için filtreye hafifçe vurun ve gerekirse, filtrenin alt tarafından kalan numuneyi toplamak için temiz bir transfer pipeti kullanılabilir. Filtreyi çıkarın, ardından hava değişimine izin vermek için tüpü gevşek bir şekilde kapatın.
7. Filtrelenmiş sperm örneğini koloni kimliği ile etiketleyin ve örneği sperm değerlendirme iş istasyonuna taşıyın.
8. Mercan biyo-bankacılık otomatik veri sayfası dosyasını açın (Ek Dosya 1). Sperm değerlendirme sekmesinde mercan kolonisi meta verilerini girin (AH sütunları).
9. CASA değerlendirmesi için sperm hazırlayın.
   1. Sperm örneğini iyice karıştırın ve 10 μL'lik bir alikotu boş bir 1.8 mL mikrosantrifüj tüpüne çıkarın.
   2. Hemen 10-20 saniye boyunca damla damla 0.390 mL sperm aktivasyon çalışma solüsyonu ekleyin, spermi solüsyona hafifçe karıştırın. Bu, ham sperm konsantrasyonu ~ 2 × 10 9^{sperm /} mL ise CASA değerlendirmesi (~ ×50 10⁶ / mL) için uygun bir konsantrasyon sağlayan (sperm: çözelti, v / v) (veya seyreltme faktörü 40) bir seyreltme oranı verir. Tüpü 5 kez ters çevirin ve solüsyonu tüpün dibine oturtmak için açmadan önce tüp kapağını hafifçe vurun.
      NOT: CASA için sperm konsantrasyonu, doğru sperm takibine izin vermek için 8-50 × 10⁶ / mL aralığında olmalıdır¹⁷. Gerekirse konsantrasyonu azaltmak için ham sperm alikotuna ek sperm aktivasyon çalışma solüsyonu eklenebilir. Seyreltme oranını yeniden hesaplayın ve bu değeri elektronik tabloya girin. Birçok numunenin aynı anda işlenmesi gereken durumlarda, 1.8 mL mikrosantrifüj tüpleri, doğrudan üzerine eklenen 10 μL sperm numunesi alikotu ile 0.390 mL sperm aktivasyon çalışma solüsyonu ile önceden yüklenebilir, daha sonra tüpü 10× ters çevirerek ve açmadan önce tüp kapağını hafifçe vurarak iyice karıştırılabilir.
10. Zuchowicz ve ^ark.17'de tarif edildiği gibi bilgisayar destekli sperm analizi (CASA) kullanarak, bir Makler sayma odasına²⁰ 4 μL aktive sperm süspansiyonu yerleştirerek veya Hagedorn ve ark.4'te tarif edildiği gibi faz kontrast mikroskobu altında görsel değerlendirme ve hemositometre sayımı ile sperm hareketliliğini ve aktive edilmiş numunenin konsantrasyonunu değerlendirin.
    NOT: Makler haznesi ve lamel %70 etanol, ardından damıtılmış su ile iyice temizlenmeli ve numuneler arasında tüy bırakmayan bir mendil ile silinmelidir.
11. CASA değerlendirmesi için kullanılan sperm seyreltme faktörünü girin ve sperm konsantrasyonu (milyon/mL), toplam motilite (%) ve progresif motilite (%) için CASA çıkışlarını otomatik veri sayfasına girin.
    NOT: Ortalama yol hızı (VAP), düz çizgi hızı (VSL) ve eğrisel hız (VCL) dahil olmak üzere ek CASA ölçümleri isteğe bağlı olarak otomatik veri sayfasına dahil edilebilir veya daha sonra kaydedilen CASA dosyalarından alınabilir.
12. Sperm konsantrasyonunu filtrelenmiş sperm örneği tüpüne yazın ve örneği, demet parçalanması ve işlenmesiyle aynı sırayla kriyoprezervasyon iş istasyonuna aktarın.

3. Sperm seyreltme ve kriyoprotektan dengesi

1. Kriyoprezervasyon iş istasyonunda, sperm değerlendirme iş istasyonunun kullandığı aynı mercan biyo-bankacılık otomatik veri sayfası dosyasını açın ve Kriyoprezervasyon sekmesini seçin. Sperm örnek tüpü etiketini kontrol edin ve Koloni Kimliğini (sütun C) kontrol ederek ilgili girişi tanımlayın. İş istasyonları arasında aynı otomatik veri sayfası dosyasına aynı anda erişilmiyorsa, verileri otomatik veri sayfasındaki Koloni Kimliğine (sütun C) ve sperm konsantrasyonuna (sütun F) manuel olarak girin.
2. Serolojik bir pipet kullanarak, numuneyi pipete çekerek ve aynı tüpe geri atarak sperm numunesi hacmini ölçün; E sütunundaki değeri girin.
3. Gerekli kriyoprotektan konsantrasyonu için otomatik hesaplanan sütun I'i ve eklenecek kriyofiltre hacmi için sütun H'yi kontrol edin (Tablo 1).
4. 10 dakikalık bir zamanlayıcı başlatın ve serolojik bir pipet kullanarak, numuneyi sürekli ve nazikçe karıştırarak kriyodilüteni damla damla eklemeye başlayın ve DMSO kullanımı için tek kullanımlık eldivenlerin giyildiğinden emin olun.
5. P sütununda kriyoseyreltici ekleme süresini kaydedin.

Tablo 1: Kriyoprezervasyon yapılacak numunedeki toplam sperm konsantrasyonunun değerlendirilmesine dayalı olarak, mercan sperminin dondurularak saklanması için kriyoseyrelt konsantrasyonu ve seyreltme oranları.

4. Sperm kriyoprezervasyonu

1. Kaç tane kriyoviyalin doldurulacağını belirlemek için K sütununu okuyun. Bu, toplam sperm hacminden ve flakon başına istenen hacimden (çoğu durumda 1 mL) otomatik olarak hesaplanır. 10 dakikalık kuluçka süresi boyunca, 4.2 ila 4.6 arasındaki adımlarla ilerleyin.
2. Steril barkodlu kriyoviallerin kapağını açın ve kapakları temiz/steril bir yüzeye yerleştirin.
3. İsteğe bağlı: Kalıcı bir işaretleyici kullanarak her kriyoviyal üzerine # çalışmasını yazın; Bu, biyobankaya erişim için hızlı numune tanımlamasına yardımcı olabilir.
4. İstenen numune hacmine (1 mL) ayarlanmış bir serolojik pipet ve alikot edici bir pipetleyici kullanarak, numuneleri kapaksız barkodlu kriyoviyallere ve rekapaj şişelerine ayırın.
5. Bir termokupl şişesini ve tüm dolu numune şişelerini oda sıcaklığında boş bir kriyo rafına yerleştirin. Tüm şişelerde barkodlu yüzeyin dışa baktığından emin olun.
6. Gerekirse, tüm boşlukların dolu olduğundan emin olmak için kriyo rafındaki herhangi bir boş alana FSW'de %10 DMSO içeren ek sahte kriyoviyaller yerleştirin.
7. Çalışma numarasını otomatik veri sayfasına (U sütunu) girin ve kriyo rafı seri numarasını (QR kodu) V sütununa tarayın.
8. İmleci Z sütununun doğru hücresine yerleştirin ve termokupl şişesini tarayın, ardından rafa yüklenen tüm kriyoviyal tüpleri (AA sütunundan itibaren) tarayın. Numunenin şişenin dişine girmediğinden emin olmak için rafı yan yatırmaktan kaçının.
9. Tarama sırasında, verilerin doğru hücreye girildiğini ve tüm kriyoviyallerin bir kez tarandığını çapraz kontrol edin.
10. Kriyoprotektan dengeleme süresinin geri kalanı için yüklenmiş ve taranmış rafları bir kenara koyun ve soğutma kabını kriyoprezervasyon için hazırlayın.
11. Kriyo raf soğutma kabını, yaklaşık -20 °C/dk'da soğutma için gerekli olan önceden belirlenmiş uygun seviyeye kadar sıvı nitrojen ile doldurun.
    NOT: Boğulma riski olduğundan nitrojen sadece iyi havalandırılan alanlarda kullanılmalıdır. Sıvı nitrojenle çalışırken kapalı burunlu ayakkabılar, koruyucu gözlükler/yüz siperleri ve kriyo eldivenler giyilmelidir. Sıvı nitrojen kullanımı ve kullanımı hakkında özel bilgiler için kurumsal yönergelere bakın.
12. 10 dakikalık kriyoprotektan dengeleme süresinin sonunda, termokupl probunu veri kaydediciye bağlayın ve kayda başlayın, ardından dolu kriyo rafını yavaşça soğutma kabına yerleştirin ve kapağı uygulayın.
13. Başlangıç zamanını Q sütununa kaydedin.
14. Termokupl şişesi veri kaydedicide -80 °C veya altında okuduğunda, kriyo raf ekini polistiren kutu gibi ayrı bir kapta sıvı nitrojen banyosuna aktararak numuneleri sıvı nitrojen içinde söndürün.
15. Kriyovialleri raftan çıkarın ve biyodepoya taşınmak üzere kuru bir nakliyeciye aktarın.

Bu protokolde özetlenen adımlar, Hagedorn ve ark.4 tarafından tanımlanan mercan spermi kriyoprezervasyonu için orijinal yöntemlere ve ardından Zuchowicz ve ark.6 tarafından yapılan iyileştirmelere dayanmakta ve kriyoprezervasyon ve biyobankacılık için sperm işlemenin verimliliğini artırmak için önemli iyileştirmeler sağlamaktadır. Barkodlu kriyoviallerin ve alikotasyon yapan bir otomatik pipetleyicinin kullanılması, kriyoviyalleri yazdırma ve elle etiketleme ihtiyacını ortadan kaldırarak sperm paketleme prosedürünü basitleştirir ve çok sayıda numuneyi elle pipetleme zorluğunu azaltır. Daha da önemlisi, bu iyileştirmeler kriyoprezervasyon için numune hazırlama için gereken süreyi yaklaşık 8-10 dakikadan 5 dakikanın altına düşürür. CASA'nın kullanımıyla birlikte, bu iyileştirmeler, mercan sperminin verimli biyobankacılığı için gereken personel sayısını, orijinal yöntemlerde 4'ten 6'ya, mevcut protokolü kullanan iki kişiye kadar azaltmaktadır. Ek olarak, barkodlu kriyoviyallerin kullanılması, her tüpün benzersiz bir tanımlayıcıya sahip olduğu anlamına gelir, bu nedenle her biri, toplu olarak yazdırılan etiketler kullanılarak önceki yöntemden daha yüksek çözünürlükle veritabanı içinde izlenebilir.

Avustralya'daki 2022 Great Barrier Reef yumurtlama sezonu sırasında protokolün iki yumurtlama olayında saha testi, iki operatör (CASA için bir kişi, kriyoprezervasyon için bir kişi) tarafından 5 türdeki 57 koloniden 389 numunenin dondurularak saklanması ve biyobankacılığı ile sonuçlandı. Avustralya, Queensland'deki Konomie'de (Kuzey Keppel Adası) Kasım 2022'de yapılan yumurtlama olayı sırasında, 24 Acropora millepora kolonisinden 150 numune, 2 saatlik bir süre boyunca iki operatör tarafından dondurularak saklandı. Bu kadar çok sayıda mercan kolonisinden alınan bu hacimdeki numunelerin verimli bir şekilde işlenmesi ve dondurularak saklanması, öncelikle numune hazırlama süresinde elde edilen verimlilikler ve iş istasyonları arasında basitleştirilmiş meta veri aktarımı ile sağlandı.

Aralık 2023'te yumurtlama sırasında iş akışının daha fazla test edilmesi, mercan spermi için Makler sayma odasının, CASA sistemlerinde yaygın olarak kullanılan, ticari olarak mevcut sabit lamel tek kullanımlık hazne slaytlarına kıyasla daha doğru motilite ve konsantrasyon verileri sağladığını belirledi. Makler sayma odası, 4 μL numune hacmi ve mercan spermi için kullanılan standart CASA ayarları17 ile bilinen bir konsantrasyonda ticari olarak temin edilebilen lateks mikro boncuklar kullanılarak CASA için doğrulanmıştır. Bu analizler, üretici tarafından sağlanan beklenen konsantrasyon aralığına (46.0 ila 7.0 milyon / mL) düşen düşük değişkenliğe (44.5 ±± 0.7 milyon / mL) sahip tutarlı sayımlar gösterdi (Şekil 2). Makler sayma odası ve sabit lamel odası slaytları kullanılarak toplanan Acropora millepora için CASA verilerinin karşılaştırılması, iki oda tipi arasında sperm konsantrasyonu sayımlarında önemli bir fark buldu (P = 0.002; Şekil 2), Makler sayma odası kullanılarak belirlenen konsantrasyonun yarısından daha azını kaydeden sabit lamel haznesi kızakları ile. Bu eğilim, diğer iki mercan türünden alınan sperm örneklerinde de gözlenmiştir (veriler gösterilmemiştir). Aralık 2023'te yapılan testlerde ayrıca, DMSO ile 1:1 seyreltme veya 0 DMSO ile 1:2 seyreltme (sperm: kriyodilüs) kullanılarak dondurularak saklanan örneklerde toplam, hareketli veya aşamalı olarak hareketli spermlerin çözülme sonrası konsantrasyonlarında önemli bir fark bulunmadı (Şekil 3).

Şekil 1: Kriyoprezervasyon için mercan sperminin yarı otomatik işlenmesi için kullanılan iş akışı ve sahada kullanılan mobil ekipman örnekleri. (A) Mercan gamet demetleri, 5 mL FSW üzerinde 5 mL demetler oranında toplanır ve yumurtaları ve spermleri ayırmak için parçalanır (i). Koloni meta verileri otomatik veri sayfasına (ii) girilir ve izole edilen sperm örneği bilgisayar destekli sperm analizi (CASA) (iii) kullanılarak değerlendirilir. FSW'de (iv) veya 0 DMSO ilavesini hesaplamak için sperm kalitesi parametreleri otomatik veri sayfasına eklenir ve seyreltilmiş numune barkodlu kriyoviyallere (v) ayrılır. Kriyovialler kriyo rafına yüklenir ve otomatik veri sayfasına (vi) taranır, ardından -20 °C/dk ila -80 °C (vii) hızında soğutulur. Numuneler daha sonra sıvı nitrojen içinde söndürülür ve Taronga CryoDiversity Bank'a (viii) taşınmak üzere kuru nakliyecilere aktarılır. (B) Konomie Çevre Eğitim Merkezi'ndeki sınıfta uzak bir saha sahasında kurulan CASA (solda) ve kriyoprezervasyon (sağda) istasyonlarının örneği. (C) Avustralya Deniz Bilimleri Enstitüsü Ulusal Deniz Simülatörü'nde birden fazla kriyo rafını çalıştırmak üzere kurulan laboratuvar tabanlı yüksek kapasiteli kriyoprezervasyon istasyonu örneği. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Mercan sperm konsantrasyonunun ölçümü için iki farklı oda slayt seçeneğinin karşılaştırılması. (A) Acropora millepora'da (n = 3 kişi) toplam sperm konsantrasyonu ölçümlerinin Makler sayma odası ve ticari olarak temin edilebilen sabit lamel odası slaytları kullanılarak karşılaştırılması. Sütunlar ortalama ± SEM'i gösterir; yıldız işaretleri önemli bir farkı gösterir (P = 0.002). (B) Mercan spermi için bilinen bir konsantrasyonda ve standart CASA ayarlarında ticari olarak temin edilebilen lateks mikro boncuklar kullanılarak Makler sayma odasının doğrulanması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Dondurularak saklanmış örneklerde toplam, hareketli veya aşamalı olarak hareketli spermin çözülme sonrası konsantrasyonları. Kriyoprezervasyon için nihai% 10 DMSO konsantrasyonunu elde etmek için FSW'de% 20 veya% 30 DMSO kullanılarak toplam, hareketli ve aşamalı olarak hareketli sperm konsantrasyonlarının çözülme sonrası karşılaştırmaları. N = 3 bireyden alınan numuneler, her biri 2 alikota bölündü, bir alikot% 20 DMSO ilavesiyle 1: 1 kriyoprezervasyon ile kriyoprezerve edildi ve ikinci alikot, 1: 2 ilavesi ile FSW kullanılarak <2 × 109 / mL'ye seyreltildi (sperm: kriyodilent)% 30 DMSO. Sütunlar ortalama ± SEM'i gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 1: Mercan biyobankacılık otomatik veri sayfası dosyası. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarlar, beyan edilecek herhangi bir rekabet çıkarı olmadığını bildirmektedir.