Canlı Caenorhabditis elegans'ta Floresan Mikroskobu ile Endojen Yükün Aksonal Taşınmasının Görüntülenmesinin Optimize Edilmesi

Summary

Makale, canlı bir nematoda tek nöron çözünürlüğünde endojen etiketli kargoların aksonal taşınmasını görselleştirmek için floresan mikroskobu edinim parametrelerinin optimizasyonunu açıklamaktadır.

Abstract

Aksonal taşıma, aksonal proteinleri nöronal hücre gövdesindeki sentez bölgelerinden aksondaki hedeflerine ulaştırmak için bir ön koşuldur. Sonuç olarak, aksonal taşıma kaybı nöronal büyümeyi ve fonksiyonu bozar. Aksonal taşımayı incelemek bu nedenle nöronal hücre biyolojisi anlayışımızı geliştirir. CRISPR Cas9 genom düzenlemesindeki son gelişmelerle, aksonal kargoların endojen etiketlemesi erişilebilir hale geldi ve taşımanın ektopik ifade tabanlı görselleştirmesinin ötesine geçilmesini sağladı. Bununla birlikte, endojen etiketleme genellikle düşük sinyal yoğunluğu pahasına gelir ve sağlam veriler elde etmek için optimizasyon stratejileri gerektirir. Burada, yaygın sitoplazmik arka plan üzerinde endojen etiketli kargonun sinyalini iyileştirmek için edinim parametrelerini ve bir ağartma yaklaşımını tartışarak aksonal taşımanın görselleştirilmesini optimize etmek için bir protokol açıklıyoruz. Yeşil floresan protein (GFP) etiketli RAB-3 ile etiketlenmiş sinaptik vezikül öncülerinin (SVP'ler) görselleştirilmesini optimize etmek için protokolümüzü uyguluyoruz ve ince ayar edinim parametrelerinin Caenorhabditis elegans'ta (C. elegans) endojen olarak etiketlenmiş aksonal yükün analizini nasıl iyileştirebileceğini vurguluyoruz.

Introduction

Yaşam boyunca nöronlar, proteinleri, lipitleri ve diğer molekülleri hücre gövdesinden aksondaki nihai hedeflerine iletmek için aksonal taşımaya güvenir. Sonuç olarak, aksonal transportun bozulması, nöronal fonksiyon kaybı ile ilişkilidir ve sıklıkla nörodejeneratif bozuklukların patolojisinde rol oynar ^1,2. Bu nedenle, aksonal taşımanın altında yatan mekanizmaları anlamak büyük ilgi çekmektedir.

Aksonal taşıma üzerine onlarca yıl süren araştırmalar, bu taşımaya aracılık eden moleküler mekanizmalar, bileşimleri ve düzenleyici mekanizmalar hakkında birçok önemli içgörü ortaya çıkardı. Uzun menzilli aksonal taşıma, tipik olarak artı uçları^{akson 3'te} olacak şekilde yönlendirilen kısmen örtüşen mikrotübül polimerlerinden oluşan mikrotübül hücre iskeleti üzerinde meydana gelir. Sonuç olarak, anterograd taşımaya, mikrotübüllerin artı ucuna, kinesinlere yürüyen motor proteinler aracılık ederken, retrograd taşımaya eksi uç yönlü dynein motoruna bağlıdır. Taşımanın birçok yönü ortaya çıkmış olsa da, birçok aksonal protein için, taşıma makinelerine nasıl yüklendikleri, bireysel taşıma paketlerinin nasıl düzenlendiği ve bu taşımanın nasıl düzenlendiği hala belirsizliğini korumaktadır³.

Aksonal taşıma başlangıçta, radyoaktif işaretli amino asitlerin somatik bölmeye enjekte edildiği, burada yeni ortaya çıkan endojen proteinlere dahil edildiği ve zaman içinde aksonal bölmede otoradyografi⁴ ile izlenebildiği radyo etiketleme deneylerinde incelenmiştir. Radyo-etiketleme deneyleri, endojen proteinlerin in vivo olarak aksonal taşınmasının incelenmesine izin vermesine rağmen, mekanik içgörüler elde etmek için bireysel kargonun davranışının doğrudan izlenmesine izin vermez⁴. Bu sınırlama floresan mikroskobu kullanımı ile aşılmıştır. Bununla birlikte, aksonal taşıma genellikle endojen proteinler üzerinde görselleştirilmez, bunun yerine floresan etiketli bir kopyanın ekspresyonu ile görselleştirilir. Özellikle düşük eksprese edilen proteinler için aşırı ekspresyon, tercihen tek nöron çözünürlüğü ile görselleştirmeyi mümkün kılan daha yüksek sinyal yoğunlukları sağlar. Ayrıca, floresan etiketli proteinin ektopik ekspresyonu, genom düzenlemenin ihtiyaç ve zorluklarını ortadan kaldırır. Tersine, ektopik olarak ifade edilen kargonun davranışının, endojen kargonun^{davranışından} farklı olabileceği iddia edilmiştir 5.

Genom düzenlemedeki son gelişmeler, endojen etiketleme stratejilerini daha kolay erişilebilir hale getirdi. Bu nedenle, daha düşük bir sinyal yoğunluğu, bir yükün endojen etiketleme yerine ektopik ekspresyon ile aksonal taşınmasını incelemek için ana sınırlama haline gelmiştir. Edinim koşullarının optimizasyonu ile eşleştirilmiş endojen etiketleme stratejisindeki dikkatli değerlendirmeler bu zorluğun üstesinden gelebilir.

Nematodlar, şeffaflıkları ve genetik manipülasyonlardaki kolaylıkları nedeniyle in vivo aksonal taşımayı incelemek için mükemmel bir araştırma modeli sağlar. Bu protokolde, canlı Caenorhabditis elegans'ta tek nöron rezolüsyonlu endojen proteinlerin aksonal taşınmasını görselleştirmek için bir araştırma stratejisi tanımlanmıştır.Sinaptik vezikül öncülerinin aksonal taşınmasını, vezikülle ilişkili RAB GTPase, RAB3'ün motor nöron^DA9'da endojen olarak GFP ile etiketlendiği Jorgensen Lab 6 tarafından üretilen bir suş kullanarak görselleştiriyoruz. Protokol, farklı edinim parametrelerindeki küçük adaptasyonların ve foto ağartmanın bireysel taşıma olaylarının görselleştirilmesini nasıl iyileştirebileceğini sorarak, görüntüleme koşullarının nasıl optimize edileceğine dair fikirler sunar.

Protocol

Canlı hücre görüntüleme için nematodların nasıl korunacağı ve hazırlanacağı hakkında ayrıntılı bir protokol için, S.Niwa ^7'nin çalışmasına bakın.

1. Solucan suşu üretimi

Nematod suşları üretmeye ek olarak, Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)⁸ , doğrudan web sayfalarından elde edilebilen, endojen olarak floresan olarak etiketlenmiş proteinlere sahip, büyüyen bir nematod suşları koleksiyonu içerir.

1. Floresan etiketleme stratejisinin seçimi
   1. DA9 motor nöronunda RAB-3 etiketli endojen GFP'yi görselleştirmek için rab-3 (ox699) aleli^6'yı içeren nematod suşu MTS1161 kullanın (Suş CGC'de biriktirilecektir). Diğer aksonal proteinleri görselleştirmek için, Mello Lab^9'dan CRISPR Cas9 düzenleme protokolünü kullanarak endojen etiketli bir protein ile bir nematod suşu oluşturun.
      NOT: MTS1161, RAB-3'ü bir GFP etiketi⁶ ile endojen olarak hücreye özel olarak etiketlemek için bir rekombinasyon yaklaşımı kullanır. Yaygın bir alternatif yaklaşım, çoklu bölünmüş floresan kopyalar¹⁰ kullanarak endojen protein başına floresan kopya sayısını arttırdığı için özellikle düşük eksprese edilen proteinler için önerilen bir bölünmüş floresan proteinin yeniden yapılandırılmasına dayanır. Kopya sayısı başlangıçta CenGen web sayfasındaki transkriptom veri kümelerine dayalı olarak tahmin edilebilir (https://cengen.shinyapps.io/CengenApp/) ¹¹.
2. Aksonal taşımayı görselleştirmek için nöron seçimi
   1. Suş MTS1161, motor nöron DA9'da RAB-3'ü görselleştirin (bkz. Şekil 1). Diğer aksonal kargolar, özellikle düşük eksprese edilen proteinler için, CenGen web sayfasını kullanarak analiz edilen proteinin ekspresyon seviyelerinin en yüksek olduğu bir nöron tanımlayın.
      NOT: CenGen projesi (cengen.org), C. elegans sinir sisteminin 302 nöronunun tümünü kapsayan geniş bir transkriptomik veri setine dayalı olarak nematodun birçok nöronunda ilgilenilen bir proteinin ekspresyon seviyelerini tahmin etmek için harika bir çevrimiçi kaynak sağlar^12,13.

2. Solucan işleme ve görüntüleme için hazırlık

1. Nematodları, 20 ° C'de nematod büyüme ortamı plakalarına ekilen ve görüntüleme için yetişkinliğe kadar 1 günlük bir yaşa kadar büyütülen bir bakteri çimi (suş: OP50) üzerinde tutun.
   NOT: Farklı aksonal kargolar, nöron sınıfları ve organizmalar arasında yaşlanma ile birlikte taşıma oranları sürekli olarak azaldığından, tanımlanmış bir yaş aşamasında aksonal taşınmanın ölçülmesi önemlidir 14,15,16,17,18-Larva evresi L4 veya yetişkinliğe 1 gün kala nematodlar çoğu makalede kullanılmıştır ve bu nedenle karşılaştırmalar için en büyük veri kümelerini sunar.
2. Canlı hücre görüntüleme için nematodları hazırlayın: Solucanları görselleştirmek ve işlemek için sonraki tüm adımları bir stereo mikroskopla gerçekleştirin.
   1. Nematodları bir platin tel çekme kullanarak 0,5 mM Levamizol'lük bir damlacığa aktarın ve nematodları damlacık içinde 20 dakika inkübe edin.
   2. Levamizol damlacığından 10-20 nematodları, bir saç penası kullanarak bir cam slayt üzerinde% 10 agaroz (M9 ortamında çözülmüş) bir yama üzerinde 12 μL'lik bir M9 ortamı damlasına dikkatlice monte edin. % 10'luk bir agaroz yamasının nasıl yapılacağına dair ayrıntılı bir prosedür için, S.Niwa⁷ protokolüne bakın.
      NOT: Hayvanlar hipoksiden muzdarip olmaya başlamadan önce slayt başına yalnızca birkaç hayvan görüntüleneceğinden, düşük sayıda nematod monte etmek yeterlidir.
   3. Damlacığın üzerine bir kapak fişi yerleştirin (22 mm x 22 mm veya 18 mm x 18 mm). DA9 aksonunda görüntüleme aktarımı için, aksonu kapak kızağına yakın konumlandırın. Bunu yapmak için, hayvanları sırt üstü yuvarlamak için kapak kızağını agar yamasının üzerine yerleştirdikten sonra 45° döndürün.
   4. Kapak sürgüsü ile cam sürgü arasındaki boşluğu vazelin gibi viskoz bir jel ile kapatın. Bu, agaroz yamasının kurumasını önleyecektir, bu da nematodların görüntüleme alanından dışarı çıkmasına neden olabilir.
      NOT: Hayvanlara mümkün olduğunca nazik davranmak çok önemlidir. Çok yüksek konsantrasyonlarda levamisol veya solucana verilen fiziksel hasar, aksonal taşımayı bozabilir. Görüntüleme seansı sırasında kuyruğun hafif seğirmesi, hayvanın sağlıklı bir durumda kaldığına dair iyi bir işarettir. Hayvanlar sağlıklı kalır ve görüntüleme seansından sonra agaroz yamasından bile iyileşebilirler.

3. Canlı hücre mikroskobu

NOT: Tam alım parametresi değerleri mikroskoplar arasında farklılık gösterebilir. Bununla birlikte, her bir edinim parametresi için eğilimler, kullanılan mikroskoptan bağımsız olmalıdır. Bu protokolde, ağartma için ayrı bir lazer hattı ile donatılmış bir eğirme diskli konfokal mikroskop kullanıldı (mikroskopla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız). Yeşil floresan 488 nm'lik bir lazerle uyarıldı ve emisyon bir ET525/36 emisyon filtresi ile filtrelendi. Beyazlatma işlemi 488 nm lazer çizgisi kullanılarak yapıldı.

1. Odanın sıcaklığının veya sıcaklık kontrollü bir aşama mevcutsa, sabit bir sıcaklığa ayarlandığından emin olun. Nematodlar için sıcaklığı 20 °C'ye ayarlayın.
2. Slaytı monte edin ve slayttaki nematodları bulmak ve konumları ezberlemek için 4x-20x büyütmeli objektif lens kullanın. Görüntü elde etmek için 63x büyütme lensine geçin.
3. İlk alım parametrelerini kontrol etmek için tek bir görüntü çekin. Alım yazılımının yoğunluk histogramı ile görüş alanındaki sinyal yoğunluklarını takip edin. Yoğunluk değerleri, kameranın algılayabileceği maksimum sinyalin en düşük üçte birlik kısmını kapsamalıdır. Piksel doygunluğundan kaçının. Sinyal yoğunluğu çok düşükse, uyarma lazerinin yoğunluğunu artırın.
   NOT: Hızlandırılmış çekim sırasında floresan proteini ağarttığı için çok yüksek uyarma lazer yoğunlukları kullanmayın.
4. Floresan sinyali algılamayı optimize etmek için alım parametresini ve buradaki adımları değiştirin.
   1. Ağartma adımının uygulanması: Ağartma adımı için 488 nm lazer (güç: 15 mW) hattı kullanarak analiz edilecek akson bölgesini ağartın. En az %90'lık bir ağartma verimliliği hedefleyin. Beyazlatma adımından önce ve sonra bölgenin sinyal yoğunluğunu karşılaştırarak beyazlatma verimliliğini belirleyin.
      NOT: Ağartma, sabit parçacıklardan türetilen sinyalin yanı sıra arka plandaki proteinin sitoplazmik fraksiyonundan türetilen sinyalden türetilen sinyali düşürerek hareketli parçacıkların sinyalini geliştirir. Sinaptik vezikül öncüleri üzerindeki RAB-3 gibi membranöz kargo, düşük bir sitoplazmik fraksiyona sahiptir, böylece ağartma aşaması, taşıma paketinin sitoplazmik arka plan üzerindeki sinyalini sadece hafifçe iyileştirir (Şekil 2A, D). Bununla birlikte, ağartma, bireysel taşıma olaylarının daha uzun mesafelerde izlenmesini iyileştirir ve duraklama sürelerinin ölçülmesine izin verir (Şekil 2A).
   2. Gruplama: Bireysel taşıma olaylarının sinyal yoğunluğunu artırmak için 2 x 2 gruplama kullanın. Gruplama, piksel dizilerini daha büyük bir pikselde birleştirir. Bu, uzamsal çözünürlüğü azaltacak, ancak bireysel taşıma olaylarının sinyal yoğunluğunu artıracaktır ve özellikle loş parçacıklar için yararlıdır (Şekil 2B,D).
   3. Pozlama süresi: Sinyal yoğunluğunu artırmak için pozlama süresini artırın. Maruz kalma süresinin arttırılması, numunenin sinyal yoğunluğunu, taşıma olayları için daha düşük bir zamansal çözünürlük elde etme maliyetine kadar artırır. Buradaki deney için, RAB-3'ün bireysel taşıma olaylarını takip etmek için ardışık zaman noktaları (100-500 ms maruz kalma süresi) arasında 300 ms ila 700 ms arasında bir zamansal çözünürlük kullanın. (Şekil 2C,D)
5. Hızlandırılmış kayıt: Proteinin sinyal yoğunluğuna ve bireysel taşıma olaylarının sıklığına bağlı olarak en az 1-3 dakikalık bir zaman atlaması yapın. Bir zaman atlaması kaydedildikten sonra bir sonraki hayvana geçin. Kaydedilen hayvanların sağlıklı bir durumda olduğundan emin olmak için slayttaki hayvanlar 30 dakikadan fazla görüntülenmemelidir.
   NOT: Kayıt sırasında hayvanların kuyruğunun hafif seğirmesi, hayvanın hala hayatta olduğunun bir göstergesidir.

4. Aksonal taşıma verilerinin analizi

NOT: Sonraki görüntü analizi adımları için ImageJ/Fiji^19'u kullanın. Fiji, tüm yaygın mikroskopi yazılım paketleri ile veri okuyabilir.

1. Kymograph üretimi
   1. Verileri içe aktar: Hızlandırılmış veri dosyasını Fiji'ye aktarın. Verileri Fiji'ye alamaması durumunda, zaman kaydını yazılım paketinden bir tiff dosyası olarak dışa aktarın ve daha sonra Fiji'ye yükleyin.
   2. Sapma düzeltmesi: Görüntü alımı sırasında hayvan/akson segmentinin hareket edip etmediğini veya hafifçe sürüklenip sürüklenmediğini kontrol edin. StackReg²⁰ eklentisini çalıştırarak hayvan hareketini veya sürüklenmeyi düzeltin. Eklentiyi çalıştırırken Katı Gövde dönüşümünü seçin.
   3. Bir kymograph'ın manuel olarak oluşturulması: Şekil 3'te ayrıntılı bir adım adım prosedür verilmiştir. Kymografı oluşturmak için sapma düzeltmeli filmi kullanın. Segmentli Çizgi aracını kullanın ve analiz edilecek akson segmenti boyunca bir çizgi çizmek için segmentli çizgi simgesine farenin sol tuşu ile çift tıklayarak çizgi genişliğini akson çapına uyacak şekilde ayarlayın. Kymografı oluşturmak için ImageJ/Fiji eklentisi Kymoreslicewide'ı çalıştırın ve parametre ayarlarında çizginin genişliği boyunca maksimum yoğunluk değerini kullanın.
      NOT: Çizgi çizim yönünde tutarlılığı korumak (örneğin, her zaman distal aksona yakın veya ters), kymograflarda geri hareket yönünün izlenmesini basitleştirir.
2. Taşıma parametresinin analizi
   1. Taşıma parametresini hesaplayın: sonraki adımları izleyerek kymograftan olay numarası, hız, çalışma uzunluğu ve duraklama süresi.
      1. Kymograph'ta taşıma olaylarını izleme: Kymograph'ta tek tek taşıma olaylarını izlemek için Düz Çizgi aracını kullanın. Her satırı ROI yöneticisine kaydedin ve tüm taşıma olaylarını kymograph'ta izleyin. ImageJ/Fiji'de aşağıdaki ölçüm parametrelerini seçin: Alan, Sınırlayıcı dikdörtgen, Ortalama gri değer, Feret çapı.
      2. Aktarım parametresini hesapla: Sonuçlar tablosunu bir elektronik tabloya yapıştırın ve hesaplamak için sonuç bölümlerinin aşağıdaki sütunlarını kullanın:
         Çalışma uzunluğu: Çalışma uzunluğunu μm cinsinden belirlemek için genişliği (piksel cinsinden) kameranın çözünürlüğüyle (ör. x μm/pxl) çarpın.
         Hız: Koşu uzunluğu/Koşu süresi. Bir hareket olayının süresini saniye cinsinden belirlemek için, yüksekliği (piksel cinsinden) ardışık zaman noktaları (ör. x s/piksel) arasındaki alım süresiyle çarpın.
         Duraklatma süresi: Hızın 0 olduğu iki ardışık hareket arasındaki çalışma süresi.
         Olay sayısı: Toplam olaylar, dakika başına olay sayısını ve akson uzunluğu segmentini belirlemek için kymografın toplam uzunluğuna normalleştirilebilir. Olaylar ayrıca anterograd ve retrograd taşıma olayları olarak kategorize edilebilir. Her hareket olayının yönlülüğünü belirlemek için Feret Açısı aracını kullanın. Başlangıçta proksimal ve distal olmak üzere parçalı çizginin çizilmesi ile oluşturulan ve kimografideki anterograd transport olaylarının sağdan sola doğru gösterildiği kymograflarda, 90°90° retrograd bir olayı gösterecektir, aksi takdirde tersi olacaktır.

Results

Model sistemine ve ölçüm prosedürüne genel bakış
Sinaptik vezikül öncüllerinin aksonal taşınmasını görselleştirmek için, endojen olarak GFP etiketli RAB-3'ü izledik. Burada, bir hücreye özgü promotör (glr-4p) altındaki rekombinaz Flippase ekspresyonunun, DA9 motor nöronunda endojen RAB-3'ü etiketlediği, yakın zamanda oluşturulan bir GFP::Flip-on::RAB-3 suşu^6'yı kullanıyoruz. DA9 bipolar bir motor nörondur ve hücre gövdesi hayvanın arka tarafında, ventral tarafta, anüse yakın bir yerde bulunur (Şekil 1A). Ventral sinir kordonu boyunca öne doğru uzanan kısa bir dendrit ve arkaya doğru uzanan uzun bir akson içerir, bir komissür oluşturur ve daha sonra dorsal kas ve VD nöronunu innerve eden en passan sinapslar oluşturduğu dorsal sinir kordonu boyunca öne doğru ilerler 22,23,24. Asinaptik bölgede aksonal taşımayı görselleştiriyoruz; çoğu taşıma olayı tek bir odak düzlemi ile yakalanabilir (Şekil 1A). Bu bölgedeki sabit veziküllerin arka planını azaltmak için bir ilk foto-ağartma adımı uygulanır ve bu genellikle bu bölgede duraklama eğilimindedir (Şekil 1B). Hızlandırılmış videolar 3 dakika boyunca kaydedilir ve asinaptik bölge boyunca RAB-3 sinyali, bireysel taşıma olaylarını çıkarmak için bir kimografa çizilir (Şekil 1C).

Aksonal taşıma görselleştirmesini optimize etmek için edinme parametresinin ayarlanması
Birçok endojen floresan etiketli proteinin düşük sinyal yoğunluğunun üstesinden gelmek için, mikroskobun edinim parametrelerinin optimize edilmesi gerekir. Taşıma olaylarının sağlam bir şekilde ölçülmesi için, bireysel taşıma olaylarının sinyal yoğunluğunun, sitoplazmik arka plan veya duraklayan, sabit kargo üzerinde mümkün olduğunca parlak olması gerekir. Sinaptik vezikül öncüleri genellikle asinaptik bölgede farklı vezikül havuzlarında duraklar, bu da yeni gelen veziküllerin tespitine müdahale eder ve taşıma izlerini takip etmeyi zorlaştırır⁷.

Tek bir ilk floresan ağartma adımı, yeni gelen veziküllerin hareket tespitini geliştirmek için vezikül havuzlarından türetilen floresan sinyalini güçlü bir şekilde azaltabilir (Şekil 2A). Ağartma adımı, muhtemelen RAB-3'ün sitoplazmik fraksiyonunun çok düşük olması nedeniyle, sitoplazmik arka plan yoğunluğu üzerinde hareket eden RAB-3 veziküllerinin sinyalini sadece hafifçe arttırdı (Şekil 2D).

Gruplama kullanımı, bir piksel dizisini tek bir pikselde birleştirerek tek tek taşıma olaylarının arka planı üzerindeki sinyali iyileştirmek için ek bir katman sağlar. 2 x 2'lik bir gruplama, uzamsal çözünürlüğü yarıya indirecektir (burada 108.33 nm/pikselden 216.7 nm/piksele), bu da tek tek RAB-3 taşıma parçacıklarını izlemek için hala yeterlidir (Şekil 2B), ancak tek tek veziküllerin sinyal yoğunluğunu güçlü bir şekilde iyileştirir (Şekil 2D). Çok yüksek uzamsal çözünürlük gerekmedikçe, diğer birçok aksonal kargoyu görselleştirmek için gruplama da uygulanabilir.

Daha sonra, maruz kalma süresindeki değişikliklerin tek taşıma olaylarının sinyal yoğunluğunu nasıl iyileştirebileceğini sorduk. Özellikle, sonraki görüntüleme zaman noktaları arasında 700 ms ile 500 ms'ye kadar maruz kalma süresinin, sinaptik vezikül öncülerinin izlenebileceği zamansal bir çözünürlük sağladığını göstermek için analize maruz kalma süresini dahil ettik (Şekil 2C, D).

Fiji ile kimografi oluşturma ve analiz etme
Bir kymograf oluşturmak ve bireysel taşıma olaylarını analiz etmek için Şekil 3'teki adımları izleyin.

Şekil 1: Endojen floresan RAB-3'ün aksonal taşınmasını görselleştirmek için model sistemine genel bakış. (A) Üst panel: Belirtilen arka-ön ve ventral-dorsal eksen ile nematodun genel görünümü. Motor nöron DA9 mavi olarak etiketlenmiştir. Orta panel: Belirtilen DA9 bölümlendirmesi ile üst panelde gösterilen kutulu bölgeyi yakınlaştırın. En passant sinapslar yeşil renkle gösterilmiştir, * anüsü gösterir. Aksonun vulvayı geçene kadar dorsal sinir kordonunda devam ettiğini unutmayın. Kırmızı kutu, asinaptik bölgenin bölgesini gösterir. Alt panel: Tek bir odak düzleminde proksimal aksonda RAB-3 işaretli endojen GFP'nin konfokal mikroskopi görüntüsü. Çoğu RAB-3 sinaptik bölgede kümelenmesine rağmen, asinaptik bölgede daha uzun duraklayan RAB-3 vezikül lavaboları olduğunu unutmayın. Asinaptik bölge kırmızı renkle kutulanmıştır. Ölçek: 20 μm. (B) Aksonal taşımayı görselleştirmek için hızlandırılmış bir kaydın temsili görüntüleri. Bireysel taşıma parçacıklarının sabit parçacıklar üzerinde izlenebilirliğini artırmak için, asinaptik bölge başlangıçta foto-ağartılır. Mor kutulu bölgedeki alt paneller, anterograd (turuncu ok ucu) ve retrograd (mavi ok ucu) hareket olayının bir örneğini göstermektedir. Yukarıdan aşağıya paneller ardışık zaman noktalarını temsil eder. (C) (B)'deki hızlandırılmış kayıt, bir kimograf (konum üzerinden zamanın 2D temsili) olarak çizildi. Çapraz çizgiler, eğimin hızı gösterdiği hareket olaylarını temsil eder. Dikey çizgiler durağan olayları gösterir. Mor kutu, (B)'de de gösterilen taşıma olaylarını vurgulamak için kimografinin yakınlaştırılmasıdır ve anterograd (turuncu) ve retrograd (mavi) taşıma olayları izlenir. Kesikli dikey çizgiler duraklama olaylarını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Endojen aksonal yükün görselleştirilmesini iyileştirmek için edinim adımlarının ve parametrelerinin optimize edilmesi. Endojen GFP::RAB-3, DA9 aksonunun asinaptik bölgesinde görüntülendi ve konfokal eğirme diski mikroskobu üzerinde tek bir odak düzleminin görüntülerini aldı. Kimografiler, anterograd (sağdan sola) ve retrograd (soldan sağa) yönde (A-C) bireysel taşıma olaylarını görselleştirmek için elde edildi. (A) Kymograflar, RAB3 taşıma olaylarını (sol kimografiler) olmadan veya entegre bir ağartma adımıyla gösterir. Ağartma adımının, ardışık taşıma olayları (turuncu ok uçları) arasındaki duraklatma olaylarının (sarı ok başlarıyla gösterilir) görselleştirilmesini iyileştirdiğini unutmayın. (B) 2 x 2 gruplamanın uygulanması, zayıf RAB3 taşıma olaylarının sinyal yoğunluğunun iyileştirilmesine yardımcı olur. Görüntüler 300 ms pozlama süresinde elde edilmiştir ve (C) pozlama süresinin kademeli olarak artırılması (en solda 100 ms'den en sağda 500 ms'ye), bireysel taşıma olaylarının sinyal yoğunluğunun iyileştirilmesine yardımcı olur. Görüntüler 2 x 2 gruplamada ve ilk foto ağartma adımı kullanılarak elde edildi. Tüm kymograflar toplam 3 dakikalık bir süre gösterir ve aynı ölçekte çizilir, böylece ardışık görüntüleme noktaları arasındaki daha uzun zaman aralığı nedeniyle daha az çekim zaman noktasına sahip kymografların toplam kymograf uzunluğu daha kısadır. (D) (AC)'deki kimograflardan arka plan floresansının çıkarılmasından sonra taşıma olayı başına sinyal yoğunluğunun ölçülmesi. Gruplama ve fotoğraf ağartma adımının 300 ms pozlama süresinde elde edildiğini unutmayın. 100 ms (n_olay= 27_hayvan= 2), 200 ms (n_olay= 30 n_hayvan= 2), 300 ms (n_olay= 88 n_hayvan= 6), 500 ms (n_olay= 12_{n hayvanda}= 1), (w.o.) gruplamasız 300 ms_(n olay= 31_hayvanda= 3), 300 ms (w) gruplamalı (n_olay= 88_{n hayvanda}= 6) ve 300 ms, Ağartma ile 2 x 2 gruplama (n_olay= n_hayvanda = 88) ve ağartma olmadan. Her veri noktası, rastgele seçilen izi boyunca tek bir zaman noktasında arka plan (aksonun sitoplazması) çıkarılmasından sonra bireysel bir RAB-3 taşıma olayının sinyal yoğunluğunu temsil eder. Maruz kalma süresi bir Kruskal-Wallis testi kullanılarak karşılaştırıldı, ardından Dunn'ın çoklu karşılaştırması, gruplama ve foto ağartma, ikili bir Mann-Whitney testi kullanılarak karşılaştırıldı. Hata çubukları standart sapmayı gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Bir kimografi oluşturmak ve bireysel taşıma olaylarını ölçmek için adım adım prosedür. (A) Video kaydını Fiji'ye yükledikten sonra, analiz edilecek olan aksonal segmentin uzunluğu boyunca bir çizgi izlemek için segmentli çizgi aracı kullanılır. (B) Sol panelde gösterilen parametrelerle Kymoreslicewide eklentisi kullanılarak bir kymograf (sağ panel) oluşturulur. (C) Bireysel taşıma olayları, doğrusal çizgi aracıyla izlenir ve ROI yöneticisine saklanır. Sağdaki panel, sonuç tablosunu oluşturmak için kullanılan ölçüm ayarlarını gösterir. (D) Tablodaki sonuçlar taşıma parametresini hesaplamak için kullanılır. Kutular, protokolün yöntemler bölümünde açıklanan önemli parametreleri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Yöntemin sınırlılıkları ve alternatif yöntemler
Bu protokolde, sinaptik vezikül öncüleri ile ilişkili olan endojen olarak etiketlenmiş RAB-3'ün aksonal taşınmasını görselleştirmek için edinim parametrelerini optimize ettik. RAB-3'ü görselleştirmek için, yakın zamanda yayınlanan bir FLIP-on::GFP::RAB-3 suşu^6'yı kullandık ve rekombinaz Flippaze'yi hücreye özgü bir promotör (glr-4p)²⁵ altında ifade ettik. Bu strateji, RAB-3'ü tek bir GFP floroforu ile etiketlememizi sağlar. RAB-3'ün görselleştirilmesi nispeten kolaydır, çünkü sinaptik vezikül öncüleri üzerinde yüksek oranda eksprese edilir ve güçlü bir şekilde zenginleştirilir, böylece bireysel taşıma olayları, sitoplazmik arka plandan türetilen düşük bir sinyal üzerinde parlak bir sinyal yoğunluğuna sahiptir. Diğer aksonal proteinler, taşıma olaylarının görselleştirilmesini sağlamak için mikroskopi ayarlarının dışında ek optimizasyon stratejileri gerektirebilir. Özellikle düşük eksprese edilen proteinler için, split-GFP sistemi harika bir alternatif sunar. Bu sistemde, GFP₁₁, ilgilenilen proteinin endojen lokusuna yerleştirilir ve GFP_1-10, hücreye özgü bir promotörden eksprese edilir. Bu sistemin büyük bir avantajı, genomik olarak yerleştirilmesi gereken DNA onarım şablonunun (yaklaşık 70 nükleotid) küçük boyutudur, bu da homolog rekombinasyonu tüm floresan etiketinin^26,27 ORF'sinin yerleştirilmesine kıyasla daha verimli hale getirir. Küçük boyutu nedeniyle, endojen proteine birden fazla GFP₁₁ fragmanı eklenebilir, bu da protein başına sulandırılmış GFP floroforlarının sayısını arttırır ve böylece endojen proteinin ve dolayısıyla taşıma paketinin²⁸ floresan sinyalini arttırır.

Proteinin bölünmüş GFP veya GFP yaklaşımıyla etiketlenmesine ek olarak, yakın zamanda karşılaştırılan fotokimyasal özellikleri ile ilgili benzersiz avantaj ve dezavantajlara sahip genetik olarak kodlanmış diğer floroforlar da kullanılabilir²⁹. Ayrıca, daha fazla fotolanabilir özelliklere sahip kimyasal floroforlar, ilgilenilen proteini bir HALO veya SNAP etiketi³⁰ ile endojen olarak etiketleyerek kullanılabilir.

Özellikle tüm akson boyunca bol miktarda bulunan sitoplazmik proteinler için koşullu bir etiketleme yaklaşımı gerekli olabilir. Son zamanlarda, yalnızca yeni sentezlenmiş spektrin proteinlerini görselleştirmek için zamansal olarak kontrol edilen etiketleme kullanarak floresan mikroskobu ile böyle bir kargoyu, endojen spektrini görselleştirdik. Tek nöron çözünürlüğü ile koşullu etiketleme için, bir rekombinazın ısı şoku güdümlü ifadesini bir bölünmüş GFP sistemi³¹ ile birleştirdik.

Araştırma amacı organellerin taşınmasını anlamayı amaçlıyorsa, organel ile ilişkili bir protein alanının ifadesi, tam uzunluktaki proteinin ektopik olarak ifade edilmesine bir alternatif sağlayabilir.

Protokoldeki kritik adımlar
Beklenen ekspresyon seviyelerine dayalı olarak proteinin görselleştirilmesini optimize etmek ve en uygun etiketleme stratejisini seçmek için dikkatli bir hazırlık, endojen etiketli proteinlerin başarılı bir şekilde görselleştirilmesi için özellikle kritik öneme sahiptir. Birçok nörondaki çoğu protein için ekspresyon seviyeleri, Cengen^13'ten alınan transkriptomik veri setine dayanarak tahmin edilebilir. Düşük eksprese edilen veya sitoplazmik proteinler için taşıma olaylarının beklenen düşük sinyal yoğunluğu, floroforun birden fazla kopyasının eklenmesiyle iyileştirilebilir. Bununla birlikte, herhangi bir etiketleme deneyinde, etiketli proteinin işlevini bozmamaya özen gösterilmesi gerektiğini unutmayın. Karşılık gelen mutant için bilinen bir fenotip olması durumunda, etiketlemenin bu fenotipi oluşturmadığını doğrulamak önemlidir. Bilinen bir fenotipin olmadığı durumlarda, duruma göre değişecek alternatif yaklaşımlar gereklidir.

Aksonal transport olaylarının görüntülenmesinde kritik bir adım, hayvanın sağlık durumudur. Hayvanlara, görüntüleme sırasında olduğu kadar görüntü hazırlama için de mümkün olduğunca nazik davranılmalıdır (örneğin, felçli hayvanları transfer etmek için metal tel yerine kıl kıracağı kullanılması, felç edici ajanda kuluçka süresinin en aza indirilmesi, fototoksisiteyi önlemek için görüntüleme süresinin en aza indirilmesi).

Değişiklikler ve sorun giderme
Endojen proteinlerin aksonal transport görselleştirmesini optimize etmeyi amaçlasak da, edinim parametreleri için optimizasyon stratejileri ektopik eksprese edilen proteinler için de geçerlidir. Özellikle endojen ekspresyon seviyeleri taşıma olaylarını görselleştirmek için çok düşükse, proteinin ektopik ekspresyonu bir alternatif sağlayabilir.

Endojen işaretli proteinin güçlü sinyal yoğunluğuna rağmen herhangi bir taşıma olayı kaydedilemezse, hayvanlar sağlıksız bir durumda olabilir. Bu, hayvanları daha yumuşak hazırlık prosedürleri altında mikroskopi için hazırlayarak çözülebilir (örneğin, felç edici ajandaki kuluçka süresini azaltın). Alternatif olarak, aktarım olayları nadir olabilir ve olayları yakalamak için 3 dakikalık bir video kaydı yeterli olmayabilir. Nadir taşıma olaylarının yakalanması, video kaydının süresinin artırılması, görüntülenen hayvanların sayısının artırılması veya hayvanların taşıma olaylarının daha sık olabileceği farklı bir gelişim aşamasında görüntülenmesi yoluyla optimize edilebilir.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Kapak fişleri (22 mm x 22 mm, No1); Altın Mühür Kapak Camı	Thomas Scientific	6672A14
Levamisol	ChemCruz	sc-205730
Mikroskop: Nikon Ti2 ters mikroskop, Yokogawa CSU-W1 SoRa Tarama Kafası, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS kamera, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA yağa daldırma objektifi, ET525/36 emisyon filtreli 488nm'de Nikon fotostimülasyon tarayıcısı	Nikon		Eğirme Diski Konfokal Mikroskop
Nikon Ti2 için NIS elemanları AR	Nikon		Yazılımı
Düz önceden temizlenmiş mikroskopi slaytları	Thermo Scientific	420-004T
Nematod suşu	Tanımlayıcı	Kaynak
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)	MTS1161	CGC'ye yatırılacak (https://cgc.umn.edu/)