Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Canlı Caenorhabditis elegans'ta Floresan Mikroskobu ile Endojen Yükün Aksonal Taşınmasının Görüntülenmesinin Optimize Edilmesi

1.7K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/66236

⸱

16 Şubat 2024

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Yale School of Medicine

Bu makalede

Özet

Makale, canlı bir nematoda tek nöron çözünürlüğünde endojen etiketli kargoların aksonal taşınmasını görselleştirmek için floresan mikroskobu edinim parametrelerinin optimizasyonunu açıklamaktadır.

Özet

Aksonal taşıma, aksonal proteinleri nöronal hücre gövdesindeki sentez bölgelerinden aksondaki hedeflerine ulaştırmak için bir ön koşuldur. Sonuç olarak, aksonal taşıma kaybı nöronal büyümeyi ve fonksiyonu bozar. Aksonal taşımayı incelemek bu nedenle nöronal hücre biyolojisi anlayışımızı geliştirir. CRISPR Cas9 genom düzenlemesindeki son gelişmelerle, aksonal kargoların endojen etiketlemesi erişilebilir hale geldi ve taşımanın ektopik ifade tabanlı görselleştirmesinin ötesine geçilmesini sağladı. Bununla birlikte, endojen etiketleme genellikle düşük sinyal yoğunluğu pahasına gelir ve sağlam veriler elde etmek için optimizasyon stratejileri gerektirir. Burada, yaygın sitoplazmik arka plan üzerinde endojen etiketli kargonun sinyalini iyileştirmek için edinim parametrelerini ve bir ağartma yaklaşımını tartışarak aksonal taşımanın görselleştirilmesini optimize etmek için bir protokol açıklıyoruz. Yeşil floresan protein (GFP) etiketli RAB-3 ile etiketlenmiş sinaptik vezikül öncülerinin (SVP'ler) görselleştirilmesini optimize etmek için protokolümüzü uyguluyoruz ve ince ayar edinim parametrelerinin Caenorhabditis elegans'ta (C. elegans) endojen olarak etiketlenmiş aksonal yükün analizini nasıl iyileştirebileceğini vurguluyoruz.

Giriş

Yaşam boyunca nöronlar, proteinleri, lipitleri ve diğer molekülleri hücre gövdesinden aksondaki nihai hedeflerine iletmek için aksonal taşımaya güvenir. Sonuç olarak, aksonal transportun bozulması, nöronal fonksiyon kaybı ile ilişkilidir ve sıklıkla nörodejeneratif bozuklukların patolojisinde rol oynar 1,2. Bu nedenle, aksonal taşımanın altında yatan mekanizmaları anlamak büyük ilgi çekmektedir.

Aksonal taşıma üzerine onlarca yıl süren araştırmalar, bu taşımaya aracılık eden moleküler mekanizmalar, bileşimleri ve düzenleyici mekanizmalar hakkında birçok önemli içgörü ortaya çıkardı. Uzun menzilli aksonal taşıma, tipik olarak artı uçlarıakson 3'te olacak şekilde yönlendirilen kısmen örtüşen mikrotübül polimerlerinden oluşan mikrotübül hücre iskeleti üzerinde meydana gelir. Sonuç olarak, anterograd taşımaya, mikrotübüllerin artı ucuna, kinesinlere yürüyen motor proteinler aracılık ederken, retrograd taşımaya eksi uç yönlü dynein motoruna bağlıdır. Taşımanın birçok yönü ortaya çıkmış olsa da, birçok aksonal protein için, taşıma makinelerine nasıl yüklendikleri, bireysel taşıma paketlerinin nasıl düzenlendiği ve bu taşımanın nasıl düzenlendiği hala belirsizliğini korumaktadır3.

Aksonal taşıma başlangıçta, radyoaktif işaretli amino asitlerin somatik bölmeye enjekte edildiği, burada yeni ortaya çıkan endojen proteinlere dahil edildiği ve zaman içinde aksonal bölmede otoradyografi4 ile izlenebildiği radyo etiketleme deneylerinde incelenmiştir. Radyo-etiketleme deneyleri, endojen proteinlerin in vivo olarak aksonal taşınmasının incelenmesine izin vermesine rağmen, mekanik içgörüler elde etmek için bireysel kargonun davranışının doğrudan izlenmesine izin vermez4. Bu sınırlama floresan mikroskobu kullanımı ile aşılmıştır. Bununla birlikte, aksonal taşıma genellikle endojen proteinler üzerinde görselleştirilmez, bunun yerine floresan etiketli bir kopyanın ekspresyonu ile görselleştirilir. Özellikle düşük eksprese edilen proteinler için aşırı ekspresyon, tercihen tek nöron çözünürlüğü ile görselleştirmeyi mümkün kılan daha yüksek sinyal yoğunlukları sağlar. Ayrıca, floresan etiketli proteinin ektopik ekspresyonu, genom düzenlemenin ihtiyaç ve zorluklarını ortadan kaldırır. Tersine, ektopik olarak ifade edilen kargonun davranışının, endojen kargonundavranışından farklı olabileceği iddia edilmiştir 5.

Genom düzenlemedeki son gelişmeler, endojen etiketleme stratejilerini daha kolay erişilebilir hale getirdi. Bu nedenle, daha düşük bir sinyal yoğunluğu, bir yükün endojen etiketleme yerine ektopik ekspresyon ile aksonal taşınmasını incelemek için ana sınırlama haline gelmiştir. Edinim koşullarının optimizasyonu ile eşleştirilmiş endojen etiketleme stratejisindeki dikkatli değerlendirmeler bu zorluğun üstesinden gelebilir.

Nematodlar, şeffaflıkları ve genetik manipülasyonlardaki kolaylıkları nedeniyle in vivo aksonal taşımayı incelemek için mükemmel bir araştırma modeli sağlar. Bu protokolde, canlı Caenorhabditis elegans'ta tek nöron rezolüsyonlu endojen proteinlerin aksonal taşınmasını görselleştirmek için bir araştırma stratejisi tanımlanmıştır.Sinaptik vezikül öncülerinin aksonal taşınmasını, vezikülle ilişkili RAB GTPase, RAB3'ün motor nöronDA9'da endojen olarak GFP ile etiketlendiği Jorgensen Lab 6 tarafından üretilen bir suş kullanarak görselleştiriyoruz. Protokol, farklı edinim parametrelerindeki küçük adaptasyonların ve foto ağartmanın bireysel taşıma olaylarının görselleştirilmesini nasıl iyileştirebileceğini sorarak, görüntüleme koşullarının nasıl optimize edileceğine dair fikirler sunar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Canlı hücre görüntüleme için nematodların nasıl korunacağı ve hazırlanacağı hakkında ayrıntılı bir protokol için, S.Niwa 7'nin çalışmasına bakın.

1. Solucan suşu üretimi

Nematod suşları üretmeye ek olarak, Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC)8 , doğrudan web sayfalarından elde edilebilen, endojen olarak floresan olarak etiketlenmiş proteinlere sahip, büyüyen bir nematod suşları koleksiyonu içerir.

  1. Floresan etiketleme stratejisinin seçimi
    1. DA9 motor nöronunda RAB-3 etiketli endojen GFP'yi görselleştirmek için rab-3 (ox699) aleli6'yı içeren nematod suşu MTS1161 kullanın (Suş CGC'de biriktirilecektir). Diğer aksonal proteinleri görselleştirmek için, Mello Lab9'dan CRISPR Cas9 düzenleme protokolünü kullanarak endojen etiketli bir protein ile bir nematod suşu oluşturun.
      NOT: MTS1161, RAB-3'ü bir GFP etiketi6 ile endojen olarak hücreye özel olarak etiketlemek için bir rekombinasyon yaklaşımı kullanır. Yaygın bir alternatif yaklaşım, çoklu bölünmüş floresan kopyalar10 kullanarak endojen protein başına floresan kopya sayısını arttırdığı için özellikle düşük eksprese edilen proteinler için önerilen bir bölünmüş floresan proteinin yeniden yapılandırılmasına dayanır. Kopya sayısı başlangıçta CenGen web sayfasındaki transkriptom veri kümelerine dayalı olarak tahmin edilebilir (https://cengen.shinyapps.io/CengenApp/) 11.
  2. Aksonal taşımayı görselleştirmek için nöron seçimi
    1. Suş MTS1161, motor nöron DA9'da RAB-3'ü görselleştirin (bkz. Şekil 1). Diğer aksonal kargolar, özellikle düşük eksprese edilen proteinler için, CenGen web sayfasını kullanarak analiz edilen proteinin ekspresyon seviyelerinin en yüksek olduğu bir nöron tanımlayın.
      NOT: CenGen projesi (cengen.org), C. elegans sinir sisteminin 302 nöronunun tümünü kapsayan geniş bir transkriptomik veri setine dayalı olarak nematodun birçok nöronunda ilgilenilen bir proteinin ekspresyon seviyelerini tahmin etmek için harika bir çevrimiçi kaynak sağlar12,13.

2. Solucan işleme ve görüntüleme için hazırlık

  1. Nematodları, 20 ° C'de nematod büyüme ortamı plakalarına ekilen ve görüntüleme için yetişkinliğe kadar 1 günlük bir yaşa kadar büyütülen bir bakteri çimi (suş: OP50) üzerinde tutun.
    NOT: Farklı aksonal kargolar, nöron sınıfları ve organizmalar arasında yaşlanma ile birlikte taşıma oranları sürekli olarak azaldığından, tanımlanmış bir yaş aşamasında aksonal taşınmanın ölçülmesi önemlidir 14,15,16,17,18-Larva evresi L4 veya yetişkinliğe 1 gün kala nematodlar çoğu makalede kullanılmıştır ve bu nedenle karşılaştırmalar için en büyük veri kümelerini sunar.
  2. Canlı hücre görüntüleme için nematodları hazırlayın: Solucanları görselleştirmek ve işlemek için sonraki tüm adımları bir stereo mikroskopla gerçekleştirin.
    1. Nematodları bir platin tel çekme kullanarak 0,5 mM Levamizol'lük bir damlacığa aktarın ve nematodları damlacık içinde 20 dakika inkübe edin.
    2. Levamizol damlacığından 10-20 nematodları, bir saç penası kullanarak bir cam slayt üzerinde% 10 agaroz (M9 ortamında çözülmüş) bir yama üzerinde 12 μL'lik bir M9 ortamı damlasına dikkatlice monte edin. % 10'luk bir agaroz yamasının nasıl yapılacağına dair ayrıntılı bir prosedür için, S.Niwa7 protokolüne bakın.
      NOT: Hayvanlar hipoksiden muzdarip olmaya başlamadan önce slayt başına yalnızca birkaç hayvan görüntüleneceğinden, düşük sayıda nematod monte etmek yeterlidir.
    3. Damlacığın üzerine bir kapak fişi yerleştirin (22 mm x 22 mm veya 18 mm x 18 mm). DA9 aksonunda görüntüleme aktarımı için, aksonu kapak kızağına yakın konumlandırın. Bunu yapmak için, hayvanları sırt üstü yuvarlamak için kapak kızağını agar yamasının üzerine yerleştirdikten sonra 45° döndürün.
    4. Kapak sürgüsü ile cam sürgü arasındaki boşluğu vazelin gibi viskoz bir jel ile kapatın. Bu, agaroz yamasının kurumasını önleyecektir, bu da nematodların görüntüleme alanından dışarı çıkmasına neden olabilir.
      NOT: Hayvanlara mümkün olduğunca nazik davranmak çok önemlidir. Çok yüksek konsantrasyonlarda levamisol veya solucana verilen fiziksel hasar, aksonal taşımayı bozabilir. Görüntüleme seansı sırasında kuyruğun hafif seğirmesi, hayvanın sağlıklı bir durumda kaldığına dair iyi bir işarettir. Hayvanlar sağlıklı kalır ve görüntüleme seansından sonra agaroz yamasından bile iyileşebilirler.

3. Canlı hücre mikroskobu

NOT: Tam alım parametresi değerleri mikroskoplar arasında farklılık gösterebilir. Bununla birlikte, her bir edinim parametresi için eğilimler, kullanılan mikroskoptan bağımsız olmalıdır. Bu protokolde, ağartma için ayrı bir lazer hattı ile donatılmış bir eğirme diskli konfokal mikroskop kullanıldı (mikroskopla ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız). Yeşil floresan 488 nm'lik bir lazerle uyarıldı ve emisyon bir ET525/36 emisyon filtresi ile filtrelendi. Beyazlatma işlemi 488 nm lazer çizgisi kullanılarak yapıldı.

  1. Odanın sıcaklığının veya sıcaklık kontrollü bir aşama mevcutsa, sabit bir sıcaklığa ayarlandığından emin olun. Nematodlar için sıcaklığı 20 °C'ye ayarlayın.
  2. Slaytı monte edin ve slayttaki nematodları bulmak ve konumları ezberlemek için 4x-20x büyütmeli objektif lens kullanın. Görüntü elde etmek için 63x büyütme lensine geçin.
  3. İlk alım parametrelerini kontrol etmek için tek bir görüntü çekin. Alım yazılımının yoğunluk histogramı ile görüş alanındaki sinyal yoğunluklarını takip edin. Yoğunluk değerleri, kameranın algılayabileceği maksimum sinyalin en düşük üçte birlik kısmını kapsamalıdır. Piksel doygunluğundan kaçının. Sinyal yoğunluğu çok düşükse, uyarma lazerinin yoğunluğunu artırın.
    NOT: Hızlandırılmış çekim sırasında floresan proteini ağarttığı için çok yüksek uyarma lazer yoğunlukları kullanmayın.
  4. Floresan sinyali algılamayı optimize etmek için alım parametresini ve buradaki adımları değiştirin.
    1. Ağartma adımının uygulanması: Ağartma adımı için 488 nm lazer (güç: 15 mW) hattı kullanarak analiz edilecek akson bölgesini ağartın. En az %90'lık bir ağartma verimliliği hedefleyin. Beyazlatma adımından önce ve sonra bölgenin sinyal yoğunluğunu karşılaştırarak beyazlatma verimliliğini belirleyin.
      NOT: Ağartma, sabit parçacıklardan türetilen sinyalin yanı sıra arka plandaki proteinin sitoplazmik fraksiyonundan türetilen sinyalden türetilen sinyali düşürerek hareketli parçacıkların sinyalini geliştirir. Sinaptik vezikül öncüleri üzerindeki RAB-3 gibi membranöz kargo, düşük bir sitoplazmik fraksiyona sahiptir, böylece ağartma aşaması, taşıma paketinin sitoplazmik arka plan üzerindeki sinyalini sadece hafifçe iyileştirir (Şekil 2A, D). Bununla birlikte, ağartma, bireysel taşıma olaylarının daha uzun mesafelerde izlenmesini iyileştirir ve duraklama sürelerinin ölçülmesine izin verir (Şekil 2A).
    2. Gruplama: Bireysel taşıma olaylarının sinyal yoğunluğunu artırmak için 2 x 2 gruplama kullanın. Gruplama, piksel dizilerini daha büyük bir pikselde birleştirir. Bu, uzamsal çözünürlüğü azaltacak, ancak bireysel taşıma olaylarının sinyal yoğunluğunu artıracaktır ve özellikle loş parçacıklar için yararlıdır (Şekil 2B,D).
    3. Pozlama süresi: Sinyal yoğunluğunu artırmak için pozlama süresini artırın. Maruz kalma süresinin arttırılması, numunenin sinyal yoğunluğunu, taşıma olayları için daha düşük bir zamansal çözünürlük elde etme maliyetine kadar artırır. Buradaki deney için, RAB-3'ün bireysel taşıma olaylarını takip etmek için ardışık zaman noktaları (100-500 ms maruz kalma süresi) arasında 300 ms ila 700 ms arasında bir zamansal çözünürlük kullanın. (Şekil 2C,D)
  5. Hızlandırılmış kayıt: Proteinin sinyal yoğunluğuna ve bireysel taşıma olaylarının sıklığına bağlı olarak en az 1-3 dakikalık bir zaman atlaması yapın. Bir zaman atlaması kaydedildikten sonra bir sonraki hayvana geçin. Kaydedilen hayvanların sağlıklı bir durumda olduğundan emin olmak için slayttaki hayvanlar 30 dakikadan fazla görüntülenmemelidir.
    NOT: Kayıt sırasında hayvanların kuyruğunun hafif seğirmesi, hayvanın hala hayatta olduğunun bir göstergesidir.

4. Aksonal taşıma verilerinin analizi

NOT: Sonraki görüntü analizi adımları için ImageJ/Fiji19'u kullanın. Fiji, tüm yaygın mikroskopi yazılım paketleri ile veri okuyabilir.

  1. Kymograph üretimi
    1. Verileri içe aktar: Hızlandırılmış veri dosyasını Fiji'ye aktarın. Verileri Fiji'ye alamaması durumunda, zaman kaydını yazılım paketinden bir tiff dosyası olarak dışa aktarın ve daha sonra Fiji'ye yükleyin.
    2. Sapma düzeltmesi: Görüntü alımı sırasında hayvan/akson segmentinin hareket edip etmediğini veya hafifçe sürüklenip sürüklenmediğini kontrol edin. StackReg20 eklentisini çalıştırarak hayvan hareketini veya sürüklenmeyi düzeltin. Eklentiyi çalıştırırken Katı Gövde dönüşümünü seçin.
    3. Bir kymograph'ın manuel olarak oluşturulması: Şekil 3'te ayrıntılı bir adım adım prosedür verilmiştir. Kymografı oluşturmak için sapma düzeltmeli filmi kullanın. Segmentli Çizgi aracını kullanın ve analiz edilecek akson segmenti boyunca bir çizgi çizmek için segmentli çizgi simgesine farenin sol tuşu ile çift tıklayarak çizgi genişliğini akson çapına uyacak şekilde ayarlayın. Kymografı oluşturmak için ImageJ/Fiji eklentisi Kymoreslicewide'ı çalıştırın ve parametre ayarlarında çizginin genişliği boyunca maksimum yoğunluk değerini kullanın.
      NOT: Çizgi çizim yönünde tutarlılığı korumak (örneğin, her zaman distal aksona yakın veya ters), kymograflarda geri hareket yönünün izlenmesini basitleştirir.
  2. Taşıma parametresinin analizi
    1. Taşıma parametresini hesaplayın: sonraki adımları izleyerek kymograftan olay numarası, hız, çalışma uzunluğu ve duraklama süresi.
      1. Kymograph'ta taşıma olaylarını izleme: Kymograph'ta tek tek taşıma olaylarını izlemek için Düz Çizgi aracını kullanın. Her satırı ROI yöneticisine kaydedin ve tüm taşıma olaylarını kymograph'ta izleyin. ImageJ/Fiji'de aşağıdaki ölçüm parametrelerini seçin: Alan, Sınırlayıcı dikdörtgen, Ortalama gri değer, Feret çapı.
      2. Aktarım parametresini hesapla: Sonuçlar tablosunu bir elektronik tabloya yapıştırın ve hesaplamak için sonuç bölümlerinin aşağıdaki sütunlarını kullanın:
        Çalışma uzunluğu: Çalışma uzunluğunu μm cinsinden belirlemek için genişliği (piksel cinsinden) kameranın çözünürlüğüyle (ör. x μm/pxl) çarpın.
        Hız: Koşu uzunluğu/Koşu süresi. Bir hareket olayının süresini saniye cinsinden belirlemek için, yüksekliği (piksel cinsinden) ardışık zaman noktaları (ör. x s/piksel) arasındaki alım süresiyle çarpın.
        Duraklatma süresi: Hızın 0 olduğu iki ardışık hareket arasındaki çalışma süresi.
        Olay sayısı: Toplam olaylar, dakika başına olay sayısını ve akson uzunluğu segmentini belirlemek için kymografın toplam uzunluğuna normalleştirilebilir. Olaylar ayrıca anterograd ve retrograd taşıma olayları olarak kategorize edilebilir. Her hareket olayının yönlülüğünü belirlemek için Feret Açısı aracını kullanın. Başlangıçta proksimal ve distal olmak üzere parçalı çizginin çizilmesi ile oluşturulan ve kimografideki anterograd transport olaylarının sağdan sola doğru gösterildiği kymograflarda, 90°90° retrograd bir olayı gösterecektir, aksi takdirde tersi olacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Model sistemine ve ölçüm prosedürüne genel bakış
Sinaptik vezikül öncüllerinin aksonal taşınmasını görselleştirmek için, endojen olarak GFP etiketli RAB-3'ü izledik. Burada, bir hücreye özgü promotör (glr-4p) altındaki rekombinaz Flippase ekspresyonunun, DA9 motor nöronunda endojen RAB-3'ü etiketlediği, yakın zamanda oluşturulan bir GFP::Flip-on::RAB-3 suşu6'yı kullanıyoruz. DA9 bipolar bir motor nörondur ve hücre gövdesi hayvanın arka tarafında, ventral tarafta, anüse...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Yöntemin sınırlılıkları ve alternatif yöntemler
Bu protokolde, sinaptik vezikül öncüleri ile ilişkili olan endojen olarak etiketlenmiş RAB-3'ün aksonal taşınmasını görselleştirmek için edinim parametrelerini optimize ettik. RAB-3'ü görselleştirmek için, yakın zamanda yayınlanan bir FLIP-on::GFP::RAB-3 suşu6'yı kullandık ve rekombinaz Flippaze'yi hücreye özgü bir promotör (glr-4p)25 altında ifade ettik. Bu strateji, RAB-3...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, bu yazıda rapor edilen çalışmayı etkilemiş gibi görünebilecek hiçbir rakip veya mali çıkar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Yazarlar, teknik yardım, geri bildirim ve tartışmalar için Yogev ve Hammarlund laboratuvarlarına teşekkür eder. Canlı hücre görüntüleme konusunda rehberlik ettiği için Grace Swaim'e ve laboratuvarda manuel kimografi analizini ilk kez kurdukları için Grace ve Brian Swaim'e özellikle teşekkür ederiz. OG, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı) -Project# 465611822. tarafından finanse edilen bir Walter-Benjamin Bursu tarafından desteklenmektedir. SY, NIH hibesi R35-GM131744 tarafından finanse edilmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AgaroseSigma-AldrichA9539
Kapak fişleri (22 mm x 22 mm, No1); Altın Mühür Kapak CamıThomas Scientific6672A14
LevamisolChemCruzsc-205730
Mikroskop: Nikon Ti2 ters mikroskop, Yokogawa CSU-W1 SoRa Tarama Kafası, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS kamera, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA yağa daldırma objektifi, ET525/36 emisyon filtreli 488nm'de Nikon fotostimülasyon tarayıcısıNikonEğirme Diski Konfokal Mikroskop
  Nikon Ti2 için NIS elemanları ARNikonYazılımı 
Düz önceden temizlenmiş mikroskopi slaytlarıThermo Scientific420-004T
Nematod suşuTanımlayıcıKaynak
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)MTS1161 CGC'ye yatırılacak (https://cgc.umn.edu/)

Kaynaklar

  1. Millecamps, S., Julien, J. P. Axonal transport deficits and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 14 (3), 161-176 (2013).
  2. Brady, S. T., Morfini, G. A. Regulation of motor proteins, axonal transport deficits and adult-onset neurodegenerative diseases. Neurobiol Dis. 105, 273-282 (2017).
  3. Kevenaar, J. T., Hoogenraad, C. C. The axonal cytoskeleton: from organization to function. Front Mol Neurosci. 8, 44(2015).
  4. Roy, S. Seeing the unseen: the hidden world of slow axonal transport. Neuroscientist. 20 (1), 71-81 (2014).
  5. Watson, E. T., Pauers, M. M., Seibert, M. J., Vevea, J. D., Chapman, E. R. Synaptic vesicle proteins are selectively delivered to axons in mammalian neurons. Elife. 12, e82568(2023).
  6. Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
  7. Niwa, S. Immobilization of Caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons. J Vis Exp. (128), e56690(2017).
  8. Caenorhabditis genetics center (CGC). University of Minnesota. , Available from: https://cgc.umn.edu/ (2023).
  9. Ghanta, K. S., Mello, C. C. Melting dsDNA donor molecules greatly improves precision genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 216 (3), 643-650 (2020).
  10. He, S., Cuentas-Condori, A., Miller, D. M. NATF (Native and Tissue-Specific Fluorescence): A strategy for bright, tissue-specific GFP labeling of native proteins in Caenorhabditis elegans. Genetics. 212 (2), 387-395 (2019).
  11. Hammarlund, M., Hobert, O., Miller, D. M., Sestan, N. The CeNGEN Project: The complete gene expression map of an entire nervous system. Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).
  12. Taylor, S. R., et al. Molecular topography of an entire nervous system. Cell. 184 (16), 4329-4347 (2021).
  13. Hammarlund, M., Hobert, O., Miller, D. M., Sestan, N. The CeNGEN project: The complete gene expression map of an entire nervous system. Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).
  14. Takihara, Y. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (33), 10515-10520 (2015).
  15. Li, L. B. The neuronal kinesin UNC-104/KIF1A is a key regulator of synaptic aging and insulin signaling-regulated memory. Curr Biol. 26 (5), 605-615 (2016).
  16. Viancour, T. A., Kreiter, N. A. Vesicular fast axonal transport rates in young and old rat axons. Brain Res. 628 (1-2), 209-217 (1993).
  17. Cross, D. J., Flexman, J. A., Anzai, Y., Maravilla, K. R., Minoshima, S. Age-related decrease in axonal transport measured by MR imaging in vivo. Neuroimage. 39 (3), 915-926 (2008).
  18. Vagnoni, A., Hoffmann, P. C., Bullock, S. L. Reducing Lissencephaly-1 levels augments mitochondrial transport and has a protective effect in adult Drosophila neurons. J Cell Sci. 129 (1), 178-190 (2016).
  19. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  20. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  21. Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
  22. Hall, D. H., Russell, R. L. The posterior nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans: serial reconstruction of identified neurons and complete pattern of synaptic interactions. J Neurosci. 11 (1), 1-22 (1991).
  23. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the ventral nerve cord of Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 275 (938), 327-348 (1976).
  24. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314 (1165), 1(1986).
  25. Park, J., Xie, Y., Miller, K. G., De Camilli, P., Yogev, S. End-binding protein 1 promotes specific motor-cargo association in the cell body prior to axonal delivery of dense core vesicles. Curr Biol. 33 (18), 3851-3864 (2023).
  26. Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M., Mello, C. C. Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans. Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).
  27. Paix, A., Folkmann, A., Rasoloson, D., Seydoux, G. High efficiency, homology-directed genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Genetics. 201 (1), 47-54 (2015).
  28. Goudeau, J., et al. Split-wrmScarlet and split-sfGFP: tools for faster, easier fluorescent labeling of endogenous proteins in Caenorhabditis elegans. Genetics. 217 (4), (2021).
  29. Cranfill, P. J., et al. Quantitative assessment of fluorescent proteins. Nat Methods. 13 (7), 557-562 (2016).
  30. Fan, X., et al. SapTrap assembly of Caenorhabditis elegans MosSCI transgene vectors. G3. 10 (2), Bethesda. 635-644 (2020).
  31. Glomb, O., et al. A kinesin-1 adaptor complex controls bimodal slow axonal transport of spectrin in Caenorhabditis elegans. Dev Cell. 58 (19), 1847-1863 (2023).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Sinaptik Vezikül ÖncülleriGFP RAB-3Kimograf AnaliziZaman Atlamalı GörüntülemeCRISPR Cas9 EtiketlemeAkson Görüntüleme
Canlı Caenorhabditis elegans'ta Floresan Mikroskobu ile Endojen Yükün Aksonal Taşınmasının Görüntülenmesinin Optimize Edilmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.